Kinetische Verfolgung selbstreplizierender Systeme durch Messung von Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer

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1 Kinetische Verfolgung selbstreplizierender Systeme durch Messung von Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Jan Bülle aus Krefeld Bochum im August 000

2 Inhalt Einleitung... Selbstreplizierende Systeme... Das Grundprinzip selbstreplizierender Minimalsysteme... Selbstreplizierende Systeme und der Ursprung des Lebens... Das kinetische und thermodynamische Verhalten von Replikatoren... 6 Selbstreplizierende Systeme aus Oligonukleotiden... 0 Selbstreplizierende Systeme aus Peptiden Selbstreplizierende Systeme aus organischen Bausteinen Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Allgemeine physikalische Zusammenhänge Das System Cy3-Cy Die Synthese von Oligonukleotiden an der Festphase Das Verfahren allgemein Synthese spezieller Derivate... 4 Aufgabenstellung Allgemeiner Teil Planung der erforderlichen Synthesen Synthese der derivatisierten Monomerbausteine und Festphasen Amino-C-Phosphoramidit Festphase zur Synthese von 3 -Phosphat-Oligonukleotiden... 5 Synthese von Deoxy-Adenosin als Leader-Nukleosid an Aminopropyl-CPG Synthese eines Butoxyphosphat-Phosphoramidits Synthese eines alternativen 5 -Iodo-3 -Phosphorothioat-Ligationssystems Manuelle Synthese der 5 -aminomodifizierten Oligonukleotide 94a bis 94c Synthese der Oligonukleotide am Synthesizer Entschützung und Abspaltung von der Festphase Kinetische Voruntersuchungen... 6 Qualitative Verfolgung der Reaktion in der MALDI-MS... 6 HPLC-Kinetiken Vorbereitungen für die Fluoreszenzmessungen Voruntersuchungen zum System Cy3-Cy FRET-Kinetiken als Einzelpunktmessungen... 8 Theoretische Beschreibung der Kalibrierkurven... 8 Aufnahme der Kalibrierkurven Durchführung der Kinetiken FRET-Kinetiken als Online-Messungen Das zugrundeliegende mechanistische Modell für den Replikator... 9 Übergang zu Messung der Donorfluoreszenzabnahme Theoretische Beschreibung der Kurvenverläufe Die Wahl der geeigneten Reaktionstemperatur Die kinetische Untersuchung der Hydrolyse von EDC Die autokatalytische Reaktionsordnung p Die Abhängigkeit der kinetischen Parameter voneinander... 5 I

3 Inhalt Ausblick... 9 Zusammenfassung... Experimenteller Teil... 3 Verwendete Geräte... 3 Magnetische Kernresonanzspektroskopie... 3 UV-Spektroskopie... 3 Massenspektrometrische Methoden... 3 Fluoreszenzspektroskopie... 3 Chromatografie... 3 Synthesizer:... 4 Verwendete Grundchemikalien... 4 Trocknung der Lösungsmittel... 4 Feinchemikalien... 4 Zusammensetzung der Standardlösungen für die manuelle DNA-Synthese... 4 Synthese der Nukleosidderivate... 4 Geschütztes 5 -Amino-deoxycytidin (07,08)... 4 Phosphitylierungsreagens Synthese der Phosphoramidite 3, Synthese des N-4-Benzoyl-5'-iodo-',5'-dideoxycytidin-3'-O-(β-cyanoethyl-N,Ndiisopropylamino)phosphoramidits (40) Synthese des -'-O-4,4'-Dimethoxytriphenylmethoxyethylsulfonylethoxy-(- butyl-n,n-diisopropylamino)phosphoramidits (3)... 3 Synthese der Festphasen und Konjugat 7 aus geschütztem Deoxyadenosin und CPG Festphase zur Erzeugung 3 -terminaler Phosphatgruppen Manuelle Synthese der Oligonukleotide Allgemeine Arbeitsvorschriften ( AAV ) Kopplungen der verschieden 5 -Amino-Oligonukleotidsequenzen Abspaltung der Oligonukleotide und Deblockierung der Schutzgruppen Automatisierte Synthese der Oligonukleotide Reinigung und Charakterisierung der Oligonukleotide Chromatografie D-NMR der verwendeten Oligonukleotide... 4 Experimente zur Ligation im Iodo-Phosphorothioat-System Durchführung der Kinetiken zur Replikation HPLC FRET-Messungen durch Kapillartechnik Online-Kinetiken Bestimmung der thermodynamischen Parameter der Templat-Duplexe Kinetik der EDC-Hydrolyse Durchführung der Messungen Auswertung der NMR-Spektren Verwendete Abkürzungen und Akronyme... 6 Anhang II

4 Inhalt Messdaten zur Selbstreplikation Variation der initialen Templatmenge mit fünf verschiedenen Templatkonzentrationen Variation der initialen Templatmenge und Variation vom Verhältnis der beiden Phosphatbausteine d( Cy3 TCCGp) und d( Cy5 TCCGp) Messdaten zur EDC-Hydrolyse Danksagungen Persönliche Daten... 7 Literaturzitate... 7 III

5 Selbstreplizierende Systeme Einleitung Die vorliegende Arbeit behandelt die kinetische Verfolgung selbstreplizierender Systeme aus DNA-Molekülen über Messung von Fluoreszenz-Resonanz-Energie- Transfer (FRET). Aus diesem Grund wird zunächst ein Überblick über die wichtigsten bis heute bekannten selbstreplizierenden Systeme mit dem Schwerpunkt auf Systemen aus Nukleinsäuren gegeben. Danach wird das Grundprinzip des FRET erklärt und abschließend kurz auf die sequentielle Festphasensynthese von DNA eingegangen. Selbstreplizierende Systeme [ ] Das Grundprinzip selbstreplizierender Minimalsysteme Selbstreplizierende Systeme sind definitionsgemäß zur Selbstvermehrung befähigt. Es handelt sich um Systeme aus Reaktionszyklen, indem ein oder mehrere Produkte als Katalysatoren ihrer eigenen Synthese wirken. Im einfachsten Fall reagieren zwei Eduktbausteine A und B in einer irreversiblen Reaktion zu einem Produktbaustein C, der seinerseits als Templat für die Bildung von sich selbst, also als Katalysator für seine eigene Synthese im nächsten Reaktionszyklus dienen kann. Eine wesentliche Eigenschaft selbstreplizierender Systeme ist diese Autokatalyse. Die einzelnen Reaktionsschritte kann man im einfachsten Fall wie folgt aufteilen: Assoziation: Die Eduktbausteine A und B lagern sich reversibel über nichtkovalente Bindungen an den Templatbaustein C an. Es entsteht ein termolekularer Komplex ABC. Die molekulare Erkennung der drei Bausteine erfolgt dabei spezifisch. Die reaktiven Gruppen der Edukte A und B kommen durch den Templateffekt in räumliche Nähe zueinander, worin die Wirkung des Katalysators liegt. Die nicht-kovalente Assoziation von A an B ohne Templat wird als vorgelagertes Gleichgewicht in der Regel vernachlässigt, da die Komplexstabilität im Verhältnis zum termolekularen Komplex ABC und Duplex C gering ist. Ligation: Es erfolgt eine irreversible und kovalente Verknüpfung der Bausteine A und B, wodurch der Duplex C entsteht. Im autokatalytischen Fall entspricht das Reaktionsprodukt der Ligation von A mit B dem Templat C, die Bausteine vom Duplex C sind somit selbstkomplementär, der Duplex hat in Bezug auf seine Symmetrie eine zweizählige Drehachse. Dissoziation: Die beiden Templatmoleküle, die den Duplex C bilden, dissoziieren reversibel auseinander und können ihrerseits wieder als Templatbausteine für neue Katalysezyklen dienen. Erst dadurch wird der Katalysezyklus in sich geschlossen (Turnover). $EE6FKHPDWLVFKH'DUVWHOOXQJHLQHVPLQLPDOHQVHOEVWUHSOL]LHUHQGHQ6\VWHPV

6 Das Grundprinzip jedes selbstreplizierenden Systems Replizierende Systeme können prinzipiell jedoch auch deutlich komplexer sein. Im allgemeinsten Fall reagieren mehrere Eduktbausteine in mehreren reversiblen oder irreversiblen Reaktionsschritten an mehreren Templatmolekülen. Es bilden sich dann intermediär Komplexe höherer Molekularität aus. Es besteht die Möglichkeit, dass mehrere Edukte in Konkurrenz zueinander stehen. Es können auch verschiedene Zyklen miteinander gekoppelt sein. Autokatalyse geht dann z.b. in Kreuzkatalyse über, d.h. das Reaktionsprodukt des einen Katalysezyklusses dient als Templat für den anderen und umgekehrt. In diesem Fall müssen die Templatbausteine nicht mehr selbstkomplementär sein. Neben den Reaktionen in homogener Lösung sind auch in heterogenen Systemen Replikationen an Oberflächen denkbar, die aus der Sicht der präbiotischen Chemie von besonderem Interesse sind. Parallel kann auch immer die nicht-templatgesteuerte und damit unkatalysierte Reaktion ablaufen, indem sich die Edukte A und B ohne Beteiligung des Templates treffen und zum Produkt C reagieren. In diesem Fall kann demnach, wie auch bei unspezifischer Wechselwirkung zwischen Templat und den Edukten, keine Informationsübertragung vom Templat auf das Ligationsprodukt erfolgen. Grundsätzlich muss man im Zusammenhang mit Selbstreplikation zwischen zwei Arten von autokatalytischen Systemen unterscheiden: Autokatalytische Systeme ohne Informationstransfer In diesem Fall erfolgt die Katalyse durch die Matrize unspezifisch. Die Anlagerung der Substrate am Templat basiert auf attraktiven Wechselwirkungen, die nicht zwischen verschiedenen Substraten der gleichen chemischen Substanzklasse differenzieren können (z.b. unspezifische hydrophobe Wechselwirkung zwischen lipophilen Gruppen in Wasser). Replikatoren mit Informationsübertragung Hier verursachen bereits geringfügige Unterschiede in der Struktur der Substrate große Unterschiede in der Templatkatalyse. Die molekulare Erkennung zwischen Templat und Substrat erfolgt hochspezifisch; im System kann Information gespeichert werden (z.b. Watson-Crick-Basenpaarung zwischen komplementären Nukleinsäuresträngen, spezifische Abfolge von Chiralitätszentren, etc.). Informationstransfer, also die Übertragung an Information, benötigt einen molekularen Mechanismus, bei dem aus mehreren alternativen Ligationsmöglichkeiten genau eine einzige favorisiert wird. Genau dies kann aber erst durch templatgesteuerte Reaktionen realisiert werden, da der Templateffekt unter geeigneten Bedingungen für eine spezifische molekulare Erkennung der Eduktbausteine sorgt, so dass bestimmte Eduktbausteine aus einem Angebot vieler Spezies ausgewählt werden können []. Selbstreplizierende Systeme und der Ursprung des Lebens Eine direkte Rekonstruktion der Entstehung von Leben auf der Erde ist nicht möglich und wird es wahrscheinlich auch niemals sein. Man kann sich dennoch der Frage nach dem Ursprung des Lebens, wie wir es heute kennen oder von Leben ganz allgemein, von zwei Seiten her nähern, von der biologischen und der chemischpräbiotischen Seite: Für die Biologie ergibt sich die Möglichkeit, die Evolution durch phylogenetischen Vergleich der einzelnen Lebewesen zeitlich bis zur sogenannten Urzelle

7 Selbstreplizierende Systeme zurückzuverfolgen. Lebensformen, die auf eine zelluläre Struktur verzichten, sind nicht bekannt. Eine rein biologische Vorgehensweise endet daher auf dieser Stufe und vermag es kaum, die wesentliche Frage nach der Entstehung dieser Urzelle zu beantworten. Für die präbiotische Chemie ergibt sich die Möglichkeit, Bedingungen im Labor zu simulieren, wie sie vor Milliarden von Jahren vor der Entstehung des Lebens auf der Erde geherrscht haben könnten. Derartige Experimente bleiben zwar stets spekulativ, da man niemals wissen wird, wie genau sich die Biomoleküle gebildet haben, aus denen dann unser Leben hervorgegangen ist, dennoch können derartige Experimente Einsicht in lebensbildende Prozesse liefern und sind daher nicht nur von akademischem Interesse. Wie von Oparin 94 [3] und Haldane 99 [4] unabhängig voneinander vorausgesagt und von Miller [5] rund 5 Jahre später experimentell gezeigt wurde, lassen sich Aminosäuren unter geeigneten Bedingungen aus einfachen organischen Molekülen spontan erzeugen. Inzwischen ist eine Vielzahl von Experimenten zur Selbstkonstituierung biologisch relevanter Moleküle unter den verschiedensten Bedingungen beschrieben worden [6]. Unter den Bedingungen einer simulierten Atmosphäre mit reduzierenden Eigenschaften konnten als wichtige Produkte Formaldehyd und Blausäure nachgewiesen werden. Diese beiden Schlüsselmoleküle erlaubten es, die Selbstkonstitution von Aminosäuren auf die Strecker-Synthese zurückzuführen. Zusätzlich konnte durch die Bildung von Formaldehyd die Synthese der Zucker erklärt werden, da Formaldehyd in der Formose-Reaktion I eine Vielzahl von Hydroxycarbonylverbindungen liefert, unter ihnen auch Ribose als Grundbestandteil von RNA [7]. Ein weiterer wichtiger Bestandteil von RNA konnte von J. Oró 96 erzeugt werden, als er zeigte, dass aus HCN unter geeigneten Bedingungen Adenin entstehen kann [8]. L.E. Orgel gelang es, durch Eindampfen von Adenin und einfachen Ribosederivaten in Anwesenheit von Magnesiumsalzen Adenosin zu synthetisieren [9]. Aus diesem Nukleosid konnte man das Nukleotid durch Eindampfen in Anwesenheit von anorganischen Phosphaten und Harnstoff darstellen [0]. Man glaubte zeitweise, alle wichtigen Bausteine von Biomolekülen durch primitive Reaktionen aus einfachen Precursor-Molekülen erzeugen zu können. Man kannte zwar noch nicht für jede Naturstoffklasse eine präbiotisch relevante Synthesemethode, sah dies jedoch lediglich als eine Frage der Zeit an. Diese Annahme und damit die präbiotische Relevanz aller damit verbundenen Experimente brach jedoch in sich zusammen, als sich herausstellte, dass die wesentlichen Grundvoraussetzungen, auf denen alle bisher durchgeführten Experimente aufbauten, wahrscheinlich nicht haltbar waren. Es muss nämlich heute auf der Grundlage neuerer Untersuchungen vielmehr davon ausgegangen werden, dass die Uratmosphäre nicht die reduzierenden Eigenschaften hatte, wie ursprünglich angenommen. Vielmehr gilt es als wahrscheinlich, dass die Hauptbestandteilen Wasser, CO und N waren. Wieder war es Miller, der in den 80er Jahren zeigen konnte, dass praktisch keine Aminosäuren nachgewiesen werden konnten, wenn man im Experiment die stark reduzierende Atmosphäre durch eine redox-neutrale oder nur schwach reduzierende I Bei der Formose-Reaktion handelt es sich um ein Beispiel für ein autokatalytisches Reaktionssystem ohne Informationsübertragung 3

8 Selbstreplizierenden Systeme und der Ursprung des Lebens Gasmischung ersetzte []. Auch die Schlüsselmoleküle Blausäure und Formaldehyd konnten dann nicht mehr gebildet werden, wodurch auch die präbiotischen Folgeexperimente, welche von diesen beiden Molekülen ausgegangen waren, ihre direkte Bedeutung für die chemische Selbstkonstitution auf der Erde verloren. Heute ist unklar, wie die erste Lebensform aus der präbiotischen Mischung verschiedenster Substanzen hervorgehen konnte. Einige Theorien gehen davon aus, dass Kohlenstoff in niederen Oxidationszahlen durch Meteoriteneinschläge aus dem All auf die Erde gebracht wurde []. Eine andere Theorie geht davon aus, dass Wasserdampf, CO und N durch eine primordiale Autolithotrophie in NH 3, Carbonsäuren, Aldehyde, HCN, etc. umgewandelt werden konnten [3]. Eine Theorie von G. Wächtershäuser postuliert dagegen, dass Pyrit die Elektronen für die Reduktion des CO lieferte [4]. Man kann diese und andere Theorien über den Ursprung des Lebens allgemein in metabolische und genetische Theorien einteilen: Die metabolischen Theorien basieren auf einem autotrophen Stoffwechsel, der seinerseits die erste Lebensform darstellt. Dieser wurde ausschließlich durch Umsetzung von Energie- und Materieformen angetrieben, die auf der Erde anzutreffen waren (H O, CO, N, H S, etc.). Die Notwendigkeit für eine chemische Evolution einer primordialen Mischung verschiedenartiger mehr oder weniger einfach aufgebauter Moleküle bis hin zur ersten Lebensform entfällt somit. Genetische Theorien dagegen erfordern einen Stoffwechsel lediglich für den Aufbau der genetischen Moleküle, aus denen ihrerseits die erste Lebensform hervorgegangen ist. Ob dies nun zuvor durch direkte chemische Selbstkonstitution aus einer Ursuppe heraus oder aber indirekt über einen vorgeschalteten autotrophen Metabolismus geschehen ist, ist dabei prinzipiell unerheblich. Wesentlich ist lediglich, dass genetische Theorien Selbsterhaltung eines genetischen Moleküls oder aber molekularen Apparates genetischer Moleküle fordern. Mit diesen wird dann unmittelbar eine molekulare Vielfalt ermöglicht, die in verschiedener Weise durch Evolution die Überlebenschance in einem Ökosystem zu erhöhen, zu sichern und sich an eine Umwelt zu adaptieren sucht, die fortlaufenden Änderungen unterworfen ist. Dies kann nach M. Eigen, nur dadurch geschehen, dass man die Darwin sche Evolution auf die molekulare Ebene überträgt [5]. Autokatalyse als Systemeigenschaft ist dabei unabdingbar, worin auch die Relevanz selbstreplizierender Systeme für die Entstehung von Leben begründet liegt. Unter bestimmten Bedingungen ist nämlich zu erwarten, dass zwei um gemeinsame Ressourcen konkurrierende Replikatoren derart im Wettbewerb stehen, dass der eine den anderen vollständig verdrängt. Dies entspräche dann einem survival of the fittest, eben einer Darwinschen Selektion auf molekularer Ebene. Nach Eigen sind an die erste Lebensform die folgenden drei notwendigen Eigenschaften geknüpft: Metabolismus, d.h. sie kann sich aus der Umwelt mit Energie versorgen und diese für den Aufbau von Molekülsträngen nutzen. Eine einfache Form dieser Energieaufnahme kann in der Verwendung von aktivierten, und daher 4

9 Selbstreplizierende Systeme energiereichen Eduktbausteinen bestehen, die von der Umwelt zur Verfügung gestellt werden. Selbstreplikation, d.h. sie kann ihre Molekülstränge im Sinne eines wiederholten Kopiervorganges vermehren. Ein Molekülstrang enthält sowohl die genetische Information als auch die Funktion in seiner Sequenz. Durch Kopieren werden Information und Funktion auf die nachfolgende Generation übertragen (Vererbung). Die Vererbung ist nur möglich, wenn ein Molekülstrang als Matrize (Templat) für die Bildung des Tochterstanges dienen kann. Mutabilität, d.h. in gewissem Umfang ist der Kopierprozess fehlerbehaftet, so dass neue Mutanten mit neuen Funktionen entstehen können. Heutiges Leben basiert in allen seinen vielfältigen Formen universell auf der Grundlage der Proteinbiosynthese. Wegen der außerordentlichen Komplexität dieses Zusammenspiels von DNA, RNA und Proteinen spricht vieles gegen eine spontane Selbstkonstituierung dieser DNA-RNA-Protein-Welt, vielmehr erscheint es wahrscheinlich, dass es zuvor eine homomolekulare RNA-Welt gegeben hat [6]. Die von Eigen geforderten Eigenschaften der ersten Lebensform sollten auf ein vergleichsweise einfach strukturiertes molekulares System anwendbar sein, denn je komplexer das System ist, desto unwahrscheinlicher ist seine spontane Selbstkonstituierung. In der Natur werden Proteine in ihrer Sequenz aus DNA über RNA codiert, DNA wird ihrerseits in der Biosynthese aus RNA als Vorstufe chemisch erzeugt. Nukleinsäuren stehen also biosynthetisch vor den Enzymen, Ribonukleinsäuren vor den Deoxyribonukleinsäuren. Die Selbstkonstituierung der Grundbausteine des Lebens ist der eine Aspekt der präbiotischen Chemie. Nun schließen sich aber auch die Experimente an, diese Grundbausteine, auf welchem Wege auch immer sie nun entstanden sein mögen, auf ihre Fähigkeit zur chemischen Evolution hin zu untersuchen. Unter chemischer Evolution versteht man die Folgeprozesse, die im Anschluss an die Selbstkonstituierung dieser Biomoleküle zur allerersten primitiven Lebensform geführt haben. Der Ursprung des Lebens steht nach dieser genetischen Theorie gewissermaßen also am Ende der chemischen Evolution. Einblicke in lebensbildende Prozesse können auf dieser Stufe nicht nur die Nukleinsäuren liefern, auch wenn ihre präbiotische Relevanz von besonderer Bedeutung zu sein scheint. Auch andere, zum Teil vollkommen artifizielle molekulare Systeme sollten Einblicke in diejenigen Faktoren und molekularen Prozesse liefern, die zur chemischen Evolution erforderlich sind. Wesentlich ist hier jedenfalls, dass nur diejenigen autokatalytischen Systeme durch natürliche Selektion evolvieren können, die auch Information in stabiler Form speichern und vererben können. Für den Ursprung von Leben sind also diejenigen Replikatoren von besonderer Bedeutung, die zum Informationstransfer in der Lage sind (genetische Replikatoren). Selbstreplikation = Autokatalyse Informationsübertragung Die autokatalytischen Systeme ohne Informationstransfer müssen nicht völlig bedeutungslos für den Lebensursprung gewesen sein. Sie können an der Ausbildung der Umweltbedingungen beteiligt gewesen sein, die für die ersten evolvierenden Systeme notwendig waren. 5

10 Selbstreplizierenden Systeme und der Ursprung des Lebens Unter den monomeren Aminosäuren, Zuckern und polymeren Nukleotiden nehmen letztere eine Sonderstellung ein, denn sie enthalten in ihrer Sequenz neben der codierten Information zusätzlich die auch in der Natur verwendete Eigenschaft, sequenzspezifisch über Watson-Crick-Basenpaare als Templatmoleküle für Tochterstränge dienen zu können, was eine vergleichsweise überaus präzise Weitergabe der Information auf die Generation der Nachkommen (Vererbung) möglich macht. Zusätzlich ist seit den 80er Jahren bekannt, dass RNA auch katalytische Eigenschaften, also eine direkte Funktion haben kann (Ribozyme), so dass auch die für Selbstreplikation geforderte gleichzeitige Verknüpfung von Information und Funktion durch RNA realisiert werden kann [7]. Inzwischen kennt man neben den Ribozymen auch zahlreiche Deoxyribozyme [8]. Homomolekulares Leben auf der Basis von RNA scheint somit möglich, wodurch die RNA-Welt-Hypothese neuen Aufschwung bekommt. In diesem Fall der Homomolekularität der ersten Lebensform muss das erste selbstreplizierende System folglich enzymfrei gearbeitet haben. Die Katalyse muss durch die Nukleinsäuren direkt erfolgt sein, wie aus der geforderten Homomolekularität resultiert. Nukleinsäuren sind demnach zumindest unter den Biopolymeren diejenigen Moleküle, auf deren direkter Grundlage die Entstehung der ersten primitiven Lebensform im Sinne einer genetischen Theorie am plausibelsten erscheint, auch wenn eine chemische Selbstkonstituierung der Nukleinsäuren unter primordialen Bedingungen vorerst nicht experimentell realisiert werden konnte. Darüber hinaus sind selbstreplizierende Systeme nicht nur wegen ihres dynamischen Verhaltens, der molekularen Erkennung und der Katalyse von Interesse, sondern sie können eben auch im Zusammenhang mit dem Ursprung des Lebens weitere Einblicke in die chemische Evolution liefern. Inwieweit ein konkretes selbstreplizierendes System zur Evolution im Darwinschen Sinne befähigt ist, hängt eng mit seinem kinetischen und thermodynamischen Verhalten zusammen. Das kinetische und thermodynamische Verhalten von Replikatoren [9] Auf der Grundlage experimenteller Befunde ist es sinnvoll, das Wachstumsverhalten synthetischer Replikatoren in drei Hauptkategorien zu unterteilen: parabolisch, exponentiell und hyperbolisch. Eine theoretische Betrachtung für das minimale Modell eines selbstreplizierenden Systems ergibt, dass Produktinhibition systemimmanent ein Hinderungsgrund für exponentielles Wachstum ist. Exponentielles Wachstum sollte man erwarten, wenn jeder aus dem Katalysezyklus hervorgegangene neue Templatbaustein seinerseits einen neuen Zyklus einleitet. Demzufolge würden aus einem Templat zunächst zwei, aus diesen dann vier, acht, usw. neue Templatmoleküle entstehen. Durch Selbstassoziation der Templatbausteine, die über die Komplexbildungskonstante K des Duplexes C quantifiziert ist, entziehen sich jedoch Templatmoleküle der weiteren Wirkung als Matrizen, wodurch streng exponentielles Wachstum verhindert wird. Bis auf wenige Ausnahmen zeigen alle heute bekannten selbstreplizierenden Systeme dieses kinetische Verhalten. 6

11 Selbstreplizierende Systeme Die folgende empirisch gefundene Gleichung eignet sich zur allgemeinen Beschreibung des kinetischen Verhaltens minimaler selbstreplizierender Systeme: dc dt p kct [ k ] e ( a c)( b c) k ( c c ) = 0 0 a 0 b *OHLFKXQJ dc/dt beschreibt hierin die Bildungsrate des Templatmoleküls C, c die Konzentration der Matrizen zum Zeitpunkt t. a 0, b 0 und c 0 geben die initialen Konzentrationen der Eduktbausteine A, B und C an. k a ist die Geschwindigkeitskonstante des autokatalytischen, k b die des nicht-templatgesteuerten Reaktionspfades. Der exponentielle Faktor und seine apparente Geschwindigkeitskonstante k c dienen dazu, weitere Nebenreaktionen wie z.b. die Hydrolyse der aktivierten Eduktbausteine in die Kinetik zu implementieren. Ohne den exponentiellen Faktor am Ende kann man bei Zusammenfassung aller Konstanten prinzipiell auch schreiben: dc dt p = α c β *OHLFKXQJ Dabei beschreibt αc p die Geschwindigkeit im autokatalytischen, β im nichtautokatalytischen Reaktionskanal. Von entscheidender Bedeutung für das Verhalten eines selbstreplizierenden Systems ist die autokatalytische Reaktionsordnung p, die die Qualität des autokatalytischen Reaktionskanals festlegt. Ihr Wert charakterisiert die Eignung des Modellsystems für Selektionsexperimente im Sinne einer Darwinschen Evolution auf molekularer Ebene. Lösen der Differentialgleichung ergibt für die Produktkonzentration c in Abhängigkeit von t für verschiedene Werte von p verschiedene Wachstumsfunktionen. Für p = 0 erhält man eine lineare, für p = 0.5 parabolische, für p = eine exponentielle und für p eine hyperbolische Abhängigkeit. dc 3.00 p d) = αc dt.75 a) linear: c).50 p = 0, ct = c0 αt b) parabolisch:.5 b) / t.00 p =, ct = c0 α a).75 c) exponentiell: αt p =, c.50 t = c0e d) hyperbolisch:.5 p =, ct = c.00 0 c0αt mit (α = c 0 = ) Konzentration c $EE'LHYHUVFKLHGHQHQ:DFKVWXPVIRUPHQUHSOL]LHUHQGHU6\VWHPH Experimente zur Übertragung der Darwinschen Evolutionstheorie auf eine molekulare Ebene können prinzipiell zwischen zwei selbstreplizierenden Systemen durchgeführt werden, die derart in Konkurrenz zueinander stehen, dass sie um 7

12 Das kinetische und thermodynamische Verhalten von Replikatoren mindestens ein gemeinsames Eduktmolekül konkurrieren. In einem Fließreaktor, bei dem die Zu- und Abflüssraten speziell kontrolliert werden, kann ein derartiges Experiment nun prinzipiell zwei verschiedene Verläufe nehmen: Selektion: Die effizienteste Replikator hat es geschafft, sämtliche weniger effizienten Konkurrenten vollständig aus dem Reaktionsraum zu verdrängen ("Survival of the Fittest"). Koexistenz: Die effizienteste Matrize hat lediglich ein höheres Konzentrationsniveau als ihre Konkurrenten erreicht, es findet jedoch keine vollständige Verdrängung statt ("Survival of Everybody"). Exponentielles Wachstum (p = ) führt in einem solchen Experiment unweigerlich zur Selektion der effizientesten Matrize, während lineares Wachstum, das bei einer gewöhnlichen nicht-autokatalytischen Synthese zu Reaktionsbeginn beobachtet werden kann, hingegen eine Koexistenz der Matrizen zur Folge hat. Parabolisches Wachstum (p = 0.5) als Stufe zwischen linear und exponetiell führt nach den theoretischen Ergebnissen von E. Szathmary ebenfalls nicht zur Selektion, sondern zur Koexistenz konkurrierender Matrizen [0]. Im Unterschied zu linearem Wachstum sollte hier aber zumindest eine Selektivitätsverstärkung möglich sein. Betrachtet man die parallele Synthese zweier Matrizen C und C aus gemeinsamen Vorstufen und definiert man die Selektivität über das Konzentrationsverhältnis c /c, so gilt, wenn k und k die zugehörigen Geschwindigkeitskonstanten bezeichnen [9], bei linearem Wachstum: c = c k k c k bei parabolischem Wachstum: = c k Die Selektivität entspricht bei parabolischem Wachstum dem Quadrat des Reaktivitätsunterschiedes (k /k ). Kleine Unterschiede in der Reaktivität führen also zu einem größeren Konzentrationsunterschied, als mit gewöhnlichen Reaktionen erreicht werden kann. Im Regelfall ist ABC gegenüber C aus entropischen Gründen bei Raumtemperatur so stark benachteiligt, dass K zwei bis drei Zehnerpotenzen größer als K ist. Dies führt prinzipiell zu parabolischem Wachstum, da die Tendenz eines Templatmoleküls, einen termolekularen Komplex auszubilden, somit stets um Größenordnungen kleiner ist, als im Duplex zu assoziieren. In der folgenden Abbildung ist der Einfluss der Komplexbildungskonstante K für den termolekularen Komplex ABC und K für den Templatduplex C auf die autokatalytische Reaktionsordnung p des Replikators dargestellt. Dabei wurden in der Simulationsrechnung für die Konzentrationen der Spezies A, B und C Werte verwendet, wie sie bei Untersuchungen zur Selbstreplikation von Oligonukleotiden experimentell zum Einsatz kamen. 8

13 Selbstreplizierende Systeme $EE$EKlQJLJNHLWGHUDXWRNDWDO\WLVFKHQ5HDNWLRQVRUGQXQJYRQGHQ.RPSOH[ELOGXQJVNRQVWDQWHQ. XQG. Ein besonderes Design des selbstreplizierenden Systems, bei dem K < K ist, würde es demnach ermöglichen, exponentielles Wachstum über diesen Ansatz zu realisieren. Experimentell ist die Forderung K < K aber nur schwierig zu realisieren, da die Entropie einen Komplex aus drei Molekülen gegenüber einem Duplex stets benachteiligt. Ungeachtet dessen sollte dennoch bereits unter der Voraussetzung, dass der termolekulare Komplex ABC relativ gegenüber dem Templatduplex C stabilisiert ist, mit exponentiellem Wachstum gerechnet werden können. Theoretisch sollte man in Abhängigkeit von der Umsatzrate und der Temperatur außerdem noch zwei andere Wachtumsformen beobachten können, die als stark und schwach exponentielles Wachstum bezeichnet wurden [9]. Stark exponentielles Wachstum sollte bei initialen Umsatzraten zu beobachten sein, denn dann sind die Komplexe ABC stärker als C populiert. Mit fortlaufender Reaktion und damit zunehmender Matrizenkonzentration geht aber dieses stark exponentielle Wachstum in parabolisches Verhalten über. Zusätzlich sollten tiefe Temperaturen das stark exponentielle Wachstum begünstigen, da der relative Anteil von [ABC] mit sinkender Temperatur steigt (der entropische Term für G fällt dann weniger ins Gewicht). Schwach exponentielles Wachstum dagegen kann theoretisch bei hohen Temperaturen beobachtet werden, bei der fast alle Matrizenmoleküle als Einzelstränge C vorliegen. Beide Wachstumsarten sind jeweils für sich experimentell bisher nicht beobachtet worden, da sie sich überlagern. Grund dafür ist der nicht-autokatalytische Reaktionskanal. Das stark exponentielle Wachstum im autokatalytischen Reaktionskanal zu Anfang der Reaktion wird von dem zu diesem Zeitpunkt dominierenden linearen Wachstum des nicht-autokatalytischen Reaktionskanals überlagert und ist daher nicht isoliert zu beobachten. Ist auf der anderen Seite dieses anfänglich zu beobachtenede lineare Wachstum mit fortschreitender Reaktion zurückgedrängt, so dass nun der autokatalytische Reaktionskanal dominiert, hat das Wachstum bereits parabolischen Charakter, da die Templatmoleküle nun mit sich selbst verstärkt assoziieren. Neben parabolischem Wachstum ist dennoch theoretisch trotz stattfindender Produktinhibition eine autokatalytische Reaktionsordnung p > 0.5 möglich. 9

14 Das kinetische und thermodynamische Verhalten von Replikatoren Experimentelle Befunde deuten darauf hin, dass eine autokatalytische Reaktionsordnung p > 0.5 u.a. in Systemen möglich sein sollte, in denen höhermolekulare Komplexe der Edukte und Templatmoleküle an der Produktbildung beteiligt sind. Theoretisch berechnet sich in diesem Fall p aus der Reaktionsordnung über (n-)/n, wobei n die Zahl der Spezies angibt, die an der Bildung des über K beschriebenen Komplexes teilnehmen. Für das beschriebene System.. $%& $%& & & ergibt sich im Duplex C für n = eine Reaktionsordnung von 0.5. Ein höhermolekulares System.. $%& $%& & & liefert jedoch mit n = 5 eine Reaktionsordnung von 0.8. Streng exponentielles Wachstum mit p = wäre demnach (theoretisch) nur über eine unendliche Zahl von beteiligten Templatmolekülen zu realisieren, denn je größer n wird, desto mehr nähert sich die Gleichung dem Grenzwert von an. Auch wenn parabolisches Wachstum keine Selektion ermöglicht, so kann es dennoch eine Relevanz für die Entstehung des Lebens gehabt haben, denn es ermöglicht die parallele autokatalytische Ausbildung einer Vielzahl von verschiedenen Sequenzen, wie sie für die Ausbildung von komplexen Systemen und Ribozymen als Vorstufe notwendig war. Parabolisches Wachstum ist vermutlich dem exponentiellen Wachstum vorausgegangen. So war es möglich, dass sich die Ursuppe soweit diversifizierte, dass später daraus zur Selektion befähigte Spezies hervorgehen konnten. Selbstreplizierende Systeme aus Oligonukleotiden Die Replikation in der Natur basiert auf enzymkatalysierten Reaktionen der Nukleinsäuren. Daher ist es verständlich, dass die ersten wesentlichen Experimente zur in vitro Evolution mit Enzymen und Nukleinsäuren durchgeführt wurden, die zuvor aus lebenden Systemen isoliert worden waren. S. Spiegelman kann heute als Begründer einer evolutiven Biotechnologie angesehen werden, die von den 60er Jahren an bis heute so weit entwickelt wurde, dass auch zahlreiche industrielle Anwendungen aus ihr hervorgegangen sind. Er verwendete für die Experimente zur Replikation ein Verfahren, das auch als Serial Transfer bezeichnet wird. Dabei wurden aktivierte Ribonukleosidtriphosphate durch die Replikase des RNA-Phagen Qβ an dessen isolierter RNA als Matrize polymerisiert. Nach einer gewissen Zeit wurde ein Tropfen der Lösung zu einer neuen Lösung mit Qβ-Replikase und aktivierten Nukleotiden aber ohne Wildtyp-RNA gegeben []. Bereits nach einigen Replikationsrunden gingen aus der RNA des Wildtyps mit mehreren tausend Nukleotiden nur noch RNA-Moleküle mit wenigen hundert Nukleotiden hervor. Dies hing damit zusammen, dass die Replikationsgeschwindigkeit das einzige Selektionskriterium war, welchem die Moleküle ausgesetzt waren. Kürzere RNA-Fragmente, die durch Bruch oder Deletion entstanden waren, hatten eine größere Fitness, da sie schneller repliziert werden 0

15 Selbstreplizierende Systeme konnten. Wenn der Serial Transfer ins nächste Gefäß nach einer vergleichsweise kurzen Zeit stattfand, hatten die längeren RNA-Stücke keine Chance, ebenfalls in ausreichender Menge repliziert zu werden []. Sehr kurze Fragmente mit weniger als hundert Nukleotiden entstanden nicht, da die Qβ-Replikase nur solche Fragmente erkennt und dann im Anschluss repliziert, die in der Lage sind, Haarnadelschleifen auszubilden [3]. In nachfolgenden Experimenten gelang es, die RNA-Replikation durch die Zugabe von Hemmstoffen zu beeinflussen. Dies führte dazu, dass einige RNA-Sequenzen resistent gegen den Inhibitor wurden [4], andere wurden sogar von ihm abhängig - ihre Replikation war in Abwesenheit des Inhibitors langsamer [5]. Eine detailierte Theorie über die Selektion und Mutation von RNA-Molekülen wurde wie bereits erwähnt von M. Eigen et al. entwickelt [5]. Durch Aptamerselektion versucht man heutzutage, Ribozyme für verschiedenste Anwendungen zu finden. Im Regelfall geht man dabei so vor, dass man eine möglichst große Bibliothek von DNA- oder RNA-Oligomeren einem Selektionskriterium aussetzt und die selektierten Moleküle anschließend durch PCR- bzw. RT- PCR amplifiziert. Durch wiederholtes Selektionieren und Vermehren der isolierten Spezies gelingt es schließlich, das bezüglich der Selektion für die gedachte Anwendung geeignetste Molekül zu finden. Der Definition über die notwendigen Eigenschaften einer Lebensform von Eigen folgend, ergeben sich auf der Grundlage von Nukleinsäuren nun zwei grundsätzlich verschiedene Ansatzpunkte, künstliches Leben zu erzeugen zu. Der molekularbiologische Ansatz sucht nach möglichst kleinen Ribozymen, die zusätzlich in der Lage sind, sich selbst zu replizieren. Der bioorganische Ansatz sucht nach selbstreplizierenden Sytemen, deren Wachstum exponentiell verläuft, so dass Konkurrenzexperimente im Fließreaktor zu Selektion führen. Die Implementierung einer Mutabilität in die Systeme kann dann durch äußere Einflüsse erfolgen. Der molekularbiologische Ansatz Die Experimente zur in vitro Evolution auf diesem Gebiet haben das gemeinsame Ziel, den Prozess der Evolution derart zu beeinflussen, dass ein Ribozym mit Replikaseaktivität selektioniert wird, das sich zusätzlich auch noch selbst replizieren kann. In einem solchen Fall wäre nämlich die experimentelle Rekonstruktion einer aus der RNA-Welt hervorgegangenen, künstlichen Lebensform gelungen. Erste experimentelle Ergebnisse auf diesem Gebiet liegen vor. Ein Aptamer mit Replikaseaktivität konnte durch Bartel gefunden werden, es setzt bis zu sechs Nukleotidbausteine korrekt aneinander [6]. Das Ribozym selbst besteht allerdings aus 98 Nukleotiden. Von sechs bis zu 98 Nukleotiden ist es noch ein weiter Weg, dies wäre aber für eine Selbstreplikation des gesamten Ribozyms erforderlich. Selbst wenn es gelänge, eine aus ca. 00 Nukleotiden aufgebaute selbstreplizierende Replikase zu finden, so bliebe die Frage unbeantwortet, wie und warum genau dieses eine Molekül (mit formal 4 00, d.h. ca alternativen Sequenzen) in einer RNA-Welt entstehen konnte. Diese Zahlen sind vor dem Hintergrund zu interpretieren, dass die Zahl der Wasserstoffatome im gesamten Universum auf 0 80 geschätzt wird und die Masse der Erde etwa g beträgt. Würde die Erde aus reinem Kohlenstoff bestehen, so entspräche dies etwa Kohlenstoffatomen. Es wäre demnach selbst in diesem Fall unmöglich, mit dem Kohlenstoff der Erde jedes einzelne dieser möglichen 0 60 RNA-00mere zu erzeugen. Wenn dies nicht möglich ist, dann ist es aber auch kaum wahrscheinlich,

16 Selbstreplizierende Systeme aus Oligonukleotiden dass in der Evolution auf der Erde eine spezielle selbstreplizierende Replikase dieser Größe spontan aus einem Angebot zufällig entstandener 00mere verschiedener Sequenz selektiert werden konnte. Auch die Hydrolyseanfälligkeit und die damit verbundene vergleichsweise geringe Halbwertszeit von RNA-Molekülen dieser Größe spricht gegen einen derartigen Prozess. Die bereits anfangs erwähnte überaus unwahrscheinliche Selbstkonstitution einer ersten Urzelle aus der Ursuppe stellt also auch hier in zwar abgeschwächter aber dennoch schier unüberwindbarer Form die Forscher vor die gleiche Hürde, künstliches Leben quasi aus dem Nichts erschaffen zu wollen. Der bioorganische Ansatz Ein Ausweg aus dieser Problematik führt über die Annahme, dass Replikation bereits auf einer deutlich geringeren Stufe an Komplexität, also bereits vor dem Auftreten eines Replikations-Ribozyms möglich war. Experimentell sollte dies im Labor nachvollzogen werden können. Als bioorganische Reaktionen bieten sich dafür die nichtenzymatischen, matrizengesteuerten Reaktion an, die erstmalig 96 durch G. Schramm beschrieben wurden []. Die erste enzymfreie und templatgesteuerte Ligation von aktivierten Oligodeoxynukleotiden wurde 966 von Naylor und Gilham mit Hilfe wasserlöslicher Carbodiimide beschrieben [7]. In Anwesenheit der komplementären Matrize Polyadenylsäure wurden zwei Moleküle Hexathymidylsäure-5 -phosphat zu Dodekathymidylsäure-5 -phosphat verknüpft. Das Carbodiimid diente dabei als chemische Energiequelle für die Aktivierung der Phosphatgruppen. Diese templatgesteuerte Ligation von Nukleinsäuren wurde insbesondere von Shabarova systematisch untersucht und weiterentwickelt [8]. Anstelle von Hydroxygruppen als Nukleophile wurden auch andere funktionelle Gruppen untersucht. Andere wichtige Arbeiten gehen auf L.E. Orgel zurück, der insbesondere die Synthese von RNA-Oligomeren untersuchte; als aktivierte Ribonukleotide kamen dabei die 5 -Phosphoimidazolide () zum Einsatz, welche unter präbiotischen Bedingungen erhalten werden konnten [9]. Als Matrizen dienten entweder polymere oder oligomere Ribo- und Deoxyribonukleotide. 5 3 %DVH $EE$NWLYLHUWHµ3KRVSKRLPLGD]ROLGH Es wurde der Einfluss von verschiedenen Faktoren auf die Regioselektivität der Verknüpfung ('-5' oder 3'-5') untersucht. Experimente zur matrizengesteuerten Oligomerisation der 5 -Phosphoimidazolide des Adenosins bzw. Guanosins an Poly- (U) bzw. Poly-(C) ergaben, dass die erhaltenen oligomeren Produkte die nichtnatürliche -5 -Verknüpfung aufwiesen. Überraschenderweise führte die Zugabe zweiwertiger Metallionen jedoch zur Umkehrung der Regioselektivität: Bleisalze katalysierten die Bildung von 3-5 -verknüpfter Oligo-Adenylsäure [30] und Zinksalze die Bildung von 3-5 -verknüpfter Oligo-Cytidylsäure [3]. Ebenso überraschend war der experimentelle Befund, dass die Synthese natürlich verknüpfter Oligoguanylate bei Einführung einer Methylgruppe am Imidazolid in - Position auch ohne die Zugabe von Metallkationen gelang [3]. Offenbar haben bereits

17 Selbstreplizierende Systeme geringfügige Änderungen in der Zusammensetzung der Reaktionsmischung oder der Struktur der aktivierten Gruppe einen deutlichen Einfluss auf die Konformation der Komplexe, in denen matrizengesteuerte Reaktionen ablaufen. Bei den Untersuchungen stellte sich außerdem heraus, dass an pyrimidinreichen Templaten (C und U) purinreiche Oligomere synthetisiert werden konnten, diese Oligomere waren ihrerseits allerdings als Template ungeeignet [33], so dass kein Turnover und damit keine Selbstreplikation erfolgen konnte. Die Matrizenwirkung wurde in dem Maße verringert, wie der Anteil der Purinbasen in der Matrize anstieg. 983 konnten erstmalig Synthesen aus aktivierten monomeren Bausteinen an oligomeren Matrizen durchgeführt werden, die sequenzspezifisch verliefen. Am Templat CCGCC konnte das vollständig komplementäre Pentamer P GGCGG mit der nativen 3'-5'-Verknüpfung als eines der Hauptprodukte erhalten werden [34]. Als Nebenprodukt konnte P GGCG neben einer Vielzahl anderer Produkte nachgewiesen werden. Ohne die Zugabe der Matrize waren weder P GGCGG noch P GGCG nachweisbar. Damit war eindeutig sichergestellt, dass nichtenzymatische Synthesen unter Informationstransfer ablaufen können. In späteren Arbeiten gelang auch die templatgesteuerte Synthese längerer Oligomere [35]. Selbstreplikation, die die Trennung des oligomeren Produktes von seiner Matrize sowie die erneute matrizengesteuerte Synthese an beiden Stängen erfordert, konnte bei diesen Systemen aus monomeren Nukleotiden und oligomeren Matrizen jedoch nicht beobachtet werden. Ein derartiger Prozess wäre daran zu erkennen gewesen, dass die Bildung der oligomeren Produkte autokatalytisch verliefe. Eine templatgesteuerte Ligation zweier modifizierter DNA-Bausteine unter reversiblen Bedingungen und ohne vorausgehende chemische Aktivierung eines der beiden Reaktionspartner beschrieben Goodwin und Lynn 99 [36]. In ihrem Modellsystem erfolgte die Ligation reversibel zwischen einem 5'-Amin und einem 3'-Aldehyd 3 am komplementären Templat 4 zum Azomethin 5. * 3 & 3 $ 3 $ 3 & 3 * & * & 7 3 * 3 & $EE5HYHUVLEOHWHPSODWJHVWHXHUWH/LJDWLRQQDFK)QQFYKPXQG.[PP Da es sich um keine selbstkomplementäre Sequenz handelte, erfolgte keine Autokatalyse und somit auch keine Selbstreplikation. Die Komplexstabilitäten der einzelnen Spezies im System wurden abgeschätzt. In Gegenwart der 3

18 Selbstreplizierende Systeme aus Oligonukleotiden Templatmoleküle wurden mit abnehmender Temperatur ansteigende Ausbeuten beobachtet, was mit der erhöhten Stabilität der entstandenen Duplexe bei niedriger Temperatur erklärt werden konnte. Auch bei Zugabe des nichtkomplementären Konkurrenznukleophils d( n TTTT) erhielt man als Hauptprodukt hexamere Bausteine, wobei das Verhältnis Hexamer/Heptamer mit abnehmender Temperatur weiter anstieg, was durch einen Templateffekt erklärt werden konnte. Selbstkomplementäre Systeme in homogener Lösung Das erste nicht-enzymatische selbstreplizierende System wurde bereits sechs Jahre zuvor beschrieben [37]. Beim Design des Systems wurden die folgenden Überlegungen angestellt: Das Modellsystem sollte möglichst einfach strukturiert sein. Es sollte auf der Basis einer selbstkomplementären Matrize operieren, so dass Templat und Ligationsprodukt in ihrer Sequenz identisch waren und wegen der Basenpaarung durch Watson-Crick-Geometrie zwangsläufig den gleichen Gehalt an Purin- und Pyrimidinbasen enthielten. Die Bildung des Reaktionsproduktes sollte aus lediglich zwei Bausteinen erfolgen. Da Systeme aus monomeren Nukleotiden keine ausreichende Komplexstabilität besitzen, wurde aus kinetischen und thermodynamischen Daten abgeschätzt, dass ein System zweier Trimere, die zu einem Hexamer reagieren, optimal geeignet sein sollte, wenn dieses lediglich die Basen C und G enthielte Das System sollte aus analytischen Gründen nur in eindeutiger Weise reagieren können. Die Problematik einer nicht-natürlichen -5 -Verknüpfung konnte durch Verwendung von DNA anstelle von RNA ausgeschlossen werden. Schutzgruppen an den flankierenden Enden der Templatmoleküle sollten Nebenreaktionen verhindern, die zu längeren Oligomeren führen würden. Ferner sollte die Sequenz der Matrize eine eindeutige Komplexierung mit den beiden Eduktbausteinen ermöglichen. Diese Überlegungen führten konkret zu folgendem selbstreplizierenden System: Es basierte auf zwei modifizierten Oligodeoxyribonukleotiden der Sequenzen d(ccg) (6) und d(cgg) (7) und einem komplementären Hexamer d(ccgcgg) (8) als Templat. Um eine einheitliche Nomenklatur zu verwenden, könnte man dieses System als [3,3]-[6]-Replikator bezeichnen, d.h. zwei Trimere ligieren an einem hexameren Templat. $EE6FKHPDWLVFKH'DUVWHOOXQJGHVHUVWHQHQ]\PIUHLHQ 4

19 Selbstreplizierende Systeme VHOEVWUHSOL]LHUHQGHQ6\VWHPVQDFKXQP-KGFTQYUMK Die Ligation der Edukte 6 und 7 erfolgte dabei durch Aktivierung des 3 - Phosphatterminus des Trisoligonukleotids 6 mit dem wasserlöslichen Carbodiimid Ethyl(dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC). Im sich anschließenden irreversiblen und geschwindigkeitsbestimmenden Reaktionsschritt konnte der 5'-Terminus des Trinukleotids 7 nukleophil am aktivierten Phosphatrest von 6 angreifen und eine Phosphodiesterverknüpfung zwischen den beiden Strängen ausbilden. Die Matrize sorgte dabei durch ihren Templateffekt dafür, dass die beiden reaktiven Enden der Oligomere in räumliche Nachbarschaft gelangten. &O 3 * 3 * & & * & & & 3 & 3 * & 3 3 & * 3 3 $EE/LJDWLRQGHUEHLGHQ7ULPHUHLPWHUPROHNXODUHQ.RPSOH[ & * & 3 Durch die Einführung von Methylgruppen an den entsprechenden 5'-Enden und o- Chlorphenylgruppen an den 3'-Phosphatresten konnten komplexe Nebenreaktionen ausgeschlossen werden, es entstand jedoch auch immer der 3'-3'-verknüpfte Baustein d( 5 Me CCG P3-3 P GCC Me5 ) mit zentraler Pyrophosphatgruppe als Nebenprodukt. Auch die Verwendung der Phosphoimidazolide als aktivierte Bausteine konnte diese Art der Nebenreaktion nicht unterdrücken. Da die Ligationsreaktion verhältnismäßig langsam verlief, nach 4 Tagen lag die Gesamtausbeute der beiden Reaktionsprodukte unterhalb von %, nahm die Hydrolyse des Carbodiimds, die durch die 3'-Phosphatreste der Nukleotide katalysiert wurde, signifikanten Einfluss auf den kinetischen Verlauf der Reaktion. Aus den kinetischen Daten konnte jedoch abgeleitet werden, dass das System parabolisches Wachstum (p = 0.5) zeigte, wie es auch wegen der Produktinhibition zu erwarten war. Die Reaktion verlief autokatalytisch, was durch kinetische Untersuchungen mit verschiedenen Anfangskonzentrationen der Matrize 8 gezeigt werden konnte. Nur die matrizeninstruierte Bildung des Ligationsproduktes 8 sollte durch verschiedene Anfangskonzentrationen beeinflusst werden, nicht aber die nicht-templatgesteuerte Bildung des Pyrophosphates und des Templates selbst (nicht-autokatalytischer Reaktionskanal). Das gefundene Geschwindigkeitsgesetz für die Bildung der Matrize ging als Quadratwurzelgesetz der Autokatalyse in die Literatur ein: &O v c dc = = α c β dt *OHLFKXQJ Der Vergleich mit Gleichung, S. 7 zeigt, dass in diesem Fall der Exponent p = 0.5 ist. Trägt man die gemessenen Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten v c gegen die Quadratwurzeln der vorgelegten Anfangskonzentrationen c der Matrize auf, so erhält man eine Gerade mit der Steigung α und dem Ordinatenabschnitt β. Die Steigung α 5

20 Selbstreplizierende Systeme aus Oligonukleotiden ist dabei ein Maß für die Autokatalyse, während der Ordinatenabschnitt β die Geschwindigkeit der Matrizensynthese bei Abwesenheit jeglicher Matrizenmoleküle (c = 0) widerspiegelt. Die Existenz eines Ordinatenabschnittes bei dieser Auftragung impliziert unmittelbar, dass die Matrize nicht nur autokatalytisch, sondern auch spontan erzeugt wird. Durch die Wahl der Sequenz war gewährleistet, dass ein ausgewogenes Verhältnis zwischen Purin- und Pyrimidinbasen vorlag. Das analoge Adenin-Thymin-System wurde wegen der schwächeren Assoziation (pro Basenpaar nur zwei Wasserstoffbrückenbindungen) nicht in Betracht gezogen. Ein ähnliches System aus chemisch modifizierten Ribonukleotiden wurde ein Jahr später von Zielinski und Orgel beschrieben [38]. Es handelte sich um ein System von zwei Dimeren 9 und 0, die am komplementären Tetramer als Matrize ligiert wurden, also um einen [,]-[4]-Replikator. Dabei wurde ein 5'-Phosphatrest nukleophil vom 3'-Terminus des benachbarten Dimers angegriffen. Um Nebenreaktionen bei der Ligation zu vermeiden, wurde die 3'-Hydroxygruppe durch eine wesentlich nukleophilere 3'-Aminofunktion ersetzt. So wurde die Ausbildung der nicht natürlichen '-5'-Verknüpfung unterdrückt und die Gesamtreaktion beschleunigt. Es entstand ausschließlich das 3'-5'-Phosphoramidat. Als Aktivierungsreagens diente ebenfalls EDC. * & 3 * 3 3 & * & & & $EE6HOEVWUHSOL]LHUHQGHV6\VWHPQDFK<KGNKPUMKXQGTIGN Auch hier beobachtete man in einer kinetischen Analyse wegen der Produktinhibition parabolisches Wachstum, das System gehorchte also ebenfalls dem Quadratwurzelgesetz. Zusätzlich handelte es sich bei diesem System um die erste templatgesteuerte Ligation von Nukleotiden an Templatbausteinen mit nicht-nativer Backbone. Inzwischen sind auch andere Beispiele für diesen Replikationstyp bekannt [39]. Ersetzte man im tetrameren selbstreplizierenden System die Sequenzen G NHP C NH und P G NHP C N3 durch die in umgekehrter Reihenfolge angeordneten Bausteine C NHP G NH und P C NHP G N3, so erfolgte in Anwesenheit von EDC zwar eine Ligation der Bausteine zum Tetramer, ein Templateffekt und damit eine Katalyse war aber durch die komplementäre Sequenz C NHP G NHP C NHP G N3 nicht zu erkennen [40]. Setzte man P C NHP G N3 ohne Templat mit EDC um, so erfolgte keine Ausbildung des prinzipiell möglichen 5'-5'-verknüpften Pyrophosphats 3 N3 G PNH C 5 P-P5 C NHP G N3-3 als Nebenprodukt. Das System eines mit EDC aktivierten Phosphatrestes und einer Aminogruppe ist vergleichsweise reaktiv, eine ungünstige Orientierung der funktionellen Gruppen im termolekularen Komplex sollten also keine wesentliche Rolle für das Erfolgen einer Ligation spielen. Daher wurde als Grund für das & * 6

21 Selbstreplizierende Systeme Ausbleiben des Templateffektes angenommen, dass der Templatbaustein C NHP G NHP C NHP G N3 nicht in der Lage sei, mit den beiden dimeren Eduktbausteinen einen stabilen termolekularen Komplex auszubilden. Thermodynamische Betrachtungen führen dazu, dass GC einen besseren Beitrag durch Basenstapelung zur Helixstabilisierung leistet als CG [4]. So wurde erklärt, dass CGCG mehr zur intermolekularen Selbstaggregation neigt und sich somit einer Templatwirkung entzieht, GCGC dagegen eine Minihelix ausbilden kann. Die Wahl der Sequenz ist folglich beim Design von selbstreplizierenden Systemen auf der Basis von Nukleinsäuren ein wichtiger Faktor für das Gelingen des Experiments, insbesondere da sich die beiden Sequenzen CGCG und GCGC auf ersten Blick nicht sonderlich voneinander unterscheiden. Das selbstreplizierende [3,3]-[6]-System, welches auf der selbstkomplementären Templatsequenz d(ccgcgg) aufbaute, wurde weiterentwickelt [4]. Ziel war es letztendlich, eine möglichst rasche Autokatalyse (großes α) bei möglichst geringer spontaner Matrizenentstehung (kleines β) zu gewährleisten. Außerdem sollte die Reaktion insgesamt beschleunigt werden, da bei Reaktionszeiten von Tagen die Hydrolyse des Aktivators EDC, der in großem Überschuss zugegeben wurde, um eine stationäre Konzentration an aktivierten Phosphatresten zu gewährleisten, die kinetische Analyse zusätzlich verkomplizierte. Darüber hinaus bedeutete ein hoher Überschuss an EDC prinzipiell auch einen hohen Energieverbrauch des Systems, was im übertragenen Sinn auf ein präbiotisch relevantes System in einem ineffizienten Metabolismus zum Ausdruck kommt. Es mussten bessere Nukleophile bei der Ligation zum Einsatz kommen, um eine Konkurrenz mit den Wassermolekülen, die in einer schlichten Hydrolyse der aktivierten Phosphatreste resultierte, relativ zur Ligation zu unterdrücken. 988 hatte Shabarova gezeigt, welchen Einfluss die reagierenden Funktionalitäten auf die Kinetik der EDC-vermittelten Ligation haben [8] ; es wurde ein 5 -modifiziertes Undecamer mit einem 3 -modifizierten Hexamer an einer tetradecameren Matrize ligiert; dabei wurden je nach Verknüpfungschemie die folgenden relativen Geschwindigkeitskonstanten gefunden: 3 -Terminus 5 -Terminus rel. Reaktivität -OH - -OPO 3 - -OPO 3 -OH 0 - -OPO 3 - -OPO NH - -OPO OPO 3 -NH 00 Auf der Grundlage dieser kinetischen Daten generierte man zunächst ein System, in dem eine Pyrophosphatgruppe in der Verknüpfungsreaktion ausgebildet wurde. Man untersuchte die Temperatur- und Sequenzabhängigkeit des kinetischen Verhaltens der Ligation [43]. Dabei ging die Autokatalyse in gewöhnliche Templatkatalyse über, da bei geringen Umsätzen Ligationsprodukt und Matrize chemisch nicht mehr identisch waren. Konkret wurde folgendes System untersucht: 7

22 Selbstreplizierende Systeme aus Oligonukleotiden &O 3 * 3 * 3 & 3 * 3 & 3 & & & 6 % 3 DJ % % & & * 3 * 3 &O & % % & % & 3 * 3 * 3 DJ $EE'LHWHPSODWJHVWHXHUWH/LJDWLRQXQWHU$XVELOGXQJGHU3\URSKRVSKDWELQGXQJ LPWHUPROHNXODUHQ.RPSOH[.DWDO\VH &O Die Abbildung zeigt den 5 -Phosphatrest in aktivierter Form, wobei prinzipiell auch die Aktivierung über den 3 -Phosphatrest des anderen Eduktbausteins erfolgen konnte. Bei den einzelnen Experimenten wurde aus dem Baustein 3 stets auch das verknüpfte Pyrophosphat (d 3 (o-clph)p GGC P5-5 P CCG P(o-ClPh)3 ) als Nebenprodukt gebildet, 3-3 -verknüpfte Pyrophosphate waren dagegen nur in Ausnahmefällen zu detektieren. Die Sequenz des Trimers wurde so variiert, dass alle Kombinationen der Nukleobasen C und G bis auf d(gggp) untersucht wurden. B B B 3 Mismatch Ligationsprodukt a C C C 4a d( MTM CCC P-P CGG P(o-ClPh) ) b G C C 4b d( MTM GCC P-P CGG P(o-ClPh) ) c C G C 4c d( MTM CGC P-P CGG P(o-ClPh) ) d G G C 3 4d d( MTM GGC P-P CGG P(o-ClPh) ) e C C G 0 4e d( MTM CCG P-P CGG P(o-ClPh) ) f G C G 4f d( MTM GCG P-P CGG P(o-ClPh) ) g C G G 4g d( MTM CGG P-P CGG P(o-ClPh) ) 6 * C C G 0 8 d( Me CCG P CGG P(o-ClPh) ) * Der 5 -Terminus war hier mit einer Methylgruppe (Me) geschützt. Aus den Sequenzen ergab sich im Vergleich mit dem verwendeten Templatbaustein 8 unmittelbar, dass nur für das Trimer e eine vollständige Komplementarität bestand. Das System aus e, 3 und 8 konnte daher direkt mit dem zuvor beschriebenen System aus 6, 7 und 8 (Abb. 7) verglichen werden. Beide Systeme unterschieden sich lediglich in den 5 -Modifikationen der Eduktbausteine. Die 5 - Methylgruppe (Me) des Trimers 6 wurde durch eine Methylthiomethylgruppe (MTM) ersetzt, was das reaktive Verhalten des Sytems nicht beeinflusste. Die nukleophile 5 -Hydroxygruppe des Trimers 7 wurde durch eine nukleophilere 5 -Phosphatgruppe 8

23 Selbstreplizierende Systeme ersetzt, was die Reaktion deutlich beschleunigte. Die o-chlorphenylschutzgruppe (o- ClPh) am 3 -Phosphatterminus blieb in allen Systemen erhalten. Die Anzahl der Fehlpaarungen (Mismatches) bei vollständig überlappender Anlagerung der Trimere a bis g an die Matrize 8 ist in der Tabelle zusätzlich aufgeführt. Folgende Zusammenhänge konnten aus der kinetischen Untersuchung erhalten werden: Die Bildung von 4e aus den Edukten e und 3 am Templat 8 zeigte ebenfalls parabolisches Wachstum (p = 0.5). Da 8 und 4e wegen der Pyrophosphatgruppe von 4e nicht identisch waren, handelte es sich bei initialen Umsatzraten strenggenommen um keine Autokatalyse, sondern um Katalyse. Im Vergleich zum selbstreplizierenden System aus 6, 7 und 8 (Abb. 7) verlief die templatgesteuerte Ligation effektiver. Bei Variation der Sequenz des Eduktbausteins a bis g wirkten sich die Fehlsequenzen (Mismatches) auf den templatgesteuerten und matrizenunabhängigen Reaktionskanal auf verschiedene Weise aus. Erwartungsgemäß wurden die Fehlsequenzen im templatgesteuerten Reaktionskanal deutlich langsamer eingebaut als im vollständig komplementären Fall ohne Fehlsequenzen. Dies konnte als signifikanter Hinweis darauf angesehen werden, dass der Templateffekt auf Watson-Crick-Basenpaarung beruhte. Trimere mit 3 -terminaler Deoxyguanosineinheit wurden schneller umgesetzt als Trinukleotide mit 3 -terminaler Deoxycytidineinheit. Bei Anwesenheit der Matrize bildete sich das homomolekulare 5-5 -verknüpfte Pyrophosphat aus 3 langsamer als in Abwesenheit des Templats, da seine Bildung mit der heteromolekularen 3-5 -Verknüpfung von 3 mit jeweils einem der anderen Bausteine a bis g konkurrierte. Für beide Reaktionen stellte 3 eine gemeinsame Ressource dar. Die Reaktionsverläufe waren wegen der erhöhten Reaktivität und der Unterscheidbarkeit von Templat 8 und Ligationsprodukt 4a-g besser reproduzierbar. Untersuchte man den autokatalytischen Reaktionskanal α in Abhängigkeit von der Temperatur, so stellte man fest, dass es eine optimale Ligationstemperatur gab. Nicht nur k a, sondern auch [ABC] sind temperaturabhängige Größen. Nach Arrhenius nimmt k a zwar mit der Temperatur zu, ab einer bestimmten Schmelztemperatur ist der termolekulare Komplex aber nicht mehr stabil, so dass der Templateffekt nicht mehr wirken kann. Eine weitere Modifikation des ursprünglichen Systems aus Abb. 7 wurde zwei Jahre später beschrieben [44]. Da bereits bekannt war, dass 3-3 -Pyrophosphate nur in speziellen Fällen in geringen Mengen gebildet wurden und 5-5 -verknüpfte Pyrophosphate die wesentlichen unerwünschten Nebenprodukte waren, wurde die 5 -Phosphatgruppe des katalytischen Systems aus Abb. 8 durch eine noch nukleophilere 5 -Aminofunktion ersetzt. So wurde die Selbstkomplementarität erhalten, die Nebenreaktion der Pyrophosphatbildung allerdings ausgeschlossen. Wieder diente EDC als Aktivator bei diesem [3,3]-[6]-System. 9

24 Selbstreplizierende Systeme aus Oligonukleotiden &O 3 * 3 * 3 & 3 * 3 & 3 & 6 & & 6 & 3 & 3 & * &O & * * & $EE7HUPROHNXODUHU.RPSOH[GHVVHOEVWUHSOL]LHUHQGHQ6\VWHPV XQWHU$XVELOGXQJHLQHUµµ3KRVSKRUDPLGDWELQGXQJ Dieses System war deutlich effizienter als das ursprüngliche System von 986. Es entstand ausschließlich das 3'-5'-Phosphoramidat 7, Nebenreaktionen fanden nicht statt. Der Kurvenverlauf im Konzentrations-Zeit-Diagramm verlief sigmoidal (Abb., Kurve A). Genau dies konnte man auch erwarten, da zu Beginn der Reaktion mit zunehmender Bildung von Templatmolekülen diese immer schneller ihre eigene Synthese katalysieren können, bis die Lösung soweit an Eduktbausteinen verarmt, dass die Reaktion wieder langsamer wird, wodurch ein Wendepunkt im Konzentrations-Zeit-Diagramm entsteht. $EE'DV.RQ]HQWUDWLRQV=HLW'LDJUDPPGHV/LJDWLRQVSURGXNWHVEHLYHUVFKLHGHQHQ 7HPSODWNRQ]HQWUDWLRQHQGLHJHVWULFKHOWH.XUYHJLEWGHQEHUHFKQHWHQ5HDNWLRQV YHUODXIDQZLHHUWKHRUHWLVFKRKQH$XWRNDWDO\VH]XEHREDFKWHQZlUH Die Sigmoidität im Diagramm für Kurve A konnte nicht auf die vorgelagerte EDC- Aktivierung des Bausteins 5 zurückgeführt werden, da der sigmoide Kurvenverlauf abnahm, wenn mehr Templat 8 von Anfang an zugegeben wurde. Zusätzliche Studien ergaben, dass sich unter den gewählten Reaktionsbedingungen ein Aktivierungsgleichgewicht der Phosphatgruppen einstellte, in dem eine statische 0

25 Selbstreplizierende Systeme Konzentration der aktivierten Nukleotide deutlich schneller erreicht wurde, als durch den Wendepunkt der sigmoiden Kurve zu erklären gewesen wäre. Die Ligation verlief deutlich schneller bei Anwesenheit der Phosphodiestermatrize 8. Diese unterschied sich zwar chemisch geringfügig vom Ligationsprodukt 7, dennoch lieferte dieser Befund ein indirektes Maß für den Autokatalyseeffekt des Phosphoramidats 7. Bei Untersuchungen zur Sequenzabhängigkeit wurde auch bei diesem System beobachtet, dass die Art der Nukleobasen, die unmittelbar die Ligationsstelle flankieren, einen deutlichen Einfluss auf das Reaktionsverhalten des Systems hatte, was sich auch in der Temperaturabhängigkeit von k a zeigte. Die Ausbildung der Bindung zu d( 5 (...) G PNH C-(...) 3 ) fand deutlich schneller als zu d( 5 (...)-C PNH G-(...) 3 ) statt. Dies wurde auf geometrische Unterschiede in der DNA-Tertiärstruktur zurückgeführt, wobei im ersten Fall eine bessere Stapelwechselwirkung der beteiligten Nukleobasen erreicht wird, was auch durch kalorimetrische Messungen bestätigt werden konnte. $EE'LH$EKlQJLJNHLWGHU6WDSHOZHFKVHOZLUNXQJYRQGHU6HTXHQ] Bei besserer Überlappung der benachbarten Nukleobasen d( 5 (...) G PNH C-(...) 3 ) kommt es zu einer wirksameren π-stapelung, wodurch die reaktiven Enden besser fixiert werden. Die templatgesteuerte Synthese kann folglich schneller ablaufen, ist aber gegenüber Temperaturerhöhung empfindlich, da mit steigender Temperatur die Ordnung im termolekularen Komplex abnimmt. Bei geringerer Wechselwirkung d( 5 (...)-C PNH G-(...) 3 ) ist der Temperatureinfluss schwächer ausgeprägt, die Fixierung der reaktiven Gruppen und damit der Templateffekt ebenfalls. Insgesamt fand man folgende Reaktivitätsabstufung, die mit den Daten für die nichtautokatalytische chemische Ligation übereinstimmte [8] : d( 5 G PNH G 3 ) > d( 5 G PNH C 3 ) > d( 5 C PNH G 3 ) > d( 5 C PNH C 3 ) Ein effizientes selbstreplizierendes System sollte eine hohe Geschwindigkeitskonstante des autokatalytischen Reaktionskanals k a und nur eine kleine Geschwindigkeitskonstante für die nicht matrizengesteuerte Reaktion k b haben. Der autokatalytische Überschuss-Faktor ε berechnet sich aus dem verhältnis von k a und k b und ist ein direktes Maß für die Effizienz des Systems. Sigmoides Wachstum kann nur beobachtet werden, wenn k b vergleichsweise klein ist. Für das gegebene System muss k a hingegen groß sein, da als Konkurrenzreaktion die Hydrolyse der aktivierten Phosphatreste stattfindet. Für dieses System wurde ε zu 40 ermittelt, das System von Zielinski und Orgel aus Abb. 8 hatte im Vergleich dazu einen Wert von 340. Das Wachstum des Phosphoramidats 7 verlief erwartungsgemäß wegen der Produktinhibition parabolisch (p = 0.5).

26 Selbstreplizierende Systeme aus Oligonukleotiden Die bis zu diesem Zeitpunkt bekannten selbstreplizierenden Systeme ermöglichten aufgrund ihrer Konstitution keine Selektion, da sie lediglich auf zwei Eduktbausteinen aufbauten, die im wesentlichen zu einem einzigen Produktmolekül abreagieren konnten. Ferner konnte ein reiner Informationstransfer nicht experimentell bewiesen werden, da auch der nicht-autokatalytische Reaktionskanal Ligationsprodukte hervorbrachte, die aufgrund ihrer terminalen Schutzgruppen mit denjenigen Sequenzen übereinstimmten, die am Templat im autokatalytischen Reaktionskanal und damit unter Informationstransfer gebildet wurden. Kreuzkatalyse in homogener Lösung Da in der Natur die replizierten Nukleinsäurestränge in der Regel nicht selbstkomplementär sind, wurden gekoppelte Replikatoren untersucht [45]. Es sollte experimentell gezeigt werden, dass sich das Prinzip der Selbstreplikation, das zu diesem Zeitpunkt nur für selbstkomplementäre Sequenzen bekannt war, auch allgemein auf beliebige Sequenzen übertragen ließ. Mit gekoppelten Replikatoren sollte es möglich sein, gewöhnliche nicht-selbstkomplementäre Sequenzen zu replizieren. Im einfachsten Fall eines kreuzkatalytischen Replikationssystems katalysiert das Ligationsprodukt der einen Sequenz die Synthese der komplementären Sequenz und umgekehrt. Die Kreuzkatalyse ist ein Beispiel dafür, dass ein dynamisches System komplexer sein kann als die Summe seiner Komponenten. $EE6FKHPDWLVFKH'DUVWHOOXQJGHVNUHX]NDWDO\WLVFKHQ6\VWHPV Orgel hatte ja bereits gezeigt, dass eine templatgesteuerte Ligation von monomeren Nukleotidbausteinen lediglich an pyrimidinreichen Templaten, nicht jedoch an purinreichen Templaten gelang. Mit dem kreuzkatalytischen Replikationssystem konnte also untersucht werden, wie sich dieses Phänomen verhielt, wenn man Paare selbstkomplementärer Sequenzen anstelle einer einzelnen selbstkomplementären Sequenz und oligomere anstelle monomerer Eduktbausteine einsetzte. Die verwendeten Sequenzen der einzelnen beteiligten Replikatoren waren dadurch nicht mehr selbstkomplementär. Die verwendete Sequenz der Edukte baute dabei auf den bekannten Systemen auf, auch die EDC-vermittelte Verknüpfung über 5'-3'-Phosphoramidatbindungen wurde beibehalten. Als Eduktbausteine kamen wieder die Trimere der Sequenzen d(ccg) und d(cgg) zum Einsatz, jeder Baustein aber einmal am 5'-Terminus, das andere Mal am 3'-Ende geschützt.

27 Selbstreplizierende Systeme ('& G &&* 3 G Q &&* 3R&O3K G &&* 3 &&* 3R&O3K G 070 &** 3 G Q &** 3R&O3K G 070 &** 3 &** 3R&O3K ('& $EE.UHX]NDWDO\VHDOVHLQHGHUEHLGHQ.RPELQDWLRQVP JOLFKNHLWHQGHU(GXNWEDXVWHLQH Zusätzlich konnten die vier Bausteine jeweils ihre Reaktionspartner tauschen und in den korrespondierenden autokatalytischen Systeme reagieren. Die kreuz- und autokatalytischen Systeme standen somit miteinander in direkter Konkurrenz. G &&* 3 G Q &** 3R&O3K G &&* 3 &** 3R&O3K ('& ('& G 070 &** 3 G Q &&* 3R&O3K G 070 &** 3 &&* 3R&O3K $EE'LHDXWRNDWDO\WLVFKHQ.RQNXUUHQ]V\VWHPHDOV5HVXOWDWGHUDQGHUHQ.RPELQDWLRQVP JOLFKNHLW GHU(GXNWEDXVWHLQH Alle vier möglichen Reaktionprodukte 0, 3, 4 und 5 wurden mit vergleichbarer Geschwindigkeit gebildet, obwohl die Templatmoleküle, die ihre Bildung katalysierten, zum Teil einen unterschiedlichen Gehalt an Purinnukleotiden aufwiesen. Die autokatalytischen Systeme waren notwendigerweise selbstkomplementär und hatten somit den gleichen Gehalt an Purin- (dg) und Pyrimidinnukleotiden (dc). Die kreuzkatalytischen Systeme dagegen unterschieden sich in ihrem Gehalt an Cytosin und Guanin. Untersuchte man die vier Systeme isoliert voneinander, so stellte man erwartungsgemäß fest, dass die isolierten autokatalytischen Systeme deutlich schneller abreagierten als die isolierten Bestandteile der kreuzkatalytischen Systeme. Dies war zu erwarten, da die nicht-autokatalytischen Systeme nur katalysiert waren, wenn sie gekoppelt reagieren konnten (kreuzkatalysiert). Lagen sie isoliert vor, so konnte kein Templateffekt erfolgen, da simultan keine komplementären Matrizen im System ausgebildet wurden. Setzte man die vier Trimerbausteine lediglich in Gegenwart einer der komplementären Hexamersequenzen um, so ließ sich das dazu komplementäre Produkt zu Lasten der anderen Reaktionsprodukte stimulieren. In einer detaillierten kinetischen Analyse konnten alle experimentellen Daten an einen Satz von lediglich drei apparenten Geschwindigkeitskonatanten gefittet werden (k a für die unkatalysierte Ligation, k b für die katalysierte Ligation und k c für die Duplexdissoziation). Dabei konnte eine gute Übereinstimmung zwischen dem gewählten Modell und den Daten erhalten werden. In diesem System aus vier Eduktbausteinen 8, 9, und waren die zentralen Subsequenzen in allen Fällen gleich, die Effizienz der kreuzkatalytischen und autokatalytischen Systeme war identisch. Zu diesem Zeitpunkt war es nicht mehr sehr verwunderlich, dass die Wachstumskurven der Sequenzen d(ccg PNH CCG) (0) und d(cgg PNH CGG) (3) trotz ihres verschiedenen Gehaltes an Purinen und Pyrimidinen vergleichbar waren, denn bereits die Experimente zur Sequenz- und Temperaturabhängigkeit der Ligation (siehe 3

28 Selbstreplizierende Systeme aus Oligonukleotiden Abb. ) hatten gezeigt, dass es im wesentlichen nur auf die Sequenz der Ligationsstelle, nicht aber auf die chemische Natur der seitlich flankierenden Nukleobasen ankam. Die Ligationsstelle war jedoch für beide Sequenzen identisch d(...g PNH C...). Wie zu erwarten, gehorchte auch hier das Wachstum der Produktbausteine in allen vier Fällen einem Quadratwurzelgesetz, da auch für den Fall der Kreuzkatalyse Produktinhibition zu erwarten war. Replikatoren mit mehr als zwei Edukten in homogener Lösung Die experimentellen Befunde warfen die Frage auf, ob und wie sich ein autokatalytischer Templateffekt in komplexeren Systemen auswirken könnte, denn mit diesem Experiment war der Weg geebnet, ganze Netzwerke aus autokatalytischen, kreuzkatalytischen und kollektiv autokatalytischen Subsystemen zu untersuchen. Letztere entsprechen den sog. Autocatalytic Sets, wie sie von S. Kaufmann in die Theorie molekularer Selbstorganisation eingeführt wurden [46]. Die Komplexität eines Systems steigt allgemein mit der Zahl der eingesetzten Eduktbausteine und der möglichen Reaktionsprodukte. In komplexeren Systemen mit mindestens drei Eduktbausteinen sollte es außerdem erstmals möglich sein, Informationstransferprozesse zu beobachten. T. Achilles untersuchte in diesem Zusammenhang ein [,,3]-[6]-System, das sich prinzipiell in seiner inneren Dynamik als recht komplex erwies, jedoch in mehrere kleinere und damit weniger komplexe Subsysteme aufgeschlüsselt werden konnte [47]. So konnte auf der einen Seite untersucht werden, wie ein Replikator reagiert, wenn auch kürzere Sequenzen im Gemisch als Eduktbausteine angeboten werden, die aufgrund ihrer schwächeren Assoziation an den Templatbaustein weniger eindeutig als komplementäre Bausteine durch die Matrize erkannt werden sollten. Auf der anderen Seite konnte aber auch untersucht werden, wie sich der Replikator verhielt, wenn die Matrize aus drei oder noch mehr Bausteinen gebildet wurde. Es kamen die drei Eduktbausteine d( MTM CCG P ) (6), d( n CG P ) (7) und d( n G P(o-ClPh) ) (8) zum Einsatz. Dabei waren im wesentlichen durch die in Anwesenheit von - Methylimidazol und EDC durchgeführte Ligation fünf Reaktionsprodukte möglich, die alle eine zentrale Phosphoramidatbindung (PNH) aufwiesen: d(mtm-ccg PNH G P(o- ClPh)) (9), d( MTM CCG PNH CG P ) (30), d( MTM CCG PNH CG PNH G P(o-ClPh) ) (3), d( n CG PNH CG P ) (3) und d( n CG PNH G P(o-ClPh) ) (33) möglich. Höhere Oligomere wie z.b. das Hexamer d( n CG PNH CG PNH CG P ) (34) wurden unter den gewählten Reaktionsbedingungen nicht beobachtet. Das Hexamer 3 wurde dabei sowohl durch die Reaktion von 6 mit 33, als auch durch Umsetzung von 30 mit 8 gebildet. Das Gesamtsystem wurde in weniger komplexe Subsysteme aufgeschlüsselt und jedes für sich kinetisch im Hinblick auf den Effekt für die Bildung jedes der fünf Reaktionsprodukte analysiert. Dazu musste beispielsweise für die Synthese des Pentamers ein Dimer ohne 3 - terminale Phosphatgruppe d( n CG) (35) eingesetzt werden, um die Bildung von Nebenprodukten zu verhindern. Als Templatmoleküle kamen nicht-modifizierte Oligonukleotide mit der entsprechenden Sequenz zum Einsatz. G 070 &&* 3 &* 3 * 3R&O3K G Q &* 3 * 3R&O3K G 070&&* 3 G Q&* 3 G Q* 3R&O3K G 070&&* 3 &* 3 G Q&* &* 3 3 G 070&&* 3 * 3R&O3K $EE'DVNRPSOH[HUHVHOEVWUHSOL]LHUHQGH6\VWHPDXVGUHL(GXNWEDXVWHLQHQ 4

29 Selbstreplizierende Systeme Experimentell fand man u.a., dass sich das Pentamer 30 und das Hexamer 3 als gekoppelte Autokatalysatoren verhielten. Beide Sequenzen wirkten autokatalytisch auf ihre eigene Synthese (Egoisten) und zusätzlich als Kataylsatoren für die gegenseitige Synthese (Altruisten). Altruistisches und egoistisches Verhalten waren also gekoppelt. Dies ließ sich bei genauer Betrachtung der theoretisch möglichen termolekularen Komplexe erklären. Dabei war zu berücksichtigen, dass die Bildung des Hexamers 3 sowohl durch Ligation des Pentamers 30 mit dem Monomer 8 als auch durch Ligation der beiden Trimere 9 und 3 möglich war: >@>@6\VWHP >@>@6\VWHP >@>@6\VWHP HJRLVWLVFKHVH[DPHU DOWUXLVWLVFKHVH[DPHU >@>@6\VWHP >@>@6\VWHP >@>@6\VWHP HJRLVWLVFKHV3HQWDPHU DOWUXLVWLVFKHV3HQWDPHU $EE'LHYHUVFKLHGHQHQWHUPROHNXODUHQ.RPSOH[HGHU HJRLVWLVFKHQXQGDOWUXLVWLVFKHQ5HSOLNDWRUHQ Zusätzlich diente das Pentamer 30 als Edukt für die Bildung des Hexamers 3. Im Gegensatz dazu wurde das Tetramer 9 hauptsächlich über einen nichtautokatalytischen Reaktionskanal gebildet und verhielt sich seinerseits als isolierter Autokatalysator ohne zusätzliche Wirkung auf die anderen Subsysteme. Es wies eine effiziente G-G-Stapelwechselwirkung an der Ligationsstelle auf. Im Gesamtsystem konkurrierten die gekoppelten Autokatalysatoren 30 und 3 mit dem isolierten Autokatalysator 9 um die gemeinsamen Ressourcen der drei Eduktbausteine 6, 7 und 8. Auch hier war also die Konkurrenz als Grundvoraussetzung für Selektion implementiert. Wegen des parabolischen Verhaltens der Replikatoren schlug sich diese Selektion jedoch ebenfalls lediglich in der relativen Konzentration der Spezies nieder (Koexistenz), die den Verbrauch der Eduktbausteine bestimmte. In diesem Fall kann ein schwacher Katalysator den Wettstreit gewinnen, wenn er auf einer höheren Anfangskonzentration als die übrigen Systeme beruht. Es kam auch hier zu keiner vollständigen Verdrängung eines der Replikatoren im Gesamtsystem (Survival of the Fittest). Es konnte jedoch durch anfängliche Zugabe von hexameren Bausteinen erreicht werden, dass der isolierte Autokatalysezyklus zugunsten der gekoppelten Autokatalysatoren zurückgedrängt wurde. Dies konnte im erweiterten Sinn als die erste experimentell beobachtete Form von Selektion und gleichzeitigem Informationstransfer angesehen werden. Ein echter Selektionsprozess war jedoch auch hier wegen des fehlenden exponentiellen Wachstums nicht zu beobachten. Diese Arbeit trug dazu bei, dass derartige Reaktionsnetzwerke später als molekulare Ökosysteme bezeichnet wurden [48]. 5

30 Selbstreplizierende Systeme aus Oligonukleotiden Es ist zwar grundsätzlich ein durchaus attraktives Forschungsziel, die Komplexität solcher molekularer Ökosysteme weiter zu erhöhen und verschiedene äußere Faktoren zu verändern, um ihren Einfluss auf diese Systeme zu studieren, ein systemimmanentes Grundproblem bleibt jedoch erhalten: Produktinhibition führt zu parabolischem Wachstum, unabhängig von der Art der Matrizen, der Art der Rückkopplung und dem Ausmaß der Rückkopplung. Solange exponentielles Wachstum in den replizierenden Subsystemen nicht gezielt erreicht werden kann, werden auch keine Phänomene wie Selektion, Konzentrationsoszillation, räumliche Musterbildung und Chaos beobachtet werden können. Und genau diese dynamischen Phänomene sind es, für die das Studium molekularer Ökosysteme in Zukunft eine besondere Bedeutung spielen könnten. Zur Zeit erscheint es jedoch konsequent, zunächst systematisch die Suche nach exponentiellem Wachstum fortzusetzen und sich erst dann wieder den molekularen Ökosystemen zuzuwenden II, vgl. [49]. Schrittweise operierende Replikatoren Neben den auf Watson-Crick-Basenpaarung beruhenden Doppelhelices bilden DNA und RNA auch noch weitere Sekundär- und Tertiärstrukturen aus, die alle prinzipiell an selbstreplizierenden Systemen beteiligt sein können. P.B. Dervan konnte bereits 989 zeigen, dass eine enzymfreie Ligation von zwei DNA-Oligomeren auch an einem DNA-Doppelstrang stattfinden kann, wobei intermediär eine Tripelhelix durchlaufen wird [50]. Tripelhelices können von DNA nur dann ausgebildet werden, wenn die beteiligten Einzelstränge ihrerseits nur Pyrimidine bzw. nur Purine enthalten. Hat sich ein gewöhnlicher antiparalleler Doppelstrang über Watson-Crick-Basenpaare aus einem Homopyrimidin- und einem komplementären Homopurinstrang gebildet, so kann ein weiterer komplementärer Homopyrimidinstrang über Hoogsteen-Basenpaare in der großen Furche der Doppelhelix parallel an den Homopurinstrang anlagern und somit eine Tripelhelix ausbilden. Ausgehend von diesem experimentellen Befund wurde von A. Kanavarioti 99 vorgeschlagen, Tripelhelices auf ihre Eignung für Selbstreplikationsexperimente hin zu untersuchen [5]. Da der dritte Strang weniger fest als der Duplex gebunden ist, sollte auch bei längeren Sequenzen bereits bei verhältnismäßig geringen Temperaturen ein Turnover im Sinne eines Replikationszyklus' möglich sein. Experimentell konnte dies 994 in einem Experiment von K. C. Nicolaou gezeigt werden [5] (Abb. 8). Zwei selbstkomplementäre und zusätzlich palindrome 4mere (grün und rot) bildeten dabei einen gewöhnlichen antiparallelen DNA-Duplex 34 aus, der unter den gewählten Reaktionsbedingungen quasi vollständig assoziiert vorlag. An dieses Palindrom 34 lagerten sich bei ph 6 nun parallel zum Homopurinstrang zwei komplementäre mere 35 und 36 an (blau und gelb). Dadurch kamen ihre reaktiven Enden in räumliche Nachbarschaft und konnten nach Aktivierung des Phosphatrestes mit N-Cyanoimidazol ligiert werden. So entstand der termolekulare II Die Untersuchung einer großen Anzahl konkurrierender parabolischer Replikatoren sollte zwar nach Lancet auch zu einer Dominanz der weniger schlechten Replikatoren führen, es ist allerdings davon auszugehen, dass eine Selektion nach dem am wenigsten schlecht replizierenden System eine größere Anzahl an Spezies liefert, die wegen ihrer Komplexität nur sehr schwierig analysierbar sein sollte. 6

31 Selbstreplizierende Systeme Komplex 37. Bis zu dieser Stufe handelte es sich also um ein [,]-[4,4]-System. Dieser termolekulare Komplex konnte nun bei ph 7 das gebildete und weniger fest gebundene 4mer 38 (grün) freisetzen, welches seinerseits als einzelsträngiger Templatbaustein für zwei komplementäre mere 39 und 40 (violett und orange) dienen konnte, also seinerseits Bestandteil eines [,]-[4]-Systems war. Diese beiden Dodecamere wurden miteinander verknüpft und waren in ihrer Sequenz mit dem ursprünglichen Duplex 34 identisch. Wegen ihrer deutlich höheren Komplexstabilität blieben die Duplexe thermisch stabil, lediglich die Tripelhelices dissoziierten wieder auseinander und dienten als Matrizen für neue Replikationszyklen, wenn der ph-wert wieder auf 6 herabgesetzt wurde. $EE'DVWULSHOKHOLFDOHVHOEVWUHSOL]LHUHQGH6\VWHPQDFK0KEQNCQW Die Nukleotidbausteine waren nicht von Beginn an vorhanden, sondern wurden nach und nach hinzugegeben, je nachdem, welcher Reaktionsschritt als nächster vorgesehen war. Dieses schrittweise Modell hat prinzipiell das Potential dazu, die unerwünschte Produktinhibition zu umgehen, es eignet sich allerdings nur für Oligonukleotide, die aus Homopurin- bzw. Homopyrimidinsträngen aufgebaut sind und zusätzlich als Palindrome vorliegen. Neben der Replikation in homogener Lösung ist auch die Replikation an Oberflächen aus präbiotischer Sicht aus verschiedenen Gründen ein reizvolles Forschungsgebiet. J. P. Ferris und L. E. Orgel berichteten 996, dass die Synthese längerer präbiotischer Oligomere an Oberflächen von Mineralien möglich ist [53]. So gelang es, aktivierte Nukleotide an Montmorillonit, Aminosäuren an Hydroxylapatit oder Illit zu 7

32 Selbstreplizierende Systeme aus Oligonukleotiden oligomerisieren. Dabei wurden Sequenzlängen mit mehr als 50 Monomereinheiten erreicht, was in Lösung zuvor nicht möglich gewesen war, da hier die Hydrolyse eine wesentliche Nebenreaktion ist. Sie erfolgt als Konkurrenzreaktion zu schnell, so dass längere Oligomere nicht erhalten werden können. An der Oberfläche des Minerals können die aktivierten Nukleotide jedoch unspezifisch über Magnesiumionen gebunden und somit lokal aufkonzentriert werden. Dort reagieren sie dann wesentlich schneller als in Lösung, die Hydrolyse wird weniger bedeutsam und größere Sequenzlängen werden möglich. Die Minearloberfläche und die Backbone der Oligonukleotide sind negativ geladen. Die zweifach positiv geladenen Magnesiumionen dienen daher als elektrostatische Ladungsvermittler zwischen der Oberfläche und dem Substrat. Die entstehenden Oligoanionen werden mit wachsender Kettenlänge immer stärker an die Oberfläche gebunden, bis sie sich ab einer gewissen Größe nicht mehr von dieser ablösen können. Experimentell schafft man durch Zugabe relativ kurzer Primersequenzen dadurch Nukleationskeime an der Mineraloberfläche, so dass die Strangsynthese im Sinne einer Primerverlängerung ablaufen kann. Besonders lange Oligomere erhält man, wenn man stufenweise immer wieder die Oberfläche einer frischen Lösung der aktivierten Bausteine aussetzt. Durch dieses Experiment konnte erstmals gezeigt werden, dass bei Übergang von homogenen auf heterogenen Systemen auch längere Oligomere spontan aus aktivierten Monomeren erzeugt werden können. Dies ist für die Entstehung genetischer Moleküle unter primordialen Bedingungen wichtig, da so auch die spontane Selbstkonstitution kurzer Ribozyme vorstellbar wird. Den Replikations- Ribozymen kommt man durch die experimentelle Realisierung von Oligomerisationsgraden von mehr als 50 Basen deutlich näher, auch wenn das Problem der unwahrscheinlichen spontanen Bildung eines speziellen Oligomers aus einem überaus großen Sequenzraum bestehen bleibt. Aus präbiotischer Sicht erweiterte sich auf der Grundlage dieser experimentellen Befunde das mögliche Szenario der chemischen Evolution: zur Theorie der Ursuppe kam die Chemie der heterogenen Katalyse durch Oberflächen hinzu. Zu diesem Paradigmenwechsel hatten sicherlich auch schon zuvor G. Wächtershäuser [54], Bernal [55], Kuhn [56], Cairns-Smith [57] und andere beigetragen. Es ist durchaus vorstellbar, dass Leben an einer Art primordialen Crêpes entstand, wobei der Backvorgang in der Dehydratisierung der Bausteine bestand, die so zu Oligomeren zusammengefügt wurden [58]. Die Ursuppe lieferte dabei die Bausteine, die auf den heissen Oberflächen zur Reaktion kamen. Die Ergebnisse von Ferris und Orgel warfen unmittelbar die Frage auf, wie wohl Replikation an Oberflächen stattfinden könnte. Ein erster Replikator, der an Oberflächen reagierte, wurde 998 beschrieben. Es handelte sich dabei um ein generell auf alle möglichen Sequenzen anwendbares und ebenfalls schrittweise ablaufendes Replikationssystem, das als SPREAD-Verfahren bezeichnet wurde (Surface Promoted Replication and Exponential Amplification of DNA-Analogues) [59]. Auch hier wurde wie grundsätzlich auch im Replikationssystem von Nicolaou die Produktinhibition umgangen. Mit dem SPREAD-Verfahren konnte exponentielles Wachstum von modifizierten DNA-Bausteinen unter nicht-enzymatischen Bedingungen erstmals kinetisch experimentell nachgewiesen werden. Bei dem Experiment waren die Oligomere im Gegensatz zu den Untersuchungen von Ferris und Orgel nicht durch schwache Wechselwirkungen, sondern kovalent an der 8

33 Selbstreplizierende Systeme Oberfläche der Festphase immobilisiert. Ein 4meres Templatmolekül (rot) wurde kovalent an einem festen Träger fixiert. Zwei komplementäre Eduktbausteine in Lösung (gelb und blau) konnten sich spezifisch über Watson-Crick-Basenpaarung anlagern und nach Aktivierung miteinander reagieren. Es bildete sich ein Templat- Duplex an der Matrize aus. Nun wurde der entstandene Duplex chemisch dissoziiert. Die immobilisierten Templatmoleküle (rot) verblieben auf dem Trägermaterial, die entstandenen komplementären Moleküle (grün) wurden heruntergespült und in ein neues Reaktionskompartiment überführt. Dort wurden sie ihrerseits immobilisiert und dienten als zusätzliche Templatbausteine für die nächste Replikationsrunde mit zwei komplementären Heptameren (orange und violett). Diese wurden dann zu einem 4mer verknüpft, das mit dem Templat im anderen Reaktionskompartiment identisch war (rot). Dadurch wurde der Replikationszyklus geschlossen. Auf diese Weise wurde durch die räumliche Separation von Templat und Produkt auf der Festphase gewährleistet, dass keine Produktinhibition stattfinden konnte. Das Verfahren arbeitete daher exponentiell. $EE6FKHPDWLVFKH'DUVWHOOXQJGHV635($'9HUIDKUHQVGLHYHUVFKLHGHQHQ 5HDNWLRQVNRPSDUWLPHQWHVLQGJUDXXQWHUOHJW Damit die Immobilisierung an der Festphase erfolgen konnte, war eine geeignete chemische Modifikation an den DNA-Bausteinen notwendig, die für das SPREAD- Verfahren in seiner ersten Version in der Einführung einer Thiolgruppe bestand. Die Immobilisierung erfolgte dann durch Ausbildung von Disulfidbrücken an einer Thiosepharose. Die Ligation der komplementären Oligonukleotide erfolgte durch Aktivierung mit dem wasserlöslichen Carbodiimid EDC, die Denaturierung und damit Trennung von Produkt und immobilisiertem Templat erfolgte mit verdünnter Natronlauge. Zwar waren diese Reaktionsbedingungen nicht realistisch für die präbiotische Chemie, dennoch lässt sich für jeden modularen Reaktionsschritt im Verfahren ein Äquivalent finden, dessen Plausibilität für frühgeschichtliche Ereignisse auf der Erdoberfläche weniger zweifelhaft ist. Die Trennung von Produkt und Templat könnte z.b. auch thermisch induziert erfolgen, was durch Tag-Nacht-Zyklen oder pulsartige Erwärmung an submarinen Hydrothermalquellen sein präbiotisches Äquivalent findet. Auch die Struktur und chemische Beschaffenheit von Festphasenoberfläche und Templatmolekül ist für die präbiotische Plausibilität nicht maßgeblich, da für jeden Schritt eine beliebige Anzahl von Varianten besteht. Vielmehr ist das SPREAD-Verfahren als ein universelles 9

34 Selbstreplizierende Systeme aus Peptiden Procedere zu verstehen, das die exponentielle Vermehrung von genetischen Molekülen an Oberflächen beschreibt und auf diverse andere Systeme übertragen werden kann. Ein ebenfalls exponentiell und stufenweise arbeitendes System wurde von D. Albagli 999 veröffentlicht [60]. Bei diesem System fand eine photochemisch induzierte Ligation zwischen einer mit Cumarin modifizierten Deoxyribose und einem Thymin im komplementären Stang statt ([]-Photozykloaddition). Die Verknüpfung der DNA- Bausteine erfolgte also nicht über die Phosphat-Backbone, sondern über die Nukleobasen gegenüberliegender Stränge. Aus diesem Grund waren verzweigte Geometrien in den termolekularen Komplexen erforderlich, wie sie auch in der folgenden Abbildung dargestellt sind: $EE'LHYHU]ZHLJWHQ6WUXNWXUHQI UGLH3KRWR/LJDWLRQ]ZLVFKHQ JHJHQ EHUOLHJHQGHP&XPDULQ;XQG7K\PLQ7 Durch Kopplung von zwei derartigen, zueinander komplementären Systemen konnte bei schrittweiser Wiederholung von wechselnden Reaktionsbedingungen (Zykling) eine exponentielle, nicht-enzymatische Amplifikation der Oligonukleotide beobachtet werden. Das gesamte Verfahren und auch die Bedingungen der einzelnen Zyklen erinnerten dabei sehr stark an PCR-Experimente: a) 6min bei 5 C; b) min bei 50 C mit Lichteinstrahlung; c) 0s bei 86 C. Wirkten die photochemisch verknüpften Bausteine ihrerseits dabei als neue Template, so wurden vierfach-verzweigte Überstrukturen der DNA durchlaufen, wie sie in verwandter Form auch bei den Holiday-Junctions in der Natur beobachtet werden. Selbstreplizierende Systeme aus Peptiden Inzwischen sind auch einige selbstreplizierender Systeme bekannt geworden, deren molekulare Erkennung nicht auf die Watson-Crick-Basenpaarung von Oligonukleotiden zurückgeht. Das erste selbstreplizierende Peptid wurde von R. Ghadiri 996 beschrieben [6]. Dies sorgte für gewisses Aufsehen, da die Replikation von Peptiden in der Natur bisher so gut wie nicht bekannt war [6]. Ähnlich wie für Oligonukleotide sind auch Kondensationsreaktionen für Aminosäuren unter plausiblen präbiotischen Bedingungen untersucht worden [63]. Diese proteinogenen Substanzen zeigten teilweise sogar katalytische Aktivität, es gibt u.a. Beispiele für die Katalyse von Esterspaltungen, Dephosphorylierungen, Decarboxylierungen, Desaminierungen und Oxidationen [64]. Die Abfolge der einzelnen Aminosäuren in der Sequenz wurde während der Synthese in gewissem Ausmaß durch die Art der terminalen Aminosäure im wachsenden Oligomer bestimmt. Nicht zuletzt durch die bereits erwähnten Ergebnisse von Ferris und Orgel lassen sich Aminosäuren auch zu längeren Oligomeren kondensieren. 30

35 Selbstreplizierende Systeme Das von Ghadiri beschriebene System basierte auf einer leicht veränderten und aus 3 Aminosäuren aufgebauten Leucine-Zipper-Domäne des Transkriptionsfaktors GCN4 aus Hefe. Diese Domäne bildet eine α-helix aus, die mit einer heptameren Peptidsequenz als Repetiereinheit beschrieben werden kann. Eine dieser Einheiten umfasst zwei Drehungen in der Helix. Im Leucine-Zipper befindet sich eine Aminosäure mit lipophiler Seitenkette (Leucin, Isoleucin oder Valin) an jeder zweiten und fünften Position in der Repetiereinheit, so dass die lipophilen Reste bei Ausbildung einer α-helix an der gleichen Seite des Moleküls zu liegen kommen $EE'LH5HSHWLHUHLQKHLWDXVVLHEHQ$PLQRVlXUHQLQGHU$XIVLFKWELOGHWHLQH.RQWDNWIOlFKHDQGHUHLQH]ZHLWHHOL[SDUDOOHODQODJHUQNDQQ Auf diese Weise entsteht an der Helix auf einer Seite eine hydrophobe Oberfläche durch den hydrophoben Effekt der Seitenketten der entsprechenden Aminosäuren. Es können folglich in Wasser als Lösungsmittel zwei komplementäre Peptide (coiled coils) zu einem Duplex assoziieren, bei dem die Alkylketten der entsprechenden Aminosäuren wie bei einem Reissverschluss ineinandergreifen. $EE'HUVFKHPDWLVLHUWH$XIEDXHLQHV.GWEKPG<KRRGTU Als Ligation wurde die Verknüpfungsreaktion nach Kent gewählt [65], bei der zunächst ein aktivierter Thioester des C-Terminus des einen Peptidfragments 4 vom Cystein am N-Terminus des anderen Peptidfragments 4 angegriffen wird. Im Anschluss erfolgt eine intramolekulare Umlagerung vom intermediär gebildeten Thioester 43 zum kondensierten Peptid 44. Es wurde also wie bei den Nukleinsäuren auf Enzyme (Ligasen oder Polymerasen) verzichtet Ã%] $EE'LH3HSWLGNRSSOXQJQDFK-GPV 3

36 Selbstreplizierende Systeme aus Peptiden Es wurden ein nukleophiles Pentadecamer 45 und ein elektrophiles Heptadecamer 46 an einem Templat 47 aus 3 Aminosäuren ligiert. Das korrespondierende [5,7]- [3]-System zeigte wegen der Produktinhibition erwartungsgemäß parabolisches Wachstum und gehorchte qualitativ dem Quadratwurzelgesetz der Autokatalyse. Bei Zugabe von Denaturierungsmittel konnte kein Templateffekt mehr beobachtet werden, da die strukturelle Organisation unterdrückt wurde. Um zu beweisen, dass beide Eduktbausteine durch hydrophobe Wechselwirkung am Templat angelagert wurden und somit eine vollständige Präorganisation stattfand, wurden als alternative Template die beiden Mutanten 48 und 49 synthetisiert, die in der hydrophoben Erkennungseinheit eine Glutaminsäure anstelle von Leucin enthielten. Dadurch wurde an dieser Stelle die hydrophobe Wechselwirkung unterbrochen und somit ein Templateffekt verhindert. Aufgrund der regionalen Lage der Punktmutation auf dem Templatmolekül verhinderte die Mutante 48 selektiv die Anlagerung des nukleophilen Bausteins 45, umgekehrt die Mutante 49 die Anlagerung des elektrophilen Bausteins 46. Dies konnte durch entsprechende kinetische Kontrollexperimente gezeigt werden. Gleiche Ergebnisse erhielt man, wenn man die Mutationen in den elektrophilen oder nukleophilen Bausteinen einführte. 7HPSODW 0XWDQWH 0XWDQWH 5ÃÃÃ0ÃÃÃÃ.ÃÃÃ4ÃÃÃÃ/ÃÃÃ(ÃÃÃÃ(ÃÃÃÃ.ÃÃÃÃ9ÃÃÃ<ÃÃÃÃ(ÃÃÃÃ/ÃÃÃÃ/ÃÃÃÃ6ÃÃÃÃ.ÃÃÃÃ9ÃÃÃÃ$ 5ÃÃÃ0ÃÃÃÃ.ÃÃÃ4ÃÃÃÃ/ÃÃÃ(ÃÃÃÃ(ÃÃÃÃ.ÃÃÃÃ9ÃÃÃ<ÃÃÃÃ(ÃÃÃÃ/ÃÃÃÃ/ÃÃÃÃ6ÃÃÃÃ.ÃÃÃÃ9ÃÃÃÃ$ 5ÃÃÃ0ÃÃÃÃ.ÃÃÃ4ÃÃÃÃ(ÃÃÃ(ÃÃÃÃ(ÃÃÃÃ.ÃÃÃÃ9ÃÃÃ<ÃÃÃÃ(ÃÃÃÃ/ÃÃÃÃ/ÃÃÃÃ6ÃÃÃÃ.ÃÃÃÃ9ÃÃÃ$ &ÃÃÃÃ/ÃÃÃÃ(ÃÃÃ<ÃÃÃÃ(ÃÃÃÃ9ÃÃÃÃ$ÃÃÃÃ5ÃÃÃ/ÃÃÃÃ.ÃÃÃÃ.ÃÃÃÃ/ÃÃÃÃ9ÃÃÃ*ÃÃÃÃ( &ÃÃÃÃ/ÃÃÃÃ(ÃÃÃ<ÃÃÃÃ(ÃÃÃÃ9ÃÃÃÃ$ÃÃÃÃ5ÃÃÃ(ÃÃÃÃ.ÃÃÃÃ.ÃÃÃÃ/ÃÃÃÃ9ÃÃÃ*ÃÃÃÃ( &ÃÃÃÃ/ÃÃÃÃ(ÃÃÃ<ÃÃÃÃ(ÃÃÃÃ9ÃÃÃÃ$ÃÃÃÃ5ÃÃÃ/ÃÃÃÃ.ÃÃÃÃ.ÃÃÃÃ/ÃÃÃÃ9ÃÃÃ*ÃÃÃÃ( (OHNWURSKLO XFOHRSKLO 5ÃÃÃ0ÃÃÃÃ.ÃÃÃ4ÃÃÃÃ/ÃÃÃ(ÃÃÃÃ(ÃÃÃÃ.ÃÃÃÃ9ÃÃÃ<ÃÃÃÃ(ÃÃÃÃ/ÃÃÃÃ/ÃÃÃÃ6ÃÃÃÃ.ÃÃÃÃ9ÃÃÃÃ$ &ÃÃÃÃ/ÃÃÃÃ(ÃÃÃ<ÃÃÃÃ(ÃÃÃÃ9ÃÃÃÃ$ÃÃÃÃ5ÃÃÃ/ÃÃÃÃ.ÃÃÃÃ.ÃÃÃÃ/ÃÃÃÃ9ÃÃÃ*ÃÃÃÃ( $EE'LH%DXVWHLQHGHVVHOEVWUHSOL]LHUHQGHQ6\VWHPVXQGGLH 0XWDQWHQI UGLH.RQWUROOH[SHULPHQWHXQG Auch die Punktmutation in der hydrophoben Erkennungssequenz eines Leucin- oder Valin-Restes gegen einen ebenfalls verhältnismäßig hydrophoben Alanin-Rest im Templat führte zu einer signifikanten Inhibition des Systems, wodurch die Sequenzspezifität des Replikators demonstriert werden konnte. Eine detailierte kinetische Analyse des ursprünglichen Systems zeigte, dass die autokatalytische Reaktionsordnung p mit 0.63 etwas größer war, als man theoretisch für einen streng parabolisch wachsenden Replikator erwarten sollte (p = 0.5). Dies wurde dadurch erklärt, dass neben einem termolekularen Komplex 50 aus den Bausteinen 45, 46 und 47 auch ein tetramolekularer Komplex 5 möglich war, bei dem zwei Templatmoleküle 47 gleichzeitig an der Autokatalyse beteiligt sind WHUPROHNXODU WHWUDPROHNXODU $EE'LHP JOLFKHQWHUXQGWHWUDPROHNXODUHQ5HDNWLRQVNRPSOH[HXQG 3

37 Selbstreplizierende Systeme Wie bereits erwähnt, ergibt sich theoretisch für ein selbstreplizierendes System mit einem tetramolekularen Komplex im geschwindigkeitsbestimmenden Reaktionsschritt eine autokatalytische Reaktionsordnung von p=0.66 ((n-)/n). Selbstreplizierende Peptidsysteme wurden in den folgenden Jahren von der Gruppe um R. Ghadiri [66], zum anderen von J. Chmilewski weiter ausgebaut. In Analogie zu den Arbeiten von D. Sievers im Zusammenhang kreuzkatalytisch replizierender DNA- Bausteine [45] und T. Achilles über molekulare Ökosysteme [47] wurde dieses Konzept auch auf Peptide übertragen. In einem Netzwerk selbstreplizierender Peptide wurde der oben beschriebene Replikator aus dem nukleophilen Baustein 45, dem Elektrophil 46 und dem Templat 47 verwendet. Daran gekoppelt wurde ein zweites selbstreplizierendes System, das den gleichen elektrophilen Baustein 46 enthielt, dessen Nukleophil 5 sich jedoch vom Nukleophil 45 darin unterschied, dass in der coiled-coil-erkennungssequenz die hydrophoben Aminosäuren Valin und Leucin gegen Isoleucin und Leucin ersetzt wurden [67]. Nach der Ligation bildeten 46 und 5 dann entsprechend das Templatmolekül 53. Durch den in diesem Fall vergleichsweise unspezifischen Charakter der hydrophoben Erkennungssequenz war es möglich, dass die gleiche Erkennungsstelle im Templatmolekül sowohl den einen als auch den anderen nukleophilen Baustein mit unterschiedlicher Bindungsstärke anlagern konnte. Somit kam es durch Kombination der beiden Replikatoren zu einem übergeordneten Zyklus, wie in der folgenden Abbildung schematisch dargestellt ist: $EE'LHJHNRSSHOWHQVHOEVWUHSOL]LHUHQGHQ3HSWLGH Der Versuch, mit diesem System einen Hyperzyklus [68] zu generieren, schlug jedoch fehl. Unter einem Hyperzyklus versteht man ein System aus mehreren Replikatoren, die über einen übergeordneten Zyklus miteinander verbunden sind und deren Autokatalyse dabei höherer Ordnung ist. Das Wachstum erfolgt dann hyperbolisch. Peptidreplikatoren wurden auch in gekoppelten Systemen dazu verwendet, den Einfluss von Punktmutationen in der Erkennungssequenz auf diese nicht linearen Systeme zu untersuchen. Es wurde von dynamischer Fehlerkorrektur in einem 33

38 Selbstreplizierende Systeme aus Peptiden autokratischen Netzwerk [69], Modulation durch den ph-wert [70] und durch Ionenkontrolle [7] berichtet, aber auch ein kreuzkatalytisches System wurde untersucht [7]. Selbstreplizierende Systeme aus organischen Bausteinen Das erste selbstreplizierende System, das geringere Verwandschaft mit Biomolekülen aufwies und mehr als artifizielles System bezeichnet werden könnte, wurde 990 von J. Rebek [73] beschrieben [74]. Es enthielt als Erkennungsmotiv auf der einen Seite ein Derivat des Adenosins 53 und auf der anderen eine entsprechende Erkennungseinheit für Adenin 54. Die Verknüpfungschemie bestand in der Ausbildung einer Amidbindung, wie man sie auch in Peptiden findet. Das Reaktionsprodukt 55 war selbstkomplementär (Abb. 7). ; $EE'DVVHOEVWUHSOL]LHUHQGH6\VWHPQDFK4GDGM Die beobachtete Autokatalyse gehorchte dem Quadratwurzelgesetz, wie es für einen parabolischen Replikator charakteristisch ist [75]. Der Replikator wurde später durch eine photochemisch abspaltbare Schutzgruppe an der molekularen Erkennungsstelle des Adenins modifiziert und das kinetische Verhalten unter Lichteinwirkung untersucht [76]. Auch wurde der Naphthylspacer zwischen der Erkennungseinheiten gegen einen Binaphthylrest ersetzt und das kinetische Verhalten untersucht [77]. Die Bahauptung, mit derartigen Replikatoren Modellsysteme im günstigsten Fall ein primitives Anzeichen für künstliches Leben gefunden zu haben, führte zu einer Kontroverse über die Rebek schen Experimente [78]. F. Menger stellte die These auf, die Autokatalyse sei nicht auf einen Templateffekt zurückzuführen, sondern auf eine unspezifische Amid-Autokatalyse. Dies hätte zur Folge, dass es sich um keine Selbstreplikation handelte, da keine Informationsübertragung stattfand, sondern lediglich um gewöhnliche Autokatalyse, wie sie z.b. auch bei den Arbeiten von P. L. Luisi zur micellaren und liposomalen Autokatalyse [79] oder von J. Sagiv zur Vermehrung amphiphiler Monolayer [80] beobachtet wurde. Erst eine Veröffentlichung von D. Reinhoudt führte 996 zu einer Antwort auf die aufgeworfene Frage [8]. Wie Reinhoudt zeigen konnte, hatten beide Arbeitsgruppen recht: In verdünnter Lösung läuft eine Selbstreplikation ab, bei höheren Konzentrationen zusätzlich auch Amid-Autokatalyse. Das kleinste bisher bekannte und vollständig artifizielle Replikationssystem wurde 99 beschrieben [8]. Es verzichtete gänzlich auf molekulare Erkennungsstrukturen aus der Chemie der Peptide oder Nukleinsäuren. Die Assoziation der Bausteine erfolgte beim Terfort schen Replikator über Salzbrücken zwischen einer Amidiniumfunktion des einen Bausteins 56 und einem Carboxylatrest des anderen 34

39 Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer Eduktes 57. Als Ligationsreaktion wurde die Ausbildung eines Azomethins verwendet. Es entstand ein konjugierter und damit planarer Templatbaustein 58 (Abb. 8). 5 5 $EE'HU5HSOLDNWRUQDFK6GTHQTV Eine NMR-spektroskopische Analyse des kinetischen Verhaltens zeigte ebenfalls parabolisches Wachstum (p = 0.5). Modifizierte man dagegen den Templatbaustein an den Seitenketten des aromatischen Systems (R bis R4; gezielte Variation mit -H, -CH 3, -NO bzw. -tertbutyl), so beobachtete man überraschenderweise eine Katalyse erster Ordnung. Die eingesetzte Matrize war aufgrund ihrer chemischen Modifikation spektroskopisch von dem aus der Ligationsreaktion hervorgehenden Templat unterscheidbar. Dies deutete darauf hin, dass mit geeigneten Matrizen auch exponentielles Wachstum beobachtet werden können sollte. 997 berichtete Sutherland über einen ebenfalls vollständig artifiziellen Selbstreplikator, bei dem die Ligationschemie auf einer Diels-Alder-Reaktion basierte [83]. Als Dien diente das mit einem Naphthyridin gekoppelte Zyklohexadien- Derivat 59, als Dienophil das mit dem Aminopyridon verknüpfte Maleinimid 60. Durch die Reaktion entstand das Templat 6 (Abb. 9). 5 5 & & & & $EE'HU5HSOLNDWRUDXV'LHQXQG'LHQRSKLOQDFK5WVJGTNCPF Die kinetische Analyse ergab, dass eine autokatalytische Reaktionsordnung von p = 0.8 vorlag. Möglicherweise lag bei diesem System der Fall vor, dass im termolekularen Komplex die beiden Eduktbausteine 59 und 60 räumlich in eine besonders günstige Anordnung für die Diels-Alder-Reaktion gelangten, der Templat- Duplex dagegen sterisch weniger gut zur Assoziation geneigt war. Dies würde nämlich eine relative Stabilitätssteigerung des termolekularen Komplexes gegenüber dem Templat-Duplex bewirken, was dann auch über die Theorie eine derart hohe autokatalytische Reaktionsordnung erklären würde. Die prinzipielle Möglichkeit, exponentielles Wachstum zu erreichen, war jedenfalls durch dieses Experiment absehbar. & & 35

40 Das System Cy3-Cy5 Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Allgemeine physikalische Zusammenhänge Bei FRET [84] handelt es sich um den strahlungsfreien Energietransfer von einem Fluoreszenz-Donor auf einen Akzeptor, der seinerseits ebenfalls ein Fluorophor sein kann, nicht aber notwendigerweise sein muss. Wesentliche Beiträge für das Verständnis vom zugrundeliegenden Mechanismus lieferte Th. Förster Ende der 40er Jahre [85]. Den Prozess kann man am besten über ein Jablonski-Termschema veranschaulichen. Zunächst werden die elementaren photochemischen Prozesse allgemein dargestellt (Abb. 30): (QHUJLH Singulett-Termsystem Triplett-Termsystem 95 6,& $EVRUSWLRQ,& 95,6& 6,6& ) ÃÃ Ã9LEURQLVFKHÃ5HOD[DWLRQ,&ÃÃÃ Ã,QWHUQDOÃ&RQYHUVLRQ,6&Ã Ã,QWHUV\VWHPÃ&URVVLQJ )ÃÃÃÃÃ Ã)OXRUHV]HQ] 3ÃÃÃÃÃ Ã3KRVSKRUHV]HQ] $EE-DEORQVNL7HUPVFKHPDYRQ6LQJXOHWWXQG7ULSOHWW7HUPV\VWHP Dabei ist in klassischer Darstellungsweise das Singulett-Termsystem links, das Triplett-Termsystem rechts abgebildet. Zur Veranschaulichung des FRET betrachtet man günstigerweise lediglich ein Termsystem (gewöhnlich Singulett), stellt aber Donor und Akzeptor nebeneinander dar (Abb. 3): (QHUJLH 'RQRU6LQJXOHWW7HUPV\VWHPÃÃÃÃÃÃÃÃÃÃÃÃÃÃÃÃÃÃÃÃÃÃ$N]HSWRU6LQJXOHWW7HUPV\VWHP 6 )5(7 6 ) ) 6 6 $EE)5(7LP-DEORQVNL7HUPVFKHPD 6 Die oben abgebildeten Termschemata stellen demnach völlig verschiedene Prozesse zwischen verschiedenen Spezies dar. 36

41 Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer Durch den strahlungslosen Energietransfer vom Donor auf den Akzeptor bildet sich ein weiterer Mechanismus aus, über den der Donor seine Anregungsenergie an die Umgebung abgeben kann. Dadurch wird seine eigene Fluoreszenzausbeute vermindert. Der Akzeptor hingegen wird durch den Energietransfer erst angeregt (sensibilisiert), da die Wellenlänge des eingestrahlten Lichtes im Absorptionsspektrum des Donors, nicht aber des Akzeptors liegt. Handelt es sich beim Akzeptor wie in Abb. 3 ebenfalls um einen Fluoreszenzfarbstoff, so ist eine Möglichkeit, wie der Akzeptor nun seine Anregungsenergie an die Umgebung abgeben kann, die induzierte Fluoreszenz seinerseits. FRET schwächt somit die Fluoreszenz des Donors und induziert die Fluoreszenz des Akzeptors. Wie bereits eingangs erwähnt können aber auch Akzeptoren verwendet werden, die selbst keine Fluorophore sind. In diesem Fall wird dann lediglich die Fluoreszenz des Donors geschwächt. Allgemein gibt es fünf verschiedene Messmethoden, wie der FRET gemessen werden kann: Abnahme der Donor-Fluoreszenzintensität oder Quantenausbeute Zunahme der sensibilisierte, Fluoreszenzintensität des Akzeptors Abnahme der Fluoreszenzlebensdauer des Donors Abnahme der Geschwindigkeit von Fluoreszenzbleichung des Donors Änderung der sensibilisierten Fluoreszenzlebensdauer des Akzeptors Während die Methoden. und. mit einem gewöhnlichen steady-state-fluorimeter durchgeführt werden können, sind für die Methoden 3. bis 5. aufwendigere zeitabhängige und meist auf Laserpulsen basierende Messverfahren notwendig. Eine wesentliche Eigenschaft eines in Fluoreszemzresonanz stehenden Systems ist die Tatsache, dass die Effizienz des Energietransfers eine Funktion des Abstandes zwischen Donor und Akzeptor ist: E = 6 *OHLFKXQJ R R0 Darin bedeuten E die Effizienz des Energietransfers, R den Abstand zwischen Donor und Akzeptor und R 0 eine spezifische Konstante, die für jedes Donor-Akzeptor-Paar verschiedene Werte annimmt. Gewöhnlich liegen die Werte von R 0 im Bereich von bis 0nm. R 0 ist demnach der Abstand, bei dem die Effizienz des Energie-Transfers genau 50% beträgt. Aufgrund der reziproken Abhängigkeit der Effizienz von der sechsten Potenz des Abstandes ergibt sich grafisch folgender Zusammenhang für ein System mit R 0 = 5nm: Effizienz von FRET bei R 0 = 5.0nm Abstand R [nm] $EE'LH$EKlQJLJNHLWGHU(IIL]LHQ]GHV)5(7YRP$EVWDQG]ZLVFKHQ'RQRUXQG$N]HSWRU 37

42 Das System Cy3-Cy5 Man erkennt deutlich, dass bei Abständen, die signifikant größer sind als R 0, die Effizienz rasch abnimmt. Dies stellt dann hohe Anforderungen an die Empfindlichkeit des Messverfahrens. Prinzipiell lassen sich mit Hilfe von FRET die Abstände zwischen Donor und Akzeptor bei bekannten Parametern der Farbstoffe absolut bestimmen. In der vorliegenden Arbeit wurden jedoch lediglich Relativmessungen durchgeführt, so dass auf eine detailierte Abhandlung über die Verfahren zur Absolutmessung verzichtet werden kann. Entfernungen von bis 0nm werden auf molekularer Ebene nur bei Makromolekülen erreicht, aus diesem Grunde ist auch verständlich, warum die Messung von FRET hauptsächlich Anwendung in den Polymer- und den Biowissenschaften findet. Strukturelle und kinetische Untersuchungen an Nukleinsäuren wurden auf verschiedene Weise mit Hilfe zum FRET befähigter Farbstoffpaare umgesetzt. Einige ausgewählte Beispiele aus neuerer Zeit sind im folgenden kurz aufgeführt: Die Helicalität von DNA-Doppelsträngen wurde durch Messung der 5-5 -Abstände in einer Serie von Sequenzhomologen zunehmender Länge veranschaulicht [86]. Auch die Stereochemie der Helicalität konnte über FRET gezeigt werden [87]. DNA- Junctions [88] und auch andere tetramere Überstrukturen (i-motif) [89] wurden untersucht und durch Abstandsmessungen charakterisiert. FRET zur Untersuchung kinetischer Phänomene wurde bisher in einigen Systemen aus Proteinen, DNA und RNA eingesetzt. So untersuchte man die Kinetik einer Restriktionsendonuklease unter Echtzeitbedingungen [90], indem man Donor und Akzeptor am 5 - bzw. 3 -Ende einführte und die Abnahme des FRET mit der Zeit beobachtete. In einem anderen Experiment konnte die durch eine Helicase katalysierte Aufwindung der Spiralisierung beobachtet werden [9]. Auch die Spaltreaktion von RNA durch ein synthetisches Hammerhead-Ribozym konnte beobachtet werden [9]. Ähnlich wie auch bei der kinetischen Untersuchung der Restriktionsendonukleasen wurde dabei die Abnahme des FRET duch Spaltung eines terminal mit Donor und Akzeptor gelabelten Substrates untersucht. Auch die Ausbildung von Tripelhelices wurde kinetisch und thermodynamisch über FRET-Messungen analysiert [93]. Dazu wurde das eine 5 -Ende eines DNA-Duplexes mit dem Donor, das 5 -Ende eines Einzelstranges mit dem Akzeptor gelabelt. Der thermisch induzierte Triplex-Duplex-Übergang konnte so beobachtet werden. Thermodynamische Daten der Assoziation wurden durch Vergleichsmessungen gewonnen [94] ; ein mit Donor und Akzeptor an den 5 -Enden gelabelter Duplex, der in seiner Sequenz Mismatches, modifizierte Basen, Deletionen oder Bulged bases enthielt, wurde mit Einzelsträngen titriert, die weder Akzeptor noch Donor enthielten, aber zu einer der beiden Sequenzen im Doppelstrang exakt komplementär waren. In Konkurrenz zum FRET-aktiven Duplex konnten sich auf diese Weise andere Duplexe ausbilden, wodurch die FRET-Effizienz geschwächt wurde. Eine thermodynamische Analyse der Daten lieferte die Assoziationsparameter. Das Donor-Akzeptorpaar Cy3-Cy5, welches in der vorliegenden Arbeit verwendet wurde, kam bisher vorwiegend in fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen (Lokalisationsstudien) zur Anwendung [95]. Das System Cy3-Cy5 Bei diesen beiden Fluorophoren handelt es sich um Cyaninfarbstoffe, die sich strukturell nur in einer Vinylgruppe unterscheiden. Die Zahlen 3 und 5 stehen für die Anzahl der Kohlenstoffatome, die zwei N-alkylierte 3,3-Dimethylindol-Reste miteinander verbinden. 38

43 Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer 3 & 3 & $EE'LH6WUXNWXUHQYRQ&\XQG&\LQGHUNRPPPHU]LHOO HUKlOWOLFKHQ)RUPDOV007JHVFK W]WH3KRVSKRUDPLGLWH Cy3 hat ein Absorptionsmaximum bei 548nm und erscheint damit rosa, Cy5 absorbiert im Bereich von 644nm und ist somit blau. Beide Farbstoffe zeichnen sich durch große molare Extinktionskoeffizienten aus, über deren Beträge in der Literatur jedoch recht unterschiedliche Werte angegeben werden. Die Fa. Pharmacia Amersham, bei der die entsprechenden Phosphoramidite bezogen wurden, gibt für die Extinktionskoeffizienten von Cy und von Cy bezogen auf die jeweiligen Absorptionsmaxima in Wasser an [96]. In der Literatur sind mitunter für sehr verwandte Derivate mit geringfügigen Modifikationen in der Seitenkette des N-Alkylrestes am Stickstoff des Indolsystems sehr verschiedene Werte angegeben; da sie im Verlauf der durchgeführten Experimente von großer Bedeutung sind, seien die Werte an dieser Stelle tabelliert: ε (Cy3) [lmol - cm - ] ε (Cy5) [lmol - cm - ] Quelle (λ max ) (λ max ) [96] (λ max ) 5000 (λ max ) [97] 4000 (54nm, 0000 (64nm, MeOH) [98] EtOH) 0000 (635nm, MeOH) 5000 (64nm, EtOH) (λ max ) 5000 (λ max ) [95a] Der Wert für R 0 im FRET-System aus Cy3 als Donor und Cy5 als Akzeptor wird mit 5nm angegeben [95a]. Weitere Details zum System Cy3-Cy5 werden an anderer Stelle behandelt. Die Synthese von Oligonukleotiden an der Festphase [ 99] Das Verfahren allgemein Synthetisch erhält man DNA-Polymere über reaktive, geschützte Monomerbausteine, die Phosphoramidite [00] (63), in der folgenden Abbildung am Beispiel des Adenosins gezeigt: 39

44 Das Verfahren allgemein '076FKXW]JUXSSH 0H 0H %HQ]R\O6FKXW]JUXSSH & &\DQRHWK\O6FKXW]JUXSSH 3 $EE.RPPHU]LHOOHUKlOWOLFKHYROOVWlQGLJJHVFK W]WH3KRVSKRUDPLGLWH I UGLH'$6\QWKHVHDP%HLVSLHOGHV$GHQLQLQV Die DNA-Synthese erfolgt zumeist an der Festphase. Dabei wird zunächst die erste Base des zu synthetisierenden DNA-Stranges an einer Festphase über einen Linker immobilisiert. Danach geht man wie folgt vor: & '07 % 3 ÃYROOVWlQGLJH 'HEORFNLHUXQJ OLJRQXFOHRWLG '07 % Ã[LGDWLRQ, % '07 % Ã'HWULW\OLHUXQJ &&O & & 3 ÃÃ % % &.HWWHQDEEUXFK % Ã&DSSLQJ $F Ã.RSSOXQJ 7HWUD]RO & '07 % 3 $EE'DVDXWRPDWLVLHUWH6\QWKHVHYHUIDKUHQYRQ'$DQGHU)HVWSKDVH Die Dimethoxytritylschutzgruppe (DMT-Schutzgruppe) ist anders als die anderen verwendeten Schutzgruppen im Sauren abspaltbar (Orthogonalitäts-Prinzip). Das an der Festphase immobilisierte Nukleotid 64 kann daher unter Einwirkung von Dichloressigsäure deblockiert werden. Das entstehende DMT-Kation absorbiert bei 500nm mit hoher Extinktion und lässt sich somit im UV/VIS-Spektrometer vermessen. So können später die Kopplungsausbeuten quantitativ durch relativen Extinktionsvergleich nach den sequentiellen Kopplungsschritten bestimmt werden. 40

45 Die Synthese von Oligonukleotiden an der Festphase Anschließend wird die am 5 -Ende deblockierte Verbindung 65 mit dem Phosphoramidit der gewünschten Nukleobase und einem Aktivator (z.b. Tetrazol) umgesetzt. Dabei nutzt man die Tatsache, dass die P-O-Bindung stabiler ist als die P-N-Bindung, so dass ein Triester unter Abspaltung der Diisopropylaminogruppe entsteht. Durch die größere Reaktivität des dreiwertigen Phosphors gegenüber dem fünfwertigen verläuft die Reaktion in kurzer Zeit nahezu quantitativ. Natürlich beträgt die Kopplungsausbeute mit dem Phosphoramidit 66 nicht exakt 00%, sondern in der Regel nur ca. 99%. Deshalb werden die noch verbliebenen Hydroxygruppen (entsprechend ca. %) mit Acetanhydrid acyliert, man spricht vom Capping. Dabei werden die sogenannten Deletionsmutanten 69 an der weiteren Reaktion in nachfolgenden Zyklen gehindert. Sie müssen nach der Gesamtsynthese vom gewünschten Reaktionsprodukt abgetrennt werden. Der dreiwertige Phosphor in Verbindung 67 muss nun noch zum fünfwertigen oxidiert werden. Dies geschieht meist mit wäßriger Iodlösung. Anschließend kann man die DMT-Schutzgruppe von 68 wieder im Sauren abspalten, die Kopplungsausbeute im UV bestimmen und so den Zyklus beliebig fortsetzen. Hat man die gewünschte Sequenz synthetisiert, spaltet man das Oligonukleotid 70 von der Festphase ab. Dazu muss zwischen dem Oligonukleotid und der Festphase natürlich eine geeignete Spaltstelle vorhanden sein. Meist verwendet man Linker, die sich in ammoniakalischer Lösung zersetzen, da sich die noch vorhandenen Schutzgruppen am Phosphor und an den Aminogruppen der Nukleobasen ebenfalls unter diesen Bedingungen abspalten lassen (Umamidierung). Abschließend erfolgt in der Regel eine chromatografische Reinigung des Syntheseproduktes. Je nach Nukleobase müssen die exozyklischen Aminogruppen des Adenins, Guanins und Cytosins verschiedenartig geschützt werden. Für Standardsynthesen verwendet man dazu kommerziell erhältliche Phosphoramidite, bei denen die Nukleobasen die folgenden Schutzgruppen tragen: Benzoyl für Adenin (7) und Cytosin (7), Isobutyryl für Guanin (73). Diese Schutzgruppen wie auch die 5 -DMT- Schutzgruppe gehen auf Arbeiten von Khorana in den frühen 60er Jahren zurück [0] : $EE'LHI UJHZ KQOLFKYHUZHQGHWHQ6FKXW]JUXSSHQGHUH[R]\NOLVFKHQ$PLQRIXQNWLRQHQ Synthese spezieller Derivate Für Synthesen von DNA-Derivaten, die funktionelle Gruppen tragen, welche den relativ drastischen Entschützungsbedingungen (z.b. 85 C, konz. NH 4 OH, h) nicht standhalten, sind labilere Schutzgruppen entwickelt worden, die unter milderen Bedingungen abgespalten werden können; je nach Hersteller unterscheiden sie sich, so dass meist verschiedenartig geschützte Phosphoramidite für ein Nukleotid erhältlich sind. Für Adenin finden Isobutyryl (74) und Phenoxyacetyl [0] (75) Verwendung, für Cytosin Acetyl (76) und Isobutyryl (77), für Guanin hingegen hat sich 4-iso-Propylphenoxyacetyl (78) als beste Wahl herausgestellt. 4

46 Synthese spezieller Derivate $EE'LHI UPLOGHUH(QWVFK W]XQJVEHGLQJXQJHQNRPPHU]LHOOHUKlOWOLFKHQ6FKXW]JUXSSHQ Die Festphasensynthese erfolgt vom 3 - zum 5 -Ende, also entgegengesetzt zur konventionellen Schreibrichtung der Sequenz. Nach der letzten DMT-Entschützung liegt ein freies 5 -Hydroxyende vor. Soll dieses dagegen eine 5 -Phosphatende tragen, wie es u.a. für viele molekularbiologische Anwendungen notwendig ist, so wird als letztes Phosphoramidit in der Synthesesequenz die kommerziell erhältliche Verbindung 79 eingeführt [03] : & 0H 3 6 0H $EE(LQ5HDJHQV]XU(LQI KUXQJYRQ3KRVSKDWUHVWHQ Wird nach dem Aufbau der Gesamtsequenz und abschließender Detritylierung 80 mit konz. Ammoniaklösung behandelt, so erfolgt an zwei der drei Seitenketten vom 5 - Phosphat eine β-eliminierung unter Freisetzung eines 5 -Phosphorsäuremonoesters 8; Nebenprodukte sind das Vinylsulfon 8 und Acrylnitril (83): % 6 3 % 6 3 % & % & $EE$EVSDOWXQJGXUFKβ(OLPLQLHUXQJDP6XOIRQXQGLWULO Auf ähnlichem Wege geht man vor, wenn man den 3 -Terminus des zu synthetisierenden Oligonukleotids mit einem Phosphatrest versehen möchte. Für die Synthese der 3 -Hydroxy-Derivate 85 stehen kommerzielle Festphasen 84 zur Verfügung, an die eines der vier Nukleotide bereits über einen Ester mit der 3 - Hydroxygruppe verknüpft ist [04]. In der Regel handelt es sich dabei um einen Ester einer ω-disäure (z.b. Bernsteinsäure), die am anderen Carboxyende mit Hilfe eines Aktivierungsreagenz (DCC, TBTU, etc.) an eine primäre Aminogruppe eines festen Trägermaterials gebunden wird [05]. Dieser Ester lässt sich dann am Ende der Gesamtsynthese mit konz. Ammoniaklösung spalten, wodurch eine freie 3 - Hydroxygruppe entsteht. 4

47 Die Synthese von Oligonukleotiden an der Festphase % % $EE'LH(U]HXJXQJYRQµ\GUR[\JUXSSHQ Festphasen zur Synthese von 3 -Phospho-Oligonuleotiden [06] sind dagegen ähnlich modifiziert wie das Reagens 79 zur Einführung von Phosphatresten am 5 - Terminus [07]. Die Beladung der Festphase 88 wird zunächst durch Detritylierung ermittelt. Nun erfolgt sequentieller Aufbau der Gesamtsequenz mit Hilfe von Phosphoramiditen 66. Der 3 -Phosphatterminus von 9 wird dann durch ammoniakalische Behandlung ebenfalls im Sinne einer β-eliminierung freigesetzt. ' '07 % & 3 % '07 % & % 3 6 % & 3 6 $EE'LH(U]HXJXQJYRQµ3KRVSKDWJUXSSHQ 43

48 Aufgabenstellung Aufgabenstellung Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Bausteine selbstreplizierender Systeme, aufgebaut aus selbstkomplementären Deoxynukleotiden, derart mit zwei Fluorophoren zu markieren, dass die Replikationskinetik über Messungen von FRET verfolgt werden konnte. Bisher waren die Experimente zur Selbstreplikation von Oligonukleotiden durch RP- HPLC analysiert worden. Dieses Verfahren hatte den Nachteil, dass durch die Methode an sich die Anzahl der Messpunkte für die Kinetik begrenzt war. Zusätzlich kamen experimentelle Fehlerquellen hinzu, da die Reaktionslösung zu Beginn der Kinetik auf Kapillaren eines definierten Volumens (in der Regel µl) aufgeteilt wurde, und diese Partitionen der Gesamtlösung nach verschiedenen Zeiten um den Faktor 000 verdünnt wurden. Somit wurde die Reaktion quasi abgebrochen und die verdünnte Lösung in der HPLC nach und nach analysiert. Die Dauer der HPLC- Elutionsprogramme (in der Regel 30 Minuten und mehr) limitierte die Zahl der möglchen Messpunkte. Ein auf FRET-Messungen aufbauendes Verfahren sollte schneller mehr Messpunkte liefern, wenn es ebenfalls nach diesem Verfahren der Kapillartechnik arbeiten würde. Ein Messwert pro Kapillare sollte in einer Küvette vermessen in wenigen Sekunden oder Minuten zugänglich sein. Im Idealfall sollten sogar Online-Kinetiken möglich sein, aber nur für den Fall, dass Bedingungen gefunden werden könnten, bei denen sowohl die Kinetik kontrolliert ablaufen und die Fluoreszenzmessung fehlerfrei durchgeführt werden könnte. Für einen solchen Fall wären dann die zusätzlichen Fehlerquellen der Kapillartechnik eliminiert (Handhabung der Kapillaren, Verdunsten von Lösungsmittel aus den Kapillaren, Integration der Elutionsdiagramme, Injektion der Substanz auf die HPLC-Säule, etc.), und auch Parallelmessungen auf Mikrotiterplatten wären denkbar. Eine getrennte Durchführung von Kinetik und Messung hatte dennoch den offensichtlichen Vorteil, dass beide Aspekte der Methode unter jeweils für sich optimierten und relativ unabhängigen Bedingungen durchgeführt werden konnten. Aufbauend auf den detailierten Untersuchungen zur selbstkomplementären Sequenz d(ccgcgg) sollte die Sequenzlänge dabei sukzessive erhöht werden, wodurch drei neue Replikatoren verschiedener Größe entstehen sollten, ein [4,4]-[8]-, ein [5,5]- [0]- und ein [6,6]-[]-System. 44

49 Planung der erforderlichen Synthesen Allgemeiner Teil Planung der erforderlichen Synthesen Da für die Realisierung der Systeme einige chemische Derivatisierungen an den Nukleinsäuren notwendig waren, sollten einige der Sequenzen, welche nicht durch kommerziell erhältliche Phosphoramidite synthetisiert werden konnten, für alle drei Systeme in einer Serie manuell hergestellt werden. Die Darstellung der übrigen Bausteine sollte am DNA-Synthesizer erfolgen. Bei der kinetischen Untersuchung sollte man sich im Rahmen der vorliegenden Arbeit jedoch lediglich auf das [4,4]-[8]-System beschränken, die übrigen Systeme sollten später untersucht werden [08]. Die Sequenzen der drei Systeme wurden wie folgt festgelegt: System Edukt Edukt Templat [4,4]-[8] d(tccg) d(cgga) d(tccgcgga) [5,5]-[0]: d(ttccg) d(cggaa) d(ttccgcggaa) [6,6]-[]: d(tttccg) d(cggaaa) d(tttccgcggaaa Die Wahl dieser Sequenzen hatte verschiedene Vorteile: In allen drei Systemen waren die Enden der Sequenzen jeweils durch die gleichen Nukleotide flankiert. Chemische Modifikationen, die für eine angestrebte Ligationschemie notwendig waren, konnten somit durch geringeren synthetischen Aufwand realisiert werden, da immer nur ein Deoxynukleotid chemisch modifiziert werden musste. Die Verwendung der bewährten Core-Sequenz d(ccgcgg) sollte zu stabilen Komplexen führen, deren Tendenz zur Ausbildung von Hairpins vermindert sein sollte. Da zwischen C und G jeweils drei Wasserstoffbrückenbindungen ausgebildet werden, zwischen A und T dagegen nur zwei, sollte die Core-Sequenz die Komplexe zentral zusammenhalten. Im Hairpin können sie Nukleobasen, welche in der Region der Rückfaltung liegen, nicht miteinander paaren. Sequenz 9 sollte demnach weniger zur Ausbildung von Hairpins neigen als Sequenz 93: * & & 7 7 $ $ $EE*CKRKPUXU'XSOH[ Die Verwendung flankierender A-T-Basenpaare sollte zu einer geringeren Anhebung der Schmelztemperatur der Duplexe führen, als es bei Verwendung von weiteren C- G-Basenpaaren der Fall wäre. Da die Eignung von EDC in Ligationsexperimenten wegen auftretender Nebenreaktionen nicht bei Temperaturen oberhalb von ca. 45 C gegeben ist [09], musste ein Kompromiss zwischen Verlängerung der Sequenz und Schmelztemperatur eingegangen werden. Durch die Verwendung selbstkomplementärer Sequenzen war ein ausgewogenes Verhältnis zwischen Purinen und Pyrimidinen gewährleistet. 45

50 Planung der erforderlichen Synthesen Als Ligationsreaktion sollte die EDC-vermittelte Kondensation eines 5 -Aminoendes mit einem 3 -Phosphat erfolgen. Die nukleophilen Sequenzen d(cgga), d(cggaa) und d(cggaaa) mussten daher am 5 -Ende eine Aminogruppe tragen (94a bis 94c), die elektrophilen Bausteine d(tccg), d(ttccg) und d(tttccg) entsprechend am 3 -Ende eine Phosphatgruppe (95a bis 95c). Als Fluorophore sollten Cy3 und Cy5 dienen, die als Phosphoramidite kommerziell erhältlich sind. Ihre Einführung in die Sequenz kann prinzipiell sowohl am 3 - als auch am 5 -Terminus erfolgen. Der R 0 -Wert und die prinzipielle Eignung zur Erzeugung FRET-aktiver Spezies waren zu diesem Zeitpunkt bekannt. Als Vorteil dieser Fluorophore wurde ihre enge strukturelle Verwandtschaft und ihre gleiche Ladung angesehen. Es musste davon ausgegangen werden, dass bei den vergleichsweise kurzen DNA-Sequenzen die chemische Natur des Farbstoffs Einfluss auf die Assoziationstendenz mit komplementären Oligonukleotiden hatte (möglicherweise Intercalation, Rückfaltung der positiven Ladung auf die Phosphat-Backbone, etc.). Ein in der Literatur wesentlich häufiger verwendetes und somit auch detailierter beschriebenes Farbstoffpaar aus Fluorescein (96) und Tetramethylrhodamin (97) hingegen, beide ebenfalls in Form der Phosphoramidite kommerziell erhältlich, sollte den Nachteil verschiedener Ladung haben, was sich verschiedenartig auf die Komplexstabilität auswirken könnte. & & & & & & $EE'LHDOWHUQDWLYHQ)OXRURSKRUH)OXRUHVFHLQXQG7HWUDPHWK\OUKRGDPLQ Hinzu kam, dass die Carboxylatgruppe dieser Farbstoffe, die im Gleichgewicht mit einer lactoiden Form steht, Nebenreaktionen bei der EDC-vermittelten Ligation eingehen kann, da der Carboxylatrest ebenfalls durch EDC aktiviert werden kann [0]. Zusätzlich war die Lichtstabilität von Cy3 und Cy5 über längere Zeiträume bekannt, was ebenfalls als Vorteil gewertet werden konnte. Die Fluoreszenzausbeute war mit ca. 0.3 zwar deutlich geringer als die von Fluorescein (ca. 0.9), dieser Nachteil sollte aber durch eine Erhöhung der Empfindlichkeit am Messgerät kompensiert werden können. Ein geeignetes Labeling für die kinetische Verfolgung des selbstreplizierendes System war an zwei wesentliche Bedingungen geknüpft: Das Labeling musste eindeutig erfolgen, in allen FRET aktiven Spezies sollten Donor und Akzeptor den gleichen Abstand zueinander einnehmen. Der zu erwartende Abstand von Donor und Akzeptor sollte in einem Bereich von R 0 = 5nm liegen, um eine ausreichende Effizienz des Energietransfers zu gewährleisten. Es war offensichtlich, dass ein kombiniertes 3-5 -Labeling (Abb. 44) der beiden Eduktbausteine, also vom Aminobaustein 94c am 3 -Ende und vom Phosphatbaustein 96c am 5 -Ende, durch die Reaktion zum Einzelstrang 98 problematisch war, da dann im mit dem Einzelstrang im Gleichgewicht befindlichen Duplex 99 durch die antiparallele Anordnung die verschieden gelabelten Sequenzenden in größere Nähe kommen würden, als sie es kovalent im nicht zum Duplex assoziierten 46

51 Planung der erforderlichen Synthesen Einzelstrang 98 könnten. Es würden zwei verschiedene Abstände zwischen Donorund Akzeptormolekülen entstehen, wodurch der FRET nicht mehr eindeutig zugeordnet werden könnte. G &\ 777&&*SÃ ÃÃÃÃÃÃÃÃÃ ÃÃG Q &**$$$ &\ ÃÃÃÃÃÃÃÃÃÃG &\ 777&&*&**$$$ &\ [ G &\ 777&&*&**$$$ &\ G &\ $$$**&*&&777 &\ F F $EE'LHYHUVFKLHGHQHQ$EVWlQGHYRQ'RQRUXQG$N]HSWRUEHL0DUNLHUXQJEHLGHU(GXNWEDXVWHLQH Ein FRET im Templat-Duplex wäre zwar prinzipiell auch hier als Relativmessung beobachtbar, nach der Theorie sollte die Effizienz sogar viel größer sein, aber möglicherweise käme es hier wegen des sehr geringen Abstandes bereits zum Fluoreszenzquenching, da die Orbitale wegen ihrer räumlichen Nähe bereits überlappen könnten. Ein Ausweg aus diesem Dilemma wäre prinzipiell die Messung der Fluoreszenz unter stark denaturierenden Bedingungen (z.b. Zusatz von Harnstoff, Formamid, NaOH oder durch hohe Temperatur), wenn man zu bestimmten Zeiten definierte Volumina der Kinetiklösung entnehmen und diese dann unter denaturierenden Bedingungen vermessen würde; Online-Messungen würden dann allerdings von vornherein ausgeschlossen werden. Eine andere mögliche Form der Markierung basierte jedoch auf dem Labeling nur eines Eduktbausteins und des Templates. In diesem Fall konnte FRET-Aktiviät zwar nur im Duplex (oder termolekularen Komplex) beobachtet werden, nicht aber im Einzelstrang; dies sollte jedoch für die Verfolgung der Kinetik vollkommen ausreichend sein. Wie bereits erwähnt, lassen sich die Cyaninfarbstoffe prinzipiell sowohl am 3 - als auch am 5 -Ende einführen. Für die Vermessung der Kinetik erschien dies unerheblich, daher entschied man sich für ein 5 -Labeling, da dies rein präparative Vorteile hatte: Die Cyaninfarbstoffe sollten dem Molekül in der RP-HPLC einen deutlichen lipophilen Shift verleihen, wodurch eine Abtrennung von den Deletionsmutanten erleichtert sein sollte. Da beim 5 -Labeling nur Deletionsmutatnten ohne Fluorophor entstehen (Synthese von 3 - in 5 -Richtung), erschien diese Vorgehensweise sinnvoll. Da Amidite, die sich nicht von Nukleotiden ableiten, am Synthesizer häufig mit verminderter Ausbeute in die Sequenz eingebaut werden [], war eine 5 - Markierung bezüglich der Gesamtausbeute ökonomischer. Da der Aminoterminus am 5 -Ende der nukleophilen Bausteine 94a bis 94c ebenfalls durch ein zuvor zu synthetisierendes Phosphoramidit eingeführt werden musste, sollte die Effizienz dieser Synthesen nicht zusätzlich durch den Nachteil einer gleichzeitigen 3 -Markierung mit einem schlechter reagierenden Farbstoff- Phosphoramidit belastet werden. Im Falle eines 5 -Labelings erfolgte die Markierung des entsprechend anderen Eduktbausteins 96a bis 96c. Es blieb die Frage zu klären, ob bei terminaler Markierung der Moleküle der Abstand von Donor und Akzeptor im Templatduplex ausreichend klein sein sollte, um eine messbare FRET-Effizienz zu ermöglichen. Dazu modelierte man die zu erwartenden Komplexe auf der Grundlage einer B-DNA-Struktur mit dem Computer. Als Gesamtstruktur des Duplexes für das [4,4]-[8]-System erhielt man (als wenig differenzierte) (MM)-Rechnung folgende Struktur (es handlete sich dabei lediglich 47

52 Planung der erforderlichen Synthesen um eine Veranschaulichung der Größenverhältnisse im Gesamtmolekül zwischen Farbstoffen und Doppelhelix): Als mittlerer Abstand der 5 -Phosphatgruppen im Duplex wurde durch HyperChem Tm eine Distanz von 3.nm angegeben. Der R 0 -Wert des Sytems Cy3-Cy5 beträgt im Vergleich dazu 5.0nm. Der Abstand der zentralen Kohlenstoffatome im konjugierten Cyanin betrugt 4.nm. Für die Annahme, dass der mittlere Abstand beider Farbstoffe im Bereich zwischen 3.5 und 4.5nm liegen sollte, ergibt sich nach Förster folgender Zusammenhang:.0 Effizienz des FRET für R 0 = 5nm Abstand Cy3 zu Cy5 [nm] $EE'LH]XHUZDUWHQGH)5(7(IIL]LHQ]I U$EVWlQGHYRQELVQPXQG5 QP Man erkennt deutlich, dass im gewählten System die Effizienz des Energietransfers im Bereich von 70 bis 90% liegen sollte. Auch für die anderen beiden Systeme ([5,5]- [0] und [6,6]-[]) erhielt man theoretische Distanzen, die noch deutlich im messbaren Bereich liegen sollten. Zunächst war es nach dem Kenntnisstand gleichgültig, welcher Baustein mit dem Donor (Cy3), welcher mit dem Akzeptor (Cy5) markiert werden sollte. Da für Kalibrierzwecke ohnehin der entsprechend anders markierte Templatbaustein 48

53 Planung der erforderlichen Synthesen benötigt wurde, um gewissermaßen das Ligationsprodukt zu simulieren, wurden alle vier Derivate synthetisiert. Man gelangte somit zu den folgenden Molekülen, die für eine Realisierung der drei selbstreplizierenden Systeme notwendig waren: Aminobausteine: Phosphatbausteine: mit Cy3 markiert mit Cy5 markiert Templatmoleküle: mit Cy3 markiert G Q &**$G Q &**$$G Q &**$$$ D E F G &\ 7&&*SÃÃÃÃÃÃG &\ 77&&*SÃÃÃÃÃÃÃÃÃG &\ 777&&*S D E F G &\ 7&&*SÃÃÃÃÃÃG &\ 77&&*SÃÃÃÃÃÃG &\ 777&&*S D ÃÃÃ E F G &\ 7&&*&**$G &\ 77&&*&**$$G &\ 777&&*&**$$$ DEF mit Cy5 markiert G &\ 7&&*&**$G &\ 77&&*&**$$G &\ 777&&*&**$$$ DEF Da kinetisch zunächst lediglich das [4,4]-[8]-System untersucht werden sollte und die Moleküle 96b, 96c, 00b, 00c, 0b und 0c kurzfristig am DNA-Synthesizer hergestellt werden können, beschränkte man sich auf die Synthese aller drei Aminobausteine 94a bis 94c und der Phsophat- und Templatmoleküle des [4,4]-[8]- Systems 96a, 00a, 0a und 0a. Das selbstreplizierende [4,4]-[8]-System mit der einen Realisierungsmöglichkeit der Markierung des Templates mit Cy3 und der des Phosphatbausteins mit Cy5 ist in folgender Abbildung zur Veranschaulichung dargestellt:.. D D D D $EE'DV>@>@6\VWHPPLWJHHLJQHWHP)OXRUHV]HQ]ODEHOLQJ 49

54 5 -Amino-C-Phosphoramidit Aus diesem Replikationsschema ist unmittelbar ersichtlich, dass durch die Ligationsreaktion fortlaufend 0a aus 94a und 00a nachgebildet wird, die Menge an 0a aber konstant bleibt. Dies hat aber zur Folge, dass drei verschiedene Duplexe miteinander im Gleichgewicht stehen, deren Population sich mit fortschreitender Reaktion sowohl insgesamt als auch relativ zueinander verändert. Lediglich der heteromolekulare Templat-Duplex in der Mitte aus 0a und 0a ist jedoch in der Lage, FRET auszubilden. D D D D D D $EE'LHP JOLFKHQ7HPSODW'XSOH[HLP>@>@6\VWHP Die Selbstassoziation der Templatmoleküle, beschrieben durch die Gleichgewichtskonstante K, welche für das im allgemeinen unerwünschte parabolische Wachstum derartiger selbstreplizierender Systeme verantwortlich ist, machte man sich also hier gewissermaßen als FRET-Sonde zunutze. Zunächst mussten einige Nukleoside derivatisiert werden, ehe sie als Phosphoramidite in die entsprechenden Oligonukleotidsequenzen eingebaut werden konnten. Auch war bestimmten Fällen chemische Modifikation der festen Trägermaterialien notwendig. Synthese der derivatisierten Monomerbausteine und Festphasen 5 -Amino-C-Phosphoramidit Um die 5 -Aminogruppe des Cytidins in den nukleophilen Bausteinen 94a bis 94c einführen zu können, wurde ein entsprechend modifiziertes Phosphoramidit [] synthetisiert, das dann zusammen mit den anderen, kommerziell erhältlichen Amiditen manuell an eine geeignete Festphase gekoppelt wurde. Man ging dazu von käuflichem -Deoxycytidin (03) aus, welches zunächst an der Nukleobase mit einer Benzoylschutzgruppe blockiert wurde. Dazu wurden die Hydroxygruppen vorübergehend mit Trimethylsilylgruppen geschützt und dann die exozyklische Aminogruppe der Nukleobase mit Benzoylchlorid umgesetzt [3]. Das Amid 04 konnte auskristallisiert werden. &O & 6L&O & 6L & & 6L & & & $EE'DVÄVTCPUKGPVRTQVGEVKQP³(LQWRSI9HUIDKUHQQDFK,QPGUGDUJHVWHOOW DP%HLVSLHOGHVµ'HR[\EHQ]R\OF\WLGLQV 50

55 Synthese der derivatisierten Monomerbausteine und Festphasen Nun konnte über eine Variante der Appel-Reaktion [4] ein Azidrest am 5 -Teminus eingeführt werden [4b], ohne dass die sekundäre 3 -Hydroxygruppe geschützt werden musste. Anschließend wurde das Azid 05 nach Staudinger mit Triphenylphosphin zum Amin 06 reduziert [5]. 33K Ã&%U Ã/L 33K $EE$]LGLHUXQJXQG5HGXNWLRQ]XP$PLQDPµ7HUPLQXVGHVEHQ]R\OJHVFK W]WHQ&\WLGLQV Als Schutzgruppe hatte man zwei Alternativen zur Auswahl. Als säurelabile Schutzgruppe war die Monomethoxytriphenylmethyl-Schutzgruppe (MMT) in der Literatur beschrieben [4b]. Wegen der erhöhten Basizität des 5 -Stickstoffatoms wäre eine DMT-Gruppe ungeeignet, da das abgespaltene Carbokation zu stark resonanzstabilisiert ist und demnach zu leicht in Freiheit gesetzt würde (pk R -.6 für DMT gegenüber 3.46 für MMT [6] ). Als basenlabile Schutzgruppe bot sich zusätzlich die Trifluoracetylschutzgruppe an [7]. Diese war zwar prinzipiell nicht mit dem Standardprotokoll der Festphasensynthese von DNA über das Phosphoramiditverfahren vereinbar, da hier eine säurelabile Gruppe erforderlich ist. Da aber nach Einführung des Aminobausteins kein weiteres Phosphoramidit in die Sequenz eingeführt werden musste, war dies unerheblich, und die Trifluoracetylgruppe konnte zusammen mit den anderen Amiden am Ende der Synthese mit konz. NH 4 OH abgespalten werden. Bei Verwendung eines mit der Trifluoracetylgruppe geschützten Phosphoramidits war die Kopplungsausbeute allerdings prinzipiell nicht mehr UV-spektroskopisch zu ermitteln, während das MMT-Kation eine intensive gelbe Färbung zeigt. 0H 0H &O ) ) ) ) ) ) ) ) ) $EE'LHDOWHUQDWLYHQ6FK W]XQJVVWUDWHJLHQGHVµ$PLQRWHUPLQXV 5

56 Festphase zur Synthese von 3 -Phosphat-Oligonukleotiden Auf diese Weise kam man zu den beiden zweifach geschützten Nukleosiden 07 und 08. Für die Umsetzung zu Phosphoramiditen mußte man zunächst ein Phosphitylierungsreagens 09 aus Phosphortrichlorid (0), 3-Hydroxypropionitril () und Diisopropylamin () herstellen [8]. Dieses konnte dann an die Nukleoside 07 und 08 gekoppelt werden. So gelangte man je nach verwendeter Amino-Schutzgruppe zu den beiden Phosphoramiditen 3 und 4, die dann später in der Festphasensynthese eingesetzt werden konnten. & 6L 6L 6L & &O 3 &O &O &O &O 3 & & &O 3 & $EE6\QWKHVHGHV3KRVSKLW\OLHUXQJVUHDJHQ]XQGDQVFKOLH HQGH.Q SIXQJDQGLHXNOHRVLGH Die Verwendung der Trifluoracetylschutzgruppe war als Alternative aufgeworfen worden, da festgestellt wurde, dass das MMT-geschützte Nukleosid 07 über längere Zeit bei -5 C nicht stabil war. Festphase zur Synthese von 3 -Phosphat-Oligonukleotiden [07] Man stellte entsprechend der nachfolgenden beiden Abbildungen eine modifizierte Festphase her. %U 6 '%8 6 &O 0H 0H 6 0H 0H $EE6\QWKHVHGHVJHVFK W]WHQ7KLRHWKHUVI UGLH)HVWSKDVH Ausgehend von 6-Bromhexansäure (5) und Mercaptoethanol (6) synthetisierte man dazu zunächst den Thioether 7, welcher anschließend am Hydroxyterminus DMT-geschützt wurde. 5

57 Synthese der derivatisierten Monomerbausteine und Festphasen 6 0H 7%78 6 0H 0H 0H D, 6 0H 0H $EE)HUWLJVWHOOXQJGHU)HVWSKDVHI UGLH6\QWKHVHYRQµ3KRVSKRROLJRQXNOHRWLGHQ Die Kopplung des geschützten Thioethers 8 erfolgte an die Festphase Aminopropyl-CPG (9) über eine Amidbindung. Dazu musste die Carboxylgruppe von 8 zunächst aktiviert werden. Man verwendete TBTU als Aktivator. Hierbei handelt es sich um ein sehr mildes Kopplungsreagens für die Amidsynthese. Gelegentlich können die Ausbeuten durch Zusatz von Hydroxybenzotriazol (HOBT) noch weiter erhöht werden. 5& 5 5 %7(VWHU %) $EE5HDNWLRQVPHFKDQLVPXVYHUHLQIDFKWI UGLH7%78YHUPLWWHOWH$PLGELOGXQJ Der Thioether wurde abschließend mit Natriumperiodat zum Sulfon an der Festphase oxidiert, die nach Trocknen über Nacht einsatzbereit war. Synthese von Deoxy-Adenosin als Leader-Nukleosid an Aminopropyl-CPG Im Handel ist Festphasenmaterial erhältlich, welches jeweils eines der vier möglichen Deoxynukleoside über einen Ester am 3 -Ende verknüft enthält. Man spricht in diesem Fall auch von Leader-Nukleosiden. Da dieses Trägermaterial auf der Basis von Polystyrol allerdings so feinkörnig war, dass es mit den Methoden der manuellen Festphasensynthese nicht gehandhabt werden konnte, wurde es notwendig, eine vergleichbare Festphase auf der Basis von Aminopropyl-CPG (9) herzustellen. Die Aminobausteine 94a bis 94c endeten alle in ihrer Sequenz am 3 -Ende auf Adenosin, so dass für alle drei Fälle eine Festphase mit Adenosin als Leader- Nukleosid erforderlich war. 53

58 Synthese von Deoxy-Adenosin als Leader-Nukleosid an Aminopropyl-CPG &O 0H &O 0H 0H 0H 0H 0H $EE6\QWKHVHGHVJHVFK W]WHQ$GHQRVLQVDOV.GCFGTXNOHRVLG Ausgehend von -Deoxyadenosin (3) führte man zunächst die Basenschützung nach Jones mit Benzoylchlorid durch [3]. Dann acylierte man nach 5 -DMT- Schützung [9] die 3 -Hydroxygruppe mit Bernsteinsäureanhydrid [0] und erhielt so Verbindung 6, die man nach Aktivierung am Carboxyterminus mit TBTU (0) an die Aminogruppe der Festphase koppeln konnte (Abb. 57). 0H 7%78 0H 0H $EE.RSSOXQJGHV.GCFGTXNOHRVLGVDQGLH)HVWSKDVH$PLQRSURS\O&3* Synthese eines Butoxyphosphat-Phosphoramidits Dieses Phosphoramidit sollte als lipophiles Shiftreagens für HPLC-Experimente und Schutzgruppe des 5 -Terminus dienen. In Replikationskinetiken, die via HPLC-Messungen ausgewertet werden, ist es wichtig, das durch die Reaktion aus den Edukten hervorgegangene Templat vom initial zugegebenen Templat zu unterscheiden. Dies kann durch Verwendung verschiedener Schutzgruppen am 5 -Terminus geschehen, die im HPLC-Elutionsdiagramm verschiedene retardierende Einflüsse auf die entsprechend markierten Bausteine haben, so dass diese basisliniensepariert eluieren und getrennt integriert werden können. Zwar war eine HPLC-technische Analyse der zu untersuchenden Replikatoren grundsätzlich nicht als Hauptbestandteil der vorliegenden Arbeit angedacht, dennoch war es mitunter recht praktikabel und wenig zeitaufwendig, die Eignung eines Systems für Replikationsexperimente qualitativ über derartige Messungen 0H 54

59 Synthese der derivatisierten Monomerbausteine und Festphasen abzuschätzen eine funktionierende Methode, die auf FRET-Messungen basierte, war zu diesem Zeitpunkt noch nicht bekannt. Zusätzlich war eine freie 5 -Hydroxygruppe in Bezug auf den Angriff an einen EDCaktivierten 3 -Phosphatterminus zwar deutlich weniger nukleophil als eine 5 - Aminofunktion [8], dennoch musste bei freier Hydroxygruppe möglicherweise mit Nebenreaktionen gerechnet werden. Eine lipophile 5 -Schutzgruppe diente also gleichzeitig der Blockierung dieser Funktionalität. Aus diesem Grunde wurde ein entsprechendes Phosphoramidit entwickelt, dessen Kopplungsausbeute zusätzlich über die DMT-Extinktion am Synthesizer ermittelt werden konnte. Ausgehend von n-butanol (8), Phosphortrichlorid (0) und Diisopropylamin () wurde das Chlorphosphit 9 hergestellt, welches anschließend mit einseitig DMTgeschützten bis-hydroxyethylsulfon (30) [03] zum Amidit 3 gekoppelt wurde. &O 0H 3 &O &O &O 6 &O 0H 3 &O 0H 3 &O 0H 6 0H 3 6 0H $EE'LH6\QWKHVHVHTXHQ]]XUHUVWHOOXQJGHV3KRVSKRUDPLGLWV PLWGHPHLQOLSRSKLOHU5HVWDPµ(QGHHLQJHI KUWZHUGHQNRQQWH Mit diesem Phosphoramidit 3 stellte man u.a. am DNA-Synthesizer die folgenden Oligomere her, die man später in qualitativen HPLC_Analysen zur Replikation einsetzte: G EXS 7&&* 3 G EXS 7&&*&**$ Synthese eines alternativen 5 -Iodo-3 -Phosphorothioat-Ligationssystems Die Ligation von Oligonukleotiden mit dem Kopplungsreagens EDC ist nur in einem gemäßigten Temperaturbereich möglich, oberhalb von ca. 45 C scheinen auch die exozyklischen Aminogruppen der Nukleobasen mit den durch EDC aktivierten Phosphatresten zu reagieren [09]. Idealerweise sollten Replikationsexperimente im Temperaturbereich der Schmelzpunkte der korrespondierenden Templat-Duplexe durchgeführt werden. Mit zunehmender Sequenzlänge überschreiten diese Schmelzpunkte aber rasch die Marke von 45 C, so dass auch nach alternativen Ligationsreaktionen gesucht wurde, die unter diesen Bedingungen zu keinen unerwünschten Nebenreaktionen führen sollten. 55

60 Synthese eines alternativen 5 -Iodo-3 -Phosphorothioat-Ligationssystems Eine in der Literatur beschriebene Methode zur Ligation basiert auf dem Angriff einer nukleophilen 3 -Phosphorothioatgruppe des eine Oligonukleotids 34 am 5 - Iodoterminus eines anderen Oligonukleotids 35 []. Durch nukleophile Substitution entsteht dann ein Phosphorsäure-Thioester 36 in der DNA-Backbone: % % 3 6, 3 6 % Ã, % $EE'DV9HUIDKUHQGHU/LJDWLRQ EHUHLQHµ,RGRµ3KRVSKRURWKLRDWO9HUNQ SIXQJ Man entschied sich, die folgenden beiden Verbindungen als Testsubstanzen für diese Ligationsmethode zu synthetisieren: G EXS 7&&* 36 ÃÃÃÃÃÃÃÃÃÃÃG, &**$ Synthese des 5 -Iodobausteins 40 Nachdem bei ersten Syntheseversuchen eine in der Literatur beschriebene Methode zur Einführung 5 -Terminaler Iodreste auf der Basis von Triphenoxyphosphoniummethyliodid nur mit geringen Ausbeuten verlief [], entschied man sich danach für eine Umsetzung über eine Variante der Appel-Reaktion mit Triphenyphosphin und elementarem Iod [3], die in deutlich besseren Ausbeuten verlief (Abb. 60). 33K, &O 3 &,, 3\ULGLQ 3 $EE6\QWKHVHGHVµ,RGRSKRVSKRUDPLGLWVYRQ'HR[\&\WLGLQ Die Entschützung mit konz. NH 4 OH nach der Synthese des Oligonukleotids 38 am DNA-Synthesizer sollte laut Literatur [a] bei Verwendung der Standard- Schutzgruppen für die Nukleobasen trotz der 5 -Iodofunktion keine Probleme bereiten Daher plante man die Synthese ausgehend von benzoylgeschütztem - Deoxycytidin 04. Synthese des Phosphorothioates 44 Setzt man im Syntheseprotokoll des DNA-Synthesizer zunächst keine Iodlösung in THF als Oxidationsmittel ein, sondern gibt man nach der Kopplung des erste Phosphoramidits an die Festphase 4 das kommerziell erhältliche Beaucage- Reagens 4 (3H-,-Benzodithiol-3-on-,-dioxid) hinzu, so kommt es zur selektiven Oxidation des dreiwertigen Phosphoratoms zum Phosphorothioat 44 & 56

61 Manuelle Synthese der 5 -aminomodifizierten Oligonukleotide durch dieses Thiosulfonat [4]. Verwendet man im Anschluss daran für alle weiteren Synthesezyklen die klassische Iodoxidation, so ist am Ende der Gesamtsynthese lediglich das 3 -Ende des Oligonukleotids zum Phosphorothioat 37 derivatisiert. 6 6 & 3 6 & & $EE0HFKDQLVPXVGHU[LGDWLRQYRP7ULHVWHUGHU3KRVSKRULJHQ6lXUH]XP3KRVSRURWKLRDW Manuelle Synthese der 5 -aminomodifizierten Oligonukleotide 94a bis 94c Die Synthesen wurden in Polystyrol-Spritzen mit eingesetztem porösem Diaphragma (Fritte) unter Argon durchgeführt. Die Festphase befand sich fortlaufend in der Spritze, die erforderlichen Reagenzien wurden dazu über ein Septum aus einem Vorlagekolben in die Spritze überführt, mit der Festphase geschüttelt und dann durch bloßes Niederdrücken des Spritzenstempels durch die Fritte von der Festphase getrennt. Es folgten mehrere Wasch- und Trocknungsschritte, ehe die nächste Stufe im Synthesezyklus begonnen wurde. Zum Trocknen wurden die Spritzen mit aufgesetztem Stempel in einen Kolben überführt und auf ein Feinvakuum über Nacht evakuiert. Wie bereits erwähnt, ist im Handel eine Festphase auf der Basis von Polystyrol erhältlich, die jeweils bereits eines der vier verschiedenen Leader-Nukleoside trägt. Alle Versuche, dieses Material in den Spritzen zu handhaben, schlugen fehl. Das Material war derart feinkörnig, dass es die Fritte immer wieder verstopfte oder gar nicht erst von dieses zurückgehalten wurde. Spritzen mit eingesetzten feineren Filtern oder Spritzenvorfiltern für molekularbiologische und chromatografische Anwendungen waren ebenso ungeeignet wie die Verwendung von Schlenkgefäßen mit eingesetzten G4- und G5-Fritten. Die Materialien waren häufig nicht geeignet für eine Verwendung verschiedenster organischer Lösungsmittel (Acetonitril, THF, Aceton, Dichlormethan, Diethylether). Inerte Filterpapiere konnten nicht genutzt 57

62 Manuelle Synthese der 5 -aminomodifizierten Oligonukleotide werden, da das Diaphragma bei diesem Verfahren in beiden Richtungen von den Lösungsmitteln durchspült werden musste (Einsaugen und Herausdrücken) III. Weitere Versuche mit anderen Materialien erschienen wenig sinnvol und recht zeitintensiv, so dass man sich der Synthese und Verwendung einer eigenständig modifizierten Festphase 7 zuwandte (Abb. 57). Diese auf Aminopropyl-CPG basierende Festphase hatte den Vorteil, dass die Eignung des Trägermaterials für die manuelle Synthese in Spritzen bekannt war [07]. Da es sich bei den drei nukleophilen Aminobausteinen 94a bis 94c um sequenzhomologe Systeme handelte, wurde die Synthese parallel in drei Spritzen durchgeführt. Im Sinne der Syntheserichtung vom 3 - zum 5 -Ende waren die jeweils ersten Adenosine bereits als Leader-Nukleoside an der Festphase vorhanden. Man begann mit der separaten Kopplung eines Amidites des Deoxy-Adenosins für Verbindung 94c, wiederholte diese Kopplung für Verbindungen 94b und 94c und koppelte die nächsten beiden erforderlichen Deoxy-Guanosine parallel in allen drei Spritzen. So kam man zu drei Typen von modifizierten Festphasen in drei verschiedenen Spritzen, die abschließend alle nur noch mit dem Amino-C-Amidit 3 bzw. 4 umgesetzt werden mussten. Als zu koppelnde Bausteine wurden käufliche Phosphoramidite verwendet, die durch eine -Cyanoethylgruppe geschützt waren. Da keine besonders schonenden Entschützungsbedingungen erforderlich waren, wiesen die verwendeten Phosphoramidite als Basenschutzgruppen im Fall von Adenin einen Benzoylrest und im Fall von Guanin eine Isobutyrylgruppe auf. Für die Kopplung des entsprechenden Phosphoramidits an die zuvor getrocknete und detritylierte Festphase wurde dieses jeweils in 0.5 molarer Lösung in Acetonitril eingesetzt. Als Aktivator diente -H-Tetrazol, welches in einer 0.5 molaren Acetonitrillösung Verwendung fand. Die Umsetzung wurde mit einem fünffachen molaren Überschuss des Amidits und einem 35fachen molaren Überschuss des -H- Tetrazols vorgenommen. Die Kopplungszeit betrug in allen Fällen 7 Minuten. Es wurde nun gründlich mit Acetonitril und THF gewaschen. Nach dem sich unmittelbar anschließenden Capping der nicht umgesetzten 5'-Hydroxygruppen mit Acetanhydrid und,6-lutidin in THF (und einem kurzen Waschvorgang mit THF) erfolgte die Oxidation des dreiwertigen Phosphors zur Oxidationsstufe V. Als Oxidationsmittel diente dabei eine wäßrige Lösung von Iod und,6-lutidin in THF. Der Wassergehalt der Oxidationslösung stellte den Grund für die gewählte Reihenfolge von Detritylierung und Oxidation dar. Auf diese Weise wurde die Hydrolyse des als Cappingreagens fungierenden Acetanhydrids verhindert. Nun wurde die Festphase erneut mit THF gewaschen und zweimal mit Dichlormethan benetzt. Dem Oxidationsschritt folgte die Detritylierung am 5'-Terminus mit 3% Dichloressigsäure in Dichlormethan. Parallel dazu wurde eine geringe Menge Festphase (ca. 5mg) aus der Spritze entnommen, genau eingewogen, mit einem definierten Volumen der Detritylierungslösung versetzt und im UV vermessen. Über den unter diesen Bedingungen bekannten molaren Extinktionskoeffizienten des DMT-Kations bei III Derartige Festphasen werden in Kartuschen für DNA-Synthesizer eingesetzt. Da es sich hier aber um Durchflußreaktoren handelt, die nur in einer Richtung durchströmt werden, gelingt es, die Festphase mit inerten Filtermaterialen zurückzuhalten. 58

63 Synthese der Oligonukleotide am Synthesizer 500nm (ε = 66600lmolcm - [5] ) konnte die Ausbeute der Kopplung bestimmt werden, indem man die gemessene Extinktion auf die Extinktion nach der Detritylierung der Festphase im vorangegeangenen Arbeitsschritt bezog. Zum Schluss der Synthese wurden die frisch bereiteten Phosphoramidite 3 bzw. 4 nach gleichem Verfahren gekoppelt, oxidiert und detrityliert. Das Verhältnis der molaren Extinktionskoeffizienten vom DMT-Kation bei 500nm und vom MMT-Kation bei 573nm beträgt.33 [6]. Alle Kopplungsausbeuten lagen im Bereich von 90% oder mehr (im Fall vom Amidit 4 konnten sie wegen der Trifluoracetylschutzgruppe nicht direkt bestimmt werden). Die Abspaltung der basenlabilen Schutzgruppen und von der Festphase erfolgte mit konz. NH 4 OH bei 55 C für 6h. Die Reinigung der Moleküle erfolgte zunächst über Ionentauscherchromatografie an einem starken Anionentauscher mit quartären Amoniumionen an der stationären Phase im Gradienten von Wasser/wäßrige Lösung NH 4 HCO 3 (000mM). Im Anschluss daran erfolgte eine präparative HPLC- Aufreinigung an C 8 -Material im Acetonitrilgradienten und 0.M NH 4 HCO 3 -Puffer. Die Verwendung von NH 4 HCO 3 als Puffersystem sowohl für die Ionentauscherchromatografie als auch für die HPLC hatte den entscheidenden Vorteil, dass dieser Puffer durch Koevaporation mit Wasser/Ethanol : (v/v) im Vakuum entfernt werden konnte. Entsalzungsverfahren für NaCl wie Dialyse, Gelfiltration, Gelpermeation, etc. sind erst ab Sequenzlängen von 0 bis 0 Basenpaaren mit kommerziell erhältlichen Medien durchführbar. Für derart kurze Oligonukleotide, wie sie in dieser Arbeit verwendet wurden, gibt es keine standardisierten Reinigungsverfahren, die über klassische chromatografische Trennmethoden hinausgehen. Nach Reinigung erhielt man folgende Stoffmengen der entsprechenden Oligonukleotide, die man zunächst durch MALDI-TOF-MS charakterisierte: Sequenz (Nr.) ε (54nm) IV OD 54 nmol M r theoretisch gemessen d( n CGGA) (94a) d( n CGGAA) (94b) d( n CGGAAA) (94c) Synthese der Oligonukleotide am Synthesizer Die Synthese der übrigen Oligonukleotide erfolgte nach einem Standardprotokoll am DNA-Synthesizer. Für die Sequenzen d( bup TCCGp) (3), d( bup TCCGCGGA) (33), d( bup TCCG PS ) (37) und d( I CGGA) (38) wurden Standard-Phosporamidite verwendet; im Fall der Cy3- und Cy5-gelabelten Substanzen war jedoch eine Verwendung von PAC-Amiditen notwendig (vgl. Abb. 37, S. 4). Für Sequenzen, die einen 3 -Hydroxyterminus tragen sollten, wurden käufliche Festphasen mit entsprechend geschützten Leader-Nukleosiden (Standard bzw. PAC) verwendet. Alle 3 -Phosphatsequenzen und das Phosphorothioat 37 wurden dagegen an der modifizierten CPG-Festphase aufgebaut. IV Zur Berechnung der molaren Extinktionskoeffizienten verwendete man folgende Inkremente: TMP = 750, CMP = 654, AMP = 300, GMP = 3679 [lmol - cm - ] 59

64 Entschützung und Abspaltung von der Festphase Entschützung und Abspaltung von der Festphase Die Entschützungsbedingungen waren mitunter recht verschieden; in allen Fällen wurde jedoch direkt nach der Inkubation auf tiefe Temperaturen abgeschreckt und dann der Ammoniak am SpeedVac eingedampft: Deblockierung der mit Butoxyphosphat markierten Bausteine Es handelte sich um die Substanzen d( bup TCCGp) (3), d( bup TCCGCGGA) (33) und d( bup TCCG PS ) (37). Hier erfolgte die Entschützung für 6h bei 55 C mit 33%iger wässriger Ammoniaklösung (NH 4 OH). Deblockierung der mit Cy3 und Cy5 markierten Bausteine Es handelte sich um die Substanzen d( Cy3 TCCGp) (96a), d( Cy5 TCCGp) (00a), d( Cy3 TCCGCGGA) (0a) und d( Cy5 TCCGCGGA) (0a). Für die Abspaltung der labileren PAC-Schutzgruppen und für die Trennung von den verwendeten Festphasen waren wesentlich mildere Bedingungen ausreichend. Man inkubierte die Substanzen lediglich für 30min bei 60 C und schreckte dann mit flüssigem Stickstoff ab. Deblockierung des 5 -Iodo-Bausteins Es handelte sich um die Substanz d( I CGGA) (38). Hier waren entgegen der Literaturvorschrift für die 5 -Iodo-Tymidinderivate [a], die auf einer DC-Analyse fußte, wesentlich mildere Bedinungen erforderlich, der Einfluss des Cytosins auf die Reaktivität der 5 -Position war signifikant. In zeitabhängigen MALDI-MS-Analysen konnte unter verschiedenen Bedingungen gezeigt werden, dass die aus chemischer Sicht zu erwartenden Nebenreaktionen der Alkylierung und Eliminierung dominierten, wenn die Entschützungstemperatur zu hoch gewählt wurde. Auf der anderen Seite waren insbesondere zur Abspaltung der Isobutyrylgruppen vom Guanin relativ drastische Bedingungen notwendig. Wählte man Temperaturen oberhalb von 5 C, so fanden bereits nach kurzer Zeit Eliminierung zum 5 -Methenyl-Derivat und N-Alkylierung zum Aminobaustein statt, die Isobutyrylgruppen der Guanine waren aber unter diesen Bedingungen noch nicht vollständig abgespalten. Bei Bedingungen von 33%igem NH 4 OH für 90 Minuten bei 55 C fand man folgendes komplexes Produktgemisch: m/z 500 Verbindung M r theoretisch M r gefunden d( I CGG(ibu)A) d( I CGGA) d( n CGG(ibu)A) d( Methenyl CGG(ibu)A) d( n CGGA) d( Methenyl CGGA) $EE'DVNRPSOH[H3URGXNWJHPLVFKQDFK0LQXWHQEHLƒ& Die besten Entschützungsbedingungen fand man bei 5 C für 0h mit konz. NH 4 OH. Die Reinheit nach erfolgter HPLC-Reinigung ist im folgenden Massenspektrum dokumentiert: 60

65 Synthese der Oligonukleotide am Synthesizer m/z $EE'LHUHLQH9HUELQGXQJQDFKRSWLPLHUWHU(QWVFK W]XQJXQGFKURPDWRJUDILVFKHU5HLQLJXQJ Auf der Grundlage dieser experimentellen Befunde muss davon ausgegangen werden, dass bei erneuter Synthese dieses Moleküls die Verwendung von PAC- Amiditen die Entschützung wesentlich vereinfachen sollte. Leider wurde keine Entschützungsbedingung gefunden, unter der ausschließlich d( n CGGA) (94a) entstand, da dies eine interessante Alternative zur deutlich aufwendigeren Synthese über die Phosphoramidite 3 bzw. 4 gewesen wäre. Die erhaltenen Gesamtausbeuten der verschiedenen Verbindungen nach chromatografischer Reinigung (Ionenaustauscherchromatografie und gegebenenfalls HPLC) sind in der folgenden Übersicht zusammengestellt: Verbindung nmol M r theoretisch gemessen d( bup TCCGp) (3) d( bup TCCGCGGA) (33) d( bup TCCG PS ) (37) d( I CGGA) (38) d( Cy3 TCCGp) (96a) d( Cy5 TCCGp) (00a) d( Cy3 TCCGCGGA) (0a) d( Cy5 TCCGCGGA) (0a) Kinetische Voruntersuchungen Eine kinetische Untersuchung konnte durch verschiedene Verfahren durchgeführt werden. Jede Methode hatte dabei ihre Vor- und Nachteile bezüglich der Genauigkeit, der Datenmenge und der Geschwindigkeit der Durchführbarkeit. Alle Oligonukleotide waren zuvor durch analytische RP-HPLC auf ihre Reinheit überprüft und ihre Sequenz durch MALDI-TOF-MS-Messungen als Massensignal verifiziert worden. Qualitative Verfolgung der Reaktion in der MALDI-MS Die EDC-vermittelte Ligation der Testsubstanzen Eine der schnellsten zur Verfügung stehenden Methoden, die Ligationsreaktion zu beobachten, war durch die MALDI-Massenspektrometrie gegeben. Die Bausteine d( bup TCCGp) (3) und d( n CGGA) (94a) wurden dazu in 0.5mM Konzentration und mit 0.M EDC in 0.M HEPES/NaOH-Puffer (ph 7.35) bei Raumtemperatur für 6

66 Qualitative Verfolgung der Reaktion in der MALDI-MS mehrere Stunden stehengelassen und dann als Gemisch durch MALDI-MS analysiert. Das Ligationsprodukt d( bup TCCG PNH CGGA) (45) konnte dabei klar detektiert und durch den großen Masseunterschied zum initial zugesetzten Templatbaustein d(tccgcgga) V (46) unterschieden werden, wodurch verifiziert war, dass die beiden Eduktbausteine unter diesen Bedingungen miteinander reagierten m/z $EE'LH/LJDWLRQVUHDNWLRQLQGHU0$/',06 Verbindung M r theoretisch gefunden d( n CGGA) (94a) d( bup TCCGp) (3) d(tccgcgga) (46) d( bup TCCG PNH CGGA) (45) Durch EDC verursachte MALDI-Artefakte Zusätzlich wurde jedoch neben den korrekten Massen für die beiden Eduktbausteine auch sehr häufig (aber nicht immer) ein um 8-Masseeinheiten reduziertes Signal relativ zu d( bup TCCGp) (3) angezeigt. Dies war auch reproduzierbar, wenn dieses Molekül isoliert mit EDC inkubiert und dann durch MALDI-MS analysiert wurde m/z $EE'DV$XIWUHWHQGHVXP(LQKHLWHQUHGX]LHUWHQ0DVVHSHDNVLP0$/',6SHNWUXP Zunächst glaubte man, dass dieses Massesignal auf ein Zyklisierungsprodukt zurückzuführen sei, das durch Reaktion zwischen den Phosphodiestern der Backbone und dem durch EDC aktivierten 3 -Phosphat ausgebildet wurde. Bei einem derartigen Prozess würde formal ein Wassermolekül abgespalten, was mit einer Massedifferenz von 8 Einheiten korreliert. Gestützt wurde diese Hypothese von dem Befund, dass ein vergleichbares Phänomen für d( n CGGA) (94a) ohne 3 - V Oligonukleotide, die in keiner Weise derivatisiert waren, erzeugte man nach Standardprotokollen am DNA-Synthesizer. Ihre Synthese wird nicht gesondert aufgeführt. 6

67 Kinetische Voruntersuchungen Phosphatgruppe nicht zu beobachten war. Dies wäre eine wichtige Nebenreaktion, die bei der Analyse von Experimenten zur Selbstreplikation nicht ausser Acht hätte gelassen werden dürfen. Als sich jedoch herausstellte, dass die reduzierte Masse bereits unmittelbar nach der Inkubation des Moleküls mit EDC in guter Intensität zu beobachten war, mehrten sich die Zweifel an der Hypothese. Es wurde in Erwägung gezogen, ob es sich bei diesem Phänomen nicht um ein MALDI-MS-analytisches Artefakt handeln könne. Zu diesem Zweck untersuchte man das Phänomen auf der Grundlage von Polyethylenglykol-monomethylether der mittleren Molekularmasse 000gmol - (47). Man setzte dieses Molekül terminal mit dem Phosphitylierungsreagens 09 um und unterzog die Verbindung 48 einer ammoniakalischen Hydrolyse. Im Anschluss daran oxidierte man mit konz. Wasserstoffperoxid zum Phosphorsäureester 49. Ã Q &O 3 & Ã Q 3 & Ã Ã Ã Q 3 $EE6\QWKHVHGHV3(*3KRVSKDWHV Nun versetzte man dieses Phosphat mit EDC und untersuchte das Reaktionsprodukt durch MALDI-MS: $EE8QWHUVXFKXQJGHU5HDNWLRQ]ZLVFKHQ3KRVSKDWXQG('&XQWHU0$/',06%HGLQJXQJHQ Die größeren Peaks konnten (nach externer Kalibrierung mit einer Referenzmasse) jeweils den dispersen Phosphaten zugeordnet werden, die kleinen Peaks entsprachen den (m-8)-massen. Es wurde davon ausgegangen, dass es sich dabei um Metaphosphate handelte. Die vergleichsweise extremen Bedingungen auf der Probenplatte im Hochvakuum (wasserfreies Cokristallisat mit Tris-Hydroxyacetophenon) durch den Beschuss mit Laser-Pulsen schienen auszureichen, kurzfristig ein Metaphosphat als reaktive Zwischenstufe zu erzeugen, welches dann unmittelbar ins Vakuum desorbiert wurde, so dass es nicht weiter reagieren konnte. Energetisch wurde dieser Prozess dann dadurch begünstigt, dass beim Zerfall des Adduktes 50 aus EDC und dem 3 -Phosphat 49 ein thermodynamisch stabiles Harnstoff-Derivat 5 entstehen konnte. 63

68 Ligationsversuche zum 3 -Phosphorothioat-5 -Iodo-System Kν 3 & & 3 & & 0HWDSKRVSKDW $EE3RVWXOLHUWHU0HFKDQLVPXVI UGLH(U]HXJXQJYRQ 0HWDSKRVSKDWHQXQWHU0$/',06%HGLQJXQJHQ Metaphosphate lassen sich im Labor meist nur aus reaktiven Vorstufen oder unter extremen Bedingungen erzeugen [7], sie werden aber häufiger als reaktive Intermediate für Reaktionen von Phosphaten mit anderen Nukleophilen postuliert [8]. Ligationsversuche zum 3 -Phosphorothioat-5 -Iodo-System Zur qualitativen Analyse entschied man sich, zunächst die Reaktionsansätze in der MALDI-MS auf Produktbildung zu untersuchen, da für diese sehr empfindliche analytische Methode Mengen im Subnanobereich erforderlich sind. Die Ligationsversuche von d( bup TCCG PS ) mit d( I CGGA) am Templat d(tccgcgga) verliefen jedoch unter den verschiedensten Reaktionsbedingungen sehr unbefriedigend. Unter den in der Literatur beschriebenen Bedingungen für strukturell verwandte Ligationen des gleichen Typs konnte überhaupt keine Produktbildung beobachtet werden. Auch eine Erhöhung der Reaktionstemperatur und ein Wechsel der Puffersysteme führte selbst nach fünf Tagen zu keiner signifikanten detektierbaren Produktbildung. Dies war verwunderlich, da die Methode als Ligation zwischen 3 -Phosphorothioaten und 5 -Iodo-Tymidin-Oligonukleotiden an komplementären Templaten hinreichend ausführlich in der Literatur beschrieben ist []. Nach fünf Tagen bei 5 C in 0.M HEPES/NaOH-Puffer konnte bei der erforderlichen Masse von 56gmol - ein schwaches Signal detektiert werden, das bei großzügiger Betrachtung dem gewünschten Ligationsprodukt zugeordnet werden konnte Verbindung M r M r theoretisch gefunden d(tccg PS CGGA) m/z 650 $EE'DVVFKZDFKH0DVVHQVLJQDOEHLJPRO Um die Möglichkeit auszuschließen, dass das entstandene Ligationsprodukt unter den Bedingungen der MALDI-MS nicht stabil war und daher nicht detektiert werden 64

69 Kinetische Voruntersuchungen konnte, untersuchte man die Reaktion ebenfalls in der HPLC. Auch hier konnte kein Produkt detektiert werden. Als Grund für die wenn überhaupt nur außerordentlich langsam verlaufende Reaktion konnte man zwei Argumente finden: Im Vergleich zum 5 -Iodo-T (5) sind beim 5 -Iodo-C keine Anhydroderivate 53a beschrieben worden, die möglicherweise beim Mechanismus der Ligation eine Rolle spielen [9]. Zumindest stellt 5 -Iodo-Thymidin eine gute Vorstufe dar, um diese Anhydroderivate zu generieren, Nukleophile können nun am 5 - Kohlenstoffatom unter Ringöffnung angreifen:, 5 $J X $ J, 5 X 5 DE $EE'LHK\SRWKHWLVFKH$XVELOGXQJGHV$QK\GUR'HULYDWHVCEHLPµ,RGR7 DOVUHDNWLYHV,QWHUPHGLDWEHLGHU5HDNWLRQ]XP'HULYDWD Die Ligation wurde in einem selbstkomplementären System getestet. Dies hatte zur Folge, dass die Population der termolekularen Komplexe, in denen eine Präorganisation der funktionellen Gruppen gegeben war, um Größenordnungen niedriger lag als im Fall eines komplementären Systems. Die katalytische Wirksamkeit der Templatmoleküle war daher stark vermindert, da diese überweigend in Duplexen assoziiert vorlagen. Erschwerend kam bei den Experimenten noch hinzu, dass bei längerer Reaktionszeit das Phosphorothioat zu hydrolysieren begann, da nach einigen Stunden auch der Massenpeak des 3 -Phosphates in der MALDI-MS detektiert werden konnte: Verbindung M r M r theoretisch gefunden d( bup TCCG PS ) d( bup TCCG P ) $EE'LHRIIHQVLFKWOLFKH\GURO\VHGHV3KRVSKRURWKLRDWHV Da zu diesem Zeitpunkt die Ligationsexperimente mit EDC als Aktivator recht gut funktionierten, wurde von einer Optimierung und detailierteren Untersuchung des 3 - Phosphorothioat-5 -Iodo-Systems abgesehen. Da die Ligation über 5 -Iodo-Thymidin in der Literatur gut beschrieben ist, sollten für zukünftige Reaktionen dieses Typs Thymidinderivate eingesetzt werden, ihre Synthese sollte über PAC-Amidite erfolgen. Das 5 -Iodo-Deoxythymidin-Phosphoramidit ist kommerziell erhältlich. 65

70 Ligationsversuche zum 3 -Phosphorothioat-5 -Iodo-System HPLC-Kinetiken Da eine MALDI-spektrometrische Analyse nicht zur quantitativen kinetischen Auswertung geeignet war, wandte man sich nun chromatografischen Methoden zu. Da die Nukleotide alle bei 54nm absorbierten, hatte diese Methode den Vorteil, dass bei UV-Detektion und ausreichender Basislinienseparation alle Spezies im System kinetisch verfolgt werden konnten. Bei photometrischen Methoden ist dies im Regelfall nur möglich, wenn die einzelnen Spezies bei gut separierbaren Wellenlängen absorbieren. Eine HPLC-technische Untersuchung des [4,4]-[8]- Systems war daher empfehlenswert, weil so unerwartete Nebenreaktionen hätten detektiert werden können. Die Reaktionskinetiken wurden in Kapillaren durchgeführt. Dazu wurden die Eduktbausteine aus Stammlösungen, deren Gehalt an Oligonukleotiden zuvor UV-spektroskopisch bestimmt worden war, in Eppendorf- Gefäße überführt und das Lösungsmittel im Vakuum eingedampft. Dann versetzte man die getrocknete Substanzmischung mit einem definierten Volumen 0.M Lösung von EDC in HEPES-Puffer (ph 7.35). Man vermischte die Lösung sorgfältig, zentrifugierte kurz und überführte die Lösung sofort (in der Regel Volumina 5µl) in eine entsprechende Zahl von µl-kapillaren. Die Kapillaren sogen sich dabei durch die Kapillarwirkung selbständig auf. Die Kinetiken wurden bei 30 C durchgeführt. Die Stoffmengenkonzentrationen der Edukte d( bup TCCGp) (3) und d( n CGGA) (94a) betrugen dabei mm, die initiale Menge Templat d(tccgcgga) (46) wurde mit 0, 4, 8, 6 und 3 mol% variiert. $ * * & Q G $ * * & * & & 7 G S * & & 7 S X E G $ * * & * & & 7 S X E G Entnahmezeitzeit der Kinetik [min] Retentionszeit [min] $EE7\SLVFKHU5VCEM3ORWGHU(OXWLRQVGLDJUDPPHHLQHUGXUFK3/&DQDO\VLHUWHQ.LQHWLN Man erkennt deutlich, wie die Fläche des Peaks vom Ligationsprodukt 45 mit der Zeit zunahm, während die Flächen der Edukte 94a und 3 abnahmen. Die Fläche des initial zugesetzten Templatbausteins, im Beispiel 8mol%, blieb hingegen konstant. Der Einfluss des lipophilen Shiftreagens am 5 -Ende vom Ligationsprodukt d( bup TCCG PNH CGGA) (45) gegenüber von d(tccgcgga) (46) ist deutlich zu erkennen. Er betrug beim verwendeten Elutionsgradienten rund fünf Minuten. So wurde eine getrennte Integration möglich. Die Verbindung d( bup TCCGCGGA) (33) wurde benötigt, um in unabhängigen Serienmessungen zur Kalibrierung der Stoffmenge den Zusammenhang zwischen Peakfläche im Elutionsdiagramm und Stoffmenge herzustellen. Dabei wurde vernachlässigt, dass in der zentralen Position der Backbone bei 45 ein Phosphoramidat, bei 46 ein Phosphodiester vorlag. Dies war jedoch gerechtfertigt, die Retentionszeiten beider Substanzen waren identisch. 66

71 Kinetische Voruntersuchungen Die quantitative Auswertung der Peakflächen wurde dadurch erschwert, dass die selbstkomplementäre Sequenz des Ligationsproduktes recht stark zur Peakverbreiterung führte, was auf Duplexassoziation zurückgeführt werden konnte. Um diesen Effekt zu unterdrücken, wurden die Chromatografiesäulen auf 45 C geheizt. Qualitativ konnten die HPLC-Experimente einen Templateffekt zeigen, d.h. bei erhöhter Menge an initial zugesetztem Templatbaustein d(tccgcgga) (46) entstand nach gleichen Reaktionszeiten mehr Ligationsprodukt d( bup TCCG PNH CGGA) (45). Die Messreihen für sich waren aber trotz zahlreicher Wiederholungen wenig reproduzierbar, so dass man sich keiner Optimierung des Verfahrens, sondern gleich den über FRET detektierbaren Kinetiken zuwandte. Vorbereitungen für die Fluoreszenzmessungen Voruntersuchungen zum System Cy3-Cy5 Zu Beginn mussten die idealen Bedingungen gefunden werden, unter denen eine möglichst hohe FRET-Effizienz beobachtet werden konnte. Die FRET-Effizienz war die Ursache für die relative Änderung der Fluoreszenzintensität, welche während einer Kinetik maximal zu beobachten war. Je größer diese Änderung war, desto höher sollte die Güte der Messpunkte sein. Gerätetechnisch war man auf steadystate-messungen beschränkt, so dass entweder die Donorfluoreszenzschwächung oder die sensibilisierte Akzeptorfluoreszenzzunahme in Frage kamen. Erste konzentrationsabhängige Experimente zeigten sofort, dass eine Kinetik im Konzentrationsbereich von mm, wie sie bei HPLC-Kinetiken üblich ist, wegen Fluoreszenzlöschung unmöglich war. Messtechnisch war man darüber hinaus auf eine Küvette angewiesen, die wenigstens mit einem Volumen von 50µl gefüllt sein musste, um reproduzierbare Messwerte zu erhalten. Kleinere Küvetten zeigten wegen ihrer Geometrie zu große Abhängigkeit von der Platzierung der Küvette im Thermoblock. Dieses Volumen von 50µl hätte bei Stoffmengenkonzentrationen von mm zusätzlich einen Substanzverbrauch bedeutet, der aus ökonimischer Sicht unhaltbar gewesen wäre. Man ging daher zunächst davon aus, die Kinetiken unabhängig unter optimierten Bedingungen mit Konzentrationen zwischen 0. und mm in 0.-5µl-Kapillaren durchzuführen, und dann für jeden Messpunkt den Inhalt der Kapillare in ein definiertes, viel größeres Volumen ( µl) zu verdünnen. Erst diese verdünnte Lösung wurde dann in die Küvette überführt, auf eine tiefere Temperatur abgekühlt, und im Fluorimeter vermessen. Die Stoffmengenkonzentrationen der Bausteine in der Küvette lagen demnach im mikromolaren Bereich. Für erste Tests zum Ausmaß des FRET unter verschiedenen Bedingungen verwendete man die beiden Templatbausteine d( Cy3 TCCGCGGA) (0a) und d( Cy5 TCCGCGGA) (0a) in verschiedenen Verhältnissen. Später pipettierte man dann alle Bausteine, also auch die Edukte d( n CGGA) (94a) und d( Cy5 TCCGp) (00a), in den Konzentrationen ein, wie sie bei einem bestimmten Umsatz für eine kinetische Reaktionslösung zu erwarten waren. Es war klar, dass ein Zusammenhang zwischen Temperatur und FRET-Effizienz bestehen müsste, da eine Assoziation zu FRET-aktiven Duplexen nur unterhalb der Schmelztemperatur der Duplexe zu erwarten war. In der Tat zeigte sich eine deutlich Zunahme des Fluoreszenzsignals, wenn man die Küvette abkühlte, die höchsten 67

72 Voruntersuchungen zum System Cy3-Cy5 Werte beobachtete man bei Werten um 0 C. Man hatte einen Kryostaten an das Gerät angeschlossen, konnte daher prinzipiell Temperaturen von 0 bis 00 C einstellen; da als Reaktionsmedium Wasser verwendet wurde, war die Temperaturskala nach unten begrenzt. 7HPSHUDWXUI KOHU LQÃ5HIHUHQ]N YHWWH ÃÃÃÃÃÃÃÃ.U\RVWDW 0:*Ã/DXGDÃ5& 6SHNWUR)OXRULPHWHU ÃÃ.RQWURQÃ6)0Ã &RPSXWHU $EE6FKHPDWLVFKHU$XIEDXGHV0HVVJHUlWHV Man entschied sich dafür, die Experimente bei 5 C Küvettentemperatur durchzuführen, da hier im Vergleich zu 0 C noch eine deutliche Zunahme der Fluoreszenz zu beobachten war. Da bei 5 C in unklimatisierter Umgebung sofort Kondenswasser die Küvette benetzte und somit eine Messung unmöglich machte, verlegte man das Fluorimeter in einen Kühlraum bei 5 C. Glücklicherweise bemerkte man bereits nach wenigen Tagen, dass derart tiefe Temperaturen mit dem Photomultiplier des Gerätes nicht vereinbar waren, so dass man den Kühlraum wieder verlassen konnte! Man rechnete damit, nun größere Zugeständnisse bezüglich der FRET-Effizienz machen zu müssen, da bei Raumtemperatur im Winter Küvettentemperaturen unterhalb von 0 C wegen des Kondenswassers nicht realisiert werden konnten; im Sommer sah man sich bereits teilweise bei 0 C mit dieser Problematik konfrontiert. Wie sich aber herausstellte, fielen die Zugeständnisse geringer aus als erwartet, da neben der Abhängigkeit der Duplexassoziation von der Temperatur überraschenderweise auch eine starke Temperaturabhängigkeit der Fluoreszenz von Cy3 und Cy5 beobachtet wurde. Diese wurde nicht nur bei den Konjugaten vom Fluorophor mit dem Oligonukleotid, sondern auch beim freien Farbstoff beobachtet. Eine thermisch beeinflussbare Rückfaltung des kationischen Farbstoffmoleküls auf die anionische DNA-Backbone konnte also nicht verantwortlich für dieses Phänomen sein, das im folgenden zahlreiche Untersuchungen deutlich komplizierter machte als ursprünglich erwartet. Die Zunahme der Signalintensität bei Abkühlung der Küvette war demnach nur in einem höheren Temperaturbereich auf eine Zunahme der FRET-Intensität durch Duplexassoziation zurückzuführen. In tieferen Temperaturbereichen lag diese Zunahme dagegen lediglich an der Temperaturabhängigkeit der Fluoreszenz an sich VI. Entscheidend war also ein Experiment, bei dem die relative Änderung der Fluoreszenz zwischen einer simulierten Lösung für 0%- und einer Lösung für 00%- Umsatz beobachtet wurde. Führte man diese Vergleichsmessungen bei verschiedenen Temperaturen durch, so stellte man fest, dass erst oberhalb von 0 C ein signifikanter Abfall der FRET-Fluoreszenz zu beobachten, eine Temperatur, die VI Zu diesem Zeitpunkt waren die Komplexassoziationskonstanten der Templatmoleküle noch nicht bekannt und es war unklar, welchen Einfluß Cy3 und Cy5 auf diese Konstanten hatten. Dennoch war auffallend, dass auf der Grundlage einer maximalen Fluoreszenz, die asuschließlich auf eine verstärkte Assoziation hätte zurückgeführt werden können, bei 0 C die Schmelzpunkte hätten sehr niedrig sein müssen, viel niedriger als für ein ungelabeltes Templatmolekül, dessen Stabilität über Inkremente abgeschätzt werden konnte. 68

73 Vorbereitungen für die Fluoreszenzmessungen auch viel besser mit den vermuteten Schmelztemperaturen der Duplexe in Einklang stand. Grafisch zeigte sich folgender Zusammenhang: prozentuale Änderung der Fluoreszenz Temperatur [ C] $EE'HUUHODWLYH=XVDPPHQKDQJ]ZLVFKHQ7HPSHUDWXUXQG)5(7(IIL]LHQ] Zunächst war man davon ausgegangen, es sei eine sinnvolle Vorgehensweise, die Fluoreszenz als Zunahme der induzierten Zunahme des Akzeptors Cy5 zu vermessen und folglich den Baustein d( Cy5 TCCGp) (00a) als Edukt, den Baustein d( Cy3 TCCGCGGA) (0a) dagegen als Templat einzusetzen. Man gelangte zu dieser Annahme, da Cy3 in jedem Fall von der äußeren Stahlungsquelle angeregt werden musste. Wollte man nun also die Abnahme der Donorfluoreszenz durch FRET messen, so hätte man immer mit dem Problem zu kämpfen, eine möglicherweise nur geringe Änderung der Fluoreszenz durch FRET gegen eine große Grundfluoreszenz zu messen. Dieses Problem konnte man durch die Beobachtung der sensibilisierten Akzeptorfluoreszenzzunahme umgehen, da hier der Wert zunächst im Bereich von 0 rel. Fluoreszenzeinheiten liegen und dann mit fortschreitender Bildung von d( Cy5 TCCG PNH CGGA) (54) anwachsen sollte. Kleine Änderungen konnte man aber hier durch eine Erhöhung der Geräteempfindlichkeit angemessen sichtbar machen. Hinzu kam das Problem, dass man aufgrund der Überlappung der Absorptions- und Fluoreszenzspektren mit zwei grundsätzlichen Problemen konfrontiert war: Auf der einen Seite wurde Cy5 auch immer schon etwas von der äußeren Strahlungsquelle angeregt und zeigte somit eine gewisse Untergrundfluoreszenz Auf der anderen Seite fluoreszierte Cy3 auch immer bis in den Wellenlängenbereich hinein, bei dem das Maximum der Cy5-Emission lag. Das Fluorimeter war zwar mit Monochromatoren einer Bandbreite von 0nm ausgestattet, die Überlappung der Spektren war jedoch davon unabhängig und konnte durch keine Filtersysteme oder andere Maßnahmen verhindert werden. Es stellte sich heraus, dass das erste Problem durch Wahl einer vergleichsweise kurzwelligen Anregungswellenlänge, die mit 500nm deutlich vor dem Absorptionsmaximum von Cy5 lag, besser umgangen werden konnte als das zweite. Um aber auch den zweiten Effekt so minimal wie möglich zu halten, fand das Labeling der Bausteine wie beschrieben statt: Cy3 am Templat, Cy5 am Edukt. Dies war nämlich insofern günstiger, als dass der initial zugegebene Templatbaustein ja stets nur zu einigen mol% addiert wurde. Seine Stoffmenge war somit deutlich 69

74 Voruntersuchungen zum System Cy3-Cy5 kleiner als die Summe über alle Cy5-markierten Spezies (d( Cy5 TCCGp) (00a) d( Cy5 TCCG NHP CGGA) (54)). Es stellte sich durch zweidimensionale Vergleichsmessungen (Variation von Anregungs- und Emissionswellenlänge) als besonders günstig heraus, die Anregungswellenlänge auf 500nm, die Emissionswellenlänge auf 655nm zu fixieren. In einem Vergleichsexperiment wurde als Alternative auch der am 5 -Ende mit Fluorescein markierte Templatbaustein d( Fluorescein TCCGCGGA) (55) anstelle von d( Cy5 TCCGCGGA) (0a) als Akzeptor untersucht. Die Effizienz des Cy3- Fluorescein-Systems, welches als FRET-System in der Literatur beschrieben ist [87a, 30] stellte sich aber sehr schnell bei den verschiedensten Kombinationen von Anregungs- und Emissionswellenlänge als geringer heraus, so dass man wieder zum Cy3-Cy5-System zurückkehrte VII. Nun musste untersucht werden, ob auch die beiden homomolekularen Templat- Duplexe gegenüber den Einzelsträngen eine Änderung der Fluoreszenz zeigten. Es wäre denkbar gewesen, dass eine Art Fluoreszenzquenching stattfand, das möglicherweise Einfluss auf die Kalibrierung genommen hätte. Bezogen auf die gleiche UV-Extinktion von Cy3 und Cy5 stellte man vier äquimolare Lösungen der vier zur Verfügung stehenden fluoreszenzmarkierten Bausteine in jeweils isolierter Form her. Während die Phosphatbausteine d( Cy3/5 TCCGp) (96a/00a) nicht zur Selbstassoziation befähigt waren, konnte davon ausgegangen werden, dass die Templatmoleküle d( Cy3/5 TCCGCGGA) (0a/0a) bei 5 C überwiegend als Duplexe vorlagen. Ein Vergleich der relativen Fluoreszenzen des beiden Cy3-markierten und der beiden Cy5-markierten Verbindungen jeweils miteinander zeigte jedoch keinen Unterschied, so dass davon ausgegangen werden konnte, dass die Duplexbildung in heteromolekularen Komplexen FRET verursachte, in homomolekularen Duplexen jedoch keinen Einfluss auf das fluoreszente Verhalten hatte. Dies wurde auch durch ein weiteres Experiment bestätigt: die Fluoreszenzen von d( Cy5 TCCGCGGA) (0a) und d( Cy5 TCCGp) (00a) wurden bei verschiedenen Temperaturen vermessen. Da sowohl die Fluoreszenz als auch die Duplexbildung des Templates temperaturabhängug waren, musste man die Steigungen, der erhaltenen Messreihen miteinander vergleichen, ähnlich wie man es später auch bei den UV-Absorptionen zur Bestimmung der Extinktionskoeffizienten gemacht hatte (vgl. S. 7f). Die Auswertung zeigte, dass beide Steigungen identisch waren, so dass es in Bezug auf die Fluoreszenz eines einzelnen Fluorophors keinen Unterschied machte, ob er als Einzelstrang oder im Duplex mit einem identisch markierten Templatmolekül assoziiert vorlag. Weiterhin untersuchte man, ob nicht die Verwendung bestimmter Puffersysteme die Komplexassoziation begünstigte. Die Komplexstabilität komplementärer Oligonukleotide wird erheblich durch ph-wert und Salzkonzentration beeinflusst. Diese Puffer mussten nicht zu den Bedingungen der Kinetik kompatibel sein (konnten also beispielsweise Phosphat enthalten), da man sie zum Verdünnen der aus den Kapillaren stammenden Lösungen verwenden konnte. Zu diesem Zweck versetzte VII Wie bereits an anderer Stelle erwähnt, wurde inzwischen bekannt, dass Fluorescein für EDCvermittelte Ligationen ungeeignet ist, da seine Carboxylgruppe mit EDC zu reagieren scheint, wodurch die Fluoreszenz massiv gestört wird 0[FB]. 70

75 Vorbereitungen für die Fluoreszenzmessungen man gleiche Volumina einer konzentrierten Stammlösung der beiden Templatmoleküle 0a und 0a mit verschiedenen Puffern und beobachtete die relative Fluoreszenz. Man untersuchte folgende Puffer:.577 M Na in.0 M PO 4 3- bei ph 7.0 0mM PO 4 3-, 00mM Na, 0.5 mm EDTA bei ph mM HEPES mit 50mM Na bei ph 7.35 Während die Fluoreszenz beim ersten Puffer geschwächt wurde, war sie bei den beiden anderen Systemen identisch. Man beschloss daher, Puffer 3 auch für weitere Messungen zu verwenden, da dieser gleichzeitig auch mit den Bedingungen der Kinetiken kompatibel war. Als nächstes Problem, welches gelöst werden musste, ist die Oberflächenabsorption der markierten Bausteine an Kunststoff (Eppendorf-Spitzen, -Gefäße, etc.) zu nennen. Maß man die Fluoreszenz einer Lösung in der Küvette, entnahm die Lösung mit einer Eppendorf-Spritze und füllte sie wieder zurück, so sank die Fluoreszenz signifikant ab. Aus diesem Grund entschied man sich, den Lösungen der Oligonukleotide organische Lösungmittel beizumengen. Da diese einen denaturierenden Einfluss auf die Templatduplexe haben könnten, musste der Einfluss genauer untersucht werden. Man testete die mit Wasser vollständig mischbaren Lösungsmittel DMF, DMSO, Ethanol, Methanol, THF, Acetonitril und Aceton. Dazu versetzte man gleiche Volumina einer Stammlösung der beiden Templatbausteine 0a und 0a einmal mit 0% Waser, das andere Mal mit dem gleichen Volumen des organischen Lösungsmittels bei gleicher Temperatur. Volumenänderungen durch die Vermischung ließ man dabei ausser Acht. In allen Fällen nahm die Akzeptorfluoreszenz relativ zur Messung in reinem Wasser leicht zu, was nur mit einer Erhöhung der FRET-Effizienz erklärt werden konnte. Zum Vergleich setzte man einer der Lösungen Harnstoff zu, was erwartungsgemäß in einer drastischen Reduzierung der Fluoreszenz resultierte. Man entschied sich als Additiv für Acetonitril, da es im UV-Spektrum weitgehend transparent ist, mit Wasser quasi ohne Volumenkontraktion vermischbar ist und einen vergleichsweise niedrigen Siedepunkt hat. Der Siedepunkt war wichtig, da man das Lösungsmittelgemisch im SpeedVac evaporieren musste, ehe man mit einer Kinetik beginnen konnte. Es war geplant, die Stammlösungen der Moleküle alle mit 0% Acetonitril zu versetzen, um aus ihnen problemlos mit der Eppendorf-Pipette die erforderlichen Stoffmengen für eine Kinetik zu pipettieren. Das Lösungsmittel sollte dann eingedampft und die Kinetik mit einem definierten Volumen 0.M EDC in HEPES/NaOH-Puffer gestartet werden. Man wollte verhindern, die in Kapillaren durchzuführenden Kinetiken ebenfalls in einem Lösungsmittelsystem durchzuführen, das 0% Acetonitril enthielt. Dies wäre kaum möglich gewesen, da die Kapillaren an beiden Seiten offen waren und in eine mit dem entsprechenden Lösungsmittel gesättigten Dampfatmosphäre inkubiert wurden. Eine Veränderung der Lösungsmittelzusammensetzung in den Kapillaren mit der Zeit wäre daher absehbar gewesen und stattdessen nur bei azeotroper Zusammensetzung realisierbar. Die Eignung der 0%igen Mischung von Acetonitril in Wasser für diese Vergehensweise überprüfte man durch zahlreiche Transferexperimente. Man nahm dazu zunächst die Fluoreszenz einer Testsubstanz im entsprechenden Lösungsmittelgemisch auf und überführte die Lösung dann mit einer ml Spritze in 7

76 Voruntersuchungen zum System Cy3-Cy5 ein Eppendorf-Gefäß. Nun transferierte man die Lösung zehnmal mit jeweils einer neuen Eppendorf-Spitze in ein anderes Gefäß und schließlich zurück in die Küvette. Das Fluoreszenzsignal im Vergleich zur Anfangsmessung durfte nicht um mehr als 0.5% gesunken sein. Während Eppendorf-Gefäße unter diesen Bedingungen keine Probleme bereiteten, adsorbierten Glaseffekte die Substanz immer noch in großem Ausmaß. Da die Kapillaren, in denen die Kinetiken durchgeführt werden sollten, jedoch ebenfalls aus Glas waren, untersuchte man diesen Einfluss genauer. Nachdem auch eine Erhöhung des Acetonitrilgehaltes hier keine Lösung des Problems brachte, befüllte man eine Küvette mit 00µl der Stammlösung mit 0% CH 3 CN durch zwanzig 0µl- Kapillaren. Als die Fluoreszenz unter den gewählten Bedingungen lediglich von 4 auf 39 Einheiten absank, sah man dies als akzeptabel an. Offensichtlich war die Glasoberfläche der Kapillaren anders beschaffen als die der zuvor verwendeten Testgefäße. Zusätzlich waren die realen Bedingungen, unter denen die Kinetiken durchgeführt werden sollten, weniger streng, da nur eine Kapillare verwendet wurde, die dafür aber mehrere Mal mit der Lösung zur Verdünnung ausgewaschen werden konnte. Da Acetonitril aus den Kunststoffgeräten eine Substanz herauslöste, die im UV bei 60nm stark absorbiert, wurde untersucht, ob dies auch bei einer 0%igen Mischung mit Wasser zu beobachten war. Glücklicherweise konnte auch nach mehreren Wochen kein derartiger Effekt beobachtet werden. Auch die Dichtigkeit der Eppendorf-Gefäße bezüglich Diffusion und Deckeldichtung wurde gravimetrisch überprüft und für ausreichend erachtet. Das binäre Gemisch Wasser-Acetonitril ist in der Literatur detailiert beschrieben [3], insbesondere die Dichte der 0%igen Mischung mit ρ = 0.96 gcm -3 war wichtig, da sie eine gravimetrische Kontrolle der Pipettierschritte ermöglichte. Bestimmung der Extinktionskoeffizienten der Oligonukleotide im neuen Lösungsmittel Die Verwendung von 0% Acetonitril hatte aber nun die erhebliche Konsequenz, dass weder die Extinktionskoeffizienten der Nukleobasen, noch die der Fluoreszenzfarbstoffe unter diesen Bedingungen bekannt waren. Diese Werte waren aber unbedingt erforderlich, um Stammlösungen der Moleküle einstellen zu können, aus denen dann später die Kinetiken angesetzt werden sollten. Die Ungenauigkeit der für Cy3 und Cy5 in der Literatur angegebenen Werte, auf die eingangs bereits hingewiesen wurde, kam noch erschwerend hinzu. Man begann daher damit, die Extinktionskoeffizienten der einzelnen Chromophore relativ im Vergleich von Wasser zu Acetonitril/Wasser als Lösungsmittel zu bestimmen. Zunächst untersuchte man die Extinktion der Nukleobasen bei 54nm. Dazu ging man immer so vor, dass man das Molekül in Wasser gelöst gravimetrisch kontrolliert (ρ =.0gcm -3 ) in eine Küvette einpipettierte. Sollten Oberflächenabsorptionen auftreten, so war dies unerheblich, da nur die Substanzmenge relevant war, die tatsächlich in die Küvette gelangte. Nun überführte man die Lösung in ein Eppendorf- Gefäß und spülte sorgfältig mit dem doppelten Volumen Wasser/Acetonitril : (v/v) aus. Man vereinte die Lösungen, evaporierte das Lösungsmittel und füllte anschließend mit dem gleichen Volumen der 0%igen Acetonitril/Wasser-Mischung auf, was man ebenfalls gravimetrisch kontrollierte (ρ = 0.96gcm -3 ). Man bestimmte nun die Extinktion bei 54nm und verglich mit dem in reinem Wasser 7

77 Vorbereitungen für die Fluoreszenzmessungen aufgenommenen Wert. Für jede Substanz führte man zehn Messungen mit verschiedenen Stoffmengen durch. Es stellte sich bei Untersuchung von d( n CGGA) (94a) und ( bup TCCGp) (3) heraus, dass die Extinktion der Nukleobasen bei 54nm durch den Gehalt an Acetonitril nicht messbar beeinflusst wurde. Die analoge Messung wurde auch für die Templatsequenz d( bup TCCGCGGA) (33) durchgeführt. Eine Messung war hier nur bei erhöhter Temperatur sinnvol, um den Einfluss des Lösungsmittels auf die Duplexstabilität und damit auf die Hyperchromizität vom Einfluss auf die Extinktion der Nukleobasen unterscheiden zu können. Auch hier zeigte sich keine nennenswerte Veränderung der Extinktion beim Übergang von Wasser auf Acetonitril/Wasser. Die Untersuchung von d( Cy3 TCCGCGGA) (0a) bei 548nm und d( Cy5 TCCGp) (00a) bei 644nm zeigte ebenfalls, dass sich die Extinktion nicht änderte. Alle Abweichungen lagen unterhalb von %, ein Fehler, der bereits auf die Genauigkeit des UV-Gerätes zurückgeführt werden konnte. Komplizierter gestaltete sich dagegen die Bestimmung der Extinktionskoeffizienten von Cy3, Cy5 und der Nukleobasen relativ zueinander! Zunächst versuchte man, den molaren Extinktionskoeffizienten von Cy5 absolut und unabhängig zu bestimmen. Das permethylierte Salz war als Iodid 56 im Handel erhältlich., $EE'DVNRPPHU]LHOOHUKlOWOLFKH&\'HULYDW Dazu wog man eine definierte Menge ein und löste sie in 5l der Acetonitril-Wasser- Mischung. Die Messungen der Fluoreszenz zeigten die gleiche Sensibilität gegenüber der Temperatur wie im Fall der Oligonukleotid-Konjugate, das Absorptionsmaximum im UV-Spektrum zeigte dagegen eine deutliche Verschiebung um 6nm, so dass auch damit gerechnet werden musste, das die Extinktionskoeffizienten nicht übereinstimmten. Man untersuchte daher die Absorption des Farbstoffs bei 54nm: rel. Extinktion rel. Extinktion Wellenlänge [nm] Wellenlänge [nm] $EE$EVRUSWLRQVVSHNWUXPYRQ&\ YRQELVQP $EE$EVRUSWLRQVVSHNWUXPYRQ&\ YRQELVQP 73

78 Voruntersuchungen zum System Cy3-Cy5 Hier zeigte sich eine vergleichsweise geringfügige Absorption, die außerdem von 44 bis 64nm nahezu konstant war. Eine Verschiebung der Absorption durch die unterschiedliche Derivatisierung des Cy5 sollte hier also einen kleineren Einfluss auf den Extinktionskoeffizienten haben als am Maximum im Bereich von 640nm. Da man nun die Extinktion von Cy5 bei 54nm im Sinne eines Inkrementes verwenden wollte, um diese zur Extinktion der Nukleobasen zu addieren, sollte in diesem Fall ein Fehler bei der Ermittlung des Wertes einen geringenen Einfluss haben. Wie sich herausstellte, war der Extinktionskoeffizient von Cy5 bei 54nm deutlich kleiner als der durch die Summe aller Nukleobasen berechnete Wert. Ein Fehler sollte sich auf den Gesamtwert also prozentual weniger stark auswirken. Für Verbindung 56 bestimmte man den Wert nach dieser absoluten Methode zu ε = 457 lmol - cm -. Man beschloss, für die Stammlösung die Stoffmengenkonzentration der mit Cy5 markierten Oligonukleotide wie auch die der Aminobausteine über die Extinktion bei 54nm (bei C) zu bestimmen. Man hatte jedoch zusätzlich die Möglichkeit, auf anderem Wege den ermittelten Wert der Extinktion von Cy5 bei 54nm zu überprüfen, ohne dabei auf Verbindung 56 zurückgreifen zu müssen. Wenn der Kurvenverlauf der Absorption bei Verbindung 56 bei 54nm nahezu horizontal verlief, so sollte dies auch für d( Cy5 TCCGp) (00a) und d( Cy5 TCCGCGGA) (0a) gelten. Da die Nukleobasen ihrerseits nicht bei 644nm absorbierten, konnte der Extinktionskoeffizient von Cy5 bei 54nm durch Vergleichsmessungen der beiden Konjugate 00a und 0a bestimmt werden. Teilte man die Gesamtextinktion der Moleküle in eine durch Cy5 und die Nukleobasen verursachte, additive Absorption bei 54nm und eine lediglich durch Cy5 verursachte Extinktion bei 644nm auf, so kam man nach trivialer Umformung unter Verwendung des Gesetzes von Lambert und Beer zu folgendem Ausdruck: ε Cy 5 (54) E = (644) E Nucleobasen (54) (54) E ε (54) E (644) E E (54) (644) E E Nucleobasen (644) (54) (54) ε *OHLFKXQJ In Klammern sind dabei immer die entsprechenden Wellenlängen angegeben, mit den Indices und werden die beiden verschiedenen Verbindungen 00a und 0a bezeichnet. Erschwerend kam bei dieser Bestimmung hinzu, dass d( Cy5 TCCGCGGA) bei C assoziiert vorlag und der Extinktionskoeffizient bei 54nm dadurch aufgrund der Hyperchromizität reduziert war. Inkremente konnten hier also nicht direkt verwendet werden. Auch war eine Messung bei erhöhter Temperatur nicht möglich, da dadurch das Verhalten des Cy5-Restes im Molekül beeinflusst worden wäre. Stattdessen bestimmte man das Ausmaß der Hyperchromizität zunächst durch eine vergleichende temperaturabhängige Messung von d( Cy5 TCCGp) (00a) und d( Cy5 TCCGCGGA) (0a) bei 54nm. Der Einfluss der Temperaturänderung auf Cy5 sollte für beide Moleküle gleich sein, lediglich der Templatbaustein 0a sollte zusätzlich eine durch die Nukleobasen verursachte Hyperchromizität zeigen. Man bestimmte die temperaturabhängigen Extinktionen beider Bausteine bei 54 und 644nm: 74

79 Vorbereitungen für die Fluoreszenzmessungen abs. Extinktion Temperatur [ C] Extinktion CY5-TCCGp 54nm Extinktion CY5-TCCGp 644nm Extinktion CY5-TCCGCGGA 54nm Extinktion CY5-TCCGCGGA 644nm (normiert) $EE'LH7HPSHUDWXUDEKlQJLJNHLWGHU([WLQNWLRQEHLXQGQP Aus der Messung ging hervor, dass die Duplexbildung keinen Einfluss auf die Absorption des Cy5 bei 644nm hatte, da beide temperaturabhängigen Extinktionen mit geicher Steigung abnahmen. Der Schmelzvorgang beim Templat bei 54nm konnte erkannt werden. Beim Cy5 TCCGp nahm bei 54nm die Extinktion mit der Temperatur weder ab noch zu, wodurch dieser Effekt beim Cy5 TCCGCGGA einzig und allein auf den Schmelzvorgang des Oligos zurückgeführt werden konnte. Die Extinktion stieg hier von 0.64 auf etwa an, was dann prozentual der gleichen Änderung des Extinktionskoeffizienten bei 54nm entsprechen musste. Daraus konnte der apparente Extinktionskoeffizient für 54nm bei C berechnet werden. Nun setzte man in Gleichung 5, auf S. 74 den apparenten Extinktionskoeffizienten für C ein. Der erhaltene Wert für ε Cy5 (54) stimmte gut mit dem auf der anderen Methode bestimmten Wert überein. Schließlich hatte man auch die Gelegenheit, das Experiment mit einer nichtselbstkomplementären Verbindung d( Cy5 ATTCCGCCGTTA) (57) [3] zu wiederholen, wodurch die Größenordnung des Wertes ein weiteres Mal bestätigt wurde. Für die Einstellung der Stammlösung von d( Cy5 TCCGp) (00a) konnte man diesen Wert einfach zum Extinktionskoeffizienten der Nukleobasen bei 54nm addieren. Für den Cy5-markierten Templatbaustein 0a war dies hingegen nicht möglich, da er selbstassoziiert vorlag und die Extinktion der Nukleobasen daher nicht genau bekannt war. Den zuvor bestimmten apparenten Extinktionskoeffizienten wollte man aus Gründen der Genauigkeit hierzu nicht verwenden. Stattdessen verwendete man d( Cy5 TCCGp) (00a) indirekt über die Extinktion bei 644nm als Standard. Man stellte eine definierte Stammlösung der Verbindung ein mit einer Konzentration von 33.3µM. Da die Extinktion bei 54nm im Bereich zwischen 0.4 und Extinktionseinheiten lag, dies war der lineare Messbereich des UV-Gerätes, die Absorption des Cy5 bei 644nm aber deutlich darüber lag, verdünnte man die Lösung gravimetrisch kontrolliert auf das vierfache Volumen. Nun war die Extinktion bei 54nm relativ klein und für eine genaue Einstellung der Lösung ungeeignet, die Extinktion von Cy5 bei 644nm lag aber nun bei.8 Einheiten und war gut messbar. Man kannte die Konzentration des Oligonukleotids, sie war von 33.3µM um das Vierfache auf 8.333µM verdünnt worden. Man stellte daher von d( Cy5 TCCGCGGA) eine Lösung 75

80 Voruntersuchungen zum System Cy3-Cy5 ein, die bei 644nm exakt die gleiche Extinktion zeigte. Sie musste dann ebenfalls die Konzentration 8.333µM besitzen. Von Cy3 gab es kein vergleichbares kommerziell erhältliches Derivat, so dass man hier ohne weitere Experimente für beide Moleküle den Extinktionskoeffizienten von verwendete. Inzwischen wurde über UV-Messungen eines Konjugates aus Cy3 und Cy5 im gleichen Molekül das Verhältnis der Extinktionskoeffizienten der beiden Farbstoffe bekannt, wobei berücksichtigt werden musste, dass Cy5 auch am Extinktionsmaximum von Cy3 absorbiert, nicht aber umgekehrt [08]. Das Verhältnis wurde zu.4947 bestimmt. Berechnete man nun den Extinktionskoeffizienten von Cy5 auf der Grundlage der eingestellten Stoffmenge bei 54nm und dividierte den erhaltenen Wert durch.4947, so zeigte sich, das der erhaltene Extinktionskoeffizient für Cy3 exzellent mit dem Literaturwert übereinstimmte. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Extinktionskoeffizienten im Rahmen der Möglichkeiten mitunter auf komplizierten Umwegen sowohl auf das neue Lösungsmittelsystem als auch aufeinander abgestimmt wurden, so dass die Fehler beim Einstellen der Stammlösungen unterhalb von % liegen sollten. Die für die Einstellung der Stammlösungen verwendeten Extinktionskoeffizienten der einzelnen Verbindungen sind in folgender Tabelle zusammengestellt: Verbindung ε relevante Wellenlänge [nm] Eingestellte Konzentration [µm] UV-Extinktion bei dieser Wellenlänge d( n CGGA) d( Cy3 TCCGp) d( Cy3 TCCGCGGA) - 0% Templat - 0% Templat - 30% Templat d( Cy5 TCCGp) d( Cy5 TCCGCGGA) In unabhängigen HPLC-Experimenten konnte gezeigt werden, dass die auf der Grundlage der berechneten Extinktionskoeffizienten eingestellten Stammlösungen die richtige Stoffmengenkonzentration hatten. Setzte man nämlich eine äquimolare Lösung vom Amino- 94a und Phosphatbaustein 00a aus diesen Stammlösungen an und ließ sie für 48h mit EDC reagieren, so konnte in der HPLC ausschließlich Produkt 54, aber keines der Edukte mehr detektiert werden. Ein Fehler bei der Bestimmung der Extinktionskoeffizienten hätte aber in einer Abweichung von der Äquimolarität resultiert, so dass eines der beiden Edukte zu einem gewissen Ausmaß hätte zurückbleiben müssen. Diese HPLC-Analyse ergab auch als wichtiges Resultat, dass unter den gewählten Bedingungen keine detektierbaren Nebenprodukte gebildet werden (die kleinen Signale hinter dem Phosphatbaustein 00a sind auf Dephophorylierungen während der Chromatografie auf der Säule zurückzuführen). 76

81 Vorbereitungen für die Fluoreszenzmessungen $ * * & G Q $ * * & * & & 7 \ & G $ * * & * & & 7 \ & 3 G S * & & 7 \ & G Entnahmezeitzeit der Kinetik [min] Retentionszeit [min] $EE'DV&\&\6\VWHPLQGHU3/& Thermodynamische Betrachtung zur Duplexbildung komplementärer und selbstkomplementärer DNA-Stränge [33] Da die Duplexbildung selbstkomplementärer und nicht-selbstkomplementärer Oligonukleotide während des Verlauf der Kinetik von entscheidender Bedeutung für die vorliegende Arbeit ist, seien einige thermodynamische Zusammenhänge kurz erläutert. Selbstkomplementärer Fall Man betrachtet die folgende Reaktion: 00 Aus dem Massenwirkungsgesetz folgt unmittelbar: K = [ M ] [ M] *OHLFKXQJ Definiert man nun X als den Anteil der Einzelstränge, die in Doppelsträngen assoziiert vorliegen, so gilt weiterhin: X = [ M ] [ M] [ M ] *OHLFKXQJ Die Gesamtkonzentration aller Einzelstränge im System, ganz gleich ob sie gepaart oder ungepaart vorliegen, berechnet sich zu: [ M] [ ] C ges = M *OHLFKXQJ Dieser Ausdrücke können ineinander eingesetzt und vereinfacht werden. Man erhält dann den Ausdruck: 77

82 Voruntersuchungen zum System Cy3-Cy5 X K = C X ges ( ) *OHLFKXQJ Komplementärer Fall Man betrachtet die folgende Reaktion: $%& Aus dem Massenwirkungsgesetz folgt unmittelbar: K = [ C] [ A][ B] *OHLFKXQJ Definiert man für den äquimolaren Spezialfall ([A] = [B]) die Variable X als den Anteil an Einzelsträngen, die gepaart vorliegen, [ ] X = C C ges *OHLFKXQJ worin C ges die Gesamtkonzentration an Oligonukleotidstängen bedeutet, unabhängig ob gepaart oder ungepaart, [ A] [ B] [ C] C ges = so kann man auch schreiben: X = [ C] [ A] [ B] [ C] = [ C] C ges *OHLFKXQJ *OHLFKXQJ Damit folgt analog zu obiger Herleitung: XC [ C ] = ges *OHLFKXQJ Will man nun [A] und [B] analog in Abhängigkeit von C ges und X ausdrücken, so muss man sich den Spezialfall der Äquimolarität zunutze machen; [A] = [B]: X = [ C] [ A] [ B] [ C] X = [ C] [ A] [ C] = [ C] [ A] [ C] *OHLFKXQJ Für [A] kann man demnach in Analogie schreiben: [ A] = [ C] X [ C] *OHLFKXQJ 78

83 Vorbereitungen für die Fluoreszenzmessungen Man setzt diesen Ausdruck nun wieder in das Massenwirkungsgesetz ein und vereinfacht entsprechend (immer mit der Einschränkung durch den Sonderfall, dass [A] = [B]), so erhält man: K = C ges X ( X ) *OHLFKXQJ Nun kann man den selbstkomplementären und komplementären Fall vergleichen: Am Schmelzpunkt, also bei der Temperatur T m ist X genau 0.5, d.h. die Hälfte aller Einzelstränge liegt frei, die andere Hälfte in Doppelsträngen assoziiert vor. Für die Gleichgewichtskonstanten der beiden Systeme folgt daraus unmittelbar: selbstkomplementärer Fall: K Tm = C ges X ( X ) Cges = *OHLFKXQJ komplementärer Fall: K Tm = C ges X 4 ( X ) Cges = *OHLFKXQJ Stöchiometrisch gesehen sollte man zum Vergleich eines komplementären und eines selbstkomplementären Systems dennoch die doppelte und nicht die vierfache Stoffmenge des selbstkomplementären Oligonukleotids einsetzen, um thermodynamisch die richtigen Bedingungen für einen Vergleich zu schaffen. Der selbstkomplementäre Duplex aus Oligomeren hat eine zweifache Rotationssymmetrie, die in keinem Einzelstrang oder lediglich komplementären Doppelstrang erreicht wird. Diese Eigenschaft macht die Assoziation zu Doppelsträngen um den Faktor weniger wahrscheinlich, d.h. der komplementäre Doppelstrang ist doppelt so stabil wie der selbstkomplementäre Duplex. Aus diesem Grund muss die Gleichung für den selbstkomplementären Fall korrigiert werden zu: K Tm = C ges *OHLFKXQJ Bestimmung der Komplexbildungskonstanten der Templatmoleküle Für ein detailierteres Verständnis der Eigenschaften der Moleküle und Komplexe im untersuchten [4,4]-[8]-System untersuchte man die Komplexassoziationskonstanten der beiden Templatmoleküle d( Cy3 TCCGCGGA) (0a) und d( Cy5 TCCGCGGA) (0a). Dafür nahm man UV-Schmelzkurven der Verbindungen in jeweils zwölf verschiedenen Konzentrationen auf. Als Lösungsmittel diente der Acetonitril enthaltende HEPES/NaOH-Puffer. Die thermodynamischen Daten der Duplexe ließen sich aus den UV-Schmelzkurven ableiten, allerdings basierte die Analyse auf der Annahme, dass es sich um einen sprunghaften Phasenübergang ohne Kooperativität handelte [34]. Man musste dabei 79

84 Voruntersuchungen zum System Cy3-Cy5 aus Symmetriegründen stets zwischen dem selbstkomplementären und nicht selbstkomplementären Fall unterscheiden! n ist in allen Gleichungen die an Anzahl der an der Komplexbildung beteiligten Spezies. nicht selbstkomplementärer Fall Die Auftragung von /T m gegen ln(c) liefert folgenden allgemeinen Zusammenhang: T m = [ R lnn] 0 ( n ) R S ( n ) H 0 lnc selbstkomplementärer Fall H 0 *OHLFKXQJ Dieser Fall war für die geplanten Untersuchungen maßgeblich, da die beiden untersuchten Oligonukleotide selbstkomplementär waren. Die Auftragung von /T m gegen ln(c) liefert folgenden allgemeinen Zusammenhang: T m = 0 ( n ) R S ( n ) H 0 lnc [ R ln R lnn] H 0 *OHLFKXQJ Für einen bimolekularen Komplex ist n =, so dass sich der Term vereinfacht zu: T m = 0 R ln S c 0 0 H H *OHLFKXQJ Aus der Steigung lässt sich somit H, dann aus dem Ordinatenabschnitt S ermitteln. Über die Gibbs-Helmholtz-Gleichung kann dann G und daraus K berechnet werden: G = H T S G = RT lnk *OHLFKXQJ *OHLFKXQJ Die Auftragung nach van t Hoff ergab folgende Linearisierung: /T m ln(c) /T m ln(c) $EE'LH/LQHDULVLHUXQJHQQDFKXCP V*QHH]XU%HVWLPPXQJGHU.RPSOH[DVVR]LDWLRQV NRQVWDQWHQYRQG&\7&&*&**$OLQNVXQGG&\7&&*&**$UHFKWV Man erkennt deutlich die tendezielle Übereinstimmung beider Messreihen. Das lineare Fitting lieferte die folgenden Daten für H = -(55 0)kJ/mol und S = -(70 80

85 FRET-Kinetiken als Einzelpunktmessungen ± 0)J/Kmol. Für G erhält man somit je nach Temperatur den folgenden Zusammenhang: T [ C] G [kj/mol] K homo [l/mol] An dieser Stelle sei nochmals darauf hingewiesen, dass aus statistisch thermodynamischen Gründen die heteromolekularen Duplexe doppelt so stabil sind, der korrespondierende Wert für K hetero also doppelt so groß ist. Vergleicht man die Ergebnisse für d( Cy3 TCCGCGGA) und d( Cy5 TCCGCGGA) miteinander, so stellt man fest, dass die Abweichungen der thermodynamischen Parameter innerhalb der Fehlergrenzen der Methode liegen. Es wurde daher davon ausgegangen, dass beide Duplexe die gleiche Stabilität besitzen. Aus chemischer Sicht gibt es auch keine Anzeichen, warum dem nicht so sein sollte. FRET-Kinetiken als Einzelpunktmessungen Nach dem die für die Messung der Kinetiken notwendigen Parameter ermittelt und die Stammlösungen eingestellt waren, konnte man sich ersten kinetischen Experimenten zuwenden. Die Kinetiken sollten in Wasser mit HEPES/NaOH durchgeführt werden, der Puffer, welcher zum Verdünnen diente, sollte dagegen wegen der Oberflächeneffekte zusätzlich 0% Acetonitril enthalten. Um die Fluoreszenzsignale bezüglich der Kinetik quantifizieren zu können, war eine Kalibrierung notwendig. Dazu war geplant, für einen entsprechenden Umsatz die Situation derart in eine Küvette einzupipettieren, wie sie für die Kinetik zu erwarten sei. Dies bedeutet, dass man d( n CGGA) (94a), d( Cy5 TCCGp) (00a), d( Cy3 TCCGCGGA) (0a) und d( Cy5 TCCGCGGA) (0a) in den entsprechenden Stoffmengen einpipettierte und die Akzeptorfluoreszenz gemessen wurde. Auch hierbei sollte also wieder der Templatbaustein 0a das wahre Ligationsprodukt mit Phosphoramidatbindung d( Cy5 TCCG PNH CGGA) (54) simulieren. Über die Fluoreszenz-Umsatz-Kurven sollte dann aus der Messung der Kinetiken der jeweils korrespondierende Umsatz bestimmt werden. Es waren zum Zwecke der Kalibrierung zwei verschiedene Dichten zu unterscheiden: 0% CH 3 CN in H O: δ = 0.96gcm -3 0.M HEPES-Puffer mit 0.05M NaOH in 0% CH 3 CN in H O: δ = gcm -3 Mit Hilfe dieser beiden Dichten konnten die Lösungen, welche für die Kalibrierung notwendig waren, gravimetrisch kontrolliert einpipettiert werden. Die Dichte von 0.96gcm -3 war wesentlich für das Einpipettieren der richtigen Stoffmengen der einzelnen Moleküle. Das Lösungsmittel wurde dann im SpeedVac evaporiert. Die 8

86 Theoretische Beschreibung der Kalibrierkurven zweite Dichte von 0.988gcm -3 war nun wichtig, da mit ihrer Hilfe das Volumen eingestellt werden konnte, in dem dann die Mischung aller Moleküle gelöst und die Fluoreszenz gemessen wurde. Theoretische Beschreibung der Kalibrierkurven Bevor man mit der Messung der eigentlichen Kinetiken begann, suchte man nach einer theoretischen Beschreibung der Vorgänge, welche im Reaktionsgefäß stattfanden. Ein theoretisches Modell hatte nämlich den Vorteil, dass damit im Vorfeld diejenigen stöchiometrischen Verhältnisse der Bausteine für die Kinetik derart abgeschätzt werden konnten, dass dann im Experiment während der Kinetik eine maximale Änderung der induzierten Akzeptorfluoreszenz sollte beobachtet werden können. Im Laufe der Reaktion bildeten sich drei verschiedene Arten von Oktamer-Duplexen aus: Cy33 (0a 0a), Cy55 (0a 0a) und Cy35 (0a 0a) (vgl. Abb. 48, S. 50). Nur der heteromolekulare Duplex sollte Beiträge zum FRET liefern. Die Wahrscheinlichkeiten zur Ausbildung der verschiedenen Duplexe sollten sich aus dem Produkt der Konzentrationen der verschiedenen Oktamere ergeben, wobei im heteromolekularen Fall noch ein Korrekturfaktor eingeführt wurde, um zu berücksichtigen, dass die Kombination Cy35 genauso wahrscheinlich war wie Cy53. Der Anteil an heteromolekularem Duplex ergab sich aus der Wahrscheinlichkeit hierfür, geteilt durch die Summe aller Wahrscheinlichkeiten: [ Cy3] [ Cy3][ Cy5] [ Cy5] [ Cy3][ Cy5] *OHLFKXQJ Dieser Anteil musste jedoch noch multipliziert werden mit der Gesamtzahl der zum FRET befähigten Oktamere: [ Cy3] [ Cy3][ Cy5] [ Cy3][ Cy5] ([ Cy3] [ Cy5]) = [ Cy5] [ Cy3][ Cy5] [ Cy3] [ Cy5] *OHLFKXQJ Es kam jedoch erschwerend hinzu, dass aus Symmetriegründen die selbstkomplementären Duplexe Cy33 und Cy55 nur halb so stabil wie die heteromolekularen Duplexe waren (vgl. S. 77). Um dies angemessen zu berücksichtigen, mussten die thermodynamischen Parameter ins Spiel komen. Als Berechnungsgrundlage dienten die folgenden Gleichungen: G = RT lnk [ A ] mitk = [ A] *OHLFKXQJ *OHLFKXQJ [A ] war hierin die Konzentration der Duplexe, [A] die Konzentration der freien Einzelstränge. Diese beiden Konzentrationen waren nicht direkt zugänglich, die Gesamtkonzentration [C ges ] aller zur Duplexbildung befähigten Templatmoleküle (d( Cy3 TCCGCGGA) und d( Cy5 TCCGCGGA)) konnte jedoch für jeden beliebigen 8

87 FRET-Kinetiken als Einzelpunktmessungen Umsatz berechnet werden (initiale Konzentration an d( Cy3 TCCGCGGA) zuzüglich bereits durch die Reaktion gebildetes d( Cy5 TCCG PNH CGGA)). Man erhielt somit die folgende Nebenbedingung: [ A ] [ A] = [ C ges ] *OHLFKXQJ Setzte man diese Gleichungen ineinander ein und löste nach [A ] auf, so erhielt man eine quadratische Gleichung, deren physikalisch sinnvolle Lösung wie folgt lautete: 8 8 G G RT RT [ A ] = e 4[ C ] e 4[ C ] ges ges [ C ] ges 4 *OHLFKXQJ In den Simulationsrechnungen konnte C ges immer als die Summe des Umsatzes zuzüglich der initial eingesetzten Templatmenge berechnet werden. Dieser Wert änderte sich also fortlaufend mit der Reaktion. Den korrekten Molenbruch der einzelnen Duplexe erhielt man nun durch Kombination von Gleichung 30 mit Gleichung 6. Dabei mussten die verschiedenen Werte für G von den heteromolekularen und homomolekularen Duplexen berücksichtigt werden. Statistisch thermodynamisch galt, dass die Assoziationskonstante K für den heteromolekularen Komplex doppelt so groß wie für die homomolekularen Komplexe war (vgl. S. 77f). Die thermodynamischen Paramenter wurden dafür für d( Cy5 TCCGCGGA) (0a) und d( Cy3 TCCGCGGA) (0a) durch UV-Schmelzkurven bei verschiedenen Temperaturen bestimmt (vgl. S. 79f). Aus den ermittelten Werten für H und S konnte für jede Temperatur ein Wert für G berechnet werden. Über Gleichung 5 war damit eine Komplexassoziationskonstante für den homomolekularen Duplex K homo aus d( Cy5 TCCGCGGA) bestimmt. Es stellte sich bei den Schmelzkurven heraus, dass der Wert für d( Cy3 TCCGCGGA) vergleichbar war. Für den heteromolekularen Komplex aus d( Cy5 TCCGCGGA) mit d( Cy3 TCCGCGGA) war er dagegen doppelt so groß. Aus diesem K hetero konnte umgekehrt wieder aus Gleichung 5 ein entsprechender Wert für G berechnet werden. Für die Berechnung eines bezüglich der Nebenbedingung K hetero = K homo korrigierten Molenbruchs konnte man nun folgenden Ansatz machen: Zunächst definierte man zur besseren Übersichtlichkeit die Ausdrücke für die effektive Templatkonzentration der homomolekularen und heteromolekularen Duplexe [D homo ] und [D hetero ]: 8 8 Ghom o Ghom o RT RT [ D ] = e 4[ C ] e 4[ C ] homo 8 ges Ghetero Ghetero RT RT [ D ] = e 4[ C ] e 4[ C ] hetero ges 8 ges ges [ C ] ges 4 [ C ] 4 ges *OHLFKXQJ *OHLFKXQJ Die Molenbrüche der einzelnen Duplexe ergaben sich nun aus Gleichung 33 bis Gleichung 35: 83

88 Theoretische Beschreibung der Kalibrierkurven M Cy 35 = * * [ Cy3][ Cy5] Dhetero [ Cy3][ Cy5] Dhetero [ Cy3] Dhomo [ Cy5] Dhomo *OHLFKXQJ M Cy 33 = * [ Cy3] Dhomo [ Cy3][ Cy5] Dhetero [ Cy3] Dhomo [ Cy5] Dhomo *OHLFKXQJ M Cy 55 = * [ Cy5] Dhomo [ Cy3][ Cy5] Dhetero [ Cy3] Dhomo [ Cy5] Dhomo *OHLFKXQJ Das Produkt aus diesem Molenbruch mit der Konzentration des jeweiligen Duplex (statistische Betrachtung für die Verteilung der einzelnen Duplexe untereinander) lieferte dann in sehr guter Näherung die absolute Konzentration der jeweiligen Duplexe ([Cy33], [Cy55] und [Cy35]): [ Cy33 ] = M Cy 33Dhomo [ Cy55 ] = M Cy 55Dhomo [ Cy35 ] = M Cy 35Dhetero *OHLFKXQJ *OHLFKXQJ *OHLFKXQJ Grafisch ergab sich bei Verwendung der tatsächlich gemessenen thermodynamischen Parameter folgende Abhängigkeit: Konzentration Duplexe 6.0µ 0% Templat, T = 5 C, c = 40µM 4.0µ G homo = -3969J/mol, G hetero = -440J/mol,.0µ 0.0µ 8.0µ 6.0µ 4.0µ.0µ Stoffmenge (Cy33) Stoffmenge (Cy55) Stoffmenge (Cy35) Umsatz [%] $EE'DV9HUKlOWQLVGHUGUHLLP*OHLFKJHZLFKWVWHKHQGHQ'XSOH[HLQ$EKlQJLJNHLWYRP8PVDW] Folgende Zusammenhänge waren dabei auffällig: Die Gesamtkonzentration der Eduktbausteine betrug bei 0% Umsatz 40µM. Der homomolekulare Donorduplex (Cy33) fiel kontinuierlich von einer Konzentration knapp unterhalb von 4µM auf annähernd 0µM ab. Die Daten waren für 0% initiale Templatkonzentration simuliert, die Gesamtkonzentration an Cy3 TCCGCGGA (einzelsträngig und zum Duplex assoziiert) betrug somit 8µM und änderte sich während der gesamten Reaktion nicht. Lagen zu Beginn der Reaktion fast alle Template mit sich selbst assoziiert vor, so betrug die maximal mögliche Duplexkonzentration folglich genau 4µM. Die Konzentration an heteromolekularen Duplexen (Cy35) stieg stetig an und hatte den Grenzwert von 8µM, da im Idealfall bei unendlichem Überschuss von 84

89 FRET-Kinetiken als Einzelpunktmessungen d( Cy5 TCCGCGGA) alle d( Cy3 TCCGCGGA) mit d( Cy5 TCCGCGGA) abgesättigt vorlagen, die Konzentration der heteromolekularen Duplexe entsprach dann der Konzentration an Cy3-Templatmolekülen im System, also 8µM. Die Konzentration des homomolekularen Akzeptorduplexes (Cy55) stieg stetig und ohne Grenzwert an. Ab einer gewissen Absättigung von d( Cy3 TCCGCGGA) entstanden im wesentlichen nur noch homomolekulare Duplexe aus d( Cy5 TCCGCGGA). Dieses theoretische Modell ermöglichte es nun, die absoluten Konzentrationen der Duplexe vorauszusagen. Insbesondere war dabei der heteromolekulare Duplex Cy35 von Interesse. Für verschiedene Temperaturen ergab sich die berechnete Stoffmengenkonzentration der heteromolekularen Duplexe bei 5% initialer Templatzugabe aus folgender Abbildung: Konzentration heteromolekularer Duplexe.8µ 5% Templat, c = 40µM.6µ.4µ.µ.0µ 800.0n 600.0n 400.0n 00.0n C 5 C 0 C 5 C 30 C Umsatz [%] $EE'HU(LQIOXVVGHU7HPSDUDWXUDXIGLH3RSXODWLRQGHVKHWHURPROHNXODUHQ'XSOH[HV&\ Theoretisch ergab sich für simulierte verschiedene Templatkonzentrationen unter isothermen Bedingungen ganz allgemein der folgende, normierte Kurvenverlauf: rel. FRET normiert % (normiert) 5% (normiert) 0% (normiert) 0% (normiert) 30% (normiert) 50% (normiert) 00% (normiert) Umsatz [%] $EE'HUUHODWLYH.XUYHQYHUODXII UGHQKHWHUHRPROHNXODUHQ'XSOH[&\EHL 9HUZHQGXQJXQWHUVFKLHGOLFKHULQLWLDOHU7HPSODWPHQJHQ Erwartungsgemäß zeigte sich, dass für geringe Templatkonzentrationen von d( Cy3 TCCGCGGA) der Sättigungswert bei geringeren Umsatzraten schnell erreicht wurde. Da bei den experimentellen Kinetiken mit hohen Umsatzraten nicht zu rechnen war, ging aus diesen Kurvenverläufen bereits hervor, dass die verwendeten initialen Templatmengen im Bereich von 5 bis 30 mol% liegen sollten, um eine große Änderung der induzierten Akzeptorfluoreszenz beobachten zu können. Bei geringen 85

90 Theoretische Beschreibung der Kalibrierkurven Umsätzen sollte man hier deutliche Änderungen beobachten können, bei größeren Umsätzen würde dann allerdings der Fehler in der Bestimmung eines zu einer rel. Fluoreszenz gehörenden Umsatzwertes zu groß, da hier nur noch geringfügige Änderungen der Fluoreszenz zu erwarten waren. Der Zusammenhang zwischen Fehler und Umsatz ist in folgender Abbildung veranschaulicht: rel. Fluoreszenz Meßwert Umsatz [%] $EE'HU)HKOHUEHLP$EOHVHQHLQHV]XHLQHUJHPHVVHQHQ)OXRUHV]HQ]JHK UHQGHQ8PVDW]HVEHL GHU.DOLEULHUXQJXQGGLHbQGHUXQJGLHVHV)HKOHUVPLWGHP8PVDW] Aufnahme der Kalibrierkurven Man nahm zu diesem Zweck drei Kalibrierkurven mit 0, 0 und 30mol% Templat bezogen auf eine Gesamtkonzentration von 40µM in der Küvette (nicht in der Kinetik!) auf. Jede Messreihe bestand aus 0 Messpunkten, deren Dichte bei geringeren Umsätzen höher als bei größeren Umsätzen war. Die auf der Grundlagen verschiedener Empfindlichkeiten des Photomultipliers aufgenommenen Daten sind im folgenden gegenübergestellt: rel. Fluoreszenz Umsatz [%] rel. Fluoreszenz Umsatz [%] rel. Fluoreszenz Umsatz [%] $EE([SHULPHQWHOODXIJHQRPPHQH.DOLEULHUNXUYHQI UXQGPROLQLWLDO]XJHJHEHQHV 7HPSODWG&\7&&*&**$OLQNV0LWWHUHFKWV Die experimentellen Daten gaben qualitativ den korrekten Kurvenverlauf wie in der theoretischen Vorhersage wieder, wichen absolut jedoch signifikant von den berechneten Kurven ab. 86

91 FRET-Kinetiken als Einzelpunktmessungen rel. FRET normiert 0% Templat simuliert 0% Templat simuliert 30% Templat simuliert 0% Templat gemessen 0% Templat gemessen 30% Templat gemessen Umsatz [%] $EE'LH$EZHLFKXQJGHUJHPHVVHQHQQRUPLHUWHQ.DOLEULHUNXUYHQYRQGHU7KHRULH Die Gründe für die Abweichung sind im folgenden aufgeführt: Nichtlinearität der durch das Gerät gemessenen Fluoreszenz Störung durch andere Komplexe (z. B. zwischen d( Cy3 TCCGCGGA) (0a) und d( Cy5 TCCGp) (00a)) D D $EE(LQP JOLFKHU)5(7DNWLYHU.RPSOH[]ZLVFKHQHLQHP7HWUDXQGHLQHPNWDPHU Aus thermodynamischen Gründen sollte wegen der sehr großen Stabilitätsunterschiede zwischen tetrameren und oktameren Duplexen in selbstkomplementären Systemen derartige Komplexe allerdings nur sehr gering populiert sein. Zunahme der Duplexstabilität durch Ansteigen der Oktamerkonzentration während der Reaktion, d.h. Anstieg des Anteils von Duplex gegenüber der nicht assoziierten Form mit steigendem Umsatz, da die Duplexstabilität eine Funktion der Konzentration ist Im Experiment wird nicht nur auf FRET beruhende Fluoreszenz gemessen, sondern auch Untergrundfluoreszenz. Diese wurde zwar von den theoretisch berechneten Kurven abgezogen; es ist jedoch davon auszugehen, dass die Untergrundfluoreszenz zumindest bei Messung der induzierten Akzeptorfluoreszenz nicht konstant ist, da z. B. d( Cy5 TCCGp) während der Reaktion verbraucht wird. Diese Abweichung von Theorie und Praxis war allerdings für die Durchführung der Kinetiken unerheblich, da alle Effekte, wie z.b. die Untergrundfluoreszenz und Beteiligung niedermolekularer Komplexe dadurch berücksichtigt wurden, dass auch die Eduktbausteine in den Lösungen für die Kalibrierkurven entsprechend einpipettiert wurden. 87

92 Durchführung der Kinetiken Durchführung der Kinetiken Die Experimente wurden zunächst in µl-kapillaren durchgeführt, die Konzentration der Oligonukleotide betrug mm, die von EDC 0.M. Alle Messungen erfolgten in Wasser mit 0.M HEPES/NaOH bei ph Die am SpeedVac evaporierten Substanzmischungen wurden dazu zunächst im definierten Volumen des Kinetikpuffers gelöst und dann unmittelbar in die Kapillaren überführt. Zum Lösen verwendete man dazu ein konisch ausgebohrtes Teflongefäß, um die Oberflächeneffekte so gering wie möglich zu halten. Dieses war in seinen äußeren Dimensionen in Anlehnung an Eppendorf-Gefäße gefertigt worden, um es auch im SpeedVac verwenden zu können. Man löste zunächst die Oligonukleotide in reinem Lösungsmittel um zu gewähleisten, dass die Kapillaren möglichst schnell nach Zugabe des EDC befüllt werden könnten. Erst dann versetzte man mit der EDC- Lösung, deren Konzentration entsprechend so eingestellt war, dass nach Vermischung beider Lösungen eine Konzentration von 0.M vorlag. Die an beiden Enden offenen Kapillaren wurden durch die Kapillarwirkung befüllt, in eine geeignete Halterung gespannt und in einer mit Wasserdampf gesättigten Atmosphäre bei der gewünschten Temperatur inkubiert. Zu bestimmten Zeiten entnahm man einzelne Kapillaren, verdünnte diese auf 500 bzw. 000µl mit Acetonitril enthaltendem HEPES/NaOH-Puffer und überführte die Lösung in die Küvette. Man kühlte die Küvette dabei auf 8 C ab um zu gewährleisten, dass die Messungen für die Kinetiken unter den gleichen Bedingungen wie die für die Kalibrierkurven erfolgten. Man übertrug mit Hilfe der Kalibrierkurven die gemessene Fluoreszenz zu einer bestimmten Reaktionszeit auf den korrespondierenden Umsatz und gelangte so von den Fluoreszenz-Zeit-Kurven zu den Umsatz-Zeit-Kurven. Sehr schenell stellte man fest, dass eine Konzentration der Oligonukleotide von mm zu groß war. Die Reaktion verlief so schnell, dass bereits nach 5 Minuten eine deutliche Signaländerung in der Fluoreszenz zu erkennen war. Da aber etwa fünf Minuten benötigt wurden, um nach dem Start der Kinetik mit EDC die Kapillaren zu befüllen und in das temperierte Reaktionsgefäß zu überführen, waren die Reproduzierbarkeiten der Messwerte sehr gering. Man beschloss daher, die Reaktionsgeschwindigkeit durch Verdünnung auf 0.5mM herabzusetzen. Bei gleicher Stoffmenge ging man von µl- auf µl-kapillaren über. In Anlehnung an die durch HPLC analysierten Kinetiken begann man mit einer Reaktionstemperatur von 30 C. Die Reproduzierbarkeit der einzelnen Messungen war immer noch nicht vollständig gewähleistet. Dies lag an einer nicht vollständig gleichmäßigen Aufteilung der Reaktionslösung auf die einzelnen Kapillaren. Dies stellte man fest, indem man den Templatbaustein d( Cy3 TCCGCGGA) als eine Art internen Standard verwendete. Seine Konzentration änderte sich durch die Reaktion nicht, so dass in jeder Kapillare genau die gleiche durch Cy3 verursachte Fluoreszenz zu beobachten sein sollte. Bei Raumtemperatur konnte man die Fluoreszenz jedoch nicht bestimmen, da dann Assoziate mit verschiedenen Mengen an d( Cy5 TCCG PNH CGGA) (54) ausgebildet wurden, die die Donorfluoreszenz schwächten. Je nachdem, zu welchen Zeitpunkt die Kapillaren entnommen wurden, war die Reaktion unterschiedlich weit fortgeschritten. Man vermaß die Fluoreszenz daher bei 75 C, um alle Duplexe aufzuschmelzen, und verglich die Werte mit den Lösungen, mit denen man zuvor die Kalibrierkurven aufgenommen hatte. Es zeigte sich, dass eine homogenere Verteilung auf die Kapillaren erfolgte, wenn man vor dem Befüllen der Kapillaren einen Rührfisch in das Teflongefäß gab und 5 Minuten rührte, ehe man mit der EDC-Lösung versetzte. 88

93 FRET-Kinetiken als Einzelpunktmessungen Man variierte nun bei gleicher Reaktionstemperatur (30 C) und Konzentration der Eduktbausteine (0.5mM) die initiale Templatmenge (0, 0 und 30%), da man für diese drei Konzentrationen die Kalibrierkurven aufgenommen hatte. Die Reproduzierbarkeit einzelner Messungen war mitunter recht gut, es gelang aber nicht, einen ganzen Satz von drei Experimenten komplett zu wiederholen. Man entschied sich daher, die Konzentration der Oligonukleotide weiter herabzusetzen, um die Kinetik weiter zu verlangsamen. Man ging zu 5µl-Kapillaren über, die Konzentration der Bausteine betrug also 0.mM. Dies hatte den Vorteil, dass das Volumen, in dem die Oligonukleotide vorgelöst wurden, deutlich größer war, so dass eine homogene Verteilung auf die Kapillaren sichergestellt sein sollte. Erstaunlicherweise hatte die auf die Anfangskonzentration von mm bezogene Verdünnung um den Faktor 5 einen viel kleineren Einfluss auf die Replikationsgeschwindigkeit als vermutet. Ein typisches Resultat einer derartigen Messserie ist in der folgenden Abbildung dargestellt: Umsatz [%] % Templat 0% Templat 30% Templat Zeit [min] $EE'LH9DULDWLRQGHU7HPSODWPHQJHEHLP0OLJRQXNOHRWLGNRQ]HQWUDWLRQ Ein Templateffekt war deutlich zu erkennen, auch wenn die experimentelle Reproduzierbarkeit zu diesem Zeitpunkt noch nicht optimal war. Beachtenswert war jedoch, dass nach 0 Minuten unter diesen Bedingungen immer noch mehr als 5% Umsatz erreicht wurden. Es stellte sich daher die Frage, ob es nicht doch möglich sei, bei noch stärkerer Verdünnung direkt online in der Küvette Kinetiken zu vermessen. Wegen des Quenchings müsste man dazu allerdings 5 bis 0ml weiter verdünnen und gelangte damit in Konzentrationsbereiche von 0 bis 50µM. Zuvor hätte man nicht vermutet, dass unter diesen Bedingungen überhaupt die Möglichkeit bestanden hätte, einen Reaktionsverlauf zu erkennen. Da die Vorteile der Online-Messungen auf der Hand lagen, wandte man sich der Optimierung des Systems hinsichtlich weiterer Verdünnung zu und beschäftigte sich nicht weiter mit der Optimierung der Kapillartechnik. FRET-Kinetiken als Online-Messungen Es stellten sich unmittelbar die drei entscheidenden Fragen: Wie weit konnte man verdünnen und noch in vertretbaren zeitlichen Dimensionen Signaländerungen am Fluorimeter beobachten? Sah man FRET auch bei höheren Temperaturen in der Küvette? Lief die Reaktion auch schnell bei tieferer Temperatur? 89

94 Durchführung der Kinetiken Aus experimenteller Sicht sollte zu diesem Zeitpunkt eine weitere Verdünnung möglich sein, da bereits eine Verdünnung von 0.mM um den Faktor 5 eine Konzentration von 40µM bedeuten würde und in einer Küvette vermessen werden können sollte. Für die Untersuchung längerer Templatsequenzen sollte die Verdünnung zusätzlich günstig sein, da die Assoziationstendenz nach dem Massenwirkungsgesetz mit der Verdünnung abnimmt. In diesem Fall sind daher geringere Reaktionstemperaturen für einen Tunover erforderlich. 45 C waren als geschätzte Obergrenze für EDC-vermittelte Reaktionen vorgegeben. Man entschied sich, die Online-Kinetiken wegen der Oberflächeneffekte insgesamt in HEPES/NaOH-Puffer durchzuführen, der aber zusätzlich 0% Acetonitril enthalten sollte. Die Anregungswellenlänge betrug wieder 500nm, die Emissionswellenlänge 655nm (Akzeptorfluoreszenzzunahme), die Reaktionstemperatur betrug 5 C, die Konzentration lag bei 40µM bezogen auf die Oligonukleotide mit 0mol% Templat, 0.M für EDC. Man erhielt das folgende, vielversprechende Fluoreszenz-Zeit-Diagramm der ersten Online-Kinetik: rel. Fluoreszenz Zeit [min] $EE'LHHUVWHDXIJHQRPPHQHPNKPG.LQHWLNPLW'HWHNWLRQGHU$N]HSWRUIOXRUHV]HQ] Eine fundamentale Änderung für die kinetische Verfolgung selbstreplizierender Systeme zeichnete sich ab. Man überlegte zusätzlich, ob es nicht möglich sei, die Kalibrierung mit in das Fitting der kinetischen Daten einzubeziehen. Dies hätte den Vorteil, dass man neben dem erheblichen Aufwand für die Kalibrierungen auch eine signifikante Menge der Substanzen einsparen und weitere Fehlerquellen verhindern könnte. Die thermodynamischen Daten für die Komplexbildung unter den entsprechenden Reaktionsbedingungen waren bekannt (0% Acetonitril im HEPES/NaOH-Puffer), es sollte daher möglich sein, im Sinne eines dynamischen Gleichgewichtes Hin- und Rückreaktion zwischen Duplex und Einzelstrang derart festzulegen, dass der Quotient der Geschwindigkeitskonstanten der Gleichgewichtskonstante entsprach. Diese allgemeinere Kalibrierung sollte nur auf einen einzigen absoluten und unabhängigen Messwert bezogen sein, den man für die Kinetik zusätzlich einpipettieren musste. Sinnvollerweise handelte es sich bei diesem Wert um den simulierten Wert für 00%-Umsatz (siehe unten). Das für diesen Wert gemessene Signal müsste von allen Messwerten der Kinetik als Untergrundfluoreszenz abgezogen werden, die verbleibende Signaländerung entspräche der sich ändernden Population FRET-aktiver Duplexe zwischen 0 und 00% Umsatz. 90

95 FRET-Kinetiken als Online-Messungen Eine allgemeiner angelegte Kalibrierung war an verschiedene Bedingungen und Voraussetzungen geknüpft, die im folgenden erläutert werden sollen. Das zugrundeliegende mechanistische Modell für den Replikator Die Kinetiken sollten mit Hilfe des Computerprogramms SimFit ausgewertet werden [35]. Dieses Programm ermöglicht es, kinetische Messdaten an einen vorgegebenen Reaktionsmechanismus zu fitten. Das Programm ist so aufgebaut, dass mit ihm auch für gegebene Anfangskonzentrationen und Geschwindigkeitskonstanten vollständige Simulationen der Reaktionen durchgeführt werden können. Insbesondere sind auch Mischungen beider Anwendungsmöglichkeiten realisierbar: bestimmte Geschwindigkeitskonstanten können fixiert vorgegeben werden, andere werden dann auf der Grundlage von den Messdaten und den gegebenen Reaktionen gefittet. Allgemein kann man davon ausgehen, dass die Kinetik umso zuverlässiger an das Modell gefittet wurde, je weniger frei wählbare Geschwindigkeitskonstanten vorgegeben wurden, ohne dass sich dabei die statistische Güte des Fits signifikant verschlechtert. Ein mögliches Reaktionsmodell für die Kinetiken, bei denen die initiale Templatmenge variiert wurde, konnte wie folgt formuliert werden: &\ $ % &\ $ % &\ & &\ $ % &\ & &\ $%& &\ $%& &\ & &\ $%& &\ $%& &\ & &\ & QLFKWDXWRNDWDO\WLVFKHU 5HDNWLRQVNDQDO UHYHUVLEOH%LOGXQJ WHUPROHNXODUHU.RPSOH[H LUUHYHUVLEOH5HDNWLRQDXV WHUPROHNXODUHQ.RPSOH[HQ ]X'XSOH[HQ &\ & &\ & &\ & &\ & &\ & &\ & &\ & UHYHUVLEOHV*OHLFKJHZLFKW ]ZLVFKHQ(LQ]HOVWUDQJXQG 'XSOH[ $EE0 JOLFKH)RUPXOLHUXQJGHU5HDNWLRQVJOHLFKXQJHQGLHGHQ5HSOLNDWLRQVSUR]HVVEHVFKULHEHQ In SimFit sollte nun jedem Reaktionspfeil eine Geschwindigkeitskonstante, jedem Gleichgewicht ein Paar von Geschwindigkeitskonstanten für Hin- und Rückreaktion zugeordnet werden können. Der untere Block reversibles Gleichgewicht zwischen Einzelstrang und Duplex sollte im wesentlichen für die Kalibrierung notwendig sein. Da die thermodynamischen Parameter dieser drei Gleichgewichte bekannt waren, konnten die Geschwindigkeitskonstanten für diesen Teil im Programm fixiert vorgegeben werden können. Die übrigen Prozesse müssten dann an die kinetischen Daten gefittet werden. Da jedoch keine thermodynamischen Daten über die Bildung der termolekularen Komplexe bekannt und diese experimentell auch nur sehr schwer zugänglich waren, sollte eine weitere Vereinfachung des Reaktionsmodells eingeführt werden. Die Blöcke reversible Bildung termolekularer Komplexe und irreversible Reaktion aus termolekularen Komplexen zu Duplexen sollten wie folgt zusammengefasst werden: 9

96 Das zugrundeliegende mechanistische Modell für den Replikator &\ $ % &\ $ % &\ & &\ & &\ & &\ & LUUHYHUVLEOH%LOGXQJGHU 'XSOH[HDOVWHUPROHNXODUHU 3UR]HVV $EE9HUHLQIDFKXQJGHV]XJUXQGHJHOHJWHQ5HDNWLRQVPHFKDQLVPXV$XVVFKQLWW Dies war möglich, da die eigentliche Ligationsreaktion als geschwindigkeitsbestimmender Schritt bekannt war. Die Bildung der termolekularen Komplexe war demnach nur ein vorgelagertes Gleichgewicht, das formal mit in die Geschwindigkeitskonstanten einbezogen werden konnte. In diesem Modell konnten nun zusätzlich einzelne Geschwindigkeitskonstanten zusammengefasst werden. Man sollte wegen des quasi thermodynamisch identischen Verhaltens der Templatmoleküle d( Cy3 TCCGCGGA) und d( Cy5 TCCGCGGA) davon ausgehen, dass beide termolekularen Prozesse mit der gleichen Geschwindigkeit ablaufen sollten. Auch für die Gleichgewichte der beiden homomolekulaten Duplexe Cy33 und Cy55 konnte man identsche Werte einsetzen, die Werte für Cy35 mussten nur derart abgeändert werden, dass die resultierende Gleichgewichtskonstante K hetero doppelt so groß war wie K homo. Das gesamte Reaktionsmodell sollte demnach an lediglich nur noch zwei unabhängige Geschwindigkeitskonstanten k und k gefittet werden können, alle anderen notwendigen Parameter waren bekannt und konnten vorgegeben werden: &\ $ % &\ $ % &\ $ % &\ & &\ & &\ & &\ & &\ & &\ & &\ & &\ & &\ & &\ & &\ & &\ & QLFKWDXWRNDWDO\WLVFKHU 5HDNWLRQVNDQDO LUUHYHUVLEOH%LOGXQJGHU 'XSOH[HDOVWHUPROHNXODUHU 3UR]HVV UHYHUVLEOHV*OHLFKJHZLFKW ]ZLVFKHQ(LQ]HOVWUDQJXQG 'XSOH[ $EE5HDNWLRQVPHFKDQLVPXVPLW%HU FNVLFKWLJXQJGHU/LJDWLRQVUHDNWLRQDOVLUUHYHUVLEOHU WHUPROHNXODUHU3UR]HVV5HGXNWLRQDXIQXU]ZHLIUHLZlKOEDUH*HVFKZLQGLJNHLVNRQVWDQWHQN XQGN N N Einzige Observable bei der Messung war die durch den heteromolekularen Duplex Cy35 verursachte Fluoreszemzänderung von Cy3 und Cy5. Theoretisch sollten zwar auch die termolekularen Komplexe aus d( n CGGA), d( Cy5 TCCGp) und d( Cy3 TCCGCGGA) und die Duplexe von d( Cy5 TCCGp) mit d( Cy3 TCCGCGGA) ein FRET-Signal liefern, ihre Population sollte aber im Vergleich zu den wesentlich stabileren Templat-Duplexen sehr gering sein, so dass man sie vernachlässigen konnte. Der Stabilitätsunterschied zwischen den Oktamer-Duplexen und den Tetramer-Oktamer-Assoziaten ist dafür viel zu groß! Zweifelsfrei wären sie bei Aufnahme einer Kalibrierkurve, wie sie für die Kapillar-Kinetiken aufgenommen worden war, berücksichtigt worden, da hier auch die Edukte in den erforderlichen Stoffmengen vorlagen, praktisch sind sie aber irrelevant. Es mussten die folgenden beiden Bedingungen erfüllt sein, um in der gewünschten Weise eine Kalibrierung durchführen zu können: Das vom heteromolekularen Duplex ausgehende FRET-Signal musste linear mit seiner Stoffmengenkonzentration korreliert sein. 9

97 FRET-Kinetiken als Online-Messungen Die Untergrundfluoreszenz durfte sich während der gesamten Kinetik nicht ändern. Die Linearität der Signale war bei ausreichender Verdünnung gewähleistet, dies konnte durch Konzentrationsreihen der einzelnen Fluoreszenzfarbstoffe gezeigt werden. Die Untergrundfluoreszenz bereitete dagegen größere Probleme. Die Gesamtstoffmenge jedes Fluorophors blieb zwar während der Reaktion konstant, es wurde jedoch kontinuierlich d( Cy5 TCCGp) (00a) in d( Cy5 TCCGCGGA) (0a) umgewandelt. Bei Messung der induzierten Akzetorfluoreszenzzunahme änderte sich daher chemisch der Zustand desjenigen Bausteins, an dem gewissermaßen die Messsonde verankert war. Es war vorher schon gezeigt worden, dass die Fluoreszenz der beiden Fluorophore im isolierten Zustand unabhängig davon war, ob die Bausteine als Einzelstrang oder im homomolekularen Duplex assoziiert vorlagen. Prinzipiell musste man davon ausgehen, dass sich die Grundfluoreszenz additiv aus zwei Beiträgen zusammensetzte, und zwar aus der Grundfluoreszenz von Cy3 und der Grundfluoreszenz von Cy5. Ob der FRET im heteromolekularen Duplex die Grundfluoreszenz in irgendeiner Weise störte, konnte experimentell nicht im Sinne einer steady-state-messung untersucht werden, da hier Grundfluoreszenz und FRET nur als Summe messbar waren. Es war jedoch für die beabsichtigte Methode der Kalibrierung wahrscheinlich erforderlich, dass die Anregungs- und Emissionswellenlänge so gewählt wurden, dass nur die Fluoreszenz eines einzelnen Fluorophors, also von Cy3 oder Cy5 vermessen wurde, nicht aber die überlagerte Fluoreszenz beider Farbstoffe. Andernfalls wäre die eigentliche Observable, die durch den FRET-aktiven heteromolekularen Komplex verursachte Fluoreszenzänderung, nämlich von zwei gegenläufigen Effekten abhängig gewesen: von der sich durch den FRET verringernden Donorfluoreszenz des Cy3 und der durch den FRET anwachsenden Akzeptorfluoreszenz des Cy5. Für einen linearen Zusammenhang zwischen stattfindendem FRET und der Stoffmengenkonzentration heteromolekularer Komplexe wären zwei gegenläufige Prozesse zumindest nicht förderlich gewesen. Man wollte eine derartige Problematik nach Möglichkeit umgehen. Aus den zu Beginn bezüglich des Cy3-Cy5-Systems durchgeführten Untersuchungen war bekannt, dass nahezu keine Bedingungen gefunden werden konnten, bei denen die Fluoreszenz von Cy5 gemessen wurde und bei denen Cy3 nicht bis in den Emissionsbereich von Cy5 hinein selbst fluoreszierte. Die Variation der Wellenlängen war hier eingeschränkt, da man die Fluoreszenz von Cy3 benötigte, um Cy5 überhaupt erst zu sensibilisieren. Die gemessene Fluoreszenz war somit immer die Summe über beide Farbstoffe. Der Grund, warum man für die Kapillar-Kinetiken die sensibilisierte Akzeptorfluoreszenz gewählt hatte, war der Vorteil einer geringen Grundfluoreszenz und der damit großen Signaländerung durch FRET gegenüber einem kleinen Anfangssignal. Da man zunächst die Messwerte über Kalibrierkurven auswertete, spielten Probleme der Linearität oder spektralen Überlagerung keine Rolle, da dies alles in der Kalibrierung mit einbezogen war. Bei Messung der Donorfluoreszenzschwächung hingegen sollte es eventuell eine Möglichkeit geben, bei einer Emissionswellenlänge und Empfindlichkeit des Gerätes zu messen, bei der Cy5 noch nicht fluoreszierte. Man nahm daher Fluoreszenzspektren der isolierten Moleküle unter verschiedenen Anregungswellenlängen auf und verglich diese miteinander, um dann zu entscheiden, ob man die Messmethode wechselte. 93

98 Das zugrundeliegende mechanistische Modell für den Replikator Übergang zu Messung der Donorfluoreszenzabnahme Es war davon auszugehen, dass Cy5, angeregt durch FRET (also z.b. im simulierten 00%-Umsatz-Wert) bei einer Emissionswellenlänge von 557nm keine signifikante Fluoreszenz verursachte. Dieser Effekt war allerdings nicht separat messbar, da die Anwesenheit von Cy3 für den FRET notwendig war, damit aber immer gleichzeitig auch ein sehr starker Fluorophor bei 557nm vorlag. Der Kurvenverlauf der Emission von Cy5 zeigte aber sehr deutlich, dass selbst für den Fall, dass Cy5 nicht direkt durch die Strahlungsquelle, aber indirekt durch FRET über Cy3 angeregt wurde, diese Anregung zu keiner messbaren Emission bei 557nm führen konnte! Man erhielt die folgenden (normierten) Fluoreszenzspektren für den simulierten 00%-Umsatz Wert einer Kinetik mit einer Stoffmengenkonzentration von 40µM und 0% Templat bei 5 C: 557nm rel. Fluoreszenz Anregung 480nm Anregung 500nm Anregung 50nm Anregung 540nm 665nm Wellenlänge [nm] $EE'LH)OXRUHV]HQ](PLVVLRQVVSHNWUHQEHL8PVDW] LQ$EKlQJLJNHLWYHUVFKLHGHQHU$QUHJXQJVZHOOHQOlQJHQ Obwohl Cy5 stöchiometrisch in fünffachem Überschuss vorlag und der FRET in Bezug auf Kinetikbedingungen maximal ausgeprägt war, konnte man den Ausläufer der Fluoreszenz von Cy5 bei 557nm praktisch vernachlässigen, insbesondere, wenn man mit der Anregungswellenlänge unterhalb von 50nm blieb. Bei 665nm konnten zwar Signale gemessen werden, die hypsochrome Flanke dieser Signale bei 557nm war aber praktisch nicht mehr vorhanden, und 557nm sollten ja als Emissionswellenlänge für die Detektion verwendet werden. Die Zunahme der Emission bei 665nm mit zunehmender Anregungswellenlänge konnte man damit erklären, dass bei langwelligerer Anregung Cy5 auch direkt durch die Strahlungsquelle angeregt wurde, bei 480 oder 500nm dagegen nur durch FRET. Der experimentelle Beweis war somit erbracht. Man stieg auf die neue Methode der Donorfluoreszenzschwächung um und legte die Wellenlängen der Anregung auf 500nm und der Emission auf 557nm fest. Ob die Donorschwächung vom Ausmaß der Fluoreszenzänderung während der Kinetik ausreichend war, konnte mit älteren Kalibrierlösungen getestet werden, indem man die 0%-Kalibrierwerte mit den 00%- Werten unter den neuen Bedingungen verglich. Es stellte sich heraus, dass bei geschickter Wahl der Geräteempfindlichkeit 00 von maximal gerätespezifisch bedingt 00 möglichen Einheiten Änderung der relativen Fluoreszenz erzielt werden konnten. Die von Cy5 verursachte Grundfluoreszenz betrug dabei je nach Menge der initial zugegebenen Templatbausteine 50 bis 75 Einheiten. Man konnte also Kinetiken ca. bei 60 Einheiten beginnen (ab 75 Einheiten war das Stoffmengen-Fluoreszenz-Verhältnis nicht mehr linear), diese endeten dann im Falle von theoretisch 00%-Umsatz bei 50 bis 75 Einheiten. In der 94

99 FRET-Kinetiken als Online-Messungen Regel erreichte man allerdings nicht mehr als 30% Umsatz. Ein typischer Kurvenverlauf der Fluoreszenz mit der Zeit ist in folgender Abbildung dargestellt (40µM Konzentration, 5% Templat, 0 C): rel. Fluoreszenz Zeit [min] $EE7\SLVFKHV)OXRUHV]HQ]=HLW'LDJUDPPPLW0HVVSXQNWHQ EHL'HWHNWLRQGHU'RQRUIOXRUHV]HQ] Theoretische Beschreibung der Kurvenverläufe Ferner stellte sich die Frage, ob man günstigerweise auf den 00%-Umsatz-Wert kalibrierte, oder aber z.b. auf den 50%-Umsatzwert, da Umsätze von mehr als 30% vermutlich in den Kinetiken niemals erreicht würden. Dazu wendete man wieder das theoretische Modell an, welches zuvor beschrieben und für die Beschreibung der Kalibrierkurven entwickelt wurde (vgl. S. 8). Die folgende Grafik zeigt die Verteilung der homomolekularen und des heteromolekularen Duplexes auf alle Duplexe in Abhängigkeit vom Umsatz bei 0% initialer Templatkonzentration und 5 C. Es handelt sich dabei um keine Absolutkonzentration, sondern um die Molenbrüche. Erwartungsgemäß entsprach der maximale Anteil (Molenbruch) an heteromolekularem Duplex demjenigen Umsatz, der der initialen Templatkonzentration gleichkommt, hier also 0%. Molenbrüche der Duplexe bei 0% initialer Templatzugabe und 5 C Molenbruch (Cy33) Molenbruch (Cy55) Molenbruch (Cy35) Umsatz [%] $EE'LH9HUWHLOXQJGHU0ROHQEU FKHGHUYHUVFKLHGHQHQ7HPSODW'XSOH[H Analog ergab sich bei 5 C für verschiedene initiale Templatkonzentrationen der folgende Zusammenhang: 95

100 Theoretische Beschreibung der Kurvenverläufe Molenbruch heteromolekularer Duplexe bei 5 C und 40µM 0.6 Molenbruch (Cy35 5%) Molenbruch (Cy35 0%) 0.5 Molenbruch (Cy35 0%) Umsatz [%] $EE'LH9HUWHLOXQJGHU0ROHQEU FKHLQ$EKlQJLJNHLWYRQGHULQLWLDOHQ7HPSODWPHQJH Beim 5%-Wert lagen bei 5% Umsatz knapp 5% aller Duplexe heteromolekular vor. Die Tatsache, dass der Wert größer als 50% ist, hing mit der größeren Stabilität des heteromolekularen Duplexes im Vergleich zu den beiden homomolekularen Spezies zusammen. Verglich man dagegen die absoluten Konzentrationen der drei Systeme unter den gleichen Bedingungen, so erhielt man die folgende Abbildung: Konzentration heteromolekularer Duplexe 5 C, 40µM 7.0µ 6.0µ 5.0µ 4.0µ 3.0µ.0µ.0µ 0.0 Konzentration Cy35 (5% Templat) Konzentration Cy35 (0% Templat) Konzentration Cy35 (0% Templat) Umsatz [%] $EE'LHDEVROXWHQ6WRIIPHQJHQNRQ]HQWUDWLRQHQGHUKHWHURPROHNXODUHQ'XSOH[HEHL9HUZHQGXQJ YHUVFKLHGHQHULQLWLDOHU7HPSODWPHQJHQLP9HUJOHLFK Man entschied sich für den 00%-Wert zur Kalibrierung, da hier zwar der Anteil der heteromolekularen Duplexe gegenüber den anderen Duplexen wieder abgenommen hatte, die absolute Stoffmenge dennoch natürlich am höchsten war. Die Wahl eines Umsatzes von 50% hätte keinen signifikanten Vorteil gehabt, wäre aber zusätzlich verkompliziert worden, da auch noch die Eduktbausteine im angemessen Verhältnis hätten einpipettiert werden müssen, was auch eine weitere Fehlerquelle bedeutet hätte. Die Wahl der geeigneten Reaktionstemperatur Da bei den Online-Kinetiken Messung und Kinetik bei gleicher Temperatur stattfanden, musste man ein Optimum finden, bei dem die Messung aufgrund der Komplexassoziation auf einem ausreichenden FRET basierte, die Reaktion aber auch mit ausreichender Geschwindigkeit ablief. Die Temperaturoptimierung sollte 96

101 FRET-Kinetiken als Online-Messungen daher ein Maximum durchlaufen, da sich zwei Effekte überlagerten: auf der einen Seite nahm die Ligationsgeschwindigkeit nach Arrhenius mit zunehmender Temperatur zu, auf der anderen Seite sollte bei zu hoher Temperatur die Stabilität des termolekularen Komplexes immer weiter sinken, so dass der Templateffekt und damit die Katalyse unterbunden wurde - die Ligationsgeschwindigkeit des autokatalytischen Reaktionskanals fiel entsprechend ab. Zusätzlich sollte bei tiefen Temperaturen die Duplexstabilität groß sein, was in einer verstärkten Produktinhibition resultieren sollte. Da die Duplexpopulation eine Funktion der Konzentration ist, konnte nicht davon ausgegangen werden, dass eine einmal für das bei einer Konzentration von 0.5mM in Kapillaren untersuchte System gefundene optimale Reaktionstemperatur auch bei weiterer Verdünnung optimal bleibt. Mit zunehmender Verdünnung sollte die Reaktionstemperatur etwas sinken, da auch die Komplexstabilität entsprechend abnimmt. Bei zu tiefen Temperaturen können auch niedermolekulare Komplexe eine Rolle spielen, die dann eventuell zur unerwünschten BluntEndLigation führen. Die Oktamere sind bei tiefer Temperaturen ohnehin zu Duplexen assoziiert, die Tetramere sind aber ja ebenfalls zur Duplexbildung befähigt: &\ 7&&*SÃÃÃÃ Q &**$ $**&Q &\ 7&&*S $**& &\ 7&&* &\ 7&&* 3 &**$ D D $EE0 JOLFKHU0HFKDQLVPXVI UHLQH$NWPV'PF/LJDWLRQ Die entstandenen Oktamere 54 ständen dann ihrerseits mit den übrigen Oktameren im Gleichgewicht. Dieses Phänomen konnte möglicherweise bei starker Abkühlung der Reaktionslösung zu einer verstärkten Bedeutung des nicht-autokatalytischen Reaktionskanals führen, da die Tetramere aus dem Duplex heraus reagieren können, ohne dass ein Templatmolekül an der Reaktion beteiligt ist. Autokatalytischer und nicht-autokatalytischer Reaktionskanal zeigen in Bezug auf ihre Geschwindigkeit von der Theorie her eine unterschiedliche Abhängigkeit von der Temperatur. Der nicht-autokatalytische Kanal sollte nach Arrhenius mit der Temperatur schneller werden, bei sehr tiefen Temperaturen könnte dann sogar auch die Aktivierung des Phoshatbausteins durch EDC sehr langsam werden. In einem Grenzbereich könnte die Assoziation der Dimere dann zu einer Präorganisation für die BluntEndLigation führen. Der autokatalytische Kanal sollte bei tiefer Temparatur langsam sein, da quasi alle Templatmoleküle in Duplexen vorliegen und kein Turnover stattfinden kann VIII. Mit zunehmender Temperatur setzt dann die templatgesteuerte Ligation ein, bis sie ein Maximum erreicht. Jenseits dieses Maximums nimmt die Population des termolekularen Komplexes soweit ab, dass er quasi vollständig aufgeschmolzen wird und der Templateffekt verloren geht. Zur Untersuchung der Temperatureffekte führte man kinetische Messungen mit 5, 0 und 0mol% Templat durch. Die Anfangskonzentration der Oligonukleotide betrug 40µM. Man untersuchte die Reaktionen bei 0, 5, 0, 5, 30 und 35 C. VIII Die gleiche Situation hat man bei der PCR vorliegen, wenn man zur Polymerisation nicht auf 95 C aufheizt. 97

102 Die Wahl der geeigneten Reaktionstemperatur Die Ergebnisse sind in den folgenden sechs Fluoreszenz-Zeit-Diagrammen abgebildet (Abb. 99): rel. Fluoreszenz C Zeit [min] rel. Fluoreszenz C Zeit [min] rel. Fluoreszenz C Zeit [min] rel. Fluoreszenz C Zeit [min] rel. Fluoreszenz C Zeit [min] rel. Fluoreszenz C Zeit [min] $EE.LQHWLNHQPLWHLQHU$QIDQJVNRQ]HQWUDWLRQYRQ 0XQGPRO7HPSODWEHLYHUVFKLHGHQHQ 7HPSHUDWXUHQ Man beachte dabei die relative Änderung der Fluoreszenzeinheiten von Beginn bis Ende der Untersuchung. Die Werte sind numerisch in folgender Tabelle zusammengefasst: Temperatur [ C] relative Änderung

103 FRET-Kinetiken als Online-Messungen Auch wenn die Werte nicht direkt miteinander vergleichbar sind, da aufgrund der verschiedenen Empfindlichkeiten am Fluorimeter die Anfangswerte numerisch nicht immer identisch waren, erkennt man deutlich, dass bei geringerer Temperatur die Qualität der Daten viel besser ist als bei 30 oder 35 C. Dieses Ergebnis war so zu erklären, dass bei höherer Temperatur die Duplexe in signifikantem Ausmaß aufgeschmolzen wurden, wodurch die Population des heteromolekularen Komplexes und damit der FRET stark abnahm. Es stellte sich nun die entscheidende Frage, ob bei den Temperaturen von 0 und 5 C ein ausreichender Templateffekt zu beobachten war. In diesem Fall hätte die relativ schnelle Reaktion bei diesen Temperaturen nicht auf eine BluntEndLigation zurückgeführt werden können. Man musste dazu bei einer festgelegten Temperatur die Umsätze in Abhängigkeit von der initialen Templatmenge vergleichen. Die Umsätze waren aber nicht direkt aus den Fluoreszenz-Zeit-Diagrammen ersichtlich, man musste die Spektren kalibrieren und dann die Reaktionen mit den verschiedenen Templatkonzentrationen gemeinsam an den zugrundegelegten Reaktionsmechanismus fitten. Man nahm dazu zusätzlich noch die Kinetiken mit und mol% Templat auf und fittete alle fünf verschiedenen Kinetiken gemeinsam an das Reaktionsmodell. Da die Observable der heteromolekulare Templat-Duplex und nicht das Ligationsprodukt d( Cy5 TCCG PNH CGGA) (54) war, musste man mit SimFit die entsprechenden Stoffmengenkonzentrationen des Ligationsproduktes berechnen, sie sind als dickere Linien gleicher Farbe abgebildet. Der Templateffekt ist klar zu erkennen. Konzentration Cy5 TCCGCGGA [µm] % Templat 0% Templat 5% Templat % Templat % Templat Zeit [Minuten] $EE(KVVKPIGHU.LQHWLNHQPLWYDULLHUWHU7HPSODWPHQJHEHLƒ&XQG 0$XVJDQJVNRQ]HQWUDWLRQ ]XUhEHUVLFKWOLFKNHLWZXUGHQXUMHGHU0HVVZHUWDOV0HVVSXQNWDEJHELOGHW Dabei berücksichtigte man sowohl die Aktivierung des Phosphatbausteins durch EDC, als auch die parallel ablaufende EDC-Hydrolyse. Es zeigte sich nämlich beim Fitting, dass die Güte der Approximation besser wurde, wenn man diese beiden Prozesse mit in das Reaktionsmodell aufnahm. Zunächst wurden diese beiden zusätzlichen Geschwindigkeitskonstanten der EDC- Aktivierung und -Hydrolyse frei gefittet, ihre berechneten numerischen Ergebnisse entsprachen jedoch in ihren Größenordnungen den Erwartungswerten [36]. Für 99

104 Die Wahl der geeigneten Reaktionstemperatur spätere Experimente wurden sie dann unabhängig ermittelt und in den Rechnungen fixiert (siehe 00ff). Bei den Approximationen am Computer verwendete man wieder das theoretische Modell zur Beschreibung der Kalibrierkurven, um die Fluoreszenz-Zeit-Kurven zunächst in Konzentrations-Zeit-Kurven umzurechnen. Man konnte die absolute Stoffmengenkonzentration aller heteromolekularen Duplexe für den Wert bei 00% Umsatz in Abhängigkeit von der Anfangskonzentration, der Temperatur und der initialen Templatmenge berechnen. Die für diese Serie von Experimenten erforderlichen Rechenergebnisse sind in folgender Tabelle dargestellt: initiale Templatmenge 0 C [µm] 5 C [µm] 0 C [µm] 5 C [µm] 30 C [µm] 35 C [µm] % 0,396 0,395 0,394 0,390 0,38 0,365 % 0,784 0,78 0,779 0,77 0,756 0,7 40µM 5%,903,900,89,875,835,749 0% 3,63 3,66 3,6 3,577 3,499 3,33 0% 6,659 6,648 6,60 6,556 6,409 6,094 Zur Umrechnung der Daten zog man die für den 00%-Wert gemessene Fluoreszenz bei allen Messwerten als Grundfluoreszenz ab und spiegelte dann die Daten an der Abszisse. Die Umrechnung auf Konzentrationen gelang unter der Annahme, dass die jenseits der Grundfluoreszenz zwischen 0 und 00% Umsatz durchlaufene Änderung der Fluoreszenz eine lineare Abhängigkeit von der Population herteromolekularer Komplexe zeigte. Da die Kinetiken bei 0 C bereits geringfügige Probleme mit Kondenswasser gezeigt hatten, entschied man sich, die weiteren Untersuchungen bei 5 C durchzuführen, da hier der Templateffekt und die relative Änderung der Fluoreszenz ausgeprägt waren. Da unter diesen Bedingungen ein deutlicher Templat-Effekt zu erkennen war, konnte davon ausgegangen werden, dass der hypothetische Reaktionskanal im Sinne einer BluntEndLigation keine dominante Rolle spielte. Es deutete sich an, dass es für weitere kinetische Experimente wünschenswert wäre, unabhängig bestimmte kinetische Parameter bezüglich der EDC-Aktivierung und Hydrolyse zu erhalten, insbesondere, wenn die Kinetiken über noch größere Zeiträume verfolgt werden sollten. Zu diesem Zweck wandte man sich einer H-NMRkinetischen Untersuchung zu [08]. Die kinetische Untersuchung der Hydrolyse von EDC Der Mechanismus der EDC-Hydrolyse H-NMR-Messungen sollten durchgeführt werden, um auf unabhängigem Wege die Geschwindigkeitskonstanten zu bestimmen, welche für folgende Rechnungen im SimFit dann fixiert werden konnten. Je mehr Geschwindigkeitskonstanten unabhängig bestimmt werden konnten, desto abgesicherter war der Fit und desto weniger frei wählbare Konstanten benötigte man für eine Beschreibung des selbstreplizierenden Systems. Es gab verschiedene Möglichkeiten, die kinetischen Daten auszuwerten. Eine Möglichkeit bestand in einer klassischen Linearisierung, die auf verschiedenen Annahmen zur Vereinfachung beruhte, die andere Möglichkeit bestand in der computergestützten Analyse der Messdaten mit dem Programm SimFit. Beide Möglichkeiten werden im folgenden beschrieben. 00

105 FRET-Kinetiken als Online-Messungen Den Mechanismus der EDC-Hydrolyse, der Aktivierung der 3 -Phosphatbausteine und deren Weiterreaktion kann wie folgt formuliert werden: N G ('& 5 3 N D 5 3 N F 5 3 N E $EE0HFKDQLVPXVGHU('&\GURO\VHXQG$NWLYLHUXQJGHUµ3KRVSKDWUHVWH Linearisierung der Messdaten zur Bestimmung von k a und k b Aus dem Reaktionsschema resultieren die kinetischen Differentialgleichungen: [ P] d dt = k a * * [ EDC][ P] k [ P ] k [ P ][ P] b c *OHLFKXQJ d dt * [ P ] * * = k [ EDC][ P] k [ P ] k [ P ][ P] a [ PP] * = k [ P ][ P] d dt d [ EDC] dt c = k * [ P] = [ P] [ P ] [ PP] a 0 b [ EDC][ P] k [ EDC] d c *OHLFKXQJ *OHLFKXQJ *OHLFKXQJ *OHLFKXQJ Folgende Vereinfachungen konnten getroffen werden: k d (die Geschwindigkeitskonstante der unkatalysierten Hydrolyse) ist sehr klein und konnte vernachlässigt werden [8b, 37]. Die Konzentration an freiem Phosphat konnte ferner näherungsweise als konstant angesehen werden, [P] konnte daher in die Konstante mit einbezogen werden: 0

106 Die kinetische Untersuchung der Hydrolyse von EDC k a = k a [ P] *OHLFKXQJ Die Wirkung von Pyrophosphat als Katalysator konnte vernachlässigt werden, da in Analogie zu Phosphodiestern deutlich langsamere Reaktionen zu erwarten waren. Eine Geschwindigkeitkonstante k -a für die Rückreaktion von P * zu P und EDC konnte unberücksichtigt bleiben, da dieser Reaktionsschritt praktisch nicht stattfand. Mit den aufgeführten Vereinfachungen ergab sich die phosphatkatalysierte Hydrolyse zu einer Reaktion pseudo-erster Ordnung: d [ EDC] dt = k a mit k k [ P] a = a [ EDC] folgte nach Integration die lineare Gleichung *OHLFKXQJ ln [ EDC] = ln[ EDC] k t 0 a *OHLFKXQJ Aus dieser Linearisierung ließ sich jedoch zunächst nur k a bestimmen, nicht aber k a. Es war daher notwendig, die tatsächliche Konzentration an freiem Phosphat abzuschätzen, denn nur dieses stand als Katalysator zur Verfügung. Prinzipiell hatte man dazu zwei verschiedene Möglichkeiten: Bei geringem Aktivierungsgrad α konnte diese näherungsweise mit der Anfangskonzentration an eingesetztem Phosphat gleichgesetzt werden. Der Aktivierungsgrad ist definiert als: α * [ P ] [ P ] [ P] = * *OHLFKXQJ Besser war jedoch die Anwendung des Stationaritätsprinzips d[p]/dt = 0 auf den Geschwindigkeitsausdruck des freien Phosphats: [ P] d dt k = k a * * [ EDC][ P] k [ P ] k [ P ][ P] = 0 * * [ EDC][ P] k [ P ][ P] k [ P ] a c = b b * mit Gleichung 43 als Nebenbedingung [ P ] [ P] [ P ] [ PP] * [ P] ( k [ EDC] k [ P ] k ) = k [ P] k [ PP] [ P] a c b b 0 b = k k [ P] [ PP] 0 kc * [ EDC] [ P ] a b k b c = folgte: 0 *OHLFKXQJ *OHLFKXQJ *OHLFKXQJ *OHLFKXQJ 0

107 FRET-Kinetiken als Online-Messungen Die Stationärkonzentration stellte sich jedoch ein, bevor die Bildung von Pyrophosphat signifikant zum Tragen kam. Für geringe Umsatzraten konnte daher eine vereinfachte Formel angesetzt werden mit [P] = [P] stat : [ P] d dt = k * [ EDC][ P] k [ P ] a mit der Stationaritätsbedingung k * [ EDC][ P] k [ P ] a = b b [ ] d P dt = 0 * Mit der Nebenbedingung [ P ] [ P] [ P], also der Vernachlässigung der Pyrophosphatbildung, galt dann: k a [ P][ EDC] k ([ P] [ P] ) b = 0 folgte *OHLFKXQJ *OHLFKXQJ = 0 *OHLFKXQJ [ P] ( k [ EDC] k ) k [ P] 0 [ P] = a b = k kb[ P] 0 a[ EDC] kb b *OHLFKXQJ *OHLFKXQJ Durch Verfolgung der Kinetik im H-NMR wurde lediglich die Abnahme der EDC- Konzentration verfolgt. Die Bildung von Pyrophosphat musste daher ohnehin unberücksichtigt bleiben. Aus Gleichung 45 und Einsetzen von Gleichung 56 folgte: d [ EDC] dt = k a [ EDC] k [ P] kb 0 EDC k a [ ] b *OHLFKXQJ Durch Einführung der apparenten Geschwindigkeitskonstante k a = k a [P] und durch die Vereinfachung für geringe Umsatzraten [EDC] 0 = [EDC] erhielt man die folgenden Gleichungen: k a [ EDC] kb[ P] [ EDC] [ ] = ka EDC ka kb *OHLFKXQJ kak k [ P] b a 0 a[ EDC] kb = k 0 *OHLFKXQJ k a [ P] 0 = [ EDC] ka[ EDC] 0 kb 0 Die entsprechenden Werte für k a Linearisierung ermittelt werden: *OHLFKXQJ konnten demnach zunächst durch folgende 03

108 Die kinetische Untersuchung der Hydrolyse von EDC d ln [ EDC] dt = k a [ EDC] [ EDC] = ln[ EDC] k t 0 a *OHLFKXQJ *OHLFKXQJ Die Auftragung von ln[edc] gegen t liefert als Steigung -k a und als Ordinatenabschnitt eine korrigierte Ausgangskonzentration [EDC ] [EDC ] 0 = mol l ln[edc] [EDC ] 0 = mol l - [EDC ] 0 = mol l [EDC ] 0 = mol l Zeit [min] $EE/LQHDULVLHUXQJGHU(LQ]HOPHVVXQJHQ]XU(UPLWWOXQJGHUNRUULJLHUWHQ $QIDQJVNRQ]HQWUDWLRQDQ&DUERGLLPLG>('&µ@ XQGGHU6WHLJXQJ±N Dµ Die Auftragung dieser gefundenen EDC-Abnahme (/k a [EDC] 0 ) gegen den Kehrwert der EDC-Ausgangskonzentration (/[EDC] 0 ) liefert nach Gleichung 60 als Steigung /k a und als Ordinatenabschnitt /k b [p] 0 /k a [EDC] /[EDC] 0 $EE/LQHDULVLHUXQJDXVGHQ EHUGLHYRUDQJHJDQJHQH/LQHDULVLHUXQJ HUKDOWHQHQDSSDUHQWHQ*HVFKZLQGLJNHLWVNRQVWDQWHQN Dµ Die mathematische Linearisierung lieferte mit guter Korrelation die beiden Geschwindigkeitskonstanten k a = lmol - s - und k b = s -. Als Phosphatbaustein diente bei den Messungen die Verbindung d( bup TCCGp), welche strukturell am verwandtesten mit der in der Replikationskinetik verwendeten Komponente d( Cy5 TCCGp) und d( Cy3 TCCGp) war. Es bleibt allerdings darauf zu verweisen, dass im Replikationsexperiment möglicherweise durch Assoziation mit Templat und n CGGA eine Abschirmung der Phosphatgruppen erreicht wird, wodurch die Reaktivität abgeschwächt werden könnte. Zusätzlich werden in diesen 04

109 FRET-Kinetiken als Online-Messungen Komplexen die exozyklischen Aminogruppen der Nukleobasen über Watson-Crick- Basenpaare abgeschirmt, so dass sie schlechter dazu neigen sollten, mit dem EDC Nebenreaktionen einzugehen, die im kinetischen Modell nicht berücksichtigt werden. Auch die zusätzliche positive Ladung im fluoreszenzmarkierten Baustein am 5 - Temonus blieb hier bei der Modellverbindung unberücksichtigt. Nicht-lineares Fitting der Messdaten mit dem Programm SimFit SimFit lieferte auf der Grundlage des gleichen Reaktionsmechanismus, jedoch ohne Nebenbedingungen zur Näherung, das folgende Ergebnis: Konzentration Isoharnstoff [mm] Zeit [min] $EE0HVVSXQNWHXQGGLHGDKLQWHUOLHJHQGHQIGHKVVGVGP.XUYHQ]XUSKRVSKDWNDWDO\VLHUWHQ('& \GURO\VHLP05EHLƒ&(3(63XIIHUSPLW& & Das Ergebnis der Rechnungen [08] stellte sich wie folgt mit einem RMS-Wert von.03 dar: k a = (3.4 ± 0.) 0-3 (Aktivierung) (vgl. k a = Linearisierung) k b = (9. ± 0.9) 0-4 (katalysierte Hydrolyse) (vgl. k b = Linearisierung) k c = (3.09 ± 0.3) 0 - (Pyrophosphatbildung) k d = ± (unkatalysierte Hydrolyse) Der Ausdruck für die Geschwindigkeit der Aktivierung stimmte in beiden Fällen gut überein, die katalysierte Hydrolyse war gemäß der SimFit-Analyse rund zweieinhalbmal schneller als durch die Linearisierung ermittelt. Diese Abweichung konnte auf Abweichungen durch die Annahmen zur Vereinfachung der Analyse zurückgeführt werden, welche für die Linearisierung, für die Berechnung mit SimFit aber nicht notwendig waren. Der Fehler für die Geschwindigkeitskonstante der spontanen Hydrolyse war allerdings deutlich größer als der Messwert. Da weder die Pyrophosphatbildung noch die ohnehin sehr langsame spontane Hydrolyse des EDC [8b, 37] im H-NMR direkt beobachtet werden konnten und Messungen durch 3 P- NMR im gewählten Konzentrationsbereich sich als zu wenig empfindlich erwiesen, wurde ein Fitting auf der Grundlage von lediglich zwei Geschwindigkeitskonatanten favorisiert. Dieses hatte zwar eine Verschlechterung des RMS-Wertes zur Folge (von.03 auf 5.74), dennoch erhielt man auf diese Weise verlässlichere und experimentell besser belegte Werte. Die Güte eine Fittings sollte prinzipiell immer mit einer Erhöhung der frei wählbaren Geschwindigkeitskonstanten verbessert werden; dies sollte allerdings nicht immer gleichzeitig auch zu einer Erhöhung der mechanistischen Relevanz der Daten führen! 05

110 Die kinetische Untersuchung der Hydrolyse von EDC Berechnete man also zum Vergleich im SimFit auf der Grundlage von lediglich zwei Geschwindigkeitskonstanten k a und k b, also unter Vernachlässigung der spontanen Hydrolyse und Pyrophosphatbildung, so erhielt man bei einem RMS-Wert von 5.74 die folgenden Vergleichswerte: k a = (3.0 ± 0.04) 0-3 lmol - s - und k b = (5.54 ± 0.8) 0-4 s -. Kovarianz: Hier führte also bereits die Vereinfachung der Reduzierung auf nur zwei Geschwindigkeitskonstanten zu einer deutlichen Angleichung der erhaltenen Daten zwischen Rechnung und Linearisierung. Mit dem Programm SimFit lassen sich durch den Befehl Scan zweidimensional die Zusammenhänge zwischen den einzelnen Geschwindigkeitskonstanten und der Güte des Fittings darstellen. Dies erleichtert die Interpretation der erhaltenen Daten erheblich. $EE'HU]ZHLGLPHQVLRQDOH6FDQ3ORWPLW6LP)LWI UGLH('&\GURO\VH N N DN N EN N FXQGN N GVFDQ Dazu werden im Sinne einer mathematischen Potenzreihe die Werte für die ermittelten Geschwindigkeitskonstanten k a bis k d (k bis k 4 ) jeweils varriert und die mittlere Fehlerquadratsumme (RMS-Wert, Root Mean Square) für das Gesamtsystem, welches ein Maß für die Güte des Fittings ist, berechnet. Jedem RMS-Wert ist eine Farbe zugeordnet, die man der Legende rechts entnehmen kann. Grafisch erkennt man sofort, dass k a, also die Aktivierung der Phosphatbausteine, recht eindeutig festgelegt ist, d.h. Abweichungen der anderen Geschwindigkeitskonstanten relativ zu k a resultieren sofort in einem Anstieg des Fehlers. Die Einschränkung auf eindeutige Werte für k b ist schon deutlich geringer, k c und k d hingegen können in relativ weiten Grenzen variiert werden, ohne dass sich die Güte des Fittings signifikant verschlechtert. Da k c und k d für die kinetischen Untersuchungen zur Selbstreplikation ohnehin von untergeordneter Bedeutung waren und für die Existenz von Pyrophosphaten im H- NMR keine direkten spektroskopischen Hinweise gefunden werden konnten, konnte man die erhaltenen Werte für k a und k b aus dem Fitting mit nur zwei frei wählbaren Geschwindigkeitskonstanten in die Fittings zum selbstreplizierenden [4,4]-[8]-System bei 5 C einbeziehen, k c und k d blieben also unberücksichtigt. 06

111 FRET-Kinetiken als Online-Messungen Berechnung der Aktivierungsgrade der Phosphatbausteine Auf der Grundlage dieser Werte für die Geschwindigkeitskonstanten der EDC- Aktivierung und -Hydrolyse konnte man nun simulieren, zu welchem Zeitpunkt sich das Maximum der Aktivierung unter den Bedingungen der Kinetiken ausbildete. Dabei konnte man dies einmal für die Messung der EDC-Hydrolyse durch H-NMR, aber auch für die FRET-Messungen zur Selbstreplikation durchführen. Unter den Bedingungen der NMR-Kinetik zeigte sich, dass ein Maximum der Aktivierung nach ca. h erreicht wurde. Für eine Konzentration von 830µM Phosphatbaustein d( bup TCCGp) und 30.0mM EDC, also bei typischen Bedingungen der Messung, erhielt man die folgende berechnete Bildungskurve für den aktivierten Phosphatbaustein d( bup TCCGp-EDC): aktivierter Phosphatbaustein [µm] t [min] $EE%HUHFKQHWH%LOGXQJVNXUYHGHVDNWLYLHUWHQ3KRVSKDWHVLP05([SHULPHQW Der Aktivierungsgrad betrug demnach etwa α = 4.5%. Die gleiche Simulation führte man auch für die FRET-Messungen durch, welche in Abb. 00, S. 99 dargestellt wurden. Dabei verwendete man die beiden aus den NMR-Kinetiken erhaltenen Geschwindigkeitskonstanten zur Aktivierung und Hydrolyse der 3 -Phosphatbausteine und setzte für den autokatalytischen und nichtautokatalytischen Reaktionskanal die Geschwindigkeitskonstanten ein, die man aufgrund des Fittings erhalten hatte. Man erhielt den folgenden Kurvenverlauf: Konzentration [µm] t [min] aktiviertes Phosphat bei % aktiviertes Phosphat bei % aktiviertes Phosphat bei 5% aktiviertes Phosphat bei 0% aktiviertes Phosphat bei 0% Messwerte FRET 0% Templat Messwerte FRET 0% Templat Messwerte FRET 5% Templat Messwerte FRET % Templat Messwerte FRET % Templat $EE'LH%LOGXQJGHU('&µ3KRVSKDWDGGXNWHXQGLKUH:HLWHUUHDNWLRQLQ $EKlQJLJNHLWYRQGHULQLWLDOHQ7HPSODWPHQJH 07

112 Die kinetische Untersuchung der Hydrolyse von EDC Auch hier konnte man erkennen, dass der Aktivierungsgrad nach etwa h sein Maximum erreichte. Somit konnte bestätigt werden, dass die EDC-Aktivierung nicht der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Gesamtreaktion war. Der Wendepunkt der sigmoiden Produktbildungskurven lag zeitlich deutlich später. Der Aktivierungsgrad lag wegen des größeren EDC Überschusses relativ zur eingesetzten Stoffmenge an 3 -Phosphatbaustein d( Cy5 TCCGp) aber deutlich höher als bei der NMR-Kinetik, er betrug rund 50%. Er fiel erwartungsgemäß mit zunehmender initialer Templatmenge schneller ab, da die Ligation durch den Templateffekt beschleunigt wurde. Der zugrundegelegte Reaktionsmechanismus für die kinetische Untersuchung der selbstreplizierenden Systeme wurde also in Anlehnung an Abb. 9, S. 9 erweitert; die zusätzlichen Geschwindigkeitskonstanten wurden allerdings als Fixwerte eingesetzt, so dass sich die Zahl der durch das Fitting zu approximierenden Geschwindigkeitskonstanten nicht erhöhte. &\ $ ('& &\ $ % &\ $ % &\ $ % &\ & &\ & &\ & &\ & &\ & &\ & &\ $ &\ & &\ & &\ & &\ & &\ & &\ & $NWLYLHUXQJGHU3KRVSKDWH QLFKWDXWRNDWDO\WLVFKHU 5HDNWLRQVNDQDO LUUHYHUVLEOH%LOGXQJGHU 'XSOH[HDOVWHUPROHNXODUHU 3UR]HVV UHYHUVLEOHV*OHLFKJHZLFKW ]ZLVFKHQ(LQ]HOVWUDQJXQG 'XSOH[ &\ $ &\ $ \GURO\VHGHU('&$GGXNWH N N $EE(UZHLWHUWHU5HDNWLRQVPHFKDQLVPXVPLW%HU FNVLFKWLJXQJGHUNDWDO\VLHUWHQ('&\GURO\VH ]XVDPPHQJHVHW]WDXV$NWLYLHUXQJGHUµ3KRVSKDWHXQG\GURO\VHGHU$GGXNWH Die autokatalytische Reaktionsordnung p Bis zu diesem Zeitpunkt hatte sich das Verfahren der kinetischen Verfolgung selbstreplizierender Systeme durch FRET als eine gut reproduzierbare und genaue Methode mit hoher Datendichte erwiesen. Eine interessante Fragestellung blieb jedoch ungeklärt: die experimentelle Bestimmung der autokatalytischen Reaktionsordnung p. Bisher war man in den HPLC-Kinetiken zu ihrer Bestimmung derart vorgegangen, dass man im Fitting die stöchiometrischen Koeffizienten der zugrundegelegten Reaktionsgleichungen vor dem Templatbaustein variierte und die Güte des Fittings, also die Größe des RMS- Wertes, verglich. Am Minimum vom RMS-Wert lag die entsprechende Reaktionsordnung. Für p = 0.5 hätte man also für die templatkatalysierte Ligation im SimFit vorgegeben: $ % & & Die Duplexbildung der verschiedenen Templatbausteine C zu C würde dabei entsprechend als Reaktionsgleichung wegfallen. 08

113 FRET-Kinetiken als Online-Messungen Eine Messung des beschriebenen [4,4]-[8]-Systems mit 0% initialer Templatmenge war aber nicht durchführbar, da der initial zugegebene Templatbaustein den Donor Cy3 trug, welcher unbedingt für die Messung eines FRET-Signals erforderlich war. Das Problem konnte aber möglicherweise durch eine andere Wahl der Markierung der eingesetzten Bausteine gelöst werden. Wenn man kein Templat zusetzen durfte, so lag es nahe, den Phosphatbaustein d(tccgp) zu einem bestimmten Anteil mit Cy3, den Rest mit Cy5 zu markieren. Beide Bausteine sollten mit vergleichbaren Geschwindigkeitskonstanten reagieren, so dass die Gesamtmenge an entstandenem Templat C sich also linear aus der Summe der parallel ablaufenden Reaktionskanäle ergab. Der Reaktionsmechanismus wurde wie folgt formuliert: &\ $ ('& &\ $ ('& &\ $ &\ $ $NWLYLHUXQJGHU3KRVSKDWH &\ $ % &\ $ % &\ & &\ & QLFKWDXWRNDWDO\WLVFKHU 5HDNWLRQVNDQDO N &\ $ % &\ $ % &\ & &\ $ % &\ & &\ $ % &\ & &\ & &\ & &\ & &\ & &\ & LUUHYHUVLEOH%LOGXQJGHU 'XSOH[HDOVWHUPROHNXODUHU 3UR]HVV N &\ & &\ & &\ & &\ & &\ & &\ & &\ & UHYHUVLEOHV*OHLFKJHZLFKW ]ZLVFKHQ(LQ]HOVWUDQJXQG 'XSOH[ &\ $ &\ $ \GURO\VHGHU('&$GGXNWH &\ $ &\ $ $EE'HU5HDNWLRQVPHFKDQLVPXVI UGDV([SHULPHQWGHUEHLGHQNRQNXUULHUHQGHQ 3KRVSKDWEDXVWHLQHG &\ 7&&*SCXQGG &\ 7&&*SC Die ersten Experimente zu dieser Art von Kinetik wurden in einer Stoffmengenkonzentration von 80µM bezogen auf d( n CGGA) (94a) und mit äquimolaren Mengen der beiden Phosphatbausteine 96a und 00a bei 5 C durchgeführt. Die Konzentrationen wurden so hoch gewählt, da vorhergesagt werden konnte, dass die zu erwartende Signaländerung während der Kinetik deutlich geringer ausfallen sollte, als es bei den Experimenten unter Variation der initialen Templatmenge der Fall gewesen war. Man war dadurch auf relativ hohe Umsätze angewiesen, um ausreichend starke Fluoreszenzänderungen zu beobachten. Dies hing damit zusammen, dass eine große Menge Donor vorlag, die eine signifikante Untergrundfluoreszenz verursachte. Im äquimolaren Fall der beiden Phosphatbausteine änderten sich die Molenbrüche der hetero- und homomolekularen Duplexe zueinander nicht, so dass der Anteil FRET-aktiver, heteromolekularer Komplexe stets 50% der Gesamtmenge betrug. Eine Situation, bei der die Mehrzahl der mit dem Donor markierten Templatmoleküle d( Cy3 TCCG PNH CGGA) (6) mit den entsprechenden Akzeptormolekülen d( Cy5 TCCG PNH CGGA) (54) abgesättigt war, wurde nicht erreicht. Um p zu bestimmen, muss die Gesamtkonzentration aller synthetisierten Template berechnet und in einen Eingabedatensatz umgewandelt werden. Dieser wird dann gegen das Modell für p gefittet. 09

114 Die autokatalytische Reaktionsordnung p Cy3 TCCGCGGA Cy5 TCCGCGGA [µm] Messpunkte Fitting berechnetes Templat time [min] $EE6LJPRLGDOLWlWGHV([SHULPHQWHV]XU%HVWLPPXQJGHUDXWRNDWDO\WLVFKHQ5HDNWLRQVRUGQXQJS Die Auswertung bezüglich der autokatalytischen Reaktionsordnung lieferte keine chemisch relevanten Zahlenwerte. Auch das gemeinsame Fitting zusammen mit den Experimenten zur Variation der initialen Templatmenge führte zu keiner Verbesserung. Wenn man die Reaktion von d( Cy3 TCCGp) mit d( n CGGA) mit einer anderen Geschwindigkeitskonstante als die Reaktion von d( Cy5 TCCGp) mit d( n CGGA) beschrieb, erhielt man bei guten RMS-Werten das unerwartete Ergebnis, dass der Cy3-Baustein scheinbar deutlich langsamer als der Cy5-Baustein reagierte. Zunächst glaubte man, dies sei auf eine partielle Dephosphorylierung am 3 - Terminus von d( Cy3 TCCGp) zurückzuführen, eine Analyse durch MALDI-MS und HPLC konnte dies allerdings nicht bestätigen. Sollte der Cy3-Baustein tatsächlich langsamer reagieren, so sollte dies zumindest theoretisch durch die Umkehr der Fluoreszenzmarkierung und Wiederholung der Experimente zur Variation der initialen Templatmenge bestätigt werden können. Zu diesem Zweck führte man eine Reihe von Kinetiken durch, in denen d( Cy3 TCCGp) mit d( n CGGA) an verschiedenen Mengen d( Cy5 TCCGCGGA) als Templat reagierte. In diesem Fall der Experimente war man aber ebenfalls mit dem Problem konfrontiert, dass man bei Messung der Donorfluoreszenzschwächung des Cy3 mit einer großen Untergrundfluoreszenz und nur einer geringen, durch FRET bedingten Änderung der Fluoreszenz rechnen konnte. Daher wurden die initialen Templatmengen mit 0, 50 und sogar 75% so hoch gewählt, um die Population FRET-aktiver, heteromolekularer Duplexe zu erhöhen. Alle diese Messungen waren jedoch wegen der zu geringen Änderung der Fluoreszenz nicht auswertbar. Zusätzlich führte man das Phänomen der scheinbar höheren Geschwindigkeitskonstante von d( Cy5 TCCGp) darauf zurück, dass aufgrund der zu hohen Stoffmengenkonzentrationen signifikante Quencheffekte auftraten, die keine Linearität zwischen Fluoreszenzsignal und Population FRET-aktiver Duplexe gewährleisteten. Das Ausmaß des Quenching konnte man gut beobachen, da nach Zugabe der EDC-Lösung zum Starten der Kinetik trotz der Verdünnung um 5% der Betrag der gemessenen Fluoreszenz fast um das Doppelte anstieg! Es mussten daher Experimente in geringeren Konzentrationen durchgeführt werden. Da auch die Experimente zur Variation der initialen Templatmenge bei der Zugabe von EDC einen leichten Anstieg der Fluoreszenz bei Zugabe der EDC-Lösung gezeigt hatten, wurde auch hier angestrebt, zu größeren Verdünnungen überzugehen. Man reduzierte die Stoffmengenkonzentration hier von 40µM auf 30µM bezogen auf Amino- und Phosphatbaustein, die Experimente mit den beiden 0

115 FRET-Kinetiken als Online-Messungen Phosphatbausteinen d( Cy3 TCCGp) und d( Cy5 TCCGp) wurden bei 60, 40, 30 und 0µM bezogen auf den Aminobaustein unter äquimolaren Bedingungen durchgeführt, d.h. die Konzentration der Phosphatbausteine betrug hier jeweils 30, 0, 5 und 0µM. Während die Experimente zur Variation der Templatmenge auch bei 30µM gute Ergebnisse lieferten und bei Zugabe der EDC-Lösung kein Quenching mehr zeigten, waren die übrigen Messsungen mit den beiden verschiedenen Phosphatbausteinen d( Cy3 TCCGp) und d( Cy5 TCCGp) nicht auswertbar. Bei zu geringen Konzentrationen (<60µM Aminobaustein) waren die Umsätze auch nach 4h so gering, dass keine ausreichend große Änderung der Fluoreszenz gemessen werden konnte. Die Experimente mit höherer Konzentration ließen sich dagegen nicht zusammen mit den Kinetiken der Variation der initialen Templatmenge auswerten. Die Vermutung lag nahe, dass auch hier wegen des Quenching eine zu große Störung der Systeme verursacht wurde. Die berechneten Stoffmengenkonzentrationen der heteromolekularen und damit FRET-aktiven Komplexe bei 00%-Umsatz sind für die entsprechenden Experimente in den folgenden beiden Tabellen zusammengefasst, für die im Rahmen der Geräteempfindlichkeit messbare Fluoreszenzänderungen detektiert werden konnten: Alle Konzentrationsangaben erfolgen in µm bezogen auf d( n CGGA). d( Cy3 TCCGp) 5 C % 0,395 % 0,78 d( Cy3 TCCGp) d( Cy5 TCCGp) 5 C 40µM 5%,900 40µM % 3,66 60µM % 6,648 80µM %.44 30µM 0%.79 0% Man erkennt deutlich, dass die Konzentration der FRET-aktiven Duplexe im Falle der Experimente mit den zwei verschiedenen Phosphatbausteinen deutlich höher lag. Da man sich offenbar zwischen 30 und 40µM gerade an der Grenze zwischen starkem und vernachlässigbarem Fluoreszenzquenching befand, sollte dies einen signifikanten Einfluss auf die Güte der Messwerte haben. Als alternative Lösung der Probleme kam eine Dotierung der Phosphatbausteine nicht in Frage. Man hätte z.b. versuchen können, eine größere Menge d( bup TCCGp) mit einer kleineren Menge d( Cy3/5 TCCGp) zu dotieren. Zwar hätte man auf diese Weise die absolute Stoffmenge FRET-aktiver Duplexe herabsetzen können, in diesem Fall wären allerdings die messbaren Fluoreszenzänderungen noch kleiner gewesen, da die Population nicht-fret-aktiver Komplexe, die eine deutliche Grundfluoreszenz verursachten, noch dominanter gewesen wäre. Außerdem hätte man dann sehr wahrscheinlich neue Duplexstabilitäten innerhalb der neuen möglichen Duplexe vorliegen, die alle hätten vermessen und berücksichtigt werden müssen. Es musste nämlich davon ausgegangen werden, dass der Butoxyphosphat- Rest am 5 -Ende einen anderen Einfluss auf die Templatstabilität als das kationische Cy3 oder Cy5 zeigte.

116 Die autokatalytische Reaktionsordnung p Eine bessere Möglichkeit zur Lösung des Quenching-Problems erschien die Zugabe der beiden Phosphatbausteine d( Cy3 TCCGp) und d( Cy5 TCCGp) im asymmetrischen molaren Verhältnis zu sein. Setzte man den mit dem Donor markierten Baustein wie bei den Experimenten zur Variation der initialen Templatmenge im molaren Unterschuss ein, so sollte es möglich sein, Reaktionsbedingungen zu finden, die ein gemeinsames Fitting der Experimente auf der Grundlage von nur zwei frei wählbaren Geschwindigkeitskonstanten zuließen. Die zu erwartenden Stoffmengen der FRET-aktiven Duplexe konnten für verschiedene Systeme berechnet werden. Sie sind in folgender Tabelle dargestellt, in Klammern sind die Stoffmengenkonzentrationen bezogen auf d( n CGGA) angegeben. Verhältnis 5 C 3: (60µM) : (60µM) : (80µM) : (30µM).69 : (40µM) : (40µM).48 Obwohl bei der zuvor durchgeführten Experimenten mit Konzentrationen von 60 und 80µM keine guten Erfahrungen gemacht worden waren, entschied man sich, bei den Stöchiometrien 4: und 3: dennoch an diesen Konzentrationen festzuhalten, da so auf der einen Seite größere Umsätze zu erwarten waren, auf der anderen Seite Cy3 nun im Unterschuss zugegeben wurde. Cy3 war aber gerade verantwortlich für das Quenching gewesen, möglicherweise reichte die Reduzierung der Absolutmenge durch die Wahl der Verhältnisse :3 und :4 aber bereits aus, das Quenching zu unterbinden. Experimentell zeigte sich, dass ein gemeinsames Fitting der Daten mit 5, 0, und 0% initialer Templatmenge und den Kinetiken mit den beiden Phosphatbausteinen im Verhältnis :3 oder :4 bei verschiedenen Konzentrationen nur befriedigende RMS-Werte lieferte, wenn man auch hier zwei verschiedene Geschwindigkeitskonstanten für die beiden Phosphatbausteine zuließ. In diesem Fall erhielt man als Resultat, dass d( Cy3 TCCGp) rund sechsmal langsamer reagierte als d( Cy5 TCCGp). Da dieses Resultat chemisch nicht erklärt werden konnte, entschied man sich für eine drastischere Wahl der stöchiometrischen Verhältnisse zwischen den beiden Phosphatbausteinen (:9 bis :5), auch die Stoffmengenkonzentration reduzierte man weiter. Als Ergebnis erhielt man einen Satz von 6 Kinetiken unter verschiedenen Bedingungen, die sich alle zusammen auf der Grundlage von nur zwei frei wählbaren Geschwindigkeitskonstanten mit einem RMS-Wert von 4.95 über eine Reaktionsdauer 800min fitten ließen. Wählte man dagegen zwei verschiedene Geschwindigkeitskonstanten für die beiden Phosphatbausteine, so sank der RMS- Wert auf 3.74 ab, d( Cy3 TCCGp) reagierte demnach dann aber zumindest immer noch.8mal langsamer als d( Cy5 TCCGp). Ein Faktor.8 erschien jedoch eher vorstellbar als ein Faktor 6 und war zumindest nicht vollkommen abwegig. Die sehr ähnliche Komplexstabilität der homomolekularen Duplexe von d( Cy3 TCCGCGGA) und d( Cy5 TCCGCGGA) (vgl. S. 79) machte größere Abweichungen jedoch unwahrscheinlich. Die Ergebnisse bezüglich des Fittings mit nur zwei Geschwindigkeitskonstanten (RMS = 4.95) sind in den folgenden beiden Abbildungen dargestellt, die aus Gründen

117 FRET-Kinetiken als Online-Messungen der Übersichtlichkeit in einen Teil zur Variation der initialen Templatmenge und einen Teil zur Reaktion mit den zwei verschiedenen Phosphatbausteinen getrennt wurden. Kontentration [µm] Zeit [min] Produkt bei 0% Templat Produkt bei 0% Templat Produkt bei 5% Templat Meßwerte Cy35 bei 0% Templat Meßwerte Cy35 bei 0% Templat Meßwerte Cy35 bei 5% Templat $EE9DULDWLRQGHULQLWLDOHQ7HPSODWPHQJHPLWXQG7HPSODWEHL 0XQGƒ&.5 Kontentration [µm] Zeit [min] Produkte bei Verhältnis :5 und 40µM Produkte bei Verhältnis : und 40µM Produkte bei Verhältnis : 9 und 30µM Meßwerte Cy35 bei Verhältnis : und 40µM Meßwerte Cy35 bei Verhältnis :5 und 40µM Meßwerte Cy35 bei Verhältnis : 9 und 30µM $EE.LQHWLNPLWYHUVFKLHGHQHQ9HUKlOWQLVVHQGHUEHLGHQ3KRVSKDWEDXVWHLQH EHLYHUVFKLHGHQHQ*HVDPWNRQ]HQWUDWLRQHQ In Abb. sind die Produktbildungskurven abgebildet, bei denen die initiale Templatmenge d( Cy3 TCCGCGGA) (0a) variiert wurde und d( n CGGA) (94a) mit d( Cy5 TCCGp) (00a) reagierte, in Abb. sind die Produktbildungskurven abgebildet, bei denen kein Templat vorgelegt wurde und d( n CGGA) (94a) mit d( Cy3 TCCGp) (96a) und d( Cy5 TCCGp) (00a) reagierte. Die berechneten Produkte setzen sich damit in Abb. aus der Summe über die Konzentrationen aller Duplexe zusammen, an denen d( Cy5 TCCG PNH CGGA) beteiligt ist, in Abb. ist es die Summe über alle Komplexe, an denen d( Cy5 TCCG PNH CGGA) (54) oder d( Cy3 TCCG PNH CGGA) (6) beteiligt ist. Handelt es sich dabei um homomolekulare Produktduplexe, so mussten diese jeweils doppelt eingerechnet werden. Die Übereinstimmungen zwischen Messwerten und Fittingresultaten war für die Abb. deutlich schlechter, auch wenn bei nur zwei frei wählbaren Geschwindigkeitskonstanten (nicht-autokatalytischer und autokatalytischer Reaktionskanal) und mit drei unabhängigen Experimenten bei Verwendung der zwei verschiedenen Phosphatbausteine ein relativ kleiner RMS-Wert berechnet wurde. Im direkten Vergleich der Abbildungen muss auch der unterschiedliche Ordinatenmaßstab berücksichtigt werden. Für genauere Messungen mit besseren Resultaten wäre ein empfindlicheres Fluorimeter wünschenswert gewesen, da die erhaltenen Resultate an der Grenze des Untergrundrauschens lagen, wie in Abb. 3 für eine 3

118 Die autokatalytische Reaktionsordnung p der Messungen, welche nicht für die Berechnung verwendet wurde, veranschaulicht ist. Man erkennt deutlich, dass in 800min nur etwa 6 Fluoreszenzeinheiten als Änderung durchlaufen werden. Im Vergleich dazu waren es bei den Experimenten zur Variation der initialen Templatmenge durchschnittlich mehr als zehnmal so viele Fluoreszenzeinheiten, die als Änderung durchlaufen wurden. Tendeziell war der Trend der Daten allerdings eindeutig. rel. Fluoreszenz Zeit [min] $EE'LH4XDOLWlWGHUJHVDPPHOWHQ'DWHQEH] JOLFKGHU([SHULPHQWH PLWGHQ]ZHLYHUVFKLHGHQHQ3KRVSKDWEDXVWHLQHQ Mit der Güte der erhaltenen Messdaten wurde sehr klar, dass man an die Grenzen der Empfindlichkeit des Messgerätes gestoßen war. Es ist recht wahrscheinlich, dass bei einem empfindlicheren Messgerät auch bezüglich dieser Messserien mit den zwei verschiedenen Phosphatbausteinen bessere Daten erhalten werden können. Wertete man dagegen das Gesamtsystem auf der Grundlage dreier frei wählbarer Geschwindigkeitskonstanten aus und ging man dabei so vor, dass man der Reaktion der beiden Phosphatbausteine im autokatalytischen Reaktionskanal jeweils eine eigene Geschwindigkeitskonstante zuwies, so verbesserte sich nicht nur der RMS- Wert der Rechnung, sondern auch die optische Übereinstimmung von Theorie und Experiment. Optisch änderten sich die Resultate für die Variation der initialen Templatmenge nicht, daher wurde nur die Auswirkung auf die Experimente mit den beiden verschiedenen Phosphatbausteinen abgebildet..4. Produkte bei Verhältnis :5 und 40µM Produkte bei Verhältnis : und 40µM Produkte bei Verhältnis : 9 und 30µM Konzentration [µm] Zeit [min] Meßwerte Cy35 bei Verhältnis : und 40µM Meßwerte Cy35 bei Verhältnis :5 und 40µM Meßwerte Cy35 bei Verhältnis : 9 und 30µM $EE'LHEHUHLWVRSWLVFKH9HUEHVVHUXQJGHV(KVVKPIUEHL(LQI KUXQJGUHLHU XQDEKlQJLJHU*HVFKZLQGLJNHLWVNRQVWDQWHQI UGDV*HVDPWV\VWHP 4

119 FRET-Kinetiken als Online-Messungen Für eine direkte Bestimmung der autokatalytischen Reaktionsordnung p wäre eine identische Geschwindigkeitskonstante für beide Phosphatbausteine plausibel. Da die Messwerte jedoch in diesem Fall keine ausreichende Übereinstimmung von Experiment und Fitting erlaubten, sah man von einer Ermittlung der Reaktionsorsnung p auf diesem Wege ab. Die Abhängigkeit der kinetischen Parameter voneinander Ganz allgemein ist jedes selbstreplizierende System durch einen bestimmten Parametersatz beschreibbar. Dieser kann viele oder wenige Geschwindigkeitskonstanten enthalten, diese können darüber hinaus variabel im Fitting oder fixiert sein. Die Güte des Fittings ist über den RMS-Wert quantifizierbar, die berechneten Geschwindigkeitskonstanten müssen aber nicht unbedingt realistisch sein, es ist durchaus häufig, dass die Minima des Simplex-Algorithmus Werte ergeben, die chemisch unrealistisch sind. Dies tritt besonders häufig auf, wenn bestimmte Geschwindigkeitskonstanten auf der Grundlage der Messdaten nicht klar definiert sind. In einem solchen Fall ändert sich der RMS-Wert nur geringfügig, wenn diese Werte großen Schwankungen durch das Programm unterworfen werden. Für das oben in Abb. und Abb. auf S.3 beschriebene System aus den sechs Einzelexperimenten kann man im Fitting z.b. zwei, drei oder sogar 0 Geschwindigkeitskonstanten frei variieren. Im Falle der zwei frei wählbaren Konstanten wurden für die übrigen acht Konstanten fixierte Werte eingegeben. Man verwendete dabei entsprechend die Werte, die man durch die NMR-Kinetiken für die EDC-Hydrolyse ermittelt hatte, bzw. fasste die Geschwindigkeitskonstanten der zugrundeliegenden Reaktionen jeweils zusammen. Analog verfuhr man bei drei frei wählbaren Konstanten. Zusätzlich wurden die auf der Grundlage der thermodynamischen Parameter bestimmten Gleichgewichtskonstanten in allen drei Rechnungen in Form der Geschwindigkeitskonstanten für Hin- und Rückreaktion als Rahmenbedingung konstant gehalten. Die Rechenergebnisse sind in folgender Tabelle gegenübergestellt; zusammengefasste Konstanten stehen nebeneinander, unabhängig ermittelte Werte sind grau unterlegt: Beschreibung durch 0 frei wählbare Geschwindigkeitskonstanten RMS k a k a k a3 k a4 k a5 k a6 k a7 k a8 k a9 k a0.3 (3.75 ±.30) 0-3 (.35 ±0.4) 0-3 (.49 ±9.70) 0-4 (5.47 ±0.49) 0 - (4.09 ±0.96) 0 6 (5.66 ±0.58) 0 6 (3.3 ±0.) 0 6 (9.58 ±.0) 0 6 (9.3 ±5.90) 0-4 Beschreibung durch 3 frei wählbare Geschwindigkeitskonstanten RMS k b k b k b3 k b4 k b (.36 ± 0.9) 0 - (4.3 ± 0.0) 0 6 (.35 ± 0.08) Beschreibung durch frei wählbare Geschwindigkeiskonstanten RMS k c k c k c3 k c (3.9 ±.60) (4.4 ± 0.0) (8.64 ±.30) 0-4 5

120 Die Abhängigkeit der kinetischen Parameter voneinander Darin bedeuten: Einheit k a : Aktivierung von d( Cy5 TCCGp) mit EDC [lmols - ] k a : Aktivierung von d( Cy3 TCCGp) mit EDC [lmols - ] k a3 : nicht-autokatalytische Ligation von d( Cy5 TCCGp) mit d( n CGGA) [lmols - ] k a4 : nicht-autokatalytische Ligation von d( Cy3 TCCGp) mit d( n CGGA) [lmols - ] k a5 : Ligation von d( Cy5 TCCGp) mit d( n CGGA) an d( Cy5 TCCGCGGA) [l mol s - ] k a6 : Ligation von d( Cy5 TCCGp) mit d( n CGGA) an d( Cy3 TCCGCGGA) [l mol s - ] k a7 : Ligation von d( Cy3 TCCGp) mit d( n CGGA) an d( Cy5 TCCGCGGA) [l mol s - ] k a8 : Ligation von d( Cy3 TCCGp) mit d( n CGGA) an d( Cy3 TCCGCGGA) [l mol s - ] k a9 : Hydrolyse des Adduktes von EDC mit d( Cy5 TCCGp) [s - ] k a0 : Hydrolyse des Adduktes von EDC mit d( Cy3 TCCGp) [s - ] Bei den übrigen Geschwindigkeitskonstanten k b bis k b5 bzw. k c bis k c4 handelt es sich um die zusammengefassten Werte. Man erkennt deutlich, dass insbesondere die Werte für den nicht-autokatalytischen Reaktionskanal k 43 und k a4 bzw. k b bzw. k c deutlichen Schwankungen unterworfen sind. Dies ist für derartige Experimente nicht ungewöhnlich, da im wesentlichen lediglich die Werte zur Templatkatalyse recht genau ermittelt werden können. Für den nicht-autokatalytischen Reaktionskanal ist es daher im allgemeinen ratsam, die Liagationsgeschwindigkeit mit einer nicht-selbstkomplementären Sequenz ohne Templatzugabe zu untersuchen [08]. Es sollte allerdings an dieser Stelle darauf hingewiesen werden, dass bei einem derartigen Experiment aufgrund der nicht komplementären Natur der verwendeten Sequenzen auch die in selbstkomplementären Systemen stets möglichen Selbstassoziationsphänomene der beiden Eduktbausteine stets außer Acht gelassen werden müssen. In den oben beschriebenen Experimenten konnte d( n CGGA) stets mit d( Cy3/5 TCCGp) Duplexe ausbilden, was prinzipiell auch immer einen Reaktionsmechanismus im Sinne einer BluntEndLigation ermöglichten sollte. Diese Uneindeutigkeit bezüglich des nicht autokatalytischen Reaktionskanals kann man auch durch einen Scan-Plot visualisieren. In der folgenden Abbildung steht k für den nicht-autokatalytische und k für den autokatalytischen Reaktionskanal des auf der Grundlage von nur zwei frei wählbaren Konstanten ermittelten Scan-Plots: $EE6FDQ3ORWI UN XQGN LQGHU$QDO\VHGXUFK6LP)LWVFDQ 6