Untersuchungen zur Selbstreplikation von Oligonucleotiden an Oberflächen

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1 Untersuchungen zur Selbstreplikation von ligonucleotiden an berflächen Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der aturwissenschaften der Fakultät für Chemie der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Thomas Brandsch Bochum 2003

2 Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von ktober 1995 bis März 1996 am Institut für rganische Chemie und Biochemie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg und von April 1996 bis Juni 2003 an der Fakultät für Chemie der Ruhr-Universität Bochum unter der Leitung von Prof. Dr. Günter von Kiedrowski angefertigt. In der Zeit von Januar 1998 bis Juni 2003 wurde zum Teil am Limnologischen Institut Dr. Karl-Ernst owak in ttersberg daran gearbeitet. Referent: Prof. Dr. G. von Kiedrowski Korreferent: Prof. Dr. M. Feigel 3. Prüfer: Prof. Dr. M. ollmann Tag der mündlichen Prüfung: 2. Dezember 2003

3 Danksagung errn Prof. Dr. Günter von Kiedrowski danke ich für die interessante Aufgabenstellung und die Unterstützung bei der Durchführung der Arbeit. Insbesondere bin ich für seine Bereitschaft dankbar, diese Arbeit nach meiner Anstellung am Limnologischen Institut Dr. owak weiterhin zu betreuen. errn Dr. Karl-Ernst owak danke ich für die Möglichkeiten, die mir am Limnologischen Institut eingeräumt wurden, meine Arbeit fortzusetzen. Allen Kollegen an der Ruhr-Universität Bochum danke ich für die angenehme Zusammenarbeit. Insbesondere gilt mein Dank Kai aumann, welcher an dieser Arbeit als Vertiefungsstudent mitgewirkt hat und sie auch danach als Doktorand mit Rat und Tat begleitet hat. Jan Bülle danke ich für seine tatkräftige Unterstützung und Michael Wüstefeld für die Synthesen am DA-Synthesizer.

4 IV Inhaltsverzeichnis Abkürzungen und Akronyme... VI 1 Einleitung Zielsetzung Allgemeiner Teil Vorversuche mit Modellsubstanzen Methylimidazol...28 Reaktionsordnung des Imidazols Aminopropylimidazol versus istamin Konsequenzen für die weitere Vorgehensweise Synthese festphasengebundener Phosphoimidazolide Belegung der Festphase mit Aminosäuren Bildung der Phosphoimidazolide...67 Pufferreste Selbstreplikation an der Festphase Der Einfluss der Festphase auf die Selbstreplikation von ligodesoxynucleotiden Der Einfluss weiterer Aminosäuren Der Einfluss der Salzkonzentration Zusammenfassung und Ausblick...91

5 V 5 Experimenteller Teil Chemikalien und Geräte Synthesen und kinetische Experimente Synthese der ligonucleotid-bausteine Synthese der ligopeptid-festphasen Synthese der Phosphoimidazolide Kinetische Experimente SimFit-Dateien Literatur...113

6 VI Abkürzungen und Akronyme Ac API Arg Asp Boc C DA DIEA DMF EDC Fmoc G EPES is isa isme PLC Ile Im Leu Lys M MeIm MMT n MR tbu Acetyl 1-Aminopropylimidazol Arginin Asparaginsäure tert-butoxycarbonyl Cytidin (in ligonucleotidsequenzen) Desoxyribonucleinsäure Diisopropylethylamin Dimethylformamid 1-Ethyl-3-(3'-dimethylaminopropyl)-carbodiimid Fluorenylmethoxycarbonyl Guanosin (in ligonucleotidsequenzen) -(2-hydroxyethyl)piperazin- -ethanesulfonsäure istidin istamin istidin-methylester igh Performance Liquid Chromatography Isoleucin Imidazol Leucin Lysin Termolekularer Komplex 1-Methylimidazol 4-Monomethoxytrityl Aminogruppe (in ligonucleotidsequenzen), allgemein für ein als Aminokomponente reagierendes Trinucleotid uclear Magnetic Resonance tert-butylester

7 VII p Phosphatgruppe (in ligonucleotidsequenzen), allgemein für ein als Phosphatkomponente reagierendes Trinucleotid p* mit EDC aktivierte Phosphatgruppe (in ligonucleotidsequenzen), allgemein für ein als Phosphatkomponente reagierendes Trinucleotid in EDC-aktivierter Form pim Phosphoimidazolidbindung (in ligonucleotidsequenzen), allgemein für ein ligonucleotid mit Phosphoimidazolidbindung pn Phosphoamidatbindung (in ligonucleotidsequenzen), allgemein für ein ligonucleotid mit Phosphoamidatbindung pp Pyrophosphatbindung (in ligonucleotidsequenzen), allgemein für ein ligonucleotid mit Pyrophosphatbindung PTE 2-(Phenylthio)-ethyl Py-SS Pyridyldisulfide RMS Root Mean Square Ser Serin T Templat TBTU -(1--Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborat TEAB Triethylammoniumbicarbonat Trp Tryptophan Trt Trityl UV Ultraviolett (Spektroskopie)

8 KAPITEL 1 EILEITUG 1 1 Einleitung Eine Frage, welche Chemie und Biologie, sowie auch andere Wissenschaften, wohl noch lange beschäftigen wird, ist jene nach dem Ursprung des Lebens auf der Erde. Die einfachen organischen Moleküle, auf denen das Leben aufbaut, könnten sich unter bestimmten Bedingungen schon früh gebildet haben [ESCEMSER und LEWETAL, 1992]. Aber Leben, so wie wir es kennen, findet in Zellen statt, die eine außerordentlich hohe Komplexität aufweisen. Es ist daher unwahrscheinlich, dass sich funktionierende Zellen spontan aus einer Vielzahl unterschiedlicher organischer Moleküle gebildet haben. Vielmehr ist die Annahme berechtigt, dass davor einfachere Systeme in der Lage waren, eine Selbsterhaltung genetischer Moleküle zu bewerkstelligen. Eine gewisse molekulare Vielfalt vorausgesetzt, können die Überlebenschancen einzelner Moleküle in einer sich ändernden Umwelt jeweils höher sein, so dass man von einer Evolution auf molekularer Ebene sprechen kann. eben der Klärung der Frage, wie sich die Grundbausteine des Lebens zum Teil spontan gebildet haben, ist die Untersuchung der Fähigkeit zur chemischen Evolution ein wesentlicher Aspekt der präbiotischen Chemie. Dafür müssen folgende grundlegende Bedingungen erfüllt sein [EIGE, 1971; BIEBRICER et al., 1985]: Es findet ein Metabolismus statt, d.h. Energie aus der Umwelt wird aufgenommen, um größere Moleküle aufzubauen. Am einfachsten geschieht dies durch Einbau aktivierter Eduktbausteine, die in der Umgebung verfügbar sind. Es findet Selbstreplikation von Molekülen statt, so dass genetische Information übertragen wird (Vererbung). Dies geschieht dadurch, dass größere Moleküle als Template für ihre Bildung aus kleineren Molekülen fungieren. Zusätzlich muss die Möglichkeit zur Mutabilität gegeben sein, d.h. der Kopierprozess ist in gewissem Umfang fehlerhaft, so dass auch neue Varianten entstehen können.

9 KAPITEL 1 EILEITUG 2 Selbstreplizierende chemische Systeme sind in diesem Sinne die einfachsten Formen, die Evolution erlauben würden [Reviews: MADDX, 1991; FFMA, 1992; RGEL, 1992; RGEL, 1995; BAG und V KIEDRWSKI, 1996; RBERTS et al., 2000]. Dabei wirkt in einem Reaktionszyklus ein Produkt als Katalysator seiner eigenen Synthese. Diese Autokatalyse kann grundsätzlich mit oder ohne Informationstransfer stattfinden, wobei Selektion natürlich nur bei Informationsübertragung möglich ist. ierfür ist eine hochspezifische molekulare Erkennung notwendig, wie sie zum Beispiel bei der WATS-CRICK-Basenpaarung in polymeren ucleotiden vorliegt. achdem bekannt wurde, dass RA-Moleküle auch katalytische Eigenschaften aufweisen können (Ribozyme), reifte die Vorstellung einer homomolekularen RA- Welt [JYCE, 1989 und 2002], die vor der heute bekannten DA-RA-Protein-Welt bestanden haben könnte, da die Verknüpfung von Information und Funktion theoretisch in einem Molekül realisiert werden kann [CEC, 1990; ALTMA, 1990]. Inzwischen sind auch zahlreiche Desoxyribozyme bekannt [CUEUD und SZSTAK, 1995; BURMEISTER et al., 1997; SUGIMT und KUMT, 1999], so dass ucleinsäuren unter den bekannten Biopolymeren die aussichtsreichsten Kandidaten für ein enzymfrei arbeitendes selbstreplizierendes System sind, das zu chemischer Evolution befähigt wäre. Im einfachsten Fall eines selbstreplizierenden Systems reagieren zwei Eduktbausteine A und B zu einem Produkt T, das als Templat für seine eigene Bildung dient. Durch Assoziation zu einem termolekularen Komplex M, kommen die reaktiven Gruppen der Edukte A und B in räumliche ähe (Templateffekt), wodurch die autokatalytische Wirkung entsteht. Die irreversible kovalente Verknüpfung (Ligation) führt erst zum Duplex T 2, dessen reversible Dissoziation die Templatbausteine für neue Katalysezyklen freisetzt (Abb. 1).

10 KAPITEL 1 EILEITUG 3 M T 2 k K 1 K 2 A B T T Abb. 1: Schematische Darstellung eines minimalen selbstreplizierenden Systems In homogenen Lösungen kann immer auch die unkatalysierte Reaktion zwischen A und B stattfinden. Einerseits ist diese ebenreaktion Voraussetzung dafür, dass der autokatalytische Zyklus überhaupt in Gang kommen kann, andererseits findet dabei keine Informationsübertragung statt. Das Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten der autokatalytischen (k a ) und der unkatalysierten Reaktion (k b ) beschreibt die autokatalytische Effizienz des Systems. Selektion kann nur bei äußerst effizienten Systemen stattfinden. Das erste selbstreplizierende System auf Basis dieses einfachen Reaktionszyklus wurde 1986 vorgestellt [V KIEDRWSKI, 1986]. Dabei handelt es sich um zwei modifizierte ligodesoxyribonucleotide der Sequenzen CCG und CGG, sowie das selbstkomplementäre examer CCGCGG als Templat (Abb. 2). Die Ligation erfolgte durch in situ-aktivierung des 3 -Phosphats mit dem wasserlöslichen Ethyl(dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC).

11 KAPITEL 1 EILEITUG 4 Cl P G G C G C C C C G C G G C 3 3 C P - Cl P - 3 C + + C 3 Abb. 2: Termolekularer Komplex des ersten selbstreplizierenden Systems nach V KIEDRWSKI Dass die Reaktion autokatalytisch verlief, konnte dadurch gezeigt werden, dass mit steigender Anfangskonzentration des zugesetzten examers CCGCGG, die Anfangsgeschwindigkeit zunahm. Dies allerdings nicht proportional mit der zugesetzten Matrizenkonzentration sondern nach folgendem Geschwindigkeitsgesetz: dct v T = = α ct + β (1) dt Die Konstanten α und β beschreiben dabei den autokatalytischen bzw. den nichtkatalysierten Reaktionskanal, c T ist die Gesamtkonzentration aller Spezies, die Template enthalten ( c T = [T] + [ABT] + 2 [T 2 ] ). Das ermittelte Geschwindigkeitsgesetz (1) ( Quadratwurzelgesetz der Autokatalyse ) führt dazu, dass das Wachstumsverhalten in dem untersuchten System parabolisch und nicht exponentiell verläuft. Die allgemeine Form der Geschwindigkeitsgleichung für ein selbstreplizierendes System ist:

12 KAPITEL 1 EILEITUG 5 dc dt T p v T = = α ct + β (2) wobei p die autokatalytische Reaktionsordnung darstellt, die entscheidend für die Qualität des autokatalytischen Reaktionskanals ist. Für p = 0 erhält man eine lineare Wachstumsfunktion, für p = 0,5 eine parabolische und für p =1 ist das Wachstum exponentiell. Grundsätzlich gibt es auch noch die Möglichkeit eines hyperbolischen Wachstums, wenn p = 2 oder größer. Eine Voraussetzung dafür, dass chemische Evolution auftreten kann, ist die Fähigkeit eines Systems Selektion hervorzurufen. Wenn unterschiedliche Templatmoleküle, sich selbst replizieren und dabei um gemeinsame Eduktmoleküle konkurrieren, können grundsätzlich zwei Situationen auftreten: Der effizienteste Replikator verdrängt sämtliche weniger effizienten Konkurenten (Selektion) Die unterschiedlich effizienten Replikatoren erreichen lediglich unterschiedliche Konzentrationsniveaus (Koexistenz) Es konnte theoretisch gezeigt werden [SZATMÀRY und GLADKI, 1989; SMIT und SZATMÀRY, 1995], dass für das Auftreten von Selektion, exponentielles Wachstum notwendig ist. Parabolisches Wachstum (p = 0,5), führt wie lineares Wachstum (ohne Autokatalyse) auch nur zu Koexistenz, allerdings ist der Konzentrationsunterschied bei gleichem Reaktivitätsunterschied größer als im Falle des linearen Wachstums: [ T1 ] [ T ] 2 k = k (3) Eine theoretische Betrachtung des minimalen Modells eines selbstreplizierenden Systems ergibt, dass es einen systemimmanenten inderungsgrund für exponentielles Wachstum gibt. Durch die Selbstassoziation der Templatbausteine (ausgedrückt durch die Konstante K 2 ) entziehen sich Templatmoleküle der weiteren Wirkung als Matrize,

13 KAPITEL 1 EILEITUG 6 wodurch eine Produktinhibition auftritt. Somit ist eine feste Bindung zwischen den beteiligten Bausteinen einerseits Voraussetzung dafür, dass Autokatalyse überhaupt gegenüber der direkten Reaktion zum Tragen kommt, andererseits aber der Grund dafür, dass das Wachstum nur parabolisch und nicht exponentiell ist. In einer theoretischen Arbeit [V KIEDRWSKI, 1993] wurde ein allgemeiner Ausdruck für die autokatalytische Reaktionsordnung abgeleitet: p 4 K c 2 2 T = K 2 ct q + (1 + q) (1 + q) 8 K 2 ct 2 2 q + (1 + q) (4) q mit q K 1 1 =, wobei c A, cb und ct c A c B die Gesamtkonzentrationen der beteiligten Bausteine darstellen. Diese Formel erlaubt eine Berechnung der autokatalytischen Reaktionsordnung in Abhängigkeit von den Gleichgewichtskonstanten K 1 und K 2. Parabolisches Wachstum wird danach immer dann vorliegen, wenn 2 >> c c und 2 2 >> 1 K 2 ct K1 A B K (5) c T d.h. der Duplex stabiler als der termolekulare Komplex ABT ist. Dies ist in der Regel aus entropischen Gründen grundsätzlich der Fall. Exponentielles Wachstum hingegen setzt voraus, dass K1 ca cb 2 K 2 >> ct und 1 c A c B >> 1 K (6) also dass der temolekulare Komplex stabiler ist als der Duplex, was aus entropischer Sicht äußerst schwer zu realisieren ist. Theoretisch kommt es am Anfang einer autokatalytischen Reaktion zu exponentiellem Wachstum, wenn die Population des Komplexes ABT höher ist als jene von T 2.

14 KAPITEL 1 EILEITUG 7 eben diesem stark exponentiellen Wachstum, ist theoretisch auch ein schwach exponentielles Wachstum realisierbar, wenn 2 K 2 c T << 1 und 1 c A c B << 1 K. (7) Dies sollte bei hohen Temperaturen bzw. starken Verdünnungen der Fall sein, wenn die Komplexe fast vollständig dissoziiert vorliegen. Experimentell ist weder starkes noch schwaches exponentielles Wachstum beobachtet worden, weil unter den dafür geforderten Bedingungen der nichtkatalysierte Reaktionskanal dominiert. Bis auf einige Ausnahmen, die noch nicht theoretisch geklärt sind, zeigen alle bekannten selbstreplizierenden Systeme parabolisches Wachstum. Durch die erste experimentelle Realisierung eines selbstreplizierenden Systems und die theoretische Beschreibung der kinetischen und thermodynamischen Eigenschaften, waren die Grundlagen gelegt. Es folgte eine Reihe von Arbeiten, die Verbesserungen oder Erweiterungen brachten, bevor dann in den letzten Jahren einige grundlegend neue Aspekte eingebracht wurden. Anhand einiger Beispiele soll im Folgenden dieser Weg aufgezeichnet werden. Während bei dem ersten System (Abb. 2) der Autokatalysecharakter nur indirekt (durch eine Erhöhung der Anfangsgeschwindigkeit bei Zugabe der Matrize) nachgewiesen werden konnte, wurde in einer Modifikation des Systems [V KIEDRWSKI et al., 1991] ein sigmoidaler Kurvenverlauf beobachtet. Ausgangspunkt der Planung waren die vergleichenden Untersuchungen zur Kinetik der EDC-Ligation, bei Beteiligung unterschiedlicher funktioneller Gruppen [DLIAYA et al., 1988; DLIAYA et al., 1991]. So erwies sich die Ligation zwischen einer 5 -Aminogruppe und einer 3 -Phosphatgruppe als etwa 10mal schneller im Vergleich zu der entsprechenden Phosphat-Verknüpfung und etwa 100mal schneller als die natürliche Phosphat-Verknüpfung. Deshalb wurde die -Gruppe des ursprünglichen Systems durch die nukleophilere Aminogruppe ersetzt (Abb. 3), was zu einer deutlich effizienteren Autokatalyse führte.

15 KAPITEL 1 EILEITUG 8 Cl P pn C 2 SC 3 G G C G C C C C G C G G 3 CSC 2 P 2 - P - Cl 3 C + C 3 + Abb. 3: Termolekularer Komplex des selbstreplizierenden Systems unter Ausbildung einer Phosphoamidatbindung Da die Verknüpfungsreaktion deutlich schneller ablief, wurden keine ebenreaktionen beobachtet. Die autokatalytische Effizienz, als Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten des autokatalytischen und des nichtkatalysierten Reaktionskanals, lag für dieses System bei 420 M -1/2 (einem relativ hohen Wert im Vergleich zu 25 M -1/2 beim ersten System), was dazu führt, dass die Autokatalyse auch am Reaktionsverlauf erkannt werden kann. Wird keine Matrize zu Beginn dazugegeben, so nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit mit zunehmend gebildetem exanucleotid zu. Da die Konzentration der zur Verfügung stehenden Trinucleotidbausteine begrenzt ist, flacht die Reaktionskurve nach einiger Zeit ab, und durch die Kombination dieser beiden Effekte entsteht der typische sigmoidale Kurvenverlauf (Abb. 4). Ebenfalls eine Phosphoamidatverknüpfung (diesmal aber über eine 3 -Aminofunktion) erfolgt in dem System von ZIELISKI und RGEL (Abb. 5) [ZIELISKI und RGEL, 1987]. Auch dieses System zeigte wegen der Produktinhibition parabolisches Wachstum. Im Unterschied zu den vorherigen Beispielen, handelt es sich hier um ein sich selbst replizierendes Tetramer. Somit ist das Bestreben zu erkennen, ein möglichst kleines selbstreplizierendes System zu erreichen, sozusagen die Selbstreplikation auf ein

16 KAPITEL 1 EILEITUG 9 strukturelles Minimum zu reduzieren. Dafür muss allerdings von den ucleotiden auf andere organische Bausteine übergegangen werden. 1 Konzentration (c) 0,8 0,6 0,4 0, ,5 1 1,5 2 Zeit (t) Abb. 4: Beispiel eines sigmoidalen Kurvenverlaufs, Konzentration versus Zeit 3 pn pn pn C G C G G C G C pn pn 3 2 P - 3 C + C 3 + Abb. 5: Termolekularer Komplex des selbstreplizierenden Systems nach ZIELISKI und RGEL achdem REBEK 1990 das erste artifizielle selbstreplizierende System vorstellte [TJIVIKUA et al., 1990], gilt als der kleinste bisher bekannte Replikator das vollständig

17 KAPITEL 1 EILEITUG 10 artifizielle System von TERFRT [TERFRT und V KIEDRWSKI, 1992]. Die Erkennung erfolgt über Salzbrücken zwischen einem Amidinium- und einem Carboxylation, die Ligation über die Bildung eines Azomethins (Abb. 6). R 1 R 4 R R 3 Abb. 6: Termolekularer Komplex des selbstreplizierenden Systems nach TERFRT Von besonderem Interesse ist der von SUTERLAD vorgestellte Replikator [WAG und SUTERLAD, 1997], dessen Ligation über eine DIELS-ALDER-Reaktion erfolgt (Abb. 7). C 3 3 C C 5 11 C 5 11 C 3 C 3 Abb. 7: Termolekularer Komplex des selbstreplizierenden Systems nach SUTERLAD

18 KAPITEL 1 EILEITUG 11 Überraschenderweise lag die autokatalytische Reaktionsordnung bei p = 0.8 (also zwischen parabolisch und exponentiell). Eine Erklärung hierfür wäre die Möglichkeit einer besonders vorteilhaften sterischen Anordnung der Bausteine im termolekularen Komplex, im Gegensatz zu einer sterisch weniger begünstigten Duplexbildung. Dies würde zu einer relativen Stabilitätssteigerung des termolekularen Komplexes gegenüber dem Duplex führen, was der Theorie zufolge zu einem Anstieg der autokatalytischen Reaktionsordnung führt. Auch unter den natürlich vorkommenden Molekülen ist Selbstreplikation nicht auf ucleotide beschränkt. Für Aufsehen sorgte 1996 die Veröffentlichung von GADIRI [LEE et al., 1996; SEVERI et al., 1997], in der ein selbstreplizierendes System von Peptiden beschrieben wurde. Ein ligopeptid aus 32 Aminosäuren wird dabei aus einem Pentadecamer und einem eptadecamer gebildet. Die Erkennung basiert auf hydrophoben Wechselwirkungen zwischen den Aminosäureseitenketten, die in der entsprechenden Sequenz jeweils auf einer Seite der α-elix liegen. Die Ligation erfolgt über eine natürliche Amidbindung, allerdings entsprechend der Verknüpfungsreaktion nach KET [DAWS et al., 1994], aus einer als Thioester aktivierten Carbonsäurekomponente und der Aminokomponente eines Cysteins. Im Anschluss an die intermediäre Um(thio)esterung erfolgt dabei ein intramolekularer Acyl-Skip (S ), der zu dem Carbonsäureamid führt (Abb. 8). Die Bildung des untersuchten Kopplungsproduktes erfolgte autokatalytisch und ergab parabolisches Wachstum, was auf die unvermeidlich auftretende Produktinhibition hindeutete. Bei Zugabe von Denaturierungsmittel wurde die Autokatalyse verhindert, da keine Erkennung mehr möglich war. Anhand von gezielten Punktmutationen in der Sequenz der einzelnen Peptidbausteine, die zu einer Unterbrechung der hydrophoben Wechselwirkungen führten, konnte gezeigt werden, dass die Anlagerung beider Bausteine an das Templat notwendig ist. Auch konnte eine gewisse Sequenzspezifizität des Replikators demonstriert werden.

19 KAPITEL 1 EILEITUG 12 Peptid S... Peptid 2 R S 2 Peptid 1... R S... Peptid 2 Abb. 8: S Peptid Peptid 2 R Peptid-Kopplung nach KET Die autokatalytische Reaktionsordnung p erwies sich mit einem Wert von 0,63 etwas größer als für einen parabolischen Replikator erwartet. Dies könnte daran liegen, dass neben dem termolekularen Komplex aus Templat und den beiden Eduktbausteinen auch ein tetramolekularer Komplex vorliegt, in dem zwei Templatmoleküle an der Autokatalyse beteiligt sind. Wenn höhermolekulare Komplexe an dem Autokatalysezyklus beteiligt sind, führt das theoretisch zu einer autokatalytischen Reaktionsordnung p > 0,5:

20 KAPITEL 1 EILEITUG 13 Die Reaktionsgleichung der Bildung eines höhermolekularen Komplexes T n aus den Bausteinen A und B unter Beteiligung von (n-1) Templatmolekülen hat die allgemeine Form: A + B + (n-1) T K 1 k K 2 ABT n-1 T n n T Die Bildungsgeschwindigkeit ist proportional zu der Konzentration des (n+1)- molekularen Komplexes ABT n-1 : v k [ ABT 1] (8) = n Die beiden Gleichgewichte werden durch folgende Gleichungen beschrieben: K 1 ABT [ A][ B][ T ] [ n 1] = (9) n K [ Tn] n [ T ] 2 = (10) Daraus ergibt sich für die Reaktionsgeschwindigkeit der Ausdruck: v = k K (11) ( n 1) 1 [ A][ B][ T ] Andererseits ergeben sich die Gesamtkonzentrationen von A, B und T aus der jeweiligen Summe der Konzentrationen der Spezies in denen diese Moleküle vorkommen:

21 KAPITEL 1 EILEITUG 14 c T ] + n[ T ] + ( n 1)[ ABT ] (12) T = [ n n 1 c A] + [ ABT ] (13) A = [ n 1 c B] + [ ABT ] (14) B = [ n 1 Unter der Annahme, dass C A, C B >> C T und damit das erste Gleichgewicht auf die Seite der Edukte verschoben ist und das zweite auf die Seite des assoziierten Komplexes T n, können die Ausdrücke vereinfacht werden: c = n[ T n ], c A = [A], c B = [B] (15) T Die Konzentration des Komplexes T n hängt aber über die Gleichgewichtskonstante K 2 mit der Konzentration des freien Templats T zusammen (Gleichung 10), so dass: c 2[ ] n T = n K T oder 1 [ c n T T ] n K 2 = (16) Setzt man nun in Gleichung 11 ein, so erhält man unter Zusammenfassung aller Konstanten den Ausdruck: v A B n 1 n T = k ' c c c (17) Die autokatalytische Reaktionsordnung ergibt sich also aus der Molekularität der an der Reaktion beteiligten Komplexe über:

22 KAPITEL 1 EILEITUG 15 p n 1 n = (18) Für n = 2 erhält man p = 0,5, also parabolisches Wachstum, für z.b. n = 4 aber p = 0,8 usw. Je höher die Molekularität des Übergangskomplexes, um so mehr nähert sich die autokatalytische Reaktionsordnung dem Wert von 1, der exponentielles Wachstum bedeuten würde. Im Fall des oben vorgestellten selbstreplizierenden Peptids, wo eine autokatalytische Reaktionsordnung von 0,63 zu beobachten ist, legt das den Schluss nahe, dass ein tetramolekularer Komplex (n = 3) an der Autokatalyse beteiligt ist, was nach Gleichung 18 einem Wert für p von 2/3 entspräche. Ähnliche Strukturen mit drei aneinandergelagerten Molekülsträngen sind auch aus der DA-Chemie bekannt. An einen Doppelstrang aus einem omopyrimidin- und einem komplementären omopurinstrang kann ein weiterer komplementärer omopyrimidinstrang über GSTEE-Basenpaarung in der großen Furche der Doppelhelix an den omopurinstrang anlagern und eine Tripelhelix ausbilden. Ein auf diese Erkennung aufbauendes selbstreplizierendes System wurde 1994 von ICLAU vorgestellt [LI und ICLAU, 1994]. Dabei wurden zwei Dodecamere an einem DA-Duplex aus zwei selbstkomplementären und palindromen 24meren durch Aktivierung mit -Cyanoimidazol ligiert. Eine Absenkung des p-wertes führt nun dazu, dass der neu gebildete Strang von dem Doppelstrang dissoziert und als Templat für zwei weitere Bausteine zur Verfügung steht, wobei erneut der ursprüngliche Doppelstrang gebildet wird. Es handelt sich strenggenommen um zwei selbstreplizierende Systeme, die ineinander verwoben sind. Einmal fungiert der Doppelstrang als Matrix, das andere Mal ein Einzelstrang. Da die Stabilität der Tripelhelix deutlich geringer ist als jene der Doppelhelix, wird letztere unter den Versuchsbedingungen nicht dissoziieren, so dass nicht von einem tetramolekularen Komplex im Sinne der oben vorgestellten Theorie gesprochen werden kann. Vielmehr verhält sich der Duplex wie ein einziges Molekül.

23 KAPITEL 1 EILEITUG 16 Durch eine schrittweise Reaktionsführung (Assoziation, Ligation, Dissoziation) kann ähnlich wie bei der enzymatischen PCR die unerwünschte Produktinhibition umgangen werden. Ein Modell, dass dieses Potential voll ausnutzt ist das 1998 veröffenlichte SPREAD-Verfahren (Surface Promoted Replication and Exponential Amplification of DA-Analogues) [LUTER et al., 1998]. Damit wurde erstmals exponentielles Wachstum von modifizierten DA-Bausteinen unter nichtenzymatischen Bedingungen erreicht, allerdings durch eine schrittweise Reaktionsführung, welche die räumliche Separation von Templat und Produkt auf einer Festphase erlaubte. Bei der experimentellen Durchführung wurde ein thiolmodifiziertes Tetradecanucleotid als Templat über eine Disulfid-Brücke an ein festes Trägermaterial fixiert. Beim Kontakt mit einer Lösung zweier komplementärer Eduktbausteine kommt es zu deren Anlagerung an das immobilisierte Templatmolekül, und durch Aktivierung mit EDC zur Ligation. Der gebildete Templat-Duplex kann nun unter denaturierenden Bedingungen (z.b. mit verdünnter atronlauge) getrennt werden, wobei das ursprüngliche Templat- Molekül an der Festphase fixiert bleibt und das komplementäre 14mer davon heruntergespült werden kann (Abb. 9). Wird letzteres an neues Trägermaterial gebunden, so kann aus den entsprechenden Fragmenten nach demselben Verfahren das ursprüngliche Templatmolekül gebildet werden, so dass sich nach dessen erneuter Immobilisierung der Replikationszyklus schließt. Auch wenn die hier verwendeten ucleotidmodifikationen und chemischen Bedingungen aus präbiotischer Sicht nicht realistisch sind, stellt das SPREAD- Verfahren eine grundsätzliche Möglichkeit dar, wie exponentielles Wachstum an berflächen stattfinden kann. Das Prinzip der Trennung von Produkt und Templat könnte z.b. auch durch Temperaturschwankungen (Tag/acht oder in der ähe von ydrothermalquellen) erreicht werden. Damit erweitert sich die Reihe möglicher Szenarien chemischer Evolution ungemein.

24 KAPITEL 1 EILEITUG 17 S + Py-S-S Immobilisierung S S Assoziation S S S-S-Py Ligation S S S-S-Py Dissoziation S S + S-S-Py komplementäres ligonucleotid kann erneut immobilisiert werden Abb. 9: Schematische Darstellung des SPREAD-Verfahrens

25 KAPITEL 1 EILEITUG 18 Bereits 1996 berichteten FERRIS und RGEL [FERRIS et al., 1996], dass an der berfläche von Mineralien die Synthese längerer ligomere möglich ist, die in Lösung (aufgrund der zwangsläufig als ebenreaktion ablaufenden ydrolyse) nicht erreicht werden konnte [FERRIS, 1993; FERRIS und ERTEM, 1993]. So gelang die Synthese von über 50 Einheiten langen ligonucleotiden (an Montmorillonit) und ligopeptiden (an ydroxylapatit oder Illit). Als Monomere für ligonucleotide kamen dabei 5 -Phosphoimidazolide (Abb. 10) zum Einsatz. 2 R P Abb. 10: Adenosin-5 -Phosphoimidazolid Die aktivierten Monomere werden von der ionischen berfläche unspezifisch gebunden und somit lokal aufkonzentriert. Dadurch wird die Verknüpfungsreaktion wesentlich schneller und die ydrolyse weniger bedeutsam. Ab einer gewissen Kettenlänge ist die Bindung zu der berfläche so stark, dass die ligonucleotide nicht mehr abgelöst werden. Damit sind die Bedingungen einer Festphasensynthese [MERRIFIELD, 1995; MERRIFIELD, 1996] erreicht, und durch Zuführen neuer Monomere, erfolgt eine Kettenverlängerung, die durch ydrolyse und Kettenabbruchsreaktionen begrenzt ist [RGEL, 1998]. Die besten Ergebnisse wurden durch anfängliche Adsorption eines Primers an die Mineraloberfläche und wiederholte Zugabe neuer Monomerlösungen erhalten. Durch diese Experimente konnte gezeigt werden, dass in heterogenen Systemen im Unterschied zu homogenen Lösungen die Entstehung längerer ligomere spontan erfolgen kann. Dadurch wird auch die präbiotische Selbstkonstitution kurzer Ribozyme vorstellbar, allerdings muss das Bild der Ursuppe bei der Entstehung des Lebens

26 KAPITEL 1 EILEITUG 19 erweitert werden. Der Vorgang der Polymerisation an berflächen könnte besser als Backen von Crepes [V KIEDRWSKI, 1996] beschrieben werden. Die Ursuppe liefert dabei die Bausteine, die auf der berfläche zur Reaktion kommen. Die Grundlagen dieser Vorstellung wurden theoretisch schon von BERAL [BERAL, 1951] gelegt. In dieses Bild passt auch der durch das SPREAD-Verfahren aufgezeichnete Weg der Selbstreplikation von ligomeren an berflächen, der exponentielles Wachstum und somit Selektion erlaubt. Durch das inzukommen der Festphasen und der dadurch geschaffenen Möglichkeiten, können unerwünschte ebenreaktionen unterbunden werden. Im Falle der ligomerisation kommt es zu einer adsorptiven Anreicherung an der berfläche und dadurch wird der gegenläufige Effekt der ydrolyse unterbunden. Bei der Selbstreplikation schafft die Bindung an die Festphase die Möglichkeit, Templat und Produkt zu trennen, so dass die Produktinhibition umgangen wird. Für die Ursprung-des-Lebens-Diskussion ist es allerdings plausibler, wenn ein System gefunden wird, das möglichst ohne Einwirkung des Experimentators zu Selektion und Evolution befähigt wäre. Mit ilfe von Computersimulationen konnte ein Weg aufgezeigt werden, wie Selektion an Festphasenoberflächen stattfinden kann [V KIEDRWSKI und SZATMARY, 2000]. Ausgangspunkt ist die Idee, Selbstreplikation unter Chromatographie-Bedingungen durchzuführen, d.h. die Template adsorbieren reversibel an einem festen Träger und breiten sich in Fließrichtung aus. Die Adsorption der Fragmente ist viel schwächer, so dass sie über das Trägermaterial fließen und an Stellen, die von Templaten besiedelt sind, unter Templatkatalyse zu Produkten reagieren, die erst als Templat/Produkt-Duplexe vorliegen, dann aber dissoziieren und weitergespült werden, wo sie wieder adsorbieren und ihrerseits als Template für weitere Synthesen dienen können. Werden die Bausteine kontinuierlich nachgeliefert, so breiten sich die Template aus und besiedeln nach und nach den Träger. Unter der Annahme, dass zwei solcher Template, die um gemeinsame Eduktbausteine konkurrieren (z.b. Kopf-Schwanz- und Schwanz-Kopf-Anordnung), gleiche Bindungseigenschaften an die Festphase aufweisen und sich nur in der Reaktionsgeschwindigkeit des Kopplungsschrittes unterscheiden, erhält man in der Simulation ein überraschendes Ergebnis. Anfangs nimmt die Konzentration beider

27 KAPITEL 1 EILEITUG 20 Template zu, aber nach einiger Zeit nimmt die Konzentration des langsameren Replikators ab, während jene des schnelleren Replikators weiter steigt. Später wird die ganze Säule von dem schnelleren Replikator überflutet, während der langsamere in einer schmalen Zone entlang der Säule wandert. Man erhält also eine Selektion des schnelleren Replikators, obwohl dasselbe Reaktionsmodell zugrundegelegt wurde, welches in Lösung zu parabolischem Wachstum und Koexistenz der beiden Spezies führt. Mit ilfe eines kinetischen Modells wurde außerdem nach den Bedingungen gesucht, unter denen Selektion stattfindet. Unter der Annahme, dass die templatgesteuerte Reaktion nur an der Festphase stattfindet, kann das vorgeschaltete Gleichgewicht (Assoziation) mit der eigentlichen irreversiblen Reaktion (Ligation) zusammengefasst werden: A + B + T-(Festphase) k T 2 -(Festphase) Die freien Templatmoleküle befinden sich im Gleichgewicht mit dem entsprechenden Duplex, und beide können an der Festphase adsorbiert werden, so dass folgende Gleichgewichte berücksichtigt werden müssen: K 1 2 T T 2 T + (Festphase) K 2 T-(Festphase) T 2 + (Festphase) K 3 T 2 -(Festphase) Es konnte nun gezeigt werden, dass ein Replikator dann Überhand gewinnen kann, wenn die Geschwindigkeit seiner templatgesteuerten Ligation (k) groß ist und die Bindung an die Festphase (K 2 ) stark ist. Außerdem kann Selektion nur dann auftreten,

28 KAPITEL 1 EILEITUG 21 wenn K 3 > K 2, also der Doppelstrang stärker an der berfläche adsorbiert, als der Einzelstrang. Diesen Bedingungen entspricht z.b. die auf Ionenaustausch beruhende Bindung von ligonucleotiden an kationische Mineraloberflächen. Dieses Modell könnte also Relevanz für den Ursprung des Lebens besitzen, da die Chromatographiesäule ihre Entsprechung in einem Tunnel oder Flussbett hätte, in welchem eine mineralische berfläche von Wasser kontinuierlich bespült wird. Sind in diesem Wasser die entsprechenden Bausteine vorhanden, so kann die Selbstreplikation an der berfläche sowohl zu Koexistenz als auch zu Selektion führen, in Abhängigkeit von den kinetischen und thermodynamischen Parametern. Die Fitness eines Replikators hängt dabei nicht nur von der Geschwindigkeit der von ihm katalysierten Ligation ab, sondern auch von seiner Bindungsstärke an die berfläche. Die aufgeführten Beispiele zeigen eindeutig, dass die Beteiligung von Festphasen bei der Selbstreplikation einfacher Systeme zu einer Komplexitätssteigerung führt, die qualitativ neue Möglichkeiten eröffnet, in dem Bestreben ein chemisches System zu finden, dass unter Selbsterhalt zu Darwinscher Evolution befähigt ist.

29 KAPITEL 2 ZIELSETZUG 22 2 Zielsetzung Der Mechanismus einer autokatalytischen Ligation zwischen zwei ligonucleotiden, die ein selbstkomplementäres ligonucleotid bilden, hat die in Abbildung 1 dargestellte allgemeine Form. Der geschwindigkeitsbestimmende Teilschritt ist die Kondensationsreaktion eines gemischten aktivierten Komplexes M (bestehend aus den beiden Bausteinen A und B, sowie der Matrize T) zum Duplex T 2. Die Gleichgewichte K 1 und K 2 stellen sich im Vergleich dazu schnell ein. Aus entropischen Gründen ist die Stabilität des termolekularen Komplexes M gegenüber dem Duplex T 2 benachteiligt, so dass K 1 deutlich kleiner als K 2 ist. Dies führt prinzipiell zu parabolischem Wachstum, da die meisten Matrizenmoleküle als Duplex vorliegen und somit die Konzentration an freien Templatmolekülen, die in der Lage sind, den aktivierten Komplex M zu bilden, nicht proportional mit der Gesamtkonzentration an T wächst. In einem selbstreplizierenden System, bei dem K 1 > K 2, würden die meisten Matrizenmoleküle als termolekularer Komplex vorliegen. Dies würde zu exponentiellem Wachstum führen, welches als Bedingung für das Auftreten von Selektion gilt. Dieser Fall ist aber schwer realisierbar, da die Entropie einen Komplex aus drei Molekülen gegenüber einem Duplex stets benachteiligt. Es sollte allerdings möglich sein, zumindest in Richtung exponentielles Wachstum voranzuschreiten, wenn der termolekulare Komplex M relativ zu dem Templatduplex T 2 stabilisiert wird. Dafür gibt es mehrere theoretische Ansätze; einer davon unter Einbeziehung von Festphasen soll hier bearbeitet werden. Eine als Replikase wirkende berfläche könnte exponentielles Wachstum bewirken, wenn ein gebildeter termolekularer Komplex M (mit T als Matrize) kovalent an die berfläche gebunden vorläge, während der daraus gebildete Templat-Duplex T 2 nicht mehr kovalent gebunden wäre. Diese Konstellation wäre erreicht, wenn einer der

30 KAPITEL 2 ZIELSETZUG 23 Bausteine (z.b. ein Trinucleotid-3 -phosphat) über eine Gruppe X in reaktiver Form an einer Festphase gebunden vorläge und diese kovalente Bindung bei der Reaktion mit dem zweiten Baustein (z.b. einem 5 -Aminotrinucleotid) gespalten würde (Abb. 11). Abb. 11: Stabilisierung des kovalent gebundenen termolekularen Komplexes durch eine berfläche im Vergleich zu dem nicht-kovalent gebundenen Templat-Duplex Die nach Zerfall des Duplexes gebildeten einzelsträngigen Matrizenmoleküle sind dann in der Lage an der berfläche erneut termolekulare Komplexe zu bilden. Exponentielles Wachstum könnte nun beobachtet werden, wenn sich die meisten Matrizenmoleküle während des Reaktionszyklus an der berfläche als immobilisierte termolekulare Komplexe aufhalten. Eine Realisierung dieses Konzeptes wäre unter Verwendung von oberflächlich gebundenen Imidazolgruppen möglich. Diese reagieren schnell mit EDC-aktivierten Trinucleotid-3 -phosphaten (z.b CCGp*), sind gleichzeitig aber auch gute Abgangs-

31 KAPITEL 2 ZIELSETZUG 24 gruppen. Ein in der Lösung vorhandener Trimerbaustein (z.b. ncgg) und die zugehörige Matrize (z.b. CCGpnCGG) sollten sich nun mit dem oberflächlich gebundenen Phosphoimidazolid zu einem termolekularen Komplex zusammenlagern. Die Ausbildung der Internucleotidbindung bewirkt nun, dass die berfläche nur noch intermolekular mit dem entstandenen Duplex wechselwirken kann. Da das EDC-aktivierte Trinucleotid-3 -phosphat auch direkt mit dem 5 -Aminotrinucleotid reagieren kann, ist eine zweistufige Reaktionsführung notwendig, um sicherzustellen, dass die Selbstreplikation tatsächlich nur an der berfläche stattfindet. Als erstes muss das Phosphoimidazolid gebildet und isoliert werden, indem überschüssiges EDC durch Waschen entfernt wird (Abb. 12). Im p* EDC p Im p Waschen Abb. 12: Bildung eines festphasengebundenen Phosphoimidazolids In der zweiten Stufe wird dann die Reaktion zwischen oberflächengebundenem Phosphoimidazolid und in Lösung befindlichem 5 -Aminotrinucleotid verfolgt. Dabei wirkt das gebildete selbstkomplementäre exanucleotid als Templat für seine eigene Synthese, so dass eine Selbstreplikation nachweisbar sein sollte (Abb. 13).

32 KAPITEL 2 ZIELSETZUG 25 Im p n + n p n Im p p n Im + n p p n Abb. 13: Selbstreplikation an einer berfläche über festphasengebundenes Phosphoimidazolid Ziel vorliegender Arbeit ist es, die Möglichkeiten des vorgestellten Konzeptes auszuloten. Als Erstes sollte eine geeignete Festphase mit Imidazolgruppen belegt werden, um daraus festphasengebundene Phosphoimidazolide zu bilden. Damit sollte dann der Einfluss der Festphase als berfläche auf ein selbstreplizierendes System erkundet werden. Als selbstreplizierendes System wurde das im Arbeitskreis V

33 KAPITEL 2 ZIELSETZUG 26 KIEDRWSKI eingehend untersuchte selbstkomplementäre exanucleotid CCGpnCGG herangezogen, welches aus den Trimeren CCGp und ncgg gebildet wird. Um exponentielles Wachstum zu erhalten, ist es notwendig, dass der termolekulare Komplex an der berfläche zusätzlich stabilisiert wird. Dies ist prinzipiell durch eine geeignete Modifikation der Festphase möglich, was am einfachsten durch die Kopplung von Aminosäuren mit unterschiedlichen funktionellen Gruppen zu bewerkstelligen ist. Auf diese Art sollten auch einige Modifikationen der Festphasenoberfläche hergestellt werden, um deren Einfluss auf das selbstreplizierende System zu beobachten.

34 KAPITEL 3 ALLGEMEIER TEIL 27 3 Allgemeiner Teil 3.1 Vorversuche mit Modellsubstanzen Die geplanten Selbstreplikationsexperimente an der Festphase sollten in zwei Stufen erfolgen. Ein immobilisiertes Phosphoimidazolid sollte erst isoliert werden, um dann in einem zweiten Schritt mit dem 5 -Aminotrinucleotid zu reagieren. In beiden Fällen ist die ydrolyse des Phosphoimidazolids eine irreversible ebenreaktion. Ein entscheidender Punkt für die Durchführbarkeit der geplanten Versuche ist das Verhältnis zwischen den jeweiligen Geschwindigkeiten der gewünschten Reaktion (Bildung des Phosphoimidazolids bzw. dessen Reaktion mit einem 5 -Aminotrinucleotid) und der parallel stattfindenden ydrolyse des Phosphoimidazolids. 5 -Phosphoimidazolide von ucleotiden wurden als reaktive Bausteine bei der Synthese von ligonucleotiden benutzt [z.b. RGEL und LRMA, 1974; FERRIS, 1993; FERRIS et. al., 1996]. Dafür wurden sie aber in organischen Lösungsmitteln synthetisiert, so dass bei deren Bildung keine ydrolyse stattfinden konnte. Die ydrolyse von unterschiedlichen 5 -Phosphoimidazoliden in Abhängigkeit vom p-wert, sowie deren Katalyse durch Magnesiumionen wurde eingehend untersucht [KAAVARITI et. al., 1989]. Andererseits wurden Imidazole auch als Katalysatoren bei Selbstreplikationsexperimenten verwendet, wo sie die EDC-Kopplung von 3 -Posphat- mit 5 -Aminonucleotiden beschleunigen [ACILLES und V KIEDRWSKI, 1993]. Bei dieser in wässrigem Milieu stattfindenden Reaktion ist allerdings ein Überschuss an EDC vorhanden und notwendig, so dass hydrolisiertes Phosphoimidazolid ständig nachgebildet wird. Für die Zwecke dieser Arbeit stellt sich zunächst die Frage, ob Phosphoimidazolide auch in wässrigem Milieu quantitativ gebildet werden können.

35 KAPITEL 3 ALLGEMEIER TEIL 28 Da die Phosphoimidazolide stabil genug sind, um deren Bildung und Reaktion via PLC zu verfolgen, lag es nahe erst einige kinetische Daten aus Modellreaktionen in wässriger Lösung zu bestimmen, bevor mit den Festphasenversuchen begonnen wurde. Als Modellsubstanzen boten sich einerseits 1-Methylimidazol und andererseits 1-Aminopropylimidazol an. Im ersten Fall kann die Bildung des Phosphoimidazolids verfolgt werden; im zweiten Fall kommt die Möglichkeit der Bildung einer P-- Bindung hinzu, die als Modell für eine Phosphoamidatverknüpfung zwischen den beiden Trinucleotiden betrachtet werden kann. Desweiteren kommen noch istamin und istidin-methylester als Modellsubstanzen in Betracht, deren strukturelle Unterschiede zu 1-Aminopropylimidazol auf diese Art quantifiziert werden können. Da die Bindung zwischen Trinucleotid-3 -phosphat und diesen Modellsubstanzen grundsätzlich auf zwei Arten erfolgen kann, nämlich über die Imidazolgruppe als Phosphoimidazolid bzw. über die Aminogruppe als Phosphoamidat, wurde folgendes System zur Abkürzung benutzt: pim bzw. pn für die Kennzeichnung des Bindungstyps und in Klammern das entsprechende Imidazolderivat. So bedeutet z.b. die Abkürzung pim(api), dass 1-Aminopropylimidazol (API) über die Imidazolgruppe an ein Trinucleotid-3 -phosphat (p) gebunden ist, während pn(api) den Fall der Phosphoamidatverknüpfung bezeichnet Methylimidazol Ethyl-,-dimethylpropyl-carbodiimid (EDC) führt durch Reaktion mit einem Phosphat zu einer aktivierten Form des Phosphats, die einen anschließenden nucleophilen Angriff am Phosphor erlaubt. Ein EDC-aktiviertes ligonucleotid-3 - phosphat (p*) reagiert mit 1-Methylimidazol (MeIm) unter Bildung des entsprechenden Phosphoimidazolids pim(meim). Dabei findet ständig eine ydrolyse sowohl des EDCaktivierten Phosphats, als auch des Phosphoimidazolids statt. EDC wird dabei verbraucht (Umwandlung in das entsprechende arnstoffderivat EDU), so dass es im

36 KAPITEL 3 ALLGEMEIER TEIL 29 Überschuss eingesetzt werden muss. Die stattfindenden Reaktionen und die eingeführten Abkürzungen sind in Abbildung 14 dargestellt. ligo P p EDU EDC 2 ligo P + p* MeIm + (C 3 ) 2 EDU 2 ligo P + pim(meim) Abb. 14: Schema der Reaktion eines ligonucleotid-3 -phosphats mit 1-Methylimidazol in Gegenwart von EDC Für die kinetischen Experimente wurde ein 5 -geschütztes Trinucleotid ( 3 CCGp) verwendet, welches in Gegenwart einer 0,1M EDC-Lösung in 0,1M EPES-Puffer (p=7) mit unterschiedlichen Konzentrationen an 1-Methylimidazol umgesetzt wurde. In Abständen von 10 bis 15 Minuten wurde ein Aliquot der Lösung entnommen, die Reaktion durch Verdünnen um den Faktor 250 mit Wasser gestoppt und von der Lösung

37 KAPITEL 3 ALLGEMEIER TEIL 30 sofort eine PLC-Messung vorgenommen. Die Umrechnung in Konzentrationen erfolgte über den Vergleich der Peakflächen bei 254 nm mit jenen einer Lösung von 3 CCGp bekannter Konzentration. Da sowohl EDC als auch MeIm keine nennenswerte Extinktion bei 254 nm besitzen, bleibt der Extinktionskoeffizient von 3 CCGp in allen Formen erhalten. Die Auswertung der gemessenen Daten erfolgte mit ilfe des Computerprogramms SimFit (Simulation & Fitting, A Program for the Analysis of Kinetic Data, G. V KIEDRWSKI), welches anhand eines vorgeschlagenen Reaktionsmechanismus die darin vorkommenden Geschwindigkeitskonstanten durch sukzessive Variation bestimmt, indem die theoretisch berechneten Kurven des Konzentrationsverlaufs an die gemessenen Datenpunkte angepasst werden. In Abbildung 15 sind Messpunkte und theoretische Kurven der durchgeführten Experimente dargestellt. Konzentration [mm] 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 1 mm MeIm 2 mm MeIm 4 mm MeIm 6 mm MeIm 0,1 0, Zeit [min] Abb. 15: Verlauf der Phosphoimidazolidkonzentration bei der Reaktion eines Trinucleotid-3 -phosphats (jeweils 1mM) mit unterschiedlichen Konzentrationen an 1-Methylimidazol in Gegenwart von EDC

38 KAPITEL 3 ALLGEMEIER TEIL 31 Es wurde nach folgendem Reaktionsmechanismus gefittet (Abkürzungen siehe Abbildung 14): p + EDC p* p* p p* + MeIm pim(meim) pim(meim) p + MeIm bservable sind nur p = p + p* und pim(meim), da EDC und MeIm nicht durch den UV-Detektor erfasst werden und das EDC-Addukt p* nicht stabil genug ist, um getrennt nachgewiesen werden zu können. Tabelle 1 enthält die ermittelten Geschwindigkeitskonstanten, sowie den RMS-Wert ( Root Mean Square oder mittlere Fehlerquadratsumme), welcher ein Maß für die Güte des Fits ist. Der Wert von 3,3% bedeutet eine recht gute Übereinstimmung der berechneten Kurven mit den gemessenen Daten. Allgemein gilt ein RMS-Wert kleiner als 2% als gut, zwischen 2 und 5% als ausreichend, zwischen 5 und 10% als mangelhaft und oberhalb 10% als ungenügend. Tabelle 1: Mit SimFit berechnete Geschwindigkeitskonstanten bei der Reaktion eines Trinucleotid-3 -phosphats mit 1-Methylimidazol in Gegenwart von EDC MeIm p + EDC p* k 1 (5,8±0,4) 10-3 p* p k 2 (4,1±1,7) 10-1 p* + MeIm pim(meim) k 3 (7,4±3,0) pim(meim) p + MeIm k 4 (1,4±0,2) 10-4 RMS 3,3% Mit dem Programm SimFit lassen sich die Zusammenhänge zwischen den einzelnen Geschwindigkeitskonstanten und der Güte des Fits graphisch darstellen. Dabei werden die Werte für die Geschwindigkeitskonstanten k 1 bis k 4 jeweils variiert und der RMS-

39 KAPITEL 3 ALLGEMEIER TEIL 32 Wert berechnet. Letzterem wird eine Farbe zugeordnet, so dass leicht erkennbar ist, ob ein ausgeprägtes Minimum vorliegt oder nicht. Im vorliegenden Fall (Abbildung 16) erkennt man, dass k 1 recht eindeutig festgelegt ist, da geringe Abweichungen der anderen Geschwindigkeitskonstanten relativ zu k 1 sofort zu einem Anstieg des Fehlers führen. Die Einschränkung bei den anderen Geschwindigkeitskonstanten untereinander ist schon deutlich geringer, so dass sie in relativ weiten Grenzen variiert werden können, ohne dass sich die Güte des Fits ändert. Dies liegt vermutlich daran, dass die Konzentration von p* keine unabhängige bservable ist. Abb. 16: Zweidimensionaler Scan-Plot mit SimFit für die Geschwindigkeitskonstanten aus Tabelle 1 Die ermittelten Geschwindigkeitskonstanten liegen in der Größenordnung derjenigen, die durch MR-Experimente bestimmt wurden [MATZE, 1991] und die ydrolyse-

40 KAPITEL 3 ALLGEMEIER TEIL 33 konstante für pim(meim) liegt in der Größenordnung derjenigen für 5 -Phosphoimidazolide [KAAVARITI et. al., 1989]. Dies zeigt, dass trotz einiger Ungenauigkeiten die erhaltenen Ergebnisse vertrauenswürdig sind und für weitere Überlegungen herangezogen werden können. Man kann nun mit den berechneten Geschwindigkeitskonstanten den Konzentrationsverlauf auch der anderen Komponenten des Systems simulieren. Dies ist exemplarisch für den Fall 1mM MeIm in Abbildung 17 dargestellt. 1,2 1,0 Konzentration [mm] 0,8 0,6 0,4 0,2 p pim(meim) MeIm p* 0, Zeit [min] Abb. 17: Simulierter Verlauf der Konzentrationen bei der Reaktion eines Trinucleotid-3 -phosphats mit 1-Methylimidazol (jeweils 1mM) in Gegenwart von EDC Abbildung 18 zeigt einen Ausschnitt aus Abbildung 17, so dass der Verlauf der Konzentration des EDC-aktivierten Phosphats p* sichtbar wird. Es ist eindeutig die schnelle Einstellung einer stationären Konzentration zu erkennen, die allerdings nur bei etwa 0,1% der gesamten p-konzentration liegt. Dieser geringe Anteil an p* im System liegt einerseits an der relativ schnellen ydrolyse und andererseits an der schnellen

41 KAPITEL 3 ALLGEMEIER TEIL 34 Bildung des Phosphoimidazolids. Letzteres ist im Vergleich zu p* sehr stabil (Geschwindigkeitskonstante der ydrolyse k 4 um drei Größenordnungen kleiner als k 2 ). 0,0020 Konzentration [mm] 0,0015 0,0010 0,0005 pim(meim) p* 0, Zeit [min] Abb. 18: Simulierter Verlauf der Konzentrationen bei der Reaktion eines Trinucleotid-3 -phosphats mit 1-Methylimidazol (jeweils 1mM) in Gegenwart von EDC (Ausschnitt aus Abbildung 17) Reaktionsordnung des Imidazols Da die Experimente mit unterschiedlichen Anfangskonzentrationen an MeIm bei gleicher Anfangskonzentration an p durchgeführt wurden, kann man daraus die Reaktionsordnung von MeIm bestimmen. Betrachtet man die zugrundeliegenden Reaktionsgleichungen unter der Annahme einer Reaktionsordnung n für das Imidazol (hier der Einfachheit halber nur mit Im bezeichnet):

42 KAPITEL 3 ALLGEMEIER TEIL 35 k 1 [EDC] k 3 [Im] n k 4 p p* pim p + Im k 2 so berechnet sich die Bildungsgeschwindigkeit von pim nach folgender Gleichung: d[ pim] dt = (19) n k3 [ p*] [ Im] k4 [ pim] Wenn man annimmt, dass die EDC-Aktivierung schnell ist, also [p*] proportional [p] ist, ergibt sich aus Gleichung 19, unter Zusammenfassung der Konstanten, für die Anfangsgeschwindigkeit (wenn [pim] = 0) n v0 k [ p] 0 [ Im] 0 = (20) und durch Logarithmieren erhält man eine lineare Abhängigkeit zwischen lnv 0 und ln[im] 0, da die Anfangskonzentration [p] 0 konstant ist und mit k in einer neuen Konstanten zusammengefasst werden kann: ln v = k' + n ln[ Im (21) 0 ] 0 Trägt man nun die experimentell ermittelten Anfangsgeschwindigkeiten (der ersten 10 Minuten) gegen die Imidazolkonzentration logarithmisch auf, so ergibt die Steigung der Ausgleichsgeraden eine Reaktionsordnung von etwa 0,5 (Abb. 19). Dieses Ergebnis ist überraschend, da bei einfachen Reaktionen die Reaktionsordnung der Molekularität der zugrundeliegenden Reaktion entspricht. Daher ist anzunehmen, dass es für die gebrochene Reaktionsordnung eine andere Erklärung geben muss. Die Vereinfachungen des oben betrachteten Modells sind wahrscheinlich nicht gerechtfertigt

43 KAPITEL 3 ALLGEMEIER TEIL 36 und es sollte daher möglich sein, aus einer komplexeren Betrachtung das beobachtete Verhalten zu erklären. 3 2,6 y = 0,5713x + 1,6219 2,2 ln v 0 1,8 1, ,4 0,8 1,2 1,6 2 ln [Im] Abb. 19: Graphische Ermittlung der Reaktionsordnung für 1-Methylimidazol bei der Reaktion mit einem Trinucleotid-3 -phosphats in Gegenwart von EDC Unter Annahme der Steady-State-Bedingung (das schnelle Einstellen einer konstanten Konzentration an p*): d[ p*] dt = 0 (22) ergibt sich aus den betrachteten Reaktionsgleichungen (für den wahrscheinlicheren Fall einer bimolekularen Reaktion mit n = 1):