Ouchterlony-Immundiffusion. Western Blot. ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay) Immunpräzipitation

Transkript

1 Ouchterlony-Immundiffusion Western Blot ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay) Immunpräzipitation A

2 Antikörper sind wichtige diagnostische Marker

3 HIV Infektion und HIV Nachweis

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8 Verbreitung von HIV in Deutschland

9 Adults and children estimated to be living with HIV/AIDS as of end 2000 North America Caribbean Latin America 1.4 million Western Europe North Africa & Middle East Sub-Saharan Africa 25.3 million Eastern Europe & Central Asia South East Asia & Pacific & South-East Asia 5.8 million Australia & New Zealand Total: 36.1 million

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11 Globale Verbreitung von HIV-1 Subtypen B B A A/B B B, F D A A/G M,O,N C C E B C B/C C B Unterschiede in Geographie und Übertragungsgruppen

12 Nachweis von HIV-spezifischen Antikörpern durch ELISA A - B - C - D Virusproteine sind in der Kavität der ELISA-Platte adsorbiert Patientenserum wird in die Kavität gegeben, HIV-spezifische Antikörper binden an die Virusproteine. Mit Enzymen gekoppelte Anti-Human- Antikörper binden an die HIV-spezifischen Antikörper Ein farbloses Substrat wird duch das Enzym umgesetzt und es kommt zu einem Farbumschlag. HIV-spezifischer Antikörper

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15 HIV-ELISA zum Nachweis HIV-spezifischer Antikörper

16 Nachweis von HIV-spezifischen Antikörpern durch Western Blot A Aufbau des humanen Immundefizienzvirus B Zerlegung des Virus in einzelne Proteine C Proteingel Elektrophoretische Auftrennung der Proteine nach der Größe D Membran Membran Übertragung der Proteine auf eine Nitrozellulosemembran E Inkubation der Membran mit Patientenserum F Nachweis der gebundenen Antikörper durch enzymatische Färbung

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18 + - Kontrollen Wochen nach Infektion

19 Wochen nach Infektion

20 HIV Serologie: 2 Elisa als Suchtests (unterschiedliche Funktionsprinzipien) Bei positivem ELISA: Western Blot als Bestätigungstest Bei unklarer Serologie: Verlaufskontrolle

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25 Unklares Ergebnis? Eine Möglichkeit: Virus-Nachweis durch Anzuchtversuche Wie weißt man postive Anzucht nach?? Durch: a)antigen-capture-assay b)rt-test c)immunfärbung infizierter Zellen

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28 Immunfluoreszenz Fluorochrom-konjugierte spezifische Antikörper Fluorochrom-konjugierte sekundäre Antikörper (z.b. anti-ig Antikörper) Unkonjugierte spezifische Antikörper direkte Immunfluoreszenz indirekte Immunfluoreszenz

29 Immunfluoreszenz

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32 A431 cells labeled with probes for histones and the epidermal growth factor (EGF) receptor. Histones were detected with a mouse anti-histone antibody prelabeled using the Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG2a Labeling Kit (Z-25102) EGF receptors on the cell surface were detected with a mouse anti EGF receptor monoclonal IgG2a antibody prelabeled using the Zenon Alexa Fluor 555 Mouse IgG2a Labeling Kit (Z-25105). Quelle: Molecular Prob

33 Fixed and permeabilized bovine pulmonary artery endothelial cells stained with Alexa Fluor 350 phalloidin (A-22281) an anti -tubulin antibody (A-11126) and the anti cdc6 peptide antibody (A-21286). The anti -tubulin antibody was labeled with the Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit (Z-25006) and the anti cdc6 peptide antibody was labeled with the Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit (Z-25002). The image was acquired using a CCD camera controlled by MetaMorph software (Universal Imaging Corporation). Quelle: Molecular Prob

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37 Microtubules of NIH 3T3 cells labeled with mouse anti -tubulin monoclonal IgG1 antibody (A-11126) and visualized with blue-fluorescent AlexaFluor 405 goat anti mouse IgG antibody (A-31553). Nuclei were stained with red-fluorescen propidium iodide (P-1304, P-3566, P-21493). Quelle: Molecular Prob

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40 Antikörper als Medikament

41 Murine monoklonale Antikörper als Medikamente Vorteile Monoklonale Antikörper (mabs) von definierter Spezifität und Affinität können unter reproduzierbaren Bedingungen in großen Mengen hergestellt werden Die Menge von benötigtem Protein ist bei Verwendung von mabs geringer als bei Verwendung von polyklonalen Antikörpern MAbs sind besser geeignet für Standardisierung und Qualitätskontrolle Nachteile Alle monoklonalen Antikörper sind murinen Ursprungs Die Anwendung bei Menschen ruft eine Immunantwort hervor: Human anti-mouse immunglobulin (HAMA) Die Neutralisation von murinen mabs durch HAMA kann zur Attenuierung des therapeutischen Effekts und zur Beschleunigten Clearance aus dem Blut führen. Production von humanem IgE kann zu hypersensitiven Reaktionen führen Kurze Halbwertszeit, erfordert wiederholte Gabe Murine Antikörper können humane Immun-Effektor- Funktionen nicht so effizient auslösen, wie humane Antikörper Nach: Vaswani et al Annals of Allergy, Asthma & Immunol

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44 Nach: Vaswani et al Annals of Allergy, Asthma & Immunol

45 Erkrankung Protein?

46 Transmissible Spongiforme Enzephalopathien (TSE) Oder die Suche nach den Prionen Die protein only Hypothese

47 Geschichte der Prionenforschung 18. Jahrhundert: Auftreten von Scrapie 1920/21 Beschreibung der Prionen-Erkrankung beim Menschen (Creutzfeld/ Jakob) 1921 Beschreibung einer vererbbaren Prionenkrankheit (Gerstmann) 1936 Nachweis der Infektiösität von Scrapie 1957 Entdeckung von Kuru-Kuru in Papua-Neuguinea 1976 Nobelpreis für Gajdusek für Nachweis von CJK-Übertragung auf Tiere 1981 neues Verfahren zur Tiermehlherstellung in England 1982 Publikation des Prionen-Modells (S. Prusiner) Untersuchung von cow 133 in Sussex Cow 133 stirbt, spätere Diagnose: spongiforme Enzephalitis (SE) 1986 Bezeichnung BSE für mad cow disease 1987 Übertragung von BSE auf Mäuse bis 1989 in GB erkrankte Rinder geschlachtet und zu Wurst und Fleisch verarbeite BSE-erkrankte Rinder in Großbritannien 1993 BSE experimentell auf 19 Tierarten übertragen Rückgang der BSE-Fälle in Großbritannien Mai 1995 CJK bei 19!-jährigem Engländer März 1996 weltweites Exportverbot für britisches Rindfleisch Juli 1997 Übertragung von BSE auf Menschen bewiesen (Nature) Dez Nobelpreis für Stanley Prusiner erster originärer BSE-Fall in Deutschland nachgewiesen Tabelle nach Stü

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49 Die bovine spongiforme Enzephalopathie BSE Abb. von G. Wellls & S. Hawkins Histologischer Hirngewebsschnitt mit schwammartiger (spongiformer) Durchlöche

50 vcjk: Ebenfalls eine spongiforme Enzephalopathie Histologischer Schnitt aus dem frontalen Cortex Florider Plaque Abb. von J.W. Ironside

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53 Appearance of Cellular and Scrapie Isoforms of PrP in the Western Blot PrP C PrP Sc - PK + PK - PK + PK 35 kda 30 kda PrP (MW of diglycosylated ban PrP sen PrP res

54 Proteinase K Serin-Protease Endopeptidase bei ausreichend langer Inkubationszeit werden Proteine proteolytisch zu einzelnen Aminosäuren gespalten.

55 S. Prusine Verteilung von PrP Sc in Mäusehirn Inokkuliert mit Hirnextrakt von Patienten, die verstorben sind an: A) fataler familiärer Insomnie B) familiärer CJK NC Hp Hb Th Hy Am Neocortex Hippocampus Habenula Thalamus Hypothalamus Amygdala

56 Beispiel: BSE-Schnelltestung Vorbereitung einer Hirnstammprobe aus dem Schlachthaus für die Schnelltestung (Aktive BSE-Überwachung)

57 BSE-Schnelltestung: Prinzip des Prionics-Check Normales Rind BSE- Rind PK:

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64 Offene Fragen in der Prion-Forschung Was ist das infektiöse Agens? Ist PrP Sc identisch mit dem Prion? Wie bewirkt das PrP Sc die Umwandlung des PrP C in weiteres PrP Sc? Welche anderen Protein sind an diesem Prozess beteiligt? Kann die Prion-Erkrankung geheilt werden, wenn man den Konversionsprozess beeinflusst? Was sind Prion-Stämme auf molekularer Ebene und wie sind stamm-spezifische Eigenschaften kodiert? Wie gelangen peripher verabreichte Prionen zum Gehirn? Welche Moleküle und Zellen sind an der Neuroinvasion beteiligt? Welche Inhibitor-Strategien haben realistische Erfolgsaussichten? Welches sind die Mechanismen der spongiformen Neurodegeneration? Welche pathogenen Kaskaden werden aktiviert? Was sind die biochemischen Auswirkungen der Hirnschädigungen? Was ist die physiologische Funktion des normalen Prion-Proteins PrP C? PrP C ist hochgradig konserviert, also ist es wahrscheinlich nützlich. Das Pmp Gen ist 1985 identifiziert, Pmp Knockout-Mäuse gibt es seit 1992, trotzdem ist die Funktion von PrP C immer noch unbekannt. Keiner der Phenotypen, die der Abwesenheit von PrP C zugeschrieben werden, konnte auf molekularer Ebene erklärt werden. Ist eine abnorme Funktion von PrP C an der Pathogenese der Prion-Erkrankung beteiligt?

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