PARATUBERKULOSE BEIM RIND

Transkript

1 PARATUBERKULOSE Nachweis von Antikörpern in BEIM RIND der Tankmilch Kristine Klewer / Philippe Pourquier

2 Die Krankheit Chronische Darmerkrankung Unheilbar Krankheitserreger Mycobacterium avium ssp paratuberculosis (M. paratuberculosis) Klinische Ausprägung (Scanning electron micrograph of M. paratuberculosis) Durchfall Abmagerung Tödlicher Ausgang (Guernsey cow with clinical signs of Johne's disease)

3 Hauptkontaminationsquellen Milch Kolostrum Durch infizierten Kot verunreinigtes Futter oder Wasse Kot infizierter Tiere Ausscheider

4 Warum ist eine Kontrolle nötig? Tiergesundheitsproblem Direkte wirtschaftliche Verluste - Produktivität Milchleistung, Unfruchtbarkeit - Vorzeitiger Abgang Einfluss auf den Handel Handelsbeschränkunge Öffentliche Gesundheit??? Morbus Crohn

5 Aktuelle diagnostische Methoden Erregernachweis Kultur ( Gold standard ) PCR (Kot oder Milch) Nachweis von Antikörpern ELISA (Serum oder Milch) KBR (Serum) Komplemenäre Methoden mit unterschiedlichen Sensitivitäten Nachweis unterschiedlicher positiver Tiere

6 Milch und Serum ELISA Anti-Rinder IgG AK / PO-Konjug M. paratb. Antigen Identisches Protokoll für beide Anwendungen Vorinkubation mit M. phlei (1:2 Verd.) Vermeidung unspezifischer Reaktionen Indirekter ELISA TMB-Substrat Milch / Sérum A

7 Validation der Tankmilchanwendung

8 Validation Interne Validation : Institut Pourquier Externe Validation : Hinrich Voges Livestock Improvement Hamilton, Neuseeland (laufende unabhängige Studie)

9 1 : Interne Validation Spezifität 42 Milchherden (Bretagne) : 1000 Einzelmilchproben 42 Tankmilchproben

10 Spezifität in Einzel- und Tankmilchproben % an Proben NEGATIV Negative Kontrolle F r a g l i c h POSITIV Positive Kontrolle Einzelmil Tankmilc S/P-Klasse >100

11 1 : Interne Validation Die Sensitivität für Tankmilchanalysen wird normalerweise als die Fähigkeit angegeben, eine positive Probe in der Tankmilch einer bestimmten Anzahl von Tieren nachzuweisen. Grenzen : Schwierigkeiten, eine ausreichende Anzahl von klar definierten Serum / Tankmilch-Paaren zu finden. Prävalenzdaten unzuverlässig (begrenzte Sensitivität der Vergleichstests (Serum-ELISA: 50 %) Kein Standardserum verfügbar ( Brucellose / Leukose ) Evaluierung ist immer relativ. Im Moment ist die direkte Bewertung der Sensitivität auf 10 Herden

12 FIGURE 2 CORRELATION BETWEEN S/P AND SEROPREVALENCE IN FIELD BULK MILK POSITIVE ZONE CUT OFF LIGNE NEGATIVE ZONE PREVALENCE

13 1 : Interne Validation Indirekte Bewertung der Sensitivität : Milch enthält ca. 25x weniger AK als Serum Herstellung von «künstlichen Milchproben» ist möglich : 1. «Künstliche stark-positive Milch» : - Serumpool aus 30 «eher stark positiven» Feldseren - Verdünnung dieses Pools in negativer Milch (1:25 ) 2. «Künstliche schwach-positive Milch» Verdünnung des Kit-internen Kontrollserums ( cut-off) in negativer Milch (1:25) Analyse dieser Milchproben in «log2-verdünnungen.

14 FIGURE 3 200% DETECTION OF A " MEDIUM " AND A " WEAK " POSITIVE MILK IN A BULK Dilution of a " médium " positive milk in a bulk Dilution of a "weak " positive milk in a bulk 180% 160% 140% POSITIVE ZONE 120% S/P* % 80% 60% CUT OFF LIGNE 40% 20% 0% NEGATIVE ZONE PUR 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 BULK SIZE

15 1 : Interne Validation Indirekte Bewertung der Sensitivität : Die «künstliche mittelstark-positive Milch» wird bis zu einer Verdünnung von 1:50 nachgewiesen. Aber : Hängt von dem Antikörpergehalt des gewählten Serums ab. Standardserum wäre nötig zum Vergleich der verschiedenen Techniken! Die «künstliche schwach-positive Milch» wird bis zu einer Verdünnung von 1: 3 nachgewiesen. Zur Qualifizierung von gesunden Herden ungeeignet, aber erlaubt eine Überwachung der Prävalenz

16 2 : Externe Validation Validation (Livestock Improvement) 11 Herden 1664 Serum / Einzelmilch - Paare Analyse im Serum- und Milch-ELISA

17 2 : Externe Validation sammensetzung der Herden Herd Herd size Sample size (% of herd) Validation (Livestock Improvement) % of elegible cows tested Predominant breeds (cows classed by breed if >80% ancestry = 1 breed) Average age of the herd of tested cows Minimum age of tested cows (lactation) A 287 cows 150 cows (52%) 83% Jersey (56%); Friesian (32%) 4.8 years 6.2 years B 399 cows 112 cows (28%) 84% Friesian (75%); Jersey (21%) 4.8 years 6.2 years (About 1/2 the herd was newly purchased - thus excluded from trial.) C 254 cows 141 cows (56%) 87% Jersey (72%); Ayrshire (20%) 4.8 years 5.9 years D 682 cows 324 cows (48%) 93% Jersey (99%) 5.1 years 7.3 years E 534 cows 181 cows (34%) 60% Jersey (86%); Friesian (9%) 5.4 years 6.6 years F 341 cows 188 cows (55%) 89% Jersey (94%) 5.2 years 6.8 years G 340 cows 162 cows (48%) 85% Friesian (90%) 4.8 years 6.5 years H 206 cows 113 cows (55%) 90% Jersey (86%); Friesian (14%) 5.0 years 6.5 years I 453 cows 124 cows (27%) 62% Friesian (79%); Other (13%) 5.4 years 7.6 years J 220 cows 130 cows (59%) 92% Jersey (70%); Friesian (25%) 5.0 years 6.5 years K 209 cows 95 cows (45%) 73% Jersey (89%) 4.8 years 6.0 years 4 years (3rd) 4 years (3rd) 4 years (3rd) 5 years (4th) 5 years (4th) 4 years (3rd) 4 years (3rd) 4 years (3rd) 4 years (3rd) 4 years (3rd) 4 years (3rd) Min age: 4 years Overall cows 1720 cows (44%) 81% Jersey (62%); Friesian (31%) 5.1 years 6.7 yearsmax age: 19 years

18 2 : Externe Validation Ergebnise pro Herde Validation (Livestock Improvement) Number of positive cows (on biwell test) Prevalence Presumed 'true' prevalence based on Herd Cows sampled Serum ELISA Milk ELISA Both tests Either test pos Serum ELISA Milk ELISA serum ELISA results if milk ELISA results if SE = 25.00% SE = 20.00% SP = 99.50% SP = 99.50% A 150 cows 5 cows 8 cows 5 cows 8 cows 3.33% 5.33% 11.56% 24.79% B 112 cows 4 cows 1 cows 1 cows 4 cows 3.57% 0.89% 12.54% 2.01% C 138 cows 1 cows 4 cows 1 cows 4 cows 0.72% 2.90% 0.92% 12.30% D 279 cows 19 cows 14 cows 14 cows 19 cows 6.81% 5.02% 25.76% 23.17% E 175 cows 15 cows 12 cows 11 cows 16 cows 8.57% 6.86% 32.94% 32.60% F 187 cows 6 cows 5 cows 5 cows 6 cows 3.21% 2.67% 11.06% 11.15% G 162 cows 3 cows 4 cows 2 cows 5 cows 1.85% 2.47% 5.52% 10.10% H 113 cows 5 cows 2 cows 2 cows 5 cows 4.42% 1.77% 16.02% 6.51% I 124 cows 6 cows 4 cows 2 cows 8 cows 4.84% 3.23% 17.71% 13.98% J 130 cows 2 cows 2 cows 1 cows 3 cows 1.54% 1.54% 4.24% 5.33% K 94 cows 2 cows 1 cows 1 cows 2 cows 2.13% 1.06% 6.64% 2.89% Overall cows 68 cows 57 cows 45 cows 80 cows 4.09% 3.43% 14.64% 15.00%

19 2 : Externe Validation Zusammenfassung Validation (Livestock Improvement) Serum Milch POS NEG Total POS NEG Total Sensitivität (Milch): 67.9% Sensitivität (Serum): 85.7% Relative Spezifität Milch // Serum : 99.2% Korrelation: 78.5%

20 Vorläufige Schlussfolgerungen ELISA funktionniert mit Milchproben Einzelmilchproben: Sensitivität etwas geringer als für Serumproben (67,9% // 85,7%) Widersprüchlichkeiten zwischen Serum und Milchproben desselben Tieres : Korrelation 78% ( klassisch in der Serologie, cf IBR ) Sehr gute Spezifität (100% bzw. 99,2%) Tankmilch: Nicht geeignet zur Qualifikation von gesunden Herden, aber eine Überwachung der Prävalenz scheint möglich Hinweis, dass eine Prävalenz von 5-30% (Pools von 3 bis 50 Tieren) mittels Tankmilchanalysen nachgewiesen werden kann.

21 Korrelation Milch / Serum (IBR) Letzte positiv gefundene Verdünnung in Milch / Serum - Paaren (n=)