Therapeutische Strategien zur Behandlung maligner Erkrankungen

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1 Therapeutische Strategien zur Behandlung maligner Erkrankungen

2 Tumorentstehung: Verschiedene Kontrollinstanzen müssen überwunden werden Die Proliferation normaler Zellen wird durch 6 verschiedene Kategorien von Kontrollmechanismen reguliert. Blockierung von Apoptose Unabhängigkeit von Wachstumsfaktoren Überwindung der Wachstumsinhibition Für die Bildung eines metastasierenden Tumors müssen diese inaktiviert werden, d.h. in Tumorzellen müssen sich multiple Mutationen ereignet haben. (aus: Hanahan and Weinberg, Cell 100:57, Figure 1) Induktion von Neo-Angiogenese Uneingeschränkte Replikation Invasion & Metastasierung

3 Tumorentstehung: Verschiedene Kontrollinstanzen müssen überwunden werden Erworbene Eigenschaft Beispiel Unabhängigkeit von Wachstumsfaktoren Aktivierung von Onkogenen: H-Ras Überwindung der Wachstumsinhibition Verlust des Tumorsuppressors RB Blockierung von Apoptose Überexpression von Bcl-2 Uneingeschränkte Replikation Aktivierung der Telomerase Induktion von Neo-Angiogenese Produktion von VEGF-Induktoren Gewebeinvasion & Metastasierung Inaktivierung von E-Cadherin

4 Therapeutische Ansätze zur gezielten Tumorbehandlung Eingriff in gestörte Signalwege Angiogenese Wachstumskontrolle Apoptoseinduktion Zellzykluskontrolle Invasion, Metastasierung Therapieansätze Signaltransduktionsinhibitoren ( small molecules ) sirna, Antisense-Oligonukleotide Antikörper, Peptide (Liganden, Rezeptoren)

5 Vaskulogenese / Angiogenese Vaskulogenese: Gefäßneubildung während der Embryonalentwicklung aus Hämangioblasten Angiogenese: Gefäßneubildung aus bestehenden Gefäßen (Gefäßsprossung) Angiogenese

6 Aufbau der Gefäße und Kapillaren Arterie Bindegewebe glatte Muskulatur Elastische Fasern Monozelluläre Schicht endothelialer Zellen Kapillare Basalmembran

7 Zelluläre Prozesse der Angiogenese Erythrozyten Red Blood Cells Endothelzellen Endothelial Cells Basal- Basement Membrane membran Smooth Glatte Muscle Muskulatur Fibroblasts Fibroblasten Perizyten Angiogenesis Angiogenese 1. Proteolyse der Basalmembran 2. Proliferation und Migration in Richtung eines angiogenen Stimulus 3. Lumenbildung/Fusion mit anderen Gefäßen 4. Gefäßreifung

8 Physiologische Angiogenese Beispiele für physiologische Angiogenese: Vaskulo- und Angiogenese in der Embryonalentwicklung Menstruationszyklus, Schwangerschaft Regeneration/Wundheilung

9 Angiogenese-assoziierte Krankheiten zu viel: Chronische Entzündungen (z.b. Rheumatoide Arthritis) Psoriasis ( Schuppenflechte ) Diabetische Retinopathie Tumore zu wenig: Ischämie Schlaganfall Wundheilungsstörungen

10 Ohne Angiogenese ist das Tumorwachstum eingeschränkt um Ohne Neubildung von Gefäßen ist das Wachstum von Tumoren durch die O 2 -Diffusion limitiert auf einen Durchmesser von etwa 200 µm (etwa 10 Zell-Lagen).

11 Ohne Angiogenese ist das Tumorwachstum eingeschränkt Vergrößerung der Tumormasse um neugebildete Gefäße.

12 Ohne Angiogenese ist das Tumorwachstum eingeschränkt Cornea Tumor eingesetzt in die vordere Augenkammer Iris Tumor auf der Iris wachsend Tumorgröße Tumor auf der Iris wachsend Tumor eingesetzt in die vordere Augenkammer Linse Tage

13 Angiogenese erleichtert Metastasierung Primärtumor Basalmembran Invasion Angiogenese Intravasation Mikro-Metastasen Extravasation Adhäsion an Blutgefäßwand in distalen Organen Metastasierung Migration Metastasierung korreliert eng mit der Vaskularisation des Tumors. Enger Zusammenhang zwischen Vaskularisierung und Malignität!

14 Angiogenese als Angriffsziel in der Tumortherapie? Problematik konventioneller Tumortherapien: zielen nicht spezifisch auf Tumorzellen, sondern allgemein auf stark proliferierende Zellen (Nebenwirkungen) Tumorzellen sind genetisch instabil, können durch Mutation Resistenzen gegen die Therapie entwickeln (Selektion aggressiverer Tumore) Vorteile einer anti-angiogenen Therapie: zielt auf genetisch stabile Endothelzellen schädigt spezifisch Tumorgewebe mit nur geringen Nebenwirkungen für normale Gewebe wird kontrolliert durch extrazelluläre Signalmoleküle und Rezeptoren auf der Zelloberfläche (gute Interventionsmöglichkeiten)

15 Wie wird Tumor-Angiogenese induziert? Kammer mit permeabler Membran Tumorzellen Signalmoleküle Kammer wird unter der Haut eingesetzt Wie kommunizieren Tumorzellen mit Endothelzellen? Tumorzellen geben lösliche Stoffe (Signalmoleküle) in das umgebende Gewebe ab, die Gefäßwachstum anregen. TAF s: Tumor-Angiogenese-Faktoren Angiogenese ( Transfilter-diffusion studies; Greenblatt & Shubik, 1968; Ehrmann & Knoth, 1968) 1971: Judah Folkmann Antiangiogenese als Strategie zur Behandlung von Tumoren

16 Wie wird Tumor-Angiogenese induziert? Angiogenese wird streng kontrolliert durch die Balance von pro- und anti-angiogenen Faktoren. In normalen Geweben überwiegen anti-angiogenetische Faktoren bis neue Gefäße benötigt werden (Wundheilung etc.).

17 Wie wird Tumor-Angiogenese induziert? kleiner, lokalisierter Tumor angiogener Schalter : Pro-angiogene Signalmoleküle induziert Angiogenese erhöhte Konzentration proangiogener Substanzen Angiogenic Switch gegenüber antiangiogenen Substanzen verschiebt das Gleichgewicht in Richtung Angiogenese wachsender, potentiell metastasierender Tumor

18 Wie wird Tumor-Angiogenese induziert? Tumoren setzen angiogene Signalmoleküle aus der Klasse der Wachstumsfaktoren frei: bfgf (basic fibroblast growth factor = FGF-2, endothelial mitogen) VEGF (Vascular Endothelial Growth factor) Ergo: Tumorzellen stimulieren die Entwicklung ihres eigenen Versorgungssystems!

19 Angiogenese und Tumorentwicklung Tumor Endothelzelle

20 VEGF (Vascular( Endothelial Growth Factor) die Synthese wird durch Hypoxie induziert (über den Transkriptionsfaktor HIF-1: hypoxia-inducible transcription factor ) aktiv als sezerniertes, glykosyliertes, homodimeres Protein wirkt mitogen und chemotaktisch auf Endothelzellen stimuliert die Expression u.a. von Metalloproteasen und Plasminogen Aktivatoren wirkt anti-apoptotisch auf Endothelzellen 5 Gene (VEGF-A, -B, -C, -D and PlGF) VEGF-A der wesentliche angiogene Faktor VEGF-C, -D regulieren lymphatische Angiogenese verschiedene Spleißvarianten VEGF-A = VEGF gesteigerte Expression von VEGF korreliert mit höherer Invasivität und Metastasierung von Tumoren, sowie einer schlechteren Prognose

21 VEGF-Rezeptoren VEGF bindet die RTKs VEGF-R1 und -R2 (und Neuropiline) VEGF-R2: der wesentliche Mediator der mitogenen und angiogenen Effekte von VEGF VEGF-R1: eventuell decoy-funktion; ; wichtige Rolle in der Hämotopoese; ; Regulation der Expression von Matrixmetalloproteasen und Wachstumsfaktoren Neuropiline: binden VEGF und verstärken die Interaktion von VEGF/VEGF-R2 (VEGF-R3: bindet VEGF-C und -D, hauptsächlich in lympha- tischen Geweben exprimiert)

22 VEGF und VEGF-Rezeptoren löslicher VEGF-R1 Neuropilin VEGF-R1 VEGF-R2 VEGF-R3 Angiogenese Lymphangiogenese

23 VEGF und VEGF-Rezeptoren löslicher VEGF-R1 Neuropilin VEGF-R1 VEGF-R2 VEGF-R3 Angiogenese Lymphangiogenese

24 Unterschiede zwischen normaler und Tumor-assoziierter Vaskulatur Tumor Normal Normale Vaskulatur ist sehr geordnet, unverzweigt, fast parallel angeordnet. Tumorvaskulatur ist ungeordnet, unregelmäßig, geknäult, und von unterschiedlicher Größe.

25 Sauerstoffmangel ist das primäre Signal, das die Synthese des Wachstumsfaktors VEGF induziert

26 HIF-1: Hypoxia Inducible Factor - 1 HIF-1 ist ein Transkriptionsfaktor, der bei Hypoxie spezifisch Gene einschaltet, die für das Überleben unter diesen Bedingungen notwendig sind. HIF-1 ist ein Heterodimer, bestehend aus HIF-1α und HIF-1β. HIF-1α ist konstitutiv exprimiert. Bei hohem O 2 -Angebot: HIF-1α wird durch Prolyl-Hydroxylase hydroxyliert (O 2 - abhängig). Dies bedingt die Bindung des von Hippel-Lindau Tumorsuppressors (VHL), einer Ubiquitin-E3-Ligase. VHL-Bindung führt zur Ubiquitinierung und zum Abbau von HIF-1α.

27 HIF-1: Hypoxia Inducible Factor - 1 Prolyl-Hydroxylase Angiogenese (VEGF) Glukose/Energie- Metabolismus Proliferation/ Überleben

28 Antiangiogene Therapiestrategien Inhibierung endogener proangiogener Faktoren (VEGF, bfgf) Inhibierung der Aktivierung und Differenzierung von Endothelzellen Inhibierung der Proliferation und Migration von Endothelzellen Inhibierung von Enzymen, die die Extrazelluläre Matrix abbauen (Matrixmetalloproteinasen) Induktion von Endothelzell-Apoptose ~ 100 Biotech- und große Pharmaunternehmen involviert in Antiangiogenese-Forschung mehr als 30 verschiedene Strategien werden bereits in klinischen Studien erprobt

29 Antiangiogene Therapiestrategien: Endogene Inhibitoren Angiostatin: Wird durch Proteolyse aus Plasminogen generiert (z.b. von Metalloproteinasen) Inhibiert Proliferation und Migration von Endothelzellen, induziert Apoptose in Endothelzellen. Endostatin: Wird durch Proteolyse aus Kollagen XVIII generiert Induziert die Expression antiangiogener Faktoren (Thrombospondin-1 etc.), reduziert die Expression proangiogener Faktoren (HIF-1α etc.)

30 Angiogenese-Inhibitoren: Primärtumore Endostatin Injektion in Mäuse mit multiplen Tumoren: Größe der Primärtumore wird geringer, das Wachstum stoppt. Bei Unterbrechung der Behandlung erneutes Tumorwachstum. Endostatin- Behandlung Tumore entwickeln keine Resistenz.

31 Angiogenese-Inhibitoren: Metastasierung Injektion von Tumorzellen in Mäuse Bildung eines Primärtumors Entfernung des Primärtumors Angiostatin-Injektion: Angiostatin verringert das Auftreten und das Ausmaß der Metastasierung.

32 Auf VEGF gezielte, antiangiogene Strategien Kinase- Inhibitoren Anti-Rezeptor- Antikörper Hypoxie Tumorzelle Anti-VEGF- Antikörper Endothelzelle VEGF-A VEGF-R Antisense- Oligonukleotide Tumorwachstum Lösliche Rezeptoren Peptid- Antagonisten Angiogenese

33 Auf VEGF gezielte, antiangiogene Strategien

34 Auf VEGF gezielte, antiangiogene Strategien Avastin - Bevacizumab (Genentech) humanisierter, monoklonaler anti-vegf-antikörper blockiert die Bindung von VEGF an seinen Rezeptor

35 Auf VEGF gezielte, antiangiogene Strategien

36 Auf VEGF gezielte, antiangiogene Strategien Avastin - Bevacizumab (Genentech) reduziert die Neubildung Tumor-assoziierter Gefäße, sowie die Metastasierung gut verträglich, keine Dosis-limitierende Toxizität in Kombination mit Chemotherapie verbessertes Ansprechen, verlängerte Zeit bis zum Fortschreiten der Krankheit, sowie verbesserte Gesamtüberlebensrate bei metastasierenden Karzinomen des Darms. Phase 3 für Brust-, Prostata-, Darm-, Nierenzell- und Lungentumore

37 Präklinische Studien physikalische, chemische und pharmakologische Eigenschaften Phase 1 Verträglichkeit, Nebenwirkungen, Applikationsform Phase 2 Wirksamkeit Sicherheit Phase 3 größere Patientenkollektive Klinische Studien Klinische Anwendung

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39 Tumorentstehung: Verschiedene Kontrollinstanzen müssen überwunden werden Unabhängigkeit von Wachstumsfaktoren Blockierung von Apoptose Überwindung der Wachstumsinhibition (aus: Hanahan and Weinberg, Cell 100:57, Figure 1) Induktion von Neo-Angiogenese Uneingeschränkte Replikation Invasion & Metastasierung

40 Wachstumsfaktor-vermittelte Effekte ( z.b. EGF, PDGF, IGF, NGF) Wachstums faktor R R Wachstumsfaktorrezeptor Extrazellulärraum Zellmembran K K Zytoplasma Aktivierung Zellüberleben Tumorwachstum Angiogenese Metastasierung R= Rezeptor K= Rezeptortyrosinkinase

41 Deregulation der wachstumsfaktorvermittelten Signaltransduktion Mehr Wachstumsfaktor Wachstums faktor R R R R R R R R K K K K K K K K Bildung von Wachstumsfaktoren durch die Tumorzellen selbst (autokrines Wachstum) Expression eines konstitutiv aktiven Rezeptors Überexpression des Rezeptors

42 Möglichkeiten der Hemmung Hemmung der Ligandenbindung Hemmung der Rezeptortyrosinkinase Hemmung nachgeschalteter Signalwege

43 Erb-B2/HER2/Neu gehört zur Familie der Epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptoren (c-erbb-2) Ko-Rezeptor: bindet selbst nicht an EGF-ähnliche Liganden, ist jedoch präferentieller Heterodimerisierungspartner der anderen Liganden-bindenden Erb-B-Rezeptoren stärkerer Induktor mitogener Signalwege als andere Erb-B-Rezeptoren (stärkere Wachstumsfaktor-Bindung, mehr downstream Interaktionen, stärkeres Recycling) Signaltransduktion über ras, MAPK, AKT Onkogen: Gen-Amplifikation und Protein-Überexpression tritt bei ca. 30% der Frauen mit Mammakarzinom auf - ist assoziiert mit schlechter Prognose

44 HER2-Genamplifikation und Überexpression Tumor Normal

45 Strategien zur Inhibition der ErbB-Rezeptoraktivität Anti-Rezeptor- Antikörper Small molecule TK-Inhibitor Bispezifische Antikörper Konjugate Antikörper + Toxin Rekrutierung immunologischer Effektoren Signalinhibition Inhibition der TK-Aktivität Lyse / Apoptose Ak-mediierte Internalisierung zytotoxischer Substanzen Antisense Oligonukleotide gegen Ligand/Rezeptor

46 Trastuzumab / Herceptin = Therapeutischer, humanisierter, monoklonaler Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne der RT-Kinase HER2/neu (humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor) Blockierung der HER2-Wachstumssignalkaskade. Extrazelluläre Bindung führt zur Internalisierung des Rezeptors, Inhibition der Zellzyklusprogression über p27 kip1 /CDK2, Proliferation wird gestoppt, Zellen arretieren in der G1-Zellzyklusphase, sterben apoptotisch 1998 in den USA (EG: 2000) zur Behandlung von Patientinnen mit HER2- überexprimierendem Mammakarzinom zugelassen Nebenwirkungen: In 10% der Fälle treten Schädigungen des Herzmuskels auf.

47 Herceptin: Wirkungsmechanismus Herceptin HER2/neu x pakt Zell- Überleben Zell- Teilung Zell-Invasion und -Migration

48 AKT Phosphorylierung bei Mammakarzinomen HER2/Neu AKT1 AKT2 Phospho-AKT Überexpression von HER2/neu ist assoziert mit AKT-Phosphorylierung D. Altomare, J. Testa

49 Herceptin-Exposition inhibiert AKT- Phosphorylierung und Dimerisierung von HER2/neu und HER3 Lane 1 Kontrolle Lane 2 Heregulin Lane 3 Herceptin Relative Expression HER3 HER2/neu ECD ICD Signal D. Altomare, J. Testa

50 Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität Tumorzelle NK Perforin Lyse Antikörper Effektorzelle Phagozytose Die Effektivität von Herceptin und anderen Antikörpern ist verringert in der Abwesenheit der Interaktion von Antikörper-Fc-Domänen mit zellulären Fc-Rezeptoren Clynes, Presta, Ravetch

51 Hemmung der intrazellulären Tyrosinkinase Bcr-Abl Chronisch Myeloische Leukämie (CML) Extrazellulär Kinaseinhibitor Imatinib (Glivec ) K Zellmembran Zytoplasma Intrazelluläre Kinase (Bcr-Abl) Tumorzelle Tumorwachstum Angiogenese

52 Das Philadelphia-Chromosom: Translokation t(9;22)(q34;q11) De Klein et al. Nature 300, 765 (1982), Groffen et al. Cell 36, 93 (1984)

53 ABL - BCR/ABL Normal Leukämie BCR Nukleus BCR/ABL konstitutiv aktive Kinase ABL geringe Kinase-Aktivität ABL/BCR Funktion? Zytoplasma

54 BCR-ABL-Fusionsprotein: cytoplasmatische, konstitutiv aktive Kinase verringerte Adhäsion, verstärkte Mobilität Überleben, Proliferation, Differenzierung

55 CML CML entsteht aus einer Stammzelle, die ein Granulozyten-Vorläufer ist (Molecular Cell Biology Lodish et al. Fig. 24.1)

56 Leukämie ist charakterisiert durch Hyperproliferation unreifer weißer Blutzellen normal leukämisch Erythrozyten Weiße Blutzelle Hyperproliferation weißer Blutzellen

57 Klinischer Verlauf: Phasen der CML Chronic phase Accelerated phase Advanced phases Blast crisis Median 5 6 years stabilization Median duration 6 9 months Median survival 3 6 months Provided by: Gleevec.com

58 Chronisch myeloische Leukämie (CML) Krebserkrankung des Blutes und des Knochenmarks Proliferierungssignale in hämotopoetischen Stammzellen im active state eingefroren - zu viele Granulozyten Kann jahrelang unauffällig bleiben, ein Teil tritt jedoch in die akzelerierte Phase und Blastenkrise ein (Risiko der Akuten Myeloischen Leukämie (AML) mit hoher Lethalität) Diagnose: Blutbild (erhöhte Granulozytenzahl), Philadelphia-Chromosom-Nachweis (ca. 90% der Fälle)

59 Chronisch Myeloische Leukämie (CML) Jährliche Inzidenz: 1/100,000 (~15% aller Leukämien) Alters-Median: Jahre Therapie-Optionen/Medianes Überleben: 4 Jahre mit konventioneller Chemotherapie (Hydroxyharnstoff, Busulphan) 6 Jahre mit auf IFNα-basierender Therapie Hoch-Dosis-Chemotherapie/allogene Knochenmarkstransplantation kann zur Heilung der CML führen

60 Entwicklung von Tyrosinkinaseinhibitoren Unattraktiv: Inhibierung der Interaktion von TK und Ligand/Substrat durch niedermolekulare Inhibitoren Besser: Modulation der Kinase-Aktivität Mittel: ATP-kompetitive Inhibitoren Problematik: ~800 Serin/Threonin- und Tyrosinkinasen! Alle binden ATP in hoch konservierter Weise. Spezifischer Inhibitor für eine Kinase?

61 Entwicklung von Tyrosinkinaseinhibitoren Triphosphatgruppe des ATPs wird gebunden durch mehrere konservierte, basische Aminosäurereste. Bilden zusammen mit Aspartatrest das katalytische Zentrum. Problem: Hoch-polare Moleküle wären erforderlich, um die Triphosphat/katalytische Site zu besetzen. schlechte orale Absorption, schlechte Zellpermeabilität, schlechte Pharmakokinetik Adenosin wird außer durch zwei H-Brücken über lipophile/van der Waals-Wechselwirkungen in einer geringer konservierten Umgebung gebunden fast alle ATP-kompetitiven Kinase- Inhibitoren zielen auf das Adenosin-Erkennungsmotif c-abl-kinasedomäne im Komplex mit Gleevec

62 STI-571/Imatinib-Mesylate/Gleevec/Glivec In den 90er Jahren von Novartis Pharmaceuticals in High-Throughput Screens für Tyrosinkinase-Inhibitoren identifiziert Biochemical Screening: Enzymassays (radioaktiv, colorimetrisch oder fluoreszent) mit aufgereinigter Kinase und Substrat

63 Gleevec: ein spezifischer BCR-ABL-Kinase-Inhibitor Cancer Res Jan 1;56(1): Inhibition of the Abl protein-tyrosine kinase in vitro and in vivo by a 2-phenylaminopyrimidine derivative.buchdunger E, Zimmermann J, Mett H, Meyer T, Muller M, Druker BJ, Lydon NB. Ciba Pharmaceuticals Division, Oncology Research Department, Ciba-Geigy Limited, Basel, Switzerland.

64 Gleevec

65 Gleevec : in chronic phase CML Fraction of patients that responded Chronic Phase CML Major cytogenetic response Complete cytogenetic response Months Since Start of Treatment Data: Novartis Pharmaceuticals Corporation

66 Aber: Resistenz-Entwicklung Entwicklung von Resistenzen gegen Gleevec unter Therapie - Überexpression von BCR-ABL - Mutation von BCR-ABL (Gleevec Bindung gestört)

67 RTK-Inhibitoren in der Entwicklung