Wieso Enzymbestimmungen?

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2 Wieso Enzymbestimmungen? Enzyme befinden sich in allen Zellen jedes Organ besitzt ein typisches Enzymmuster (Organspezifität). Werden Zellen eines Organs zerstört, so gelangen ihre Enzyme vermehrt (CHE: vermindert) ins Blut durch ihre Erfassung (Art, Konzentration und Mengenverhältnis der gemessenen Enzyme) kann auf das geschädigte Organ geschlossen werden.

3 Enzym (Abkürzung) Alanin-Aminotransferase (ALT, ALAT) [früher Glutamat-Pyruvat- Transaminase (GPT)] Aspartat-Aminotransferase (AST, ASAT) [früher Glutamat-Oxalacetat- Transaminase (GOT)] Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT) Alkalische Phosphatase (AP, ALP) Lipase Kreatinphosphokinase (CK) Kreatinphosphokinase MB-Typ (CK-MB) Mögliche Ursache einer Vermehrung des Enzyms im Blut Schädigungen der Leber Schädigungen der Leber und des Muskels Krankheiten der Leber und der Gallenwege Krankheiten der Leber, der Gallenwege und des Knochens Schädigungen der Bauchspeicheldrüse (z.b. Pankreatitis) Muskelschäden, (Herzmuskelschäden) Herzmuskelschäden (z.b. Infarkt)

4 Enzyme pattern caused by acute virus hepatitis.

5 Enzym-Unterteilung: Plasmaspezifische Enzyme: Sie wirken im Plasma (z.b. Cholinesterase) Sezernierte Enzyme: Sie werden von exokrinen Drüsen nur in geringen Mengen an das Blut abgegeben. Bei Schädigung des Herkunftsorgans gelangen sie vermehrt ins Blut (z.b. α- Amylasen, Lipase). Zellenzyme: Sie sind intrazellulärer Herkunft. Bei Schädigung der Zellen der Herkunftsorgane gelangen sie vermehrt ins Blut (ALAT, ASAT).

6 Lokalisation der Zellenzyme:

7 Wirkungsweise von Enzymen: Enzym (E) Substrat (S) Produkt (P)

8 Energiediagramm einer biochemischen Reaktion: Mit Hilfe des Enzyms wird die Aktivierungsenergie herabgesetzt: Das Substrat A wird viel schneller in das Produkt B umgewandelt.

9 Mechanismus der Enzymkatalyse: dem Nachbarn erklären

10 Das aktive Zentrum: Jedes Enzym besitzt ein aktives Zentrum. Aufgaben: Bindung des Substrats ans Enzym: Es macht, dass nur die richtigen Substrate sich mit dem Enzym binden können. Wenn sich mehr als 1 Substrat mit dem Enzym binden muss, so sorgt es für die richtige räumliche Anordnung. Umwandlung des Substrates zum Produkt mit Herabsetzen der Aktivierungsenergie.

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12 Nomenklatur von Enzymen (Klassifikation): Der systematische Name eines Enzyms besteht aus: Name des umgesetzten Substrates Art der katalysierten Reaktion (den 6 Hauptklassen zu entnehmen)

13 Systematischer Name: Creatinkinase: das umgesetzte Substrat ist das Creatin das Produkt ist das Creatinphosphat: das Enzym überträgt das Phosphat von ATP auf das Substrat (Creatin) dieses Vorgehen wird von den Kinasen gemacht. Creatinkinase Creatin + ATP Creatinphosphat + ADP

14 Klassifizierungs-Nr./EC-Code (Enzyme-Commission-Number): 1. Zahl: Sie gibt eine der 6 Hauptgruppen an und bezieht sich auf die katalysierte Reaktion. 2. Zahl: Weitere Unterteilung der Hauptklassen in Unterklassen, je nach chem. Bindung. 3. Zahl: Unter-Unterklasse 4. Zahl: Seriennummer in der Unter-Unterklasse

15 CK (Enzym) Creatin (Substrat) + ATP Creatinphosphat (Produkt) + ADP CK hat die Systemnummer (EC): Dies bedeutet: 1. Zahl: Hauptklasse 2 = Transferase 2. Zahl: Unterklasse 7 = Phosphotransferase 3. Zahl: Unter-Unterklasse 3 = H2N als Akzeptor 4. Zahl: Seriennummer in der Unter-Unterklasse 2.

16 Messung eines Enzyms: Direkte Bestimmung der Enzymkonzentration Bestimmung der Enzymaktivität im Serum

17 Direkte Bestimmung der Enzymkonzentration:

18 Bestimmung der Enzymaktivität: Die Enzymaktivität entspricht der Geschwindigkeit, mit der die katalysierte Reaktion abläuft.

19 Substrat nimmt ab Produkt nimmt zu Substrat Zeit Produkt Zeit

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21 Enzymeinheit: 1 U = Enzymaktivität, die den Umsatz von 1 µmol Substrat pro Minute unter Standardbedingungen katalysiert.

22 Reaktionsbedingungen für Enzymmessungen: Temperaturabhängigkeit ph-wert Konzentration und Art des Substrates Coenzyme Art und Konzentration des Puffers Effektoren

23 Konzentration & Art des Substrates: Es wird immer in einem Substratüberschuss (Substratsättigung) gearbeitet. Denn jedes Enzymmolekül muss während der Reaktionszeit 1 Substratmolekül umsetzen. Bei zu hoher Substratkonzentration Substrathemmung: Art des Substrates: Je besser das Substrat zum aktiven Zentrum passt, desto rascher ist die Umsetzung (je höher die Affinität, desto kleiner die Substratkonzentration).

24 Coenzyme: Coenzyme (Cosubstrate) werden oft gebraucht, um Enzyme zu aktivieren: Das Coenzym bindet sich an das Enzym, um dann aktiv zu werden. Coenzym + Apoenzym (Enzymmolekül) = Holoenzym Das Coenzym geht verändert, das Apoenzym unverändert aus der Reaktion hervor. Coenzyme haben Vitamine als Bausteine: Coenzyme: NAD + (Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid) Vitamin B3 NADP + (Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat) Vitamin B3 Pyridoxalphosphat Vitamin B6

25 Optimierte Standardmethoden: Durch genaue Festlegung der Durchführungsbedingungen bei der Enzymaktivitätsbestimmung entstehen sog. optimierte Methoden, die von der internationalen Fachstelle für klinische Chemie (IFCC) eingeführt wurden.

26 Methoden zur Messung von Enzymaktivitäten: Enzymtests (Enzymaktivität): mit einem enzymatischen Farbtest oder mit einem optisch-enzymatischen UV-Test (einfach oder gekoppelt) Kinetische Messung!

27 Enzymatischer Farbtest (Enzymtest): Der Verlauf der Zu- oder Abnahme der Farbintensität auf Zeit ist der Enzymaktivität proportional. Glycylglycin Produktzunahme: Farbveränderung auf Zeit wird gemessen

28 Einfacher optisch-enzymatischer UV-Test: In einem bestimmten Zeitabschnitt wird die durch Bildung oder Verbrauch des Coenzyms NADH oder NADPH eintretende Extinktionsänderung der Reaktionslösung kontinuierlich oder in bestimmten Zeitabständen registriert. NADH + H + NAD + (reduzierte Coenzymform von NADH) NADPH + H + NADP + (reduzierte Coenzymform NADPH)

29 a. Messreaktion: LDH L-Lactat + NAD + Pyruvat + NADH + H + Die Geschwindigkeit der Bildung von NADH ist direkt proportional zur LDH-Aktivität.

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31 Reaktion von NADH zu NAD+ = Extinktionsabnahme Reaktion von NAD+ zu NADH = Extinktionszunahme

32 a. Messreaktion: LDH L-Lactat + NAD + Pyruvat + NADH + H + LDH: Reaktion von NAD + (Eduktabnahme) nach NADH (Produktzunahme) = Extinktionszunahme.

33 a. Messreaktion: ASAT L-Aspartat + 2-Oxoglutarat Oxalacetat + L-Glutamat b. Indikatorreaktion: Oxalacetat + NADH + H+ MDH L-Malat + NAD+ ASAT: Reaktion von NADH (Eduktabnahme) nach NAD + (Produktzunahme) = Extinktionsabnahme.

34 Gekoppelter, optisch-enzymatischer UV-Test: a. Messreaktion: ALAT L-Alanin + 2-Oxoglutarat L-Glutamat + Pyruvat b. Indikatorreaktion: LD Pyruvat + NADH + H+ Lactat + NAD+ Extinktionsabnahme

35 a. Messreaktion: CK Creatinphosphat + ADP Creatin + ATP b. Hilfsreaktion: ATP + Glucose Hexokinase Glucose-6-P + ADP c. Indikatorreaktion: Glucose-6-P- Dehydrogenase Gluc-6-P + NADP+ 6-Phosphogluconat + NADPH + H+ Extinktionszunahme

36 Enzymatische Substratbestimmung (Enzymatischer Test): Enzyme sind auch wichtige Hilfsmittel zur Bestimmung von Substratkonzentrationen. Uricase Harnsäure + H 2 O + O 2 Allantoin + CO 2 + H 2 O 2 Messung: Endpunkt oder kinetisch

37 Endpunkt: Kinetisch:

38 ALAT/ALT (Alanin-Amino-Transferase) GPT (Glutamat-Pyruvat-Transaminase): Zellenzym: im Zytoplasma ist schnell erhöht! Kommt in vielen Geweben vor In grosser Konz. in Leber und Gallenwege Leitenzym für Leber- und Gallenwegserkrankungen In kleinen Konz. in Skelettmuskeln, Herz, Niere, Pankreas, Ec bei Leber- und Gallenwegserkrankungen

39 ASAT/AST (Aspartat-Amino-Transferase) GOT (Glutamat-Oxalacetat-Transaminase): Zellenzym: 1/3 zytosolisch, 2/3 mitochondrial erst bei stärkerer Zellschädigung stärker erhöht! Kommt in vielen Geweben vor in grosser Konz. in Leber, Gallenwege sowie Herz und Skelettmuskulatur In kleinen Konz. in Gehirn, Niere, Pankreas, Lunge, Ec bei Leber-, Gallenwegs-, Skelett- und Herzerkrankungen

40 (Gesamt-) ALP/AP (Alkalische-Phosphatase): Zellenzym: membranständig hat Isoenzyme: Leber-AP, Knochen-AP (BAP), Dünndarm-AP, Plazenta-AP In grosser Konz. in Leber, Gallenwege und Knochen bei Gallenwegs-, Leber- und Knochenerkrankungen, in Schwangerschaft und Wachstumsphase

41 γ-gt/ggt (Gamma-Glutamyl-Transferase): Zellenzym: membranständig Kommt in vielen Organen vor In grosser Konz. in Leber und Gallenwege Leitenzym bei Leber- und Gallenwegserkrankungen

42 CHE (Cholinesterase): Wird in Leber produziert und ins Plasma exportiert = plasmaspezifisches Enzym CHE ist Messgrösse zur Überprüfung der globalen Leberfunktion: eher nicht zur Erkennung von Leberschäden, sondern zur Beobachtung des Verlaufs einer Leberschädigung Leitenzym nur bei schweren Leberschäden vermindert! bei Lebererkrankungen, Muskelrelaxansunverträglichkeit

43 GLDH/GD (Glutamat-Dehydrogenase): Zellenzym: mitochondrial nur bei sehr schweren Schäden erhöht! Aktivität in Leber 10x höher Leitenzym bei Leber- und Gallenwegserkrankungen

44 LDH/LD (Lactat-Dehydrogenase): Zellenzym: zytosolisch kommt in jeder Zelle vor unspezifisch, wird schnell frei Hohe Konz. in Leber, Herz, Skelett, Niere, Ec in Ec ist 160x höher kein hämolytisches Plasma hat 5 Isoenzyme: LDH-1 bis LDH-5 α-hbdh (α-hydroxybutyratdehydrogenase = LDH-1 und LDH-2): Herzinfarktparameter bei Hämolysen, Herz-, Leber-, Gallenwegs-, Nierenerkrankungen, Tumoren

45 LIPA (Lipase): wird in Pankreas gebildet und in Dünndarm abgegeben, Verdauungsenzym Exkretionsenzym Leitenzym für Pankreas nur geringe Mengen im Blut bei Pankreas- und Nierenerkrankungen (wird glomerulär filtriert, rückresorbiert, zu AS abgebaut)

46 α-amylasen: Produktion in Speicheldrüsen (S-Amylase) und Pankreas (P-Amylase), Verdauungsenzyme Exkretionsenzym Auch nachweisbar in Leber, Samenflüssigkeit, Hoden, Eierstöcken, Eileiter, Muskulatur, Lunge, Fettgewebe nur geringe Konz. im Blut bei Parotitis, Pankreas-, Darm-, Nierenerkrankungen (wird über die Nieren ausgeschieden)

47 CK (Creatin-Kinase): Zellenzym Isoenzyme: CK-MM (Skelett), CK-BB (Gehirn), CK- MB (Myokard) bei Skelett- und Herzerkrankungen CK-MB ist herzspezifischer