Aminosäuren. Versuch 1 Identifizierung von Aminosäuren durch DC und Farbreaktionen

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1 Aminosäuren, Seite 1 Aminosäuren Einführung Aminosäuren (AS) spielen in allen Zellen eine herausragende Rolle als Strukturbestandteile von komplexen Molekülen, Ausgangsstoffe von Synthesen und zum Teil als Energiequellen. Die Eigenschaften der Aminosäuren und ihr Stoffwechsel sind deshalb von besonderem medizinischem Interesse. Vererbte und erworbene Störungen im Stoffwechsel von Aminosäuren sind Ursachen von zahlreichen Krankheiten. Als Bausteine von Proteinen sind AS an der Katalyse und fast dem gesamten Stoffwechsel beteiligt. Im vorliegenden Versuch werden die Grundlagen der Struktur und Funktion von Aminosäuren, Peptiden und Proteinen deutlich gemacht. Stichworte zur Vorbereitung Struktur von Aminosäuren und Proteinen, Peptidbindung, proteinogene Aminosäuren (Wiederholungsstoff). Stoffwechsel nicht-essentieller Aminosäuren. Mechanismus und Bedeutung von Amidierungs-, Decarboxylierungs- und Transaminierungsreaktionen (einschl. diagnostisch relevanter Applikationen). Reduktive Aminierung und oxidative Deaminierung. Glucogene und ketogene Aminosäuren. Funktionen und Abbau von essentiellen und bedingt essentiellen Aminosäuren. Abbaufamilien. S-Adenosylmethionin und C1-Stoffwechsel. Phosphoadenosinphosphosulfat. Vitamine im Stoffwechsel von Aminosäuren und Folgen von Vitaminmangel. Bildung und Abbau von Signalstoffen und Hormonen aus Aminosäuren. Intrazellulärer Proteinabbau. Lysosomen, Proteasomen. Versuch 1 Identifizierung von Aminosäuren durch DC und Farbreaktionen Jede Gruppe erhält eine Lösung (AS-Lösung X), in der sich eine der folgenden Aminosäuren befindet: Alanin, Arginin, Cystein, Histidin, Prolin, Tryptophan und Tyrosin. a) Dünnschichtchromatographie Zur Identifizierung der Aminosäuren wird ein Dünnschichtchromatogramm (DC) des Gemischs angefertigt (siehe Methodische Einführung). Als stationäre Phase dient eine mit Kieselgel beschichtete Glasplatte und als Laufmittel ein Gemisch von n-butanol, Essigsäure und Wasser im Verhältnis 4:1:1. µl der AS-Lösung werden etwa 1 cm von unteren Rand entfernt auf eine DC-Platte ( x 10 cm) aufgetragen. In weitere Spuren werden zum Vergleich Proben der bereitgestellten Lösungen einzelner Aminosäuren aufgetragen. Nach Trocknen der Flecken wird die Platte vorsichtig in einen Chromatographietrog eingestellt, der 0. cm hoch mit Laufmittel gefüllt ist (Abzug!). Nach Schließen des Troges wird chromatographiert, bis die Laufmittelfront fast den oberen Rand der Platte erreicht hat. Die Platte wird entnommen und im Abzug auf Filterpapier getrocknet (Dieser Arbeitsgang läßt sich mit einem Heißlufttrockner beschleunigen). Dann wird die Platte aus etwa 30 cm Entfernung kurz mit Ninhydrin-Reagenz besprüht (die Schicht darf nicht durchfeuchtet sein) und zum Sichtbarmachen der Flecken kurz auf einer Heizplatte auf etwa C erhitzt. Alle Aminosäuren färben sich blau bis violett außer Prolin, das mit dem Reagenz eine Gelbfärbung ergibt.

2 Aminosäuren, Seite 2 Zur Identifizierung von AS in der Dünnschichtchromatographie kann man R f - Werte heranziehen. Dies ist die Angabe ihrer Wanderungsstrecke relativ zur Wanderungsstrecke des Lösungsmittels. Solche R f -Werte sind in der Tabelle aufgeführt; es handelt sich dabei allerdings nur um Anhaltspunkte, da R f -Werte je nach Versuchsbedingungen erheblich schwanken können. Aminosäure R f - Wert Alanin 0.27 Arginin 0.08 Cystein 0.30 Histidin 0.06 Prolin 0.19 Tryptophan 0.6 Tyrosin 0.47 X Ala Arg X Cys His X Pro Trp Tyr b) Identifizierung durch Farbreaktionen Die Seitenketten einiger Aminosäuren lassen sich mit bestimmten Reagenzien zu Farbstoffen umsetzen und so qualitativ nachweisen. Cole-Hopkins-Test im Reagenzglas durchführen. Konz. Schwefelsäure vorsichtig (!!!) mit Pasteurpipette aus Glas - nicht mit Eppendorf-Pipetten - dosieren! Alle andern Reaktionen können mit Eppendorfcaps und pipetten ausgeführt werden. 1. Sakaguchi-Reaktion (spezifisch für Arginin) Reagenz A) mg 1-Naphthol + g Harnstoff in ml 9 % EtOH Reagenz B) 0.7 ml Brom + g NaOH in ml H 2 O Geben Sie zu µl der AS-Lösung dasselbe Volumen von Reagenz A und dann nach Umschütteln 2 Volumina B. Bei Anwesenheit von Arginin entsteht eine Rotfärbung. 2. Pauly-Reaktion auf Tyrosin und Histidin Die aromatischen Seitenketten von Tyrosin und Histidin reagieren mit Diazoniumsalzen, z.b. diazotierter Sulfanilsäure, zu rot gefärbten Azofarbstoffen.

3 Aminosäuren, Seite 3 Reagenz A) 0. % Sulfanilsäure in 2% HCl Reagenz B) 0. % Natriumnitrit (NaNO 2 ) Etwa µl A mit µl B mischen (Diazotierung). Nach 1 min werden 400 µl AS-Lösung gegeben. Nach Umschütteln macht man durch tropfenweise Zugabe von 10 % Na 2 CO 3 alkalisch. Bei Anwesenheit von Tyrosin oder Histidin färbt sich die Lösung intensiv rot, sonst hellgelb. 3) Nachweis von Cystein durch DTNB Die freie SH-Gruppe des Cysteins reagiert mit dem Disulfid DTNB unter Freisetzung von orange gefärbtem TNB Eine µl-probe der AS-Lösung wird mit dem doppelten Volumen 10 mm DTNB in mm Tris/HCl Puffer, ph 8.0 gemischt. In Gegenwart von Cystein entsteht eine Orangefärbung. 4. Cole-Hopkins-Reaktion zum Nachweis von Tryptophan A) 1 g Glyoxylsäure in ml H 2 O B) H 2 SO 4 konz. (Vorsicht!) Zu µl der AS-Lösung in einem großen Reagenzglas gibt man zunächst 1 ml A. In diese Lösung läßt man langsam 1 ml konzentrierte Schwefelsäure (B) einfließen (Vorsicht! Reagenzglas-öffnung vom Körper abwenden!). In Gegenwart von Tryptophan entsteht nach Umschütteln ein braunvioletter Farbstoff. Die Farbreaktionen lassen sich während des DC-Laufs durchführen. Vermerken Sie im Protokoll den Verlauf der einzelnen Versuche und geben Sie an, welche Aminosäuren in Ihrer Probe enthalten sind.

4 Aminosäuren, Seite 4 Versuch 2 Aspartataminotransferasereaktion und Bestimmung von Pyridoxalphosphat im Blutplasma Einleitung Aminotransferasen (Transaminasen) sind Vitamin B 6 - abhängige Enzyme, die am Abbau der meisten Aminosäuren und an der Biosynthese nicht essentieller Aminosäuren beteiligt sind. Aspartat-Aminotransferase (AAT, GOT), die eine Rolle beim Transfer von Redoxäquivalenten aus dem Cytosol in die Mitochondrien spielt, kommt in einer relativ hohen Aktivität in Herz- und Skelettmuskulatur sowie dem Leberparenchym vor. Erhöhung ihrer Aktivität in Serumproben deutet auf eine Schädigung eines der grossen Organe. Die Bedeutung der Coenzyme für die Aminotransferase Aktivität lässt sich durch einen Vergleich der enzymatischen Aktivität in der Abwesenheit (Apoenzym) und Anwesenheit (Holoenzym) des Coenzyms demonstrieren. Unter besonderen Bedingungen kann man das Coenzym vom Holoenzym abtrennen, um das Apoenzym zu gewinnen. Durch Rekonstitution und Bestimmung der Aktitivität des Apoenzyms mit Pyridoxalphosphat (PALP) kann die Konzentration des Coenzyms (der aktiven Form des Vitamin B 6 ) bestimmt werden. Durch den Nachweis der enzymatischen Aktivität kommt es zu einer Signalverstärkung, so dass die Nachweisgrenze im fmol- bis pmol- Bereich liegt. In einer mit Malatdehydrogenase als Indikatorenzym gekoppelten Bestimmung wird PALP wie folgt quantitativ nachgewiesen. Eine Serum-Extraktprobe mit und ohne Zusatz einer bekannten Vitamin B 6 Menge wird mit Apo-AAT inkubiert. Der PALP - Menge entsprechend wird ein Teil des Apo- zum Holoenzym umgesetzt. In dem gekoppelten "Assay" wird zwischen der Geschwindigkeit der Oxidation von NADH und der Konzentration des Holoenzyms und damit der PALPs eine proportionale Abhängigkeit beobachtet. Durch die Holo-AAT, jedoch nicht durch die Apo-AAT wird in Anwesenheit von α-ketoglutarat das Aspartat zu Oxalacetat umgesetzt, das mit Hilfe von dem Indikatorenzym (Malatdehydrogenase im Überschuss) zur Oxidation von NADH genutzt wird. Die NADH-Extinktion bei 340 oder 366 nm wird je nach der Konzentration des gebildeten Holoenzyms schneller oder langsamer sinken. α Ketoglutarat AAT(PALP) Glutamat Indikatorreaktion: + Aspartat Oxalacetat Oxalacetat MDH NADH + H + Malat + NAD + Diese beiden Reaktionen sind zwar reversibel, doch zu Beginn der Reaktion wird, ausgehend von α-ketoglutarat und Aspartat, das Oxalacetat und durch dessen Reduktion bei gleichzeitiger Oxidation von NADH Malat gebildet. In Anwesenheit einer hohen Malatdehydrogenaseaktivität wird die Geschwindigkeit der Oxidation von

5 Aminosäuren, Seite NADH von der Aktivität der AAT bestimmt. Da nur das Holoenzym aktiv ist, korreliert diese Geschwindigkeit mit der PALP-Menge in der Probe. Der interne Standard, mit dem die PALP-Konzentration in dem Blutplasma bzw. dem Ansatz um 4 µm bzw. 0,32 nm erhöht wird, ist ein Maß der Konzentration von PALP im Blutplasma. (Berechnen Sie die Menge des dem internen Standard entstprechenden Coenzyms im Reaktionsansatz in der Küvette 3 in mol!) Benötigte Lösungen 1. 0,1 M Na-EDTA, ph 7, µm Pyridoxalphosphat (PALP) 3. 9 M Perchlorsäure 4. 1 M KOH. Puffer: 0,0 M EDTA, 0, M Tris - HCl, ph 6,2 6. Apo - Aspartataminotransferase, units/ml 7. Indikatorenzymgemisch: 30 mm Asparaginsäure, 0,1 mm oder 0,3 mm NADH (für Messungen bei 340 bzw. 366 nm) in 10 mm EDTA, mm Tris - HCl Puffer, ph 7,4 frisch versetzt mit Malatdehydrogenase (1 unit / ml) 8. 2 mm α-ketoglurat in 10 mm EDTA, mm Tris - HCl, ph 7,8 Durchführung a) Probenvorbereitung. Jeweils zwei Kursteilnehmer/innen bilden ein Team. In einem Reationsgefäß mit µl EDTA (Lösung 1) werden µl Kapillarblut gesammelt. Nach dem Mischen wird die Probe bei g zentrifugiert. Der klare Überstand wird in ein neues Gefäß überführt. Weiter wird nach dem Pipettierschema in der nachstehenden Tabelle gearbeitet. Gefäße 1 und 2 erhalten 2 bzw. µl H 2 0. Gefäß 3 erhält µl PALP Standard (2). Gefäße 2 und 3 erhalten je 20 µl Blutplasma. Die Proben werden mit µl Perchlorsäure (3) gemischt und min auf Eis gelagert. Weiterhin werden Proben mit 80 µl Wasser verdünnt. Nach einer Zentrifugation (2 min g) werden von den Überständen jeweils µl in neue Gefäße abgenommen. Die Überstände werden mit µl Kalilauge (4) gemischt und das gefällte KClO 4 wird abzentrifugiert (2 min, g). b) Probenanalyse In drei nummerierte Halbmikroküvetten werden je µl Pufferlösung () mit je 40 µl Probenüberstand pipettiert. Es werden je 10 µl Apo-AAT (6) hinzugefügt. Nach dem Mischen werden die Lösungen 90 Min. bei 37 C inkubiert. Nach der Bindung des PALP an das Apoenzym werden je 400 µl Indikatorenenzymgemisch (7) zugesetzt. Die Reaktion wird mit µl α-ketoglutarat - Lösung (8) gestartet. Sofort nach dem Mischen mit dem Ansatz und danach 12 mal in Abständen von 30 sec wird die Extinktion bei 340 (360) nm gemessen. Nach graphischer Auswertung der Anfangsgeschwindigkeit wird entsprechend der Anleitung in der Tabelle zunächst die durch den internen Standard verursachte Erhöhung der Reaktions-geschwindigkeit und danach die PALP-Konzentration in der Blutprobe errechnet.

6 Aminosäuren, Seite 6 Pipettierschema/Durchführung (Angaben in µl) Ansatz im Reaktionsgefäß Nr. LW 1 Probe 2 int. Standard 3 H 2 O 16 µm PALP 2 Plasma 9 M Perchlorsäure 3 Inkubation auf Eis H 2 O Zentrifugieren (14000 g) Min Min Min. 80 Neue Gefäße Nr. 1' 2' 3' Proteinfreier Überstand 1 M KOH 4 Inkubation auf Eis Zentrifugieren (14000 g) Küvette Puffer Überstand Apo AAT 6 Inkubation 37 C Enzym-Gemisch 7 Startlösung 8 Mischen Extinktion nach 30 sec " 60 sec " 90 sec " 120sec " 1 sec " 180 sec " 210 sec " 240 sec " 270 sec " 300 sec Nr Min Min Min

7 Aminosäuren, Seite 7 Auswertung Lineare Geschw. v ( E/min) Differenz v (Ansatz 2 - Ansatz 1) - - v Standard (Ansatz 3 - Ansatz 2) - - PALP-Konzentration 1 (µm) - 4 PALP-Konzentration 2 (µm) 0,032 Substratumsatz durch PALP- Zusatz 3 (µm/min) Wechselzahl 4 (min -1 ) Die PALP-Konzentration (im Ansatz 2) in der Blutplasmaprobe bzw. (im Ansatz 3) die auf 20 µl bezogene Konzentraton des PALP-Standards [16 µm x (:20) = 4 µm] Die PALP-Konzentration des Standards in 600 µl Reaktionsansatz 3 entspricht 32 nm. [16 µm : (Verdünnungsfaktor F im Extrakt x Verdünnungsfaktor im Reaktionsgemisch) = 16 µm : (33 x 1) = 32 nm] Berechnung nach dem Lambert - Beer`schen Gesetz. (Eine 1 mm NADH - Lösung in einer 1 cm Küvette ergibt bei 340 nm oder 366 nm den Extinktionswert von 6,2 bzw. 3,2.) Bei der Bestimmung der Coenzym-Konzentration anhand der Holoenzymaktivität entspricht die Wechselzahl dem Verstärkungsfaktor des Nachweises. In unserem Ansatz stellt die Wechselzahl die Zahl der in einer Minute oxidierten NADH-Moleküle dar, bezogen auf ein Molekül PALP bzw. des Holoenzyms. (Die hier zu berechnende Wechselzahl wird auf Grund einer unter den gewählten Versuchsbedingungen unvollständigen Umsetzung des Coenzyms zum Holoenzym etwas unterschätzt.) Im SI System wird das Äquivalent der Wechselzahl in sec -1 berechnet.

8 Aminosäuren, Seite 8 Grafische Ermittlung der Anfangsgeschwindigkeit ( E/min) Extinktion Zeit (sec) Das Protokoll: Die Mess- und die Indikatorreaktion: Prinzip der Messung:

9 Aminosäuren, Seite 9 Gemessene PALP-Konzentration im Blutplasma: Menge des dem internen Standard entstprechenden Coenzyms im Reaktionsansatz in der Küvette 3 in mol: Wechselzahl der Aspartataminotransferase: FRAGEN a) Wiederholungsthemen 1. Welche sind die proteinogenen Aminosäuren und in welche Strukturklassen kann man diese einteilen? 2. Welche Aminosäuren sind basisch, welche sauer, hydrophob, tragen Hydroxylgruppen, enthalten ein Schwefelatom, tragen nicht-ionisierbare oder aromatische Seitenketten? 3. Von welcher Aminosäure gibt es keine Enantiomere, von welchen mehr als zwei? b) Stoffwechselfragen 4. Warum muß die Nahrung Proteine enthalten? Wie hoch ist der tägliche Bedarf?. Wovon hängt die ernährungsphysiologische Qualität eines Proteins ab? 6. Kennen Sie die essentiellen Aminosäuren? 7. Wie werden die Aminosäuren Glutamin und Glutamat synthetisiert und abgebaut? 8. Wie und zu welchen Produkten werden Aminosäuren decarboxyliert? 9. Wie werden überschüssige Aminosäuren verwertet? 10. Welche Aminosäuren werden aus den Intermediaten der Glykolyse, welche aus denen des Citratzyklus synthetisiert? 11. Wie werden Aminosäuren bei Hunger mobilisiert? Welche Hormone fördern den Abbau von Aminosäuren und Proteinen? 12. Welche Abbaufamilien von Aminosäuren kennen Sie? 13. Durch welche Systeme werden Proteine in der Zelle abgebaut, was sind die Produkte? 14. Welche Aminosäuren und welche Vitamine sind am C1-Stoffwechsel beteiligt? 1. Welche Amino- und Ketosäuren sind Substrate der Aspartat- bzw-. Alaninaminotransferase? 16. Welche Pyridoxalphosphat-abhängige Enzyme ausser Aminotransferasen sind Ihnen bekannt? 17. Welches Stoffwechselprodukt tritt bei B 6 -Mangel in erhöhter Konzentration im Urin auf? 18. Welches Stoffwechselprodukt tritt bei Tetrahydrofolsäure-Mangel in erhöhter Konzentration in Urin auf? 19. Welche Aminosäuren werden zur Synthese von Adeninnukleotiden benötigt? 20. Welche Aminosäuren werden für die Synthese von Phosphatidyl- und Sphingolipiden benötigt?