Expression rekombinanter Proteinpharmazeutika

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1 Intro Wirtschaft Wissenschaft Politik Strukturen Special Verbände Service Extro 47 SPECIAL II Expression rekombinanter Proteinpharmazeutika Bernd Voedisch, Christian Menzel, Eva Jordan, Aymen El-Ghezal, Thomas Schirrmann, Michal Hust und Thomas Jostock, TU Braunschweig Der wachsende Markt für rekombinante Proteinpharmazeutika hat 2004 einen Umfang von rund 47 Mrd. US-$ erreicht, zahlreiche neue Proteinwirkstoffe befinden sich derzeit in klinischer und in vorklinischer Entwicklung. Aus den derzeit sehr hohen Produktionskosten für Proteintherapeutika und der begrenzten Eignung kostengünstigerer mikrobieller Systeme zur Produktion zahlreicher aktiver Proteinpharmaka ergibt sich ein großer Bedarf an neuen, effektiven Expressionssystemen für rekombinante Proteine, die die Limitierungen der derzeit hauptsächlich genutzten E. coli- und Säugerzell (CHO)- Systeme überwinden. Der folgende Beitrag gibt einen Überblick der populärsten Expressionsysteme sowie deren Leistungsfähigkeit und Potential für das Manufacturing von Biologicals. Erst Methoden der rekombinanten DNA- Technologie und des Gentransfers ermöglichten die heterologe Genexpression in Wirtsorganismen, die mit der Produktion von Insulin in E. coli 1982 erstmals kommerziell realisiert wurde. Mit Erythropoietin (EPO, Umsatz 2004: 6,9 Mrd. US-$) findet sich ein rekombinantes Protein in der Gruppe der umsatzstärksten Medikamente weltweit. Neben E. coli sind derzeit vor allem Säugerzellsysteme Produktionsstandard CHO-Zellen (chinese hamster ovarian) etwa ermöglichen erst die Produktion therapeutischer Proteine und rekombinanter monoklonaler Antikörper, deren Aktivität von einer korrekten posttranslationalen Modifikation abhängt. Andere Expressionssysteme nutzen Grampositive Bakterien, Hefen, Insektenzellen und transgene Pflanzen als Wirtsorganismen. Ein Einsatz transgener Tiere zur heterologen Produktion von Biopharmazeutika und deren Aufarbeitung, etwa aus Milch und Eiweiß, ist Gegenstand aktueller Forschung. Kosten, Sicherheitsaspekte (FDA-Zulassung) sowie posttranslationale Modifikationen determinieren die Eignung eines Expressionssystems. Kurze Generationszeiten und preiswerte Kulturmedien machen Hefen und Bakterien zwar zu kosteneffektiven Wirtsorganismen, dem steht aber das Risiko von Verunreinigungen mit Endotoxinen gegenüber. Säuger- und Insektenzellen stellen höhere Anforderungen an Kulturmedium und die Fermentationstechnologie und verteuern daher die Produktion. Säugerzellsysteme können zudem durch Viren oder Mycoplasmen kontaminiert werden. Bei transgenen Pflanzen und Tieren muß einer Auskreuzung und unkontrollierten Verbreitung des Transgens entgegengewirkt werden. Escherichia coli Aufgrund seiner sehr gut untersuchten Genetik und Physiologie, kurzen Generationszeit und einfachen Handhabung ist das Gram-negative Enterobakterium E. coli der für die Expression rekombinanter Proteine am häufigsten eingesetzte Organismus. Die Proteine können zwar auf mehr als 20% des gesamten zellulären E. coli-proteins angerei- LSC, naturwissenschaftlich ausgebildet und branchenerfahren, hilft Ihnen beim praktischen Verkauf und bei der Planung und Umsetzung Ihrer Vermarktungsstrategien. LSC denkt für Sie mit, packt an und verkauft in Ihrem Namen vom ersten Tag an. Europaweit. Mehr erfahren Sie auf der Website Wir freuen uns auf Ihre Kontaktaufnahme. T , CH-4452 Itingen

2 48 Intro Wirtschaft Wissenschaft Politik Strukturen Special Verbände Service Extro chert werden, liefern aber nur wenig aktives Protein und werden nicht posttranslational modifiziert wie in eukaryotischen Wirtsorganismen. Zudem lagern sich Fremdproteine mit größeren hydrophoben Regionen und komplexen Disulfidbrücken als unlösliche inclusion bodies im Zytoplasma von E. coli ab. Dies macht ein vollständiges Denaturieren und Rückfalten in vitro nötig, worunter die Ausbeute an funktionellem Protein leidet. Deshalb wird viel Aufwand zur Verbesserung der sekretorischen in E. coli betrieben, um die Proteinaufreinigung zu vereinfachen und die Ausbeute an funktionellem Protein zu erhöhen. im Vergleich zu Gram-negativen Bakterien die Kosten der Proteinaufreinigung reduziert. Zudem fehlt ihnen die Lipopolysaccharid-Schicht dieser Bakteriengruppe, die eine starke Immunantwort hervorrufen kann und damit therapeutische Anwendungen stört. Ein Problem bei der Produktion extrazellulärer Proteine in Bakterien und Hefen ist der Abbau durch Proteasen. Durch den Einsatz Protease-defizienter Stämme kann dieses Problem jedoch minimiert werden. Es stehen eine Vielzahl von Vektoren zur Verfügung, die frei replizierbar oder integrativ sind. Mit dem gut erforschten B. subtilis konnte 1 g/l Proinsulin produziert werden; Staphylokinase, ein Enzym zur Auflösung von Blutgerinnseln, wird mit einer Ausbeute von 337 mg/l hergestellt E. coli erreicht hier gerade einmal 50 mg/l. Single-chain-Antikörperfragmente konnten in einer Konzentration von bis zu 15 mg/l hergestellt werden. Mit B. brevis konnten bereits Zytokine, Hormone und Antikörper darunter Singlechain- und Fab-Antikörperfragmente in Ausbeuten von 10 mg/l bzw. 100 mg/l produziert werden, humanes Interleukin-2 sogar mit Produktionsraten von 120 mg/l. Hefen Abb. 1: Integration des Gene of Interest ins Hefegenom. Die Integration des Gene of Interest erfolgt in der transformierten Hefe durch homologe Rekombination. Hier dargestellt: Genintegration durch Single Crossover Am weitesten verbreitet ist das sec-system, bei dem die rekombinanten Proteine nach Fusion mit bestimmten Signalpeptiden (z. B. OmpA, PelB, PhoA, MalE) in das Periplasma sekretiert werden. Mit dem Abspalten des N-terminalen Signalpeptids verschwindet zugleich die bakterienspezifische Aminosäure Formylmethionin aus dem sekretierten Proteinprodukt. Proteine mit einem TAT-Signalpeptid (z. B. aus TorA, Tap) werden über das TAT-System (twin arginine translocation) in das Periplasma sekretiert. Dieses könnte höhere Ausbeuten liefern, da hier nur gefaltete Proteine in das Periplasma transportiert werden. Für Proteine mit komplexen Disulfidbrücken, die sich erst im oxidativeren Milieu des Periplasmas effektiv ausbilden können, ist eher das sec-system zur Sekretion geeignet. Durch niedrige Expressionstemperaturen (20-30 C) und eine geringe Expressionsinduktion werden die intrazelluläre Ablagerung der Proteine verringert und die Sekretion in das Periplasma gefördert. Die Co- oder Überexpression von Chaperonen (z. B. SurA, FkpA, Skp) und Disulfidisomerasen (DsbC, D) fördert die korrekte Proteinfaltung und Ausbildung der Disulfidbrücken, während eine periplasmatische Degradation mit Protease-defizienten E. coli- Stämmen (DegP, OmpT, Protease III, Tsp ) verringert werden kann. Die äußere Membran Gram-negativer Bakterien verhindert auch bei periplasmatischer Expression eine effiziente Sekretion in das Medium, weshalb die Bakterien vollständig oder partiell lysiert werden müssen. Das alpha-hämolysin-(hly)-transporter-system erlaubt den direkten Transport rekombinanter Proteine durch beide Membranschichten in das Medium. Eine derartige Proteinsekretion kann auch durch Verwendung zellwanddefizienter Stämme und L-Formen erhöht werden. Ausbeuten von mehreren g/l des Blutgerinnungshemmers Hirudin (alpha- Cyclodextringlykosyltransferase-Signalpeptid) wurden in einer E. coli-sekretionsmutante mit löchriger äußerer Membran erreicht. Gram-positive Bakterien Gram-positive Bakterien, wie Bacillus subtilis, B. brevis und B. megaterium stellen wegen des Fehlens einer äußeren Membran ein interessantes Produktionssystem dar, das In der heterologen stellen Hefen ein Bindeglied zwischen prokaryotischen und eukaryotischen Insekten- und Säugerzell-Expressionssystemen dar. Denn die industriell relevanten Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris und Hansenula polymorpha vereinen kurze Generationszeiten, geringe Medienansprüche und posttranslationale Modifikationen des eukaryotischen Faltungs- und Sekretionsapparates. Zwar ist S. cerevisiae die genetisch am besten charakterisierte Hefe, P. pastoris erreicht aber, u.a. durch eine effizientere Sekretion, wesentlich höhere Expressionsraten beim Tetanus-Toxin-Fragment C ergaben sich für die methylotrophe Hefe P. pastoris 12g/L, für S. cerevisiae dagegen nur 1g/L. Zur Expression heterologer cdna in P. pastoris wird diese gezielt in den AOX1-Lokus des Hefegenoms integriert. Damit nutzt man den extrem starken starken Promotor des Alkohol-Oxidase-Gens AOX1 (Abb. 1). Kommerzielle Vektorsysteme (z.b. Easy- Select TM, Invitrogen) erlauben eine intrazelluläre sowie sekretorische. Als Sekretionssignal wird meist das alphamating factor -Sekretionssignal von S. cerevisiae verwendet. Die Wahl der Signalsequenz beeinflußt die Sekretionseffizienz sowie das Ausmaß der Glykosylierung und ist von entscheidender Bedeutung für die Proteinausbeute, Qualität und Funktionalität. Im Vergleich zu S. cerevisiae (z.t. mehr als

3 Intro Wirtschaft Wissenschaft Politik Strukturen Special Verbände Service Extro 49 Tab. 1: Beispiele für Ausbeuten rekombinanter Proteine in verschiedenen Wirtsorganismen Wirtsorganismus Protein Ausbeute Quelle E.Coli Alkaline Phosphatase 5,2 g/l Choi et al Mannosemoleküle pro Seitenkette) weist P. pastoris eine deutlich geringere Hyperglykosylierung auf. Die pharmakologische Verwendung rekombinanter Proteine aus Hefen ist wegen des verglichen mit Humanproteinen abweichenden Glykosylierungsmusters begrenzt. Derzeit wird versucht die Hefe- Glykosylierung zu humanisieren. Vorteilhaft für die Aufreinigung der rekombinanten Proteine wirkt sich die geringe Zahl sekretierter Hefeproteine bei P. pastoris aus. Die Bandbreite der erfolgreich exprimierten Proteine reicht von Zytokinen und Rezeptoren bis zu Antikörpern. Momentan wird einzig rekombinantes Trypsin industriell mit P. pastoris hergestellt. Grund für deren geringe Verbreitung sind höhere Produktionskosten für explosionsgeschützte Anlagen sowie eine fehlende Zulassung für den Bereich der Lebensmitteltechnik durch die FDA. Filamentöse Pilze Humanes EGF 325 mg/l Sivakesava et al B. Brevis scfv-antikörper 10 mg/l Shiroza et al Fab-Antikörper 100 mg/l Inoue et al Humans IL mg/l Takimura et al B. Subtilis Staphylokinase 337 mg/l Ye et al scfv-antikörper 15 mg/l Wu et al 2002 Proinsulin 1g/l Olmos-Soto et al P. Pastoris Murines Kollagen 15 g/l Werten et al TNF 10 g/l Streekrishna et al scfv-antikörper 100 mg/l Ridder et al A. niger t-pa 25 mg/l Wiebe et al IgG-Antikörper 900 mg/l Ward et al Insektenzellen Humane MMP9 300 mg/l George et al CHO-Zellen t-pa 50 mg/l Wurm, F.M IgG-Antikörper 4,7 g/l Wurm, F.M Tabak GFP 4 g/kg Marillonet et al Kartoffel Hepatitis B Antigen 16 mg/kg Richter et al Verschiedenste Produkte wie Antibiotika, Enzyme, organische Säuren, Lebensmittel und Polysaccharide werden industriell mit Hilfe filamentöser Pilze produziert. Dabei haben sich zwei Arten der Gattung Aspergillus (A. niger und A. oryzae) durchgesetzt. Am Beispiel der Glukoamylase wurde gezeigt, daß Aspergillus im Submersverfahren eigene homologe Proteine hocheffizient sekretieren kann. Das macht Aspergillus interessant als Wirtsorganismus zur Herstellung heterologer Proteine. Insbesondere die Fähigkeit filamentöser Pilze (z. B. Trichoderma) zur effizienten Exkretion, kann genutzt werden, um rentable Prozesse zu entwickeln. In Aspergillus findet eine effiziente Glykosylierung statt, die aber vom Muster humaner Proteine abweicht. Intra- und extrazelluläre Proteaseaktivitiät ist ein wesentliches Problem bei der Produktion heterologer Proteine in Aspergillus, es wurden jedoch Erfolge mit proteasedefizienten Stämmen erzielt. Drei Arten von Aspergillus (A. niger, A. oryzae und A. nidulans) wurden bisher als Wirtsorganismen für die Produktion heterologer Proteine eingesetzt. Obwohl A. nidulans physiologisch und genetisch am besten charakterisiert ist, eignet sich A. niger besonders für die industrielle Produktion. Zur Expression werden Expressionskassetten ortsgerichtet und stabil in das Genom der Wirtszelle integriert. Effiziente Expression kann erzielt werden, indem das heterologe Protein als Fusion an Glukoamylase produziert wird. Zwischen das heterologe Protein und Glukoamylase kann eine Spaltsequenz (meist Kex2-Seite) zur Abtrennung des Glukoamylaseanteils eingefügt werden, so daß natives heterologes Protein in das Medium ausgeschleust werden kann (Abb. 2) In Aspergillus sind indes auch pharmazeutisch relevante Moleküle hergestellt worden. Der Tissue Plasminogen Activator t-pa ließ sich mit Ausbeuten von 12 bis 25 mg/l produzieren, humanes Interleukin-6 mit bis zu 5mg/l, daneben verschiedene rekombinante Antikörperfragmente unter anderem eine IgG-Expression von bis zu 900 mg/l. Insektenzellen Die Proteinproduktion mit Hilfe insektenzellspezifischer Baculoviren als Vektoren findet vor allem in F&E immer weitere Verbreitung. Zwar wurde gezeigt, daß die Viren unter be-

4 50 Intro Wirtschaft Wissenschaft Politik Strukturen Special Verbände Service Extro stimmten Umständen in vitro auch in Zellinien aus Säugetieren eindringen können, dort aber keine Gene exprimieren, was besondere Sicherheitsmaßnahmen überflüssig macht. Das gewünschte Gen wird in einen Transfervektor kloniert und über ein Rekombinationsereignis in das Virengenom integriert. Mit den rekombinanten Viren werden Zellen der Insektenzellinien Sf-9 und Sf-21 aus Spodoptera frugiperda oder High Five Abb. 2: Produktion eines IgG-Antikörpers in A. niger. Der IgG-Antikörper wird als Glukoamylase-Fusionsprotein exprimiert. Der Glukoamylase-Anteil wird während der Prozessierung im Golgi-Apperat proteolytisch entfernt, so daß nativer IgG-Antikörper entsteht. aus Trichoplusia ni infiziert. Die starken baculoviralen Polyhedrin- oder p10-promotoren ermöglichen eine Ausbeute von 10mg/L bis 300 mg/l. Die Expression läuft für ca. 96 Stunden, danach lysieren die Insektenzellen. Zu optimierende Parameter für eine Expression sind vor allem das eingesetzte Verhältnis von Viren zu Zellen und die Expressionsdauer. Die hohe Produktausbeute ist eine der großen Stärken des Systems. Die Proteinfaltung ist verläßlich, Sekretion in das Medium möglich. Das Muster der posttranslationalen Modifikationen ähnelt zudem stark den Mammalia-Produkten, die Glykosylierung erreicht allerdings nicht deren Komplexität. Virale Proteasen und die Lyse der Produktionszellen erfordern häufig den Einsatz von Protease-Inhibitoren. Die starke Beanspruchung des Insektenzellmetabolismus durch die viralen Promotoren kann zu einer Mischung von unterschiedlich stark posttranslational modifizierten Produkten führen. Es werden aber Zellinien und Virenstämme entwickelt, die etwa Protease-defizient sind oder Gene für Glykosyltransferasen tragen, die das Glykosylierungsmuster angleichen. Säugerzellen Trotz hoher Produktionskosten stammen derzeit 60% bis 70% aller rekombinanten Proteinpharmazeutika aus Säugerzellproduktion. Hauptgrund sind die für die Proteinfunktion essentiellen posttranslationalen Modifikationen, die in den verwendeten Zellinien weitgehend denen des Menschen entsprechen. Zur Erzeugung stabiler Transfektanten kommen meist CHO-, BHK-, NS- 0- oder Per.C6 TM -Zellen zum Einsatz, wobei Per.C6 TM -Zellen wegen ihres humanen Ursprungs das am wenigsten immunogene Glykosylierungsmuster aufweisen. Der Transfer der heterologen Expressionskassette in das Genom der Wirtszelle zur Erzeugung stabil transfizierter Zellklone für Produktionsprozesse kann prinzipiell auf dreierlei Arten erfolgen: zufällige Integration, gerichtete Integration durch homologe Rekombination oder gerichtete Integration durch heterologe Rekombinationsenzyme (Cre, Flp) und deren Erkennungssequenzen. Da die homologe Rekombination in Säugerzellen ein sehr seltenes Ereignis ist, finden Cre- oder Flp-Rekombinase-basierte Systeme vermehrt Anwendung. Vorteilhaft bei Strategien, die auf gerichteter Integration beruhen, ist vor allem die Möglichkeit, Einfluß auf die genomische Integrationsstelle und die Kopienzahl des Transgens zu nehmen beide Faktoren beeinflussen maßgeblich die Produktionsrate und die Stabilität der Expressionsklone. Die Art der verwendeten genetischen Elemente des Expressionsvektors scheint eine untergeordnete Rolle zu spielen, in der Regel kommen starke virale (z.b. CMVie) oder zelluläre (z.b. EF1) Promotoren zum Einsatz. Es hat sich gezeigt, daß eine effiziente Translation in Säugerzellen vom Splicing der mrna abhängt, weshalb die verwendeten Expressionskassetten meist mindestens ein Intron enthalten. Des weiteren wird in Einzelfällen durch Optimierung des Codon Usage des zu exprimierenden Gens eine Steigerung der Produktionsrate erzielt. Genetisch modifizierte internal ribosomal entry sites (IRES), wie Hyper-IRES, erlauben auch in Säugerzellen eine effiziente multicistronische Produktion von multimeren Proteinen. Seit t-pa (Genentech) erstmals in CHO- Zellen produziert wurde, haben sich die Ausbeuten rasant erhöht. Waren es 1986 noch 50 mg/l, so sind es heute bis zu 4,7 g/ L. Der Hauptanteil der Ertragssteigerungen ist auf verbesserte Prozeßtechnik und damit verbundene höhere Zelldichten (bis zu 10 Mio. Zellen/mL) während der Fermentation sowie eine längere Fermentationsdauer zurückzuführen. Die spezifischen Produktionsraten pro Zelle haben sich im gleichen Zeitraum weniger deutlich erhöht (von 10 auf 90 pg/zelle/tag). Die Steigerung der spezifischen Produktionsraten beruht unter anderem auf zunehmender Automatisierung und hohem Durchsatz bei Selektion und Identifikation hochexprimierender stabil transfizierter Zellklone. Bei der Säugerzellproduktion für Forschungszwecke kommen vermehrt transiente Expressionssysteme zum Einsatz, um die zeitaufwendige Selektion von Einzelklonen zu umgehen. Hier haben sich insbesondere Derivate der HEK293-Zellinie (HEK293T und HEK293-EBNA) bewährt, welche zur episomalen Replikation geeigneter Plasmidvektoren fähig sind. Bei Transfektionen in größerem Maßstab (bis zu 20 L) liegen die erzielten Produktionsraten bei etwa 10 mg/l. Transgene Pflanzen Mit steigendem Bedarf an pharmazeutisch relevanten Proteinen bietet die Produktion von rekombinanten Proteinen in Pflanzen eine Alternative zur Produktion in tierischer Zellkultur. Im Vergleich zu in Hybridoma produzierten IgA-Antikörpern betragen die kalkulierten Kosten 1 bis 10%, wobei davon der größte Kostenanteil auf die Aufreinigung des rekombinanten Proteins entfällt. Die Generierung der transgenen Pflanzen erfolgt mittels Transformation mit Agrobacterium tumefaciens. Das gene of interest wird hierfür in ein Ti-Plasmid zwischen left und right border zwei 25 Bplange non perfect repeats hinter einen Promototer wie CaMV35S kloniert. Die in E.coli klonierten Plasmide werden in Agrobakterien übertragen, um meist Tabak oder Mais zu transformieren. Die Integration erfolgt mittels nicht-homologer Rekombination in das Pflanzengenom. Die transformierten Zellen werden über eine Resistenz, meist Basta oder Hygromycin, selektiert und komplette Pflanzen regeneriert. Eine oft bei Monokotyledonen eingesetzte Methode ist die Transformation mittels Particle Gun. Tabak- und Mais-Pflanzen exprimieren u.a. Aprotinin, Hepatitis-B-Vakzin und Trypsin, Liposomal Acid Lipase und Papillomavirus-Vakzin sowie Kollagen, Lactoferrin und IgA-Antikörper. Weiterhin werden Kartoffeln, Raps, Lein- und Erbsensamen für die

5 Intro Wirtschaft Wissenschaft Politik Strukturen Special Verbände Service Extro 51 Produktion von Antikörpern eingesetzt, während die Firma Biolex etwa Antikörper und Interferon-alpha in Wasserlinsen produziert. Eine Alternative zur Integration des gene of interest in das Pflanzengenom, ist die Integration in das Chloroplastengenom. Dies bringt einige Vorteile: Durch die Genkopienzahl kann eine erhöhte Expressionsrate erreicht werden und eine Auskreuzung der transgenen Pflanzen über Pollenflug verhindert werden. Transgene Pflanzen stellen vor allem mit Blick auf die Produktionskosten eine interessante Alternative dar. Es gilt aber zu bedenken, daß die Aufarbeitung des Produktes aus pflanzlicher Rohmasse gegebenenfalls aufwendiger und kostenintensiver als bei Biofermentationen ist. Des weiteren ist der Anbau transgener Pflanzen zumindest in Deutschland ein Politikum. Fazit Neben den in Produktionsprozessen bisher dominanten Systemen, E. coli und Säugerzellen, haben sich in der Forschung insbesondere P. pastoris und Insektenzellen etabliert. P. pastoris bietet aufgrund kurzer Generationszeiten, enorm hoher Produktionsraten und einfacher Erzeugung stabiler Transformanten sehr viel Potential für Produktionsprozesse. Bestimmte komplexere, multimere Proteine, wie etwa IgG-Antikörper, konnten bisher allerdings nicht funktionell in P. pastoris produziert werden. Insektenzellen dagegen sind in der Lage, auch diese Proteine funktionell zu exprimieren, und mit Hilfe transgener Zellinien kann sogar ein humanähnliches Glykosylierungsmuster erzeugt werden. Entwicklungsbedarf besteht hier vor allem im Bereich der Prozeßtechnik und der Erzeugung stabiler Linien, da bisher weitgehend nur transiente Expressionen Anwendung finden. Gram-positive Bakterien und filamentöse Pilze sind aufgrund ihrer leistungfähigen Sekretionsapparate prädestiniert für Produktionsprozesse und sind als Produktionsorganismen teilweise schon in der Nahrungsmittelindustrie etabliert. Die Nutzung zur heterologen Expression rekombinanter Biopharmazeutika befindet sich hier aber noch im Entwicklungsstadium. Transgene Pflanzen stellen vor allem im Hinblick auf Produktionskosten eine interessante Alternative dar. Es gilt aber zu bedenken, daß die Aufarbeitung des Produktes aus pflanzlicher Rohmasse gegebenenfalls aufwendiger und kostenintensiver als bei Biofermentationen ist. Des weiteren ist der Anbau transgener Pflanzen in Deutschland politisch umstritten. Auch die etablierten E. coli und Säugerzellsysteme beinhalten weiteres Entwicklunspotential. Im Falle von E. coli liegt dieses vor allem in verbesserten Faltungs- und Sekretionseigschaften genetisch modifizierter Stämme, um das Repertoire an Proteinen zu erweitern, die funktionell in E. coli exprimiert werden können. Im Bereich der Säugerzellproduktion bieten Rekombinationssysteme die Möglichkeit definierte genomische Intergationsstellen zu verwenden, wodurch Dauer, Aufwand und Kosten der Generierung stabiler Linien reduziert werden. Bei Proteinen, die komplexe posttranslationelle Modifikationen für ihre Funktion benötigen, sind Säugerzellen nach wie vor erste Wahl und bei den Zelldichten, die im Fermantationsprozess erziehlt werden, sind weitere Steigerungen zu erwarten. Trotz großer Fortschritte in der biotechnologischen Herstellung rekombinanter Proteine, ist die Produktion von Biopharmazeutika nach wie vor signifikant teurer, als die von chemischen Wirkstoffen. Dies wird zwar teilweise durch niedrigere Entwicklungskosten kompensiert, schlägt sich aber dennoch in höheren Marktpreisen biopharmazeutischer Produkte nieder. In Anbetracht der großen Zahl therapeutischer Proteine in klinischer Entwicklung besteht dringender Bedarf, die Kosten zu reduzieren und entsprechende Therapien für die Gesundheitssysteme tragbar zu machen. echnology GmbH