PLS-Toolbox zur Automatisierung von Bioreaktoren 1
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- Margarete Schenck
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1 PLS-Toolbox zur Automatisierung von Bioreaktoren 1 (Bioreactor Control Toolbox for DCS) Dr.-Ing. Bernd-Markus Pfeiffer, Dipl-Ing. Herbert Grieb, Dipl-Ing. Jan Rougoor, Siemens AG Karlsruhe Kurzfassung Bioreaktoren zur Fermentation stellen spezielle Anforderungen an die Automatisierungstechnik, die sich deutlich von üblichen Funktionen für die chemische Verfahrenstechnik unterscheiden. Bisher wurden solche Automatisierungsfunktionen applikationsspezifisch jedes Mal neu entwickelt. Bestimmte Funktionen sind jedoch wiederverwendbar und relativ breit einsetzbar. Solche Funktionen werden in einer sog. "Bioreactor Control Toolbox" für ein Prozessleitsystem zusammengestellt. Die Methoden und Verfahren zur Steuerung und Prozessführung von Bioprozessen werden übernommen von erfahrenen Biotechnologen, erprobt in Produktionsprozessen und aufbereitet für Nicht- Biotechnologen. Sie können damit im Rahmen eines Prozessleitsystems mit geringem Engineering-Aufwand für viele verschiedene Bioprozesse angewendet werden. Die Toolbox enthält Funktionen zur Basis-Automatisierung, Soft-Sensoren, Advanced Control und Überwachungs-Funktionen. Abstract Fermentations in bioreactors rise specific challenges for automation technology - requirements that are different from typical automation functions for chemical process engineering. In the past, such automation functions have been individually developed from scratch for each application. However there are functions that can be re-used and applied to a wide range of bioprocesses. These functions are being integrated into a bioreactor control toolbox of a distributed process control system. Methods and solutions for automation and control of bioprocesses are adopted from biotechnology experts, tested in production processes and prepared for non-biologists. They can be applied to many different bioprocesses with little engineering effort inside a DCS. The functions included in the toolbox 1 VDI-Kongress Automation 2011, Baden-Baden. VDI-Berichte 2143
2 comprise basic control functions, softsensing methodologies, advanced control schemes and monitoring capabilities. Einführung Der Anteil biotechnologischer Verfahren zur Herstellung pharmazeutischer und chemischer Produkte steigt von Jahr zu Jahr, je nach Branche auf Werte zwischen 5 und 50% [1.]. Bei Produkten wie z.b. Riboflavin (Vitamin B) hat sich beispielsweise herausgestellt, dass die Biosynthese sehr viel weniger Energie verbraucht als die konventionelle Produktion mit chemischen Verfahren. Innerhalb der Biotechnologie werden verschiedene Sparten unterschieden. Die "Weiße Biotechnologie" dient der industriellen Herstellung von Produkten mit biotechnologischen Verfahren, wobei Mikroorganismen oder Zellen benutzt werden, die das gewünschte Produkt von Natur aus erzeugen. Typische Zielbranchen sind die Feinchemie oder die Lebensmitteltechnologie. Ziel der "Roten Biotechnologie" ist es dagegen, mittels Eingriff in das Genom von Mikroorganismen bestimmte Arzneimittel herzustellen oder DNA Sequenzen und Proteine für die Diagnostik zu gewinnen, also Produkte, die die Zelle von Natur aus nicht herstellen würde, und die der Pharma-Branche zugeordnet werden. Der zentrale Verfahrensschritt bei den meisten Bioprozessen ist die Fermentation. Der Begriff ist vom lateinischen Wortstamm für "Gärung" abgeleitet und bezeichnet die Umsetzung biologischer Materialien mit Hilfe von Bakterien, Pilz- oder Zellkulturen (tierischer oder pflanzlicher Zellen) oder Enzymen [5.]. Vor der Fermentation gibt es ggf. Anzuchtphasen für Zellkulturen, und danach im Rahmen des "downstream processing" verschiedene Verfahrensschritte wie sie aus der konventionellen Verfahrenstechnik bekannt sind, z.b. Zentrifugation, Mikrofiltration oder Kristallisation. Bioreaktoren zur Fermentation stellen spezielle Anforderungen an die Automatisierungstechnik, die sich deutlich von üblichen Funktionen für die chemische Verfahrenstechnik unterscheiden. Bisher werden solche speziellen Automatisierungsfunktionen üblicherweise applikationsspezifisch und manuell jedes Mal neu entwickelt. Bestimmte Funktionen sind jedoch wiederverwendbar und relativ breit einsetzbar. Solche Funktionen werden in einer sog. "Bioreactor Control Toolbox" zusammengestellt. Die Methoden und Verfahren zur Steuerung und Prozessführung von Bioprozessen werden übernommen von erfahrenen Biotechnologen, erprobt in Produktionsprozessen und aufbereitet für Nicht-Biotechnologen.
3 Sie können damit im Rahmen eines Prozessleitsystems mit geringem Engineering-Aufwand für viele verschiedene Bioprozesse angewendet werden. Bild 1 Die "Bioreactor Control Toolbox" als Werkzeugkasten zur Automatisierung von Bioprozessen Die Toolbox enthält eine Sammlung von Bibliotheks-Funktionen: Softsensoren für Bioprozesse Spezielle Regelungsstrategien für Bioprozesse Überwachungsfunktionen (Monitoring) Batch-Rezepte und Grundfunktionen Zur Toolbox gehört auch eine Infrastruktur zur Kopplung der Methoden: einheitliche Namen, kompatible Einheiten, gleiche Struktur, gemeinsame Ablaufumgebung, definierte Voraussetzungen und Schnittstellen. Zur Anwendung der Toolbox wird eine Grundausstattung an Sensoren für physikalische Messwerte (Temperatur, Druck, Füllstand, Masse, Zulaufmengen) und chemische Messwerte (ph-wert, Partialdruck Sauerstoff in der Brühe) vorausgesetzt. Spezielle Biosensoren sind nicht erforderlich, da die Soft-Sensorik auf einer Abgasmessung (Konzentration von Sauerstoff und Kohlendioxid) aufsetzt. Softsensoren für Bioprozesse Trotz intensiver Forschungsaktivitäten auf dem Gebiet der Biosensorik ist die Messung biologischer Größen immer noch ein kritisches Thema bei der Führung von Bioprozessen. Ein wesentlicher Bestandteil der Bioreactor Control Toolbox sind daher Soft-Sensoren zur Berechnung bestimmter Größen, die für die Prozessführung von entscheidender Bedeutung
4 sind, für die aber (noch) keine hinreichend genauen, preisgünstigen, robusten, online-fähigen Messgeräte zur Verfügung stehen. Kohlendioxid-Produktionsrate und Sauerstoff-Aufnahmerate Die Kohlendioxid-Produktionsrate beim Stoffwechsel und die Sauerstoff-Aufnahme sind ein Maß für den Stoffumsatz von aeroben Organismen. Sie werden in Softsensoren mit Hilfe von Massenbilanzen für CO 2 und Sauerstoff berechnet. Als Eingangsvariablen dienen die CO 2 - und Sauerstoff-Konzentration im Abgas, die Luftzufuhr und die Masse der Brühe. Die Raten werden jeweils in drei Formen ausgegeben: bezogen auf die Masse, absolut und kumuliert über die Chargendauer. Biomasse und Produktionsrate Die Biomassenkonzentration, die Wachstumsrate und die Produktionsrate sind die entscheidenden Größen zur Steuerung von Wachstum und Ausbeute. Als Eingangsgrößen für diese Softsensoren dienen die über die Chargendauer kumulierten Werte für Kohlendioxid-Produktionsrate, Sauerstoff-Aufnahme, Basenzufuhr (wegen ph-wert- Regelung), Glukose-Zufuhr (Nährstoff) und Masse der Brühe. Bei der Anwendung dieser Soft-Sensoren muss zwischen zwei Arten von Prozess-Kinetik unterschieden werden. Wenn die Produktbildung mit dem primären Stoffwechsel energetisch gekoppelt ist und mit dem Zellwachstum einhergeht, spricht man von wachstumsassoziierter Produktbildung (Typ I). Dabei ist die Reaktionsstöchiometrie, also die Umsatzkoeffizienten (Yields, beschrieben das Verhältnis eines Endstoffs zum Einsatzstoff), während dieser Phase weitestgehend konstant. Im Gegensatz dazu werden die Produkte bei Typ II erst nach der eigentlichen Wachstumsphase erzeugt, zum Beispiel durch Zugabe eines Präkursors (Vorläuferstoff für die Biotransformation), Auftreten einer Limitation im Medium oder durch Änderung von Prozessparametern. In dieser Phase kann die Biomasse als Katalysator oder Produzent angesehen werden und die Reaktionsstöchiometrie kann sich ständig mit der Zeit ändern. Aufgrund der zeitvarianten Umsatzkoeffizienten werden bei Prozessen mit Typ II Kinetik künstliche neuronale Netze als Soft-Sensoren verwendet, die mit historischen Prozessdaten trainiert werden und daher bei repetitiven Produktionsprozessen die unbekannten Zusammenhänge erlernen können. Als Ausgangsgrößen der Softsensoren stehen zur Verfügung: die aktuelle Biomassenkonzentration, die absolute Biomasse (durch Multiplikation der Konzentration mit der Masse der Brühe), die Wachstumsrate als zeitliche
5 Ableitung der Biomasse, die aktuelle Produktmenge im Fermenter sowie die Produktionsrate als deren zeitliche Ableitung. Spezielle Regelungsstrategien für Bioprozesse Für die Regelung physikalischer Größen im Fermenter werden standardmäßige PID-Regler mit speziellen Zusatzfunktionen ergänzt. Für die Biomasse kommt eine Trajektorienregelung zum Einsatz. Temperaturregelung und ph-wert-regelung Für die Regelung von Temperatur und ph-wert kommen PID-Regler mit einem Split-Range Ausgang für Heizen/Kühlen bzw. Zufuhr von Säure/Base zum Einsatz. Bei Laborprozessen mit schaltenden Binär-Ventilen wird eine Puls-Breiten-Modulation mit integrierter Split- Range-Funktionalität eingesetzt. Sowohl die Erwärmung des Fermenters als auch die Säurebildung beim Gärprozess hängen von der aktuellen Stoffwechselrate ab. Daher kommt für beide PID-Regler eine arbeitspunktabhängige Parametersteuerung ("gain-scheduling") zum Einsatz, wobei in Abhängigkeit der aktuellen CO 2 -Produktionsrate die zu diesem Arbeitspunkt passenden Reglerparameter-Sätze geladen werden, und zwischen den Arbeitspunkten linear interpoliert. Sauerstoff-Regelung Als Messgröße für den Sauerstoffgehalt in der Brühe dient der Partialdruck O 2. Der Sauerstoffgehalt in der Brühe kann sowohl durch die Einblasung von Luft oder Sauerstoff, als auch durch Veränderung der Rührerdrehzahl oder Druck-Beaufschlagung beeinflusst werden. Der Rührer soll sich immer drehen und es soll permanent Frischluft zugeführt werden. Zur Schonung der lebenden Zellen im Reaktor darf jedoch nicht zu stark gerührt werden und auch nicht zu viel Luft eingeblasen werden. Es stehen also an einem Fermenter bis zu vier verschiedene Stellgrößen zur Verfügung, die jedoch nur einen eng beschränkten Stellbereich aufweisen, und von denen typischerweise nur zwei aktiv verändert werden, während die anderen konstant gehalten werden. Für diese Aufgabenstellung wird ein sog. Split-Controller-Paar eingesetzt. Der Ansatz besteht darin, für beide veränderbaren Stellglieder einen separaten PID-Regler vorzusehen, wobei beide mit derselben Regelgröße beaufschlagt werden und denselben Wirkungssinn haben. Beide Regler sind permanent mit ihrem Stellglied verbunden. Durch die Vorgabe entsprechender Stellgrößenbegrenzungen wird sichergestellt, dass beide Stellglieder nicht
6 ganz abgeschaltet werden. Die Begrenzungen können variabel sein, abhängig vom Verlauf des Prozesses oder bestimmt durch ökonomische Gesichtspunkte. Die Sauerstoffregelung arbeitet in Kombination mit einer Antischaum-Funktion. Falls diese Funktion gerade Antischaum-Mittel zudosiert, muss die Sauerstoffregelung vorübergehend eingefroren werden. Trajektorienregelung der Biomasse Die entscheidende Größe für die Prozessführung eines Fermenters ist die Biomasse. Ein bestimmter, von Biologen geplanter Verlauf des Bakterienwachstums, d.h. eine Trajektorie der Biomasse über der Zeit, soll im Sinne eines "Golden Batch" bei jeder Charge reproduziert werden. Ein dazu passender zeitlicher Verlauf der Zufütterung von Nährlösung (Feed-Trajektorie) wird ebenfalls vorab geplant. Eine Trajektorienregelung [4.] der Biomasse greift bei kleinen Abweichungen vom geplanten Verlauf der Biomasse über kleine Korrekturen der Feedmenge ein.
7 Bild 2: Biomasse-Trajektorien-Regelung (TCCPR: Total Cumulative Carbon Production Rate = kumulierte CO 2 -Produktionsrate) Als Ersatzregelgröße für die Biomasse dient die kumulierte CO 2 -Produktionsrate, die aus der Abgasmessung abgeleitet wird. Der Stelleingriff erfolgt in einer Kaskadenschaltung durch Vorgabe von Sollwerten für den unterlagerten Feed-Regler. Dabei wird der Feed-Sollwert aus der Trajektoriendatei mit einem Faktor multipliziert, der um den Wert 1 herum variiert. Der Biomassen-Regler generiert eine Stellgröße zwischen -0.5 und 0.5. Diese Stellgröße plus 1 ist der Faktor zur Manipulation des Feed-Sollwerts. Wenn die geplante Trajektorie für die Biomasse genau getroffen wird, ist die Regelabweichung null und der Faktor ist gleich 1.
8 Bild 3: Reale Messdaten der Trajektorienregelung [2.] zeigen die gute Reproduzierbarkeit bei vier verschiedenen Chargen der Produktion rekombinanter Proteine auf E. coli Überwachungsfunktionen (Monitoring) Mengenzähler ("Totalizer"): Die Zuflüsse von Säure, Lauge, Antischaum-Mittel und Glukose werden über der Zeit aufsummiert um kumulierte Werte für jede Charge zu berechnen. Massenbilanzen für die Gesamtmasse und einzelne chemische Elemente wie z.b. Kohlenstoff können zur Überwachung von Messgeräten oder Soft-Sensoren verwendet werden. Batch-Rezepte und Grundfunktionen Die Fermentation wird als Fed-Batch-Prozess gefahren. Die "Equipment Modules" als Grundelemente zur Erstellung von Rezepten lassen sich weitgehend vereinheitlichen und wiederverwenden.
9 Bild 4: Beispielhaftes Steuerrezept für eine Fermentation in SIMATIC Batch Jedes Rezept besteht aus einer Vorbereitungsphase, in der die geforderten Reaktionsbedingungen (Druck, Temperatur, Sauerstoffgehalt und ph-wert) im Fermenter nacheinander aufgebaut werden, und der eigentlichen Fermentation, in der verschiedene Grundfunktionen (Regelungsfunktionen, Feedsteuerung, Überwachungsfunktionen etc.) zeitlich parallel ablaufen. Dazu gibt es noch eine Funktion für die automatisierte Sterilisation des Fermenters. Für die Erstellung eines Chargenprotokolls werden die standardmäßigen Mittel von SIMATIC Batch verwendet.
10 Solution Template zur Anwendung der Bioreactor Control Toolbox Bild 5: Bedienoberfläche für Fermenter auf SIMATIC PCS 7 Operator Station Eine SIMATIC PCS 7 Musterlösung zeigt die Anwendung der Bioreactor Control Toolbox beispielhaft anhand der Produktion rekombinanter Proteine auf E. coli. Zum Zweck der Vorführung und Einarbeitung ist die reale Automatisierungslösung mit einer einfachen Prozess-Simulation gekoppelt. Status Als Anwendungsbereich der Toolbox steht derzeit die Fermentation aerober Mikroorganismen in der roten und weißen Biotechnologie in repetitiven Produktionsprozessen im Fokus. Die ersten Erprobungen laufen bei der Produktion rekombinanter Proteine mit E.coli-Bakterien. Eine Ausweitung des Einsatzbereiches in Richtung anaerobe Fermentation und Tierzellkulturen ist in Arbeit. Die Toolbox wurde entwickelt in Zusammenarbeit mit der Martin-Luther-Universität Halle [2.] und der technischen Universität Wien [3.]. Das beschriebene Konzept wurde im Vorfeld im
11 Prozessleitsystem SIMATIC PCS 7 implementiert und steht für interessierte Pilotkunden zur Verfügung. Literaturhinweise [1.] Dechema Positionspapier Weiße Biotechnologie: Chancen für Deutschland [2.] Kurpijanov, A., Schaepe, S., Sieblist, C., Gnoth, S., Simutis, R., Lübbert, A.: Variability Control in Fermentations - Meeting the Challenges Raised by the FDA's PAT Initiative. BIOforum Europe, 9/2008. [3.] Wechselberger, P., Seifert, A., Herwig, Ch.: PAT method to gather bioprocess parameters in real-time using simple input variables and first principle relationships. Chemical Engineering Science 65 (2010), S [4.] Pfeiffer, B-M.: PID-Regelung von Batch-Prozessen entlang vorab optimierter Trajektorien Studien am Chylla-Haase Reaktor-Benchmark. atp 4/2003, S [5.] Wikipedia: Fermentation.
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