Kursus Medizinische Physik SS 2007

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1 Kursus Medizinische Physik SS 2007 Ablaufplan: Dienstag, 19. Juni (Vormittag): Vorlesung: Massenspektrometrische Lipidanalytik Dienstag, 19. Juni (Nachmittag): Praktikum: Lipidanalytik mittels MS und TLC Mittwoch, 20. Juni: Vorlesung: Knorpel und rheumatische Erkrankungen Mittwoch / Donnerstag, 21. Juni: Kohlenhydrat-Analytik mittels MALDI-TOF MS Donnerstag 21. Juni / Freitag, 22. Juni: Auswertung & Abschlußdiskussion

2 Kursus Medizinische Physik SS 2007 Teil A: "Massenspektrometrische Lipidanalytik" PD Dr. Jürgen Schiller Universität Leipzig, Medizinische Fakultät Institut für Medizinische Physik und Biophysik

3 Kursus Medizinische Physik SS 2007 Teil A: "Massenspektrometrische Lipidanalytik" PD Dr. rer. nat. habil. Jürgen Schiller Universität Leipzig, Medizinische Fakultät Institut für Medizinische Physik und Biophysik Härtelstraße 16-18, D Leipzig Tel.: Fax: Gliederung: o Warum Lipide? o Was sind Lipide? o Was ist "MS"? o Welche Ionisationsverfahren gibt es? o Anwendung von MALDI auf Lipide

4 Molekulare Organisation des "Lebens" Die Chemie ist letztlich für die physikalischen bzw. biomedizinischen Eigenschaften lebender Organismen verantwortlich!

5 "Lipide" sind ganz generell unpolare Moleküle, die mit organischen Lösungsmitteln aus biologischen Proben isoliert werden können Organisches Lösungsmittel Vortexen Organische Phase Wäßrige Phase Denaturierte Proteine Debris Entfernen des Lösungsmittels Wäßrige Probe Gängige Lösungsmittelgemische: Zentrifugation Organische Phase Trockener Lipidfilm a) CHCl 3 : CH 3 OH = 2:1 ("Folch") b) CHCl 3 : CH 3 OH = 1:1 ("Bligh & Dyer") c) Hexan : Isopropanol = 3:2 ("Hara")

6 Natürlich vorkommende Fettsäuren Natürliche Fettsäuren: Gesättigte Säuren: CH 3 -(CH 2 ) n -COOH gerades n; 2 < n < 20 (selten: 22 und 24) haben durchwegs Trivialnamen! Typisch: Stearinsäure CH 3 -(CH 2 ) 16 -COOH Ungesättigte Fettsäuren: Ölsäure Linolsäure Linolensäure Arachidonsäure Bei der "ω"-nomenklatur wird von der Methylgruppe aus gezählt! ω -3-Fettsäuren!

7 Wichtige physiologisch-relevante Fettsäuren (Der Gehalt an Doppelbindungen bestimmt den Schmelzpunkt) a) Gesättigte Fettsäuren (SAFA) Palmitinsäure mp: C Stearinsäure mp: 69.4 C b) Ein- und zweifach ungesättigte Fettsäuren Ölsäure mp: 4 C Linolsäure mp: -12 C c) Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA) Linolensäure mp: C Arachidonsäure mp: C

8 Einfache Fette und Wachse Fette sind Ester des Glycerins mit Fettsäuren: O R C O CH 2 O R C O CH O R C O CH 2 Wachse sind Ester von Fettsäuren mit langkettigen Alkoholen oder Cholesterin Allgemeine Definition von "Fetten": Mit organischen Lösungsmitteln (z.b. CHCl 3 ) aus Gewebe extrahierbar!

9 a) Neutrale Phospholipide Lipide sind strukturell sehr vielseitig... b) Saure Phospholipide c) Normale "Fette"

10 Arachidonsäurekaskade Arachidonsäure COX-Inhibitor! Oxygenierungen und Folgereaktionen Prostaglandin PGF2a Bei Entzündungen kein Schweinefleisch (viel AA)! Prostacyclin PGI2 Thromboxan B 2 Prostaglandine: Schmerzempfinden, Blutdruck, Steuerungsfaktoren in der Reproduktionsbiochemie, Thrombosehemmung Thromboxane: Plättchenaggregation Leukotriene: Beteiligung an Entzündungsprozessen, Allergieerscheinungen Acetylsalicylsäure hemmt das Enzym Cyclooxygenase, das die Oxygenierung der Arachidonsäure katalysiert! Thromboxan A 2 Leukotrien (LTD4)

11 Klassische Methoden der Lipidanalytik "Wir werden vielleicht nie erfahren, was unsere Fischvorfahren bewogen hat, aus dem Wasser zu steigen." David Attenborough, Naturforscher

12 (Phospho)-Lipidanalytik: Der erste Schritt Die Extraktion der unpolaren Bestandteile: Organisches Lösungsmittel Vortexen Organische Phase Wäßrige Phase Denaturierte Proteine Debris Entfernen des Lösungsmittels Wäßrige Probe Gängige Lösungsmittelgemische: Zentrifugation Organische Phase Trockener Lipidfilm a) CHCl 3 : CH 3 OH = 2:1 ("Folch") b) CHCl 3 : CH 3 OH = 1:1 ("Bligh & Dyer") c) Hexan : Isopropanol = 3:2 ("Hara")

13 (Phospho)-Lipidanalytik: Quantitative Aspekte 1. Trennung des Gemisches mittels HPLC oder TLC "Auskratzen" des (oder der) interessanten Spots Phosphat- Bestimmung Eluieren mit organischen Lösungsmitteln "Veraschen" Probleme dieser Methodik: a) Umständlich! b) Relativ zeitaufwendig! c) Nur für Phospholipide, aber nicht für Lipide geeignet! d) Recht störanfällig (Phosphat kommt ubiquitär vor!)

14 Nachteile der Routine-Verfahren a) Dünnschichtchromatographie (TLC) Für fast alle PL-Klassen einsetzbar, aber... o Sehr ähnliche Lipidklassen kaum zu trennen o Schlecht zu quantifizieren o Kaum zu koppeln mit anderen Techniken (?) b) Flüssigkeitschromatographie (HPLC) o Vergleichbar mit der TLC hinsichtlich Möglichkeiten und Grenzen o Schwer zu quantifizieren o Zeitaufwendig c) GC/MS Gaschromatographie & Massenspektrometrie Information über die Fettsäurepositionen geht verloren! Hydrolyse & Derivatisierung erforderlich! Bessere Verfahren zur Lipidanalytik??

15 Was genau ist eigentlich Massenspektrometrie? Die Massenspektrometrie ist ein Analysenverfahren zur Bestimmung von chemischen Elementen, Molekülmassen und Massenfragmenten. Für einen Analyten wird die Häufigkeit, mit der geladene Moleküle (Ionen) und deren Massenfragmente auftreten, bestimmt. Die Massenspektrometrie ist eine wichtige Methode der analytischen Chemie für die Aufklärung der Struktur und Zusammensetzung von Verbindungen und Gemischen. Der qualitative und quantitative Nachweis sehr kleiner Substanzmengen ist möglich. In der Physik werden Massenspektrometer verwendet, um die Isotopenzusammensetzungen der chemischen Elemente zu messen.

16 Kurze Geschichte der Massenspektrometrie 1906: Sir J. J. Thomson, Nobelpreis:...in recognition of the great merits of his theoretical and experimental investigations on the conduction of electricity by gases. : Die Massenspektrometrie war geboren : Francis W. Aston, Nobelpreis: Verbesserung der Massenauflösung und Untersuchung unterschiedlicher Isotope 1944: Trennung von Uran-Isotopen ( 235 U und 238 U) und Isolierung von Plutonium (ca. 1 ng) zur Herstellung von Kernwaffen 1946: W. E. Stephen entwickelt das erste TOF ( time-of-flight ) Massenspektrometer Neue Ionisationsverfahren: 1953: Field ionization durch Erwin W. Müller 1965: Chemical Ionization 1978: MS-MS-Kopplung 1981: Fast Atom Bombardment (FAB) 1982: ESI -MS-Entwicklung durch Fenn 1985: MALDI-Entwicklung durch Karas & Hillenkamp in Deutschland (Uni Münster) bzw. Tanaka (Shimadzu, Japan) Nobelpreis 2002

17 Prinzip der "klassischen" Massenspektrometrie mit "Elektronen-Stoßanregung" (EI) Prinzip: Probe wird durch Elektronenstoß ionisiert. Die gebildeten Ionen werden in einem Magnetfeld nach ihrem m/z-verhältnis getrennt! Grundgleichung: m z = r B 2 U 2 2 m, Masse z, Ladungszahl r, Radius der Kreisbahn B, Stärke des Magnetfelds U, Beschleunigungsspannung Anforderungen an die Substanz: Relativ hohe Flüchtigkeit! Stabilität der gebildeten Ionen! Elektronenstoß muß zur Ionisation führen! MALDI ermöglicht auch die Analytik anderer, polarerer und schwerer flüchtiger Substanzen

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19 Problem: Bei "EI" sind die Molekül-Ionen oft nur mit geringer Intensität nachweisbar! Fragmente haben eine viel höhere Intensität! Was ist m/z = 43??

20 "Soft-Ionization"-Techniken ermöglichen in fast allen Fällen die Detektion des intakten Molekülions a) Matrix-assisted laser desorption and ionization ("MALDI") b) Electrospray c) Chemical Ionization (CI) d) Fast atom bombardment (veraltet!) o Alle genannten Verfahren führen zur Bildung von Ionen! o Im Gegensatz zu "EI" enstehen bei diesen Verfahren aber in der Regel keine Radikalkationen! o Die enstehenden Ionen (z.b. beim MALDI) sind "quasimolekulare Ionen", d.h. ihr Molekulargewicht stimmt nicht mit dem "richtigen Molekulargewicht überein, z.b. M + H + (in aller Regel sind diese Verfahren schlechet qunatitativ auswertbar, da die Ionenaffinitäten je nach Substanzklasse unterschiedlich ist!).

21 Prinzip des "Electrospray"-(ESI)-MS Vorteile: o "Weiche" Ionisierungsmethode, die Molekulargewichtsinformationen in Form von "Quasimolekularionen", wie [M+H] +, [M+Na] + oder [M+K] + liefert o Geeignet zur Analyse von großen, polaren Bio-Polymeren o Wenig oder gar keine Fragmentierung sichtbar o On-line Kopplung zur Flüssigchromatographie (z.b. HPLC) möglich Nachteile: o Oft mehrfach geladene Ionen o Starker Einfluß von Verunreinigungen o Stark unterschiedliche Ionenausbeuten

22 Im Jahre 2002 wurde der Nobelpreis für Chemie unter vier Analytiker aufgeteilt John B. Fenn Koichi Tanaka Kurt Wüthrich ESI-MS MALDI-MS BIO-NMR

23 Manche hätten den MALDI-Nobelpreis viel lieber in Deutschland gesehen Franz Hillenkamp (Uni Münster) & Michael Karas (jetzt Uni Frankfurt) Und das ist unser Konkurrenzinstitut an der Uni Münster!

24 MALDI : Matrix-assisted laser desorption & ionization Probenplatte +20 kv hν AH + Laser U variabel U fest 1. Die Probe (A) wird mit einem Überschuß an Matrix (M) gemischt und dann auf der Probenplatte getrocknet 2. Die Laserstrahlung verdampft die Matrix (und führt zur Ionenbildung) 3. Die Probe (A) wird durch (in erster Linie) H + -Übertragung von der Matrix kationisiert: MH + + A M + AH +. Bei EI-Ionisation entstehen stattdessen Radikalkationen!

25 Prinzip der MALDI-TOF Massenspektrometrie Probenplatte Stickstoff-Laser (337 nm) Gitter "time-of-flight" (ohne Feld) Schwere Ionen Leichte Ionen Hochspannung TOF = s TOF m 2 E z kin Masse/Ladung (m/z) Aufgaben der Matrix: 1. Absorption der Laser-Energie (Absorption im UV) 2. Unterdrückung der Aggregation des Analyten 3. Ionisation und Desorption des Analyten (????) Targets

26 Ein paar typische Werte zum MALDI-Prozess - I

27 Ein paar typische Werte zum MALDI-Prozess - II

28 Schematischer Aufbau eines modernen MALDI-TOF Massenspektrometers Target Extractions - gitter Dämpfung Prisma Laser Ionen- Selektor Reflektor Detector Reflektor Linear Detektor Kamera Pumpe Pumpe

29 Definition der Auflösung an Massenspektrometern Auflösung (Resolution, R) = M / m M / 2 FWHM Unser Gerät bietet eine Auflösung von ca , d.h. Ionen mit m/z = 800 und m/z = können noch getrennt werden (Reflektor-Modus)!

30 Was bedeutet Delayed Extraction bzw. Energy-Lag-Focusing? Problem: Ursache: Die einzelnen Peaks in den MALDI-TOF Spektren sind aus Gründen der Meßtechnik verbreitert ( unbefriedigende Massenauflösung). Am Target erzeugte Ionen mit der gleichen Masse haben nicht die gleiche Anfangsgeschwindigkeit (wegen unterschiedlicher Energieabsorption bei der Laseranregung) Probe + Matrix auf der Probenplatte Ionen mit gleichem m, aber unterschiedlicher v Gleiche Ionen würden zu unterschiedlichen Zeiten am Detektor ankommen!

31 Delayed Extraction verbessert die Auflösung! 0 V Ionen mit der gleichen Masse aber unterschiedlichem v 0 A: Kein elektrisches Feld. Ionen wandern auseinander. 0 V 20 kv V B: Feld (Gradient) wird angelegt. Langsame Ionen stärker beschleunigt 20 kv C: Langsame und schnelle Ionen werden fokusiert V

32 Beispiel I: Positiv-Ionen MALDI-TOF MS von humanem Serumalbumin (geht nicht recht gut!) M M Masse (m/z) M Es funktioniert, aber: Nur schlecht zu reproduzieren! Salze stören sehr stark! Eingeschränkte Anwendbarkeit! Außerdem: Ausgangslösung muß recht "dick" sein: 1 µl auftragen MG = 100 kda 100 µg/ml 100 ng 1 pmol

33 Welche Substanzklasse kann ich empfehlen? Kleine, unpolare Moleküle (MG bis ca. 4 kda) in organischen Lsm (Lipide, Phospholipide) +++ Peptide Polarität, Molekulargewicht Oligosaccharide (Neutral) Oligosaccharide (Negativ-geladen) Moleküle kleiner als ca. 450 Da --- Große, polare Moleküle (Molekulargewichtsverteilung) Große, polare Moleküle (Definiertes MG)

34 Wie sich MALDI in den letzten Jahren entwickelte Jahr des Erscheinens Anzahl der Publikationen

35 Was in der Regel mit MALDI gemacht wird Protein ODER Peptide ODER Proteomics DNA ODER RNA ODER Nucleic Acid ODER Genomics Polymere Kohlenhydrate ODER Saccharide ODER Gluco- ODER Glyco Anzahl der Publikationen 14 Oel ODER Lipid ODER Phospholipid Niedermolekulare Verbindungen

36 DHB ist eine sehr gute Matrix für Lipide und ergibt sehr gut reproduzierbare Spektren COOH OH DHB & PC gut in org. Lsm. löslich DHB + PC HO DHB Sehr homogene Mischkristall-Bildung H 3 CO HO OCH 3 CH CH COOH Sinapinsäure ist sehr üblich in der Proteinanalytik: Dort stört die höhere Tendenz dieser Matrix zu "Photochemie" aber weit weniger (höhere MG!). Sinapinsäure

37 In den MALDI-Spektren gibt es typische Massendifferenzen Isotop Atomgewicht Alle Isotope Weitere stabile Isotope (nat. Vorkommen in %) 1 H H (0.015) = 3 8 = C 14 N 16 O 23 Na 31 P 39 K C (1.110), 14 C (0.001) 15 N (0.366) 17 O (0038), 18 O (0.200) K (0.012), 41 K (6.73) = 1 6 Die Differenzen = 16, 22 und 38 sollte man sich gut merken!

38 Einige ausgewählte MALDI-Spektren * DPPS-Na-Salz MG = Die positiv-ionen-spektren sind i.a. schwerer zu deuten! DPPE MG = DPPC MG = Masse [m/z]

39 Phosphatidylcholine zeigen eine ausgeprägte Abhängigkeit vom Molekulargewicht Positiv-Ionen MALDI-TOF Massenspektren eines Gemisches unterschiedlicher PCs (2 4:0-2 14:0), jeweils 1 mg/ml: 2 4: : Intensität nimmt ab!! 2 8: : : Na + +Na : Na + +Na + +Na+ +Na Masse [m/z]

40 Die Detektion von Phospholipiden hängt von ihrer Ladung ab...und PC stört HO OH OH O CH O C O P O CH 2 O OH O OH CH 2 O PI O C R R O 300 O P O O OH OH OH OH O O P O O PIP P O P O OH OH OH O O P O O PIP 2 Signal/Rauschen Nachweisgrenze [pmol] PC PI PI PIP PIP 2 7 Ladungen 3 PIP PL auf der Platte [pmol] Phospholipid-Spezies Unser neues Gerät ist um ca. eine Größenordnung sensitiver!

41 Anwendung I: Reinheitsüberprüfung kommerziell verfügbarer Phospholipide Beispiel: Oxidativer Abbau von PC mit einem Linolsäure-Rest (18:2) Je nach Fettsäurerest (Lage der Doppelbindungen ) existieren unterschiedliche Sollbruchstellen, die zu ganz charakteristischen Massendifferenzen führen!

42 Anwendung II: Bestimmung von Enzymaktivitäten und - teilweise - Fremdaktivitäten Produkt: LPC Zunehmende CEase-Aktivität * Substrat 1: Chol-Ester * Substrat 2: PC Masse [m/z]

43 Anwendung III: Bestimmung der PL-Zusammensetzung von Hühner-Eigelb Ungefähre Zusammensetzung... Vorteile: o Bequem zu bekommen o In großen Mengen verfügbar o Quelle für eine Vielzahl von Phospholipide, aber in ganz verschiedenen Mengen

44 Anwendung III: Bestimmung der PL-Zusammensetzung von Hühner-Eigelb u.a. Euer Job in unserem Praktikum Morgen!