ECC. -- β-aktin GLUT1 GLUT2 GLUT3 GLUT4 GLUT8

Transkript

1 3 Ergebnisse Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von auf embryonale Stamm- und Karzinomzellen und die Expression der Glukosetransporter-Isoformen untersucht. Dabei wurden 2 Zelllinien verwendet, die D3-ESC und die P19-EC-Zellen. Die ES-Zellen sind fähig, in ektodermale, endodermale und mesodermale Zellen zu differenzieren. In der frühen Phase der spontanen Differenzierung der ESC als embryoid bodies sind die Differenzierungsprozesse mit der frühen Embryonalentwicklung vergleichbar. ES-Zellen brauchen für das Wachstum eine feeder layer Zellschicht. Um toxikologische Effekte auf die feeder layer Zellen und somit indirekte Effekte auf die ESC auszuschließen, wurden die toxikologischen Studien mit an den P19-ECC durchgeführt. P19-ECC können durch Zugabe von Mediensupplementen in myogene und neuronale Zelltypen differenziert werden. 3.1 Charakterisierung von D3-ESC und P19-ECC bezüglich der Expression von Glukosetransportern Um einen Überblick über die Ausstattung der beiden Zelllinien mit GLUT und deren Expression während der spontanen Differenzierung (D3) und kardiomyogenen Differenzierung (P19) zu erhalten, wurden die Transkripte von GLUT1, 2, 3, 4, 8 durch RT- PCR detektiert (vgl. Abb. 14). In undifferenzierten D3-ES-Zellen sind die Isoformen 1, 3 und 8 konstitutiv exprimiert. GLUT4 konnte nach 2 Tagen Kultur, GLUT2 erst ab einer 15 tägiger EB-Kultur nachgewiesen werden. Die GLUT4-Transkriptmenge nimmt während der EB- Differenzierung zu, während die Menge an GLUT3 in 20 Tage alten D3-EBs verringert war. In undifferenzierten P19-EC-Zellen und während der myogenen Differenzierung sind GLUT1, 3, 4, 8 konstitutiv exprimiert. Das Transkript für GLUT2 konnte nicht nachgewiesen werden. Beide Zelllinien zeigen ähnliche Expressionsmuster für GLUT1, 2, 3 und 8, nicht jedoch für GLUT4. A ES ESC D3 EB 2d 6d 9d 15d 20d M L -- β-aktin B ECC ECC P19 EB 2d 5d 5+5d -- β-aktin GLUT1 GLUT2 GLUT3 GLUT4 GLUT8 GLUT1 GLUT2 GLUT3 GLUT4 GLUT8 Abb. 14: RT-PCR-Analyse der GLUT-Expression in D3 (A) und P19 (B)-Zellen Die Expression der Glukosetransporter (GLUT) 1, 2, 3, 4 und 8 wurde in D3-ES-Zellen und EBs nach 2, 6, 9, 15, 20 Tagen (d) Kultur (A), in P19-EC-Zellen (ECC) und myogen differenzierten EBs bestimmt (B). Als Positivkontrollen wurden die cdna aus Muskel (M) bzw. Leber (L) mitgeführt. ES= embryonale Stammzellen, ECC= embryonale Karzinomzellen, d=kultivierungsdauer in Tagen, --=Wasserkontrolle 46

2 3.1.1 Detektion von GLUT4 im Western Blot 3 Ergebnisse Die Transkriptmenge von GLUT4 steigt während der EB-Differenzierung an. Diese Zunahme konnte auch auf der Proteinebene durch Western Blot-Analyse bestätigt werden. Eine spezifische GLUT4-Bande wurde bei 45kD detektiert. Die Bandenintensität nimmt von 2 Tagen Kultur bis 15 Tagen Kultur zu. In undifferenzierten D3-Zellen ist kein Protein nachweisbar. ES EB 2d 6d 9d 15d 20 M 45kD Abb. 15: Detektion von GLUT4 im Western Blot Die Proteinproben (30µg) von undifferenzierten D3-Zellen (ES) und 2, 6, 9, 15 und 20 Tage (d) kultivierten EBs wurden mit dem spezifischen monoklonalen Antikörper anti-glut4 (DPC Biermann) im Western Blot detektiert. Als Referenz wurde Muskelgewebe aus der Maus (M) aufgetragen. ES= embryonale Stammzellen, d= Kultivierungsdauer in Tagen, M= Muskelprotein Lokalisation der GLUT in D3-EBs mittels IHC Spontan differenzierende EBs wie auch myogen und neuronal differenzierte ES-Zellen wurden immunhistochemisch auf die Lokalisation von GLUT1, 2, 3 und 4 untersucht. Die myogen differenzierten EBs wurden zur Lokalisation des GLUT4, die neuronalen für den sog. brain type GLUT3 verwendet. Um zu bestimmen, welcher Zelltyp einen bestimmten Glukosetransporter exprimiert, wurden Doppelfärbungen mit spezifischen Zellmarkern für a) undifferenzierte Zellen mit dem Stage Specific Embryonic Antigen (SSEA-1), b) endodermale Zellen mit Zytokeratin 18, 19, c) myogene mit Desmin und d) neuronale Zellen mit Nestin durchgeführt GLUT1-Lokalisation in spontan differenzierten D3-EBs In EBs nach 2d-20d Kultur ist das GLUT1-Protein in der Membran der Zellen lokalisiert (vgl. Abb. 16). Ab Tag 15 und Tag 20 konnten Zellpopulationen nachgewiesen werden, die GLUT1-negativ sind. Gleichzeitig verändert sich in 20 Tage kultivierten EBs die membranständige in eine zytoplasmatische Lokalisation (vgl. Abb. 16). Die GLUT1 + -Zellen liegen innerhalb des EBs, eine Orientierung zur Oberfläche oder Polarisation in der GLUT1- Verteilung war nicht zu erkennen GLUT2-Lokalisation in spontan differenzierten D3-EBs Übereinstimmend mit dem Nachweis der Transkripte ist das GLUT2-Protein nur in 15d und 20d kultivierten EBs nachweisbar (vgl. Abb. 16). Dabei ist GLUT2 im Zytoplasma und in der Membran einiger weniger Zellen lokalisiert. In der Doppelfärbung von GLUT2 mit GLUT4 ergeben sich Zellpopulationen die sowohl GLUT2 als auch GLUT4 (GLUT2 + /GLUT4 + ) oder 47

3 nur GLUT2- (GLUT2 + /GLUT4 -- ) oder GLUT4-Färbung (GLUT2 -- /GLUT4 + ) aufweisen (vgl. Abb. 21 C). Die GLUT2 + -Zellen ordnen sich in Zellgruppen im Inneren der EBs an. 2d 9d 15d 20d GLUT1 GLUT1 GLUT1 GLUT1 GLUT2 GLUT2 GLUT2 GLUT2 Abb. 16: Lokalisation von GLUT1- und GLUT2-Protein in spontan differenzierenden EBs Verteilung des GLUT1- und GLUT2-Proteins in spontan differenzierten EBs von 2 bis 20 Tagen (d) Kulturdauer. Die Lokalisation der GLUT Isoformen innerhalb der Zellen ist in einer höheren Vergrößerung in der rechten Ecke dargestellt. GLUT1 ist in 2d EBs nur membranständig ( ), in 20d kultivierten EBs membranständig und zytoplasmatisch lokalisiert (). Die Kerne sind blau mit Hoechst gegengefärbt. Maßstab 50µm, in den kleineren Ausschnitten 20µm GLUT3-Lokalisation in spontan differenzierten D3-EBs Der Glukosetransporter 3 ist in der Zellmembran von ES- und EB-Zellen lokalisiert (vgl. Abb. 17 A-D). Während der EB-Kultur kommt es zur Abnahme der GLUT3 + -Zellen. In 20 Tage alten EBs konnte kein GLUT3-Protein mehr detektiert werden (vgl. Abb. 17 D). Der Mangel an GLUT3-Protein in 20d EBs korreliert mit der geringen Transkriptmenge in der RT-PCR-Analyse (vgl. Abb. 14). Die GLUT3 + -Zellen liegen im EB 2d im äußeren Bereich, bei 9d sogar auffällig in den äußeren 2-3 Zelllagen des EBs. Die Randzellen zeigen eine starke, apikale (zur Oberfläche des EBs gerichtete) GLUT3-Markierung (vgl. Abb. 17 A, 19 K). Die starke Färbung von GLUT3 in der apikalen Membran deutet auf eine Funktion dieses Transporters für den Glukoseinflux in den EB durch die äußere Zellmembran hin (vgl. Abb. 17 B). Um den GLUT3 + Zelltyp näher zu charakterisieren, wurden Kolokalisationen mit SSEA-1, Zytokeratin 18 (CK18), Zytokeratin 19 (CK19), Desmin und Nestin in spontan und neuronal differenzierten EBs durchgeführt (vgl. Abb. 19). GLUT3 ist hauptsächlich in undifferenzierten inneren Zellen der EBs (SSEA-1 + /GLUT3 + ) und in der äußeren Zellschicht früher EBs exprimiert. Die Randzellen im 9d EB werden als endodermal-like cells (ELC) bezeichnet und sind durch SSEA-1 --, CK18 +, CK19 + markiert. 48

4 A 2d B 9d C 15d D 20d Abb. 17: GLUT3-Proteinlokalisation in spontan differenzierenden EBs Lokalisation von GLUT3 (grün) in Schnitten von spontan differenzierten EBs nach 2 bis 20 Tagen (d) Kultur. Die Kerne sind mit Hoechst blau gegengefärbt. Maßstab 20µm. Durch Doppelmarkierung von GLUT3 mit SSEA1 (vgl. Abb. 19 A-C), CK18 (vgl. Abb. 19 D-F) und mit CK19 (vgl. Abb. 19 G-I) lassen sich die ELC als GLUT3 + nachweisen. GLUT3 ist demnach einerseits mit der Entwicklung von ELC assoziiert. Weiterhin findet man vor allem in der Mitte der EBs auch GLUT3 + -Zellen mit SSEA-1 --, CK18 +, CK Markierung. Da GLUT3 in adulten Zellen der spezifische Transporter im neuronalen Gewebe ist, wurde auch Nestin, ein Protein von neuronalen Vorläuferzellen, in die Studie miteinbezogen. Während in spontan differenzierten EBs (2-20d) Nestin nicht detektierbar war, konnten in neuronal differenzierten EBs (5+3d) Nestin und GLUT3 kolokalisiert werden (vgl. Abb. 19 B, M-O). In 5+3d alten EBs waren alle GLUT3 positiven Zellen auch Nestin positiv. Wie Nestin war auch das filamentöse Muskelprotein Desmin nicht in spontan differenzierten EBs detektierbar (2d-20d) (vgl. Abb. 19 B, J-L). Als Antikörperkontrolle wurde die IHC auch auf Gewebeschnitten vom Intestinum durchgeführt (vgl. Abb. 19 B, L) GLUT4-Lokalisation in spontan differenzierten D3-EBs GLUT4 ist in 2-20d EBs mit zunehmender Kulturdauer nachweisbar (vgl. Abb. 18 A-D). Das Protein ist in EBs nach 2d Kultur (vgl. Abb. 18 A) hauptsächlich in den äußeren Zellen lokalisiert, während an Tag 9-20 ein Großteil der Zellen GLUT4-positiv ist. Das GLUT4- Protein befindet sich hauptsächlich im Zellkern (vgl. Abb. 20 D-F). A 2d B 9d C 15d D 20d Abb. 18: GLUT4-Protein in spontan differenzierten EBs Lokalisation des GLUT4-Proteins (rot) in EBs nach 2 bis 20 Tagen (d) Kultur. Die Kerne sind mit Hoechst blau gefärbt. Maßstab 20µm. 49

5 3 Ergebnisse B A C SSEA-1 SSEA-1/GLUT3 D SSEA-1/GLUT3 SSEA-1/GLUT3 F E CK18 CK18/GLUT3 G CK18/GLUT3 CK18/GLUT3 I H CK19 CK19/GLUT3 CK19/GLUT3 K L CK19/GLUT3 J Desmin Desmin/GLUT3 Desmin/GLUT3 M N Desmin O Nestin Nestin/GLUT3 Nestin/GLUT3 Nestin/GLUT3 Abb. 19: Kolokalisation des GLUT3-Protein mit zellspezifischen Markern Doppelfärbung von GLUT3 mit verschiedenen Zellmarkern. A-C: GLUT3 und SSEA-1 in 6d EBs D-F: GLUT3 und CK18 in 9d EBs G-I: GLUT3 und CK19 in 9d EBs, J-L: GLUT3 und Desmin in 9d EBs und L Maus Jejunum als Positivkontrolle für Desmin L M-O: GLUT3 und Nestin in 9d EBs M, N und 3+5d neuronal differenzierte Zellen O. Negativkontrollen sind als kleinere Bilder in der rechten Ecke dargestellt. Maßstab 50µm. 50

6 A B C 6d GLUT4 SSEA-1 GLUT4/SSEA-1 D E F 9d GLUT4 20 HOECHST GLUT4/HOECHST G H I 20d GLUT4 HOECHST GLUT4/HOECHST J K L 5+5d plated EB GLUT4 Desmin GLUT4/Desmin 20µm Abb. 20: Zellspezifische Lokalisation von GLUT4 und Kolokalisation mit zelltypspezifischen Markern in spontan differenzierten und plattierten EBs Doppelfärbung von GLUT4 (rote Fluoreszenz) mit SSEA-1 (braun) (A-C). Zelluläre Lokalisation von GLUT4 im Kern von 9d (D-F) und 20d (G-I) EBs, Membranlokalisation in 20d (G-I) und 5+5d plattierten (J-L) EBs. Die Negativkontrollen sind in der rechten Ecke dargestellt. Maßstab 20µm. Durch Kolokalisation mit SSEA-1 und Desmin wurde die zelluläre Lokalisation näher untersucht (vgl. Abb. 20). SSEA-1 + -Zellen sind nicht GLUT4 positiv (vgl. Abb. 20 A-C), d.h. GLUT4 ist nicht in undifferenzierten Zellen vorhanden. Die erste Membranlokalisation von GLUT4 ist in späten EBs (20d) nachweisbar (vgl. Abb. 20 G-I), wo GLUT4 in der apikalen Membran der äußeren EB-Zellen (zum Medium gerichtet) lokalisiert ist. Um die ungewöhnliche nukleäre Lage des GLUT4 (vgl. Abb. 20 D-F) zu verifizieren, wurden zusätzlich plattierte EBs (5+5d) untersucht, die myogene Zelltypen enthielten. GLUT4 wurde 51

7 in diesen Zellen nach gleichem Protokoll detektiert und mit dem myogenen Marker Desmin kolokalisiert. Auch in den myogen-differenzierten EB-Zellen (Desmin + /GLUT4 + ) war GLUT4 nachweisbar, wobei die zelluläre Lage auf die Zellmembran und das Zytoplasma beschränkt war (vgl. Abb. 20 J-L). Die Expression von GLUT4 wurde mit GLUT1 und GLUT2 im 20d kultivierten EB kolokalisiert (vgl. Abb. 21). In den äußeren Zellen des EBs, in denen sich GLUT4 in der Zellmembran befindet, liegt GLUT1 im Zytoplasma (vgl. Abb. 21 A, B), wobei in den inneren Zellen GLUT4 weiterhin im Zellkern liegt. Die Transporterisoform 2, die erst in 20 Tage alten EBs nachweisbar wird (vgl. Abb. 21 C), befindet sich dort im Zytoplasma und der Membran von innenliegenden Zellklustern (vgl. Abb. 21 D). Die GLUT2 positiven Zellen können als GLUT2 + /GLUT4 + und GLUT2 + /GLUT4 Zellen bestimmt werden. GLUT4 ist in GLUT2 + Zellen im Kern lokalisiert. A B 20d GLUT1/GLUT4/HOECHST GLUT1/GLUT4/HOECHST C D 20d GLUT2/GLUT4/HOECHST GLUT2/GLUT4/HOECHST Abb. 21: GLUT4 Kolokalisation mit GLUT1 und GLUT2 im 20d kultivierten EB Kolokalisation von GLUT4 (rot) mit GLUT1 (grün) (A; B) und GLUT2 (grün) (C-D). In A und C ist die Übersichtsaufnahme eines 20 Tage kultivierten EBs, in B und D ein vergrößerter Ausschnitt dargestellt. Die Kerne sind mit Hoechst blau gefärbt (A, B, C, G). Maßstab 20µm. 52

8 3.1.3 Einfluss der Glukosekonzentration auf die EB-Differenzierung 3 Ergebnisse Die Standard-Glukosekonzentration im Kulturmedium von EBs beträgt 4,5g/l. Um den Einfluss von Glukosemangel auf die Expression von GLUT zu untersuchen, wurde eine Minimalkultur (Glc -- ) mit 1g/l angesetzt. Bereits ein Vergleich der Morphologie der EBs bei einem Glukosegehalt von 1g/l im Medium zeigt deutliche Veränderungen gegenüber der normalen Struktur (vgl. Abb. 22). Da EBs eine Vielzahl verschiedener GLUT-Isoformen exprimieren stellte sich die Frage, welche GLUT durch Glukosemangel reguliert bzw. in der Expression verändert werden. Hierzu wurden die EBs für 4d, 6d, 8d in Glc -- -Medium kultiviert. Anschließend wurden die Transkriptmengen der GLUT-Gene und Oct-4 bestimmt sowie GLUT1, GLUT3 und GLUT4 mittels Immunfluoreszenz lokalisiert. Als Vergleich wurden immer die unter Normalbedingungen kultivierten EBs herangezogen Morphologie der EBs und SSEA-1-Präsentation unter Glc-Mangel Durch IHC wurde die Morphologie und der Anteil undifferenzierter SSEA-1 positiver Zellen in den unter Glc-Mangel kultivierten EBs mit der von Standard-EBs verglichen (vgl. Abb. 22). Die unter Glukosemangel kultivierten EBs waren insgesamt kleiner und bildeten artifizielle Höhlen, sog. cavities (vgl. Abb. 22 D, F). Der Gehalt an undifferenzierten SSEA Zellen war in EBs unter Glukosemangel deutlich erhöht (vgl. Abb. 22 E, B), was darauf hinweist, dass Glukosemangel ein verzögertes Wachstum und eine spätere Differenzierung zur Folge hat. A 4d 6d 8d C Standard Glc D F Niedrig Glc Abb. 22: Morphologie von EBs unter Glukosemangel und Expression von SSEA-1 A-C: EBs kultiviert in Standardglukose-Medium (25mM); D-F: mit Glukosemangelmedium (5mM). In der Immunhistochemie ist die Lokalisation von SSEA-1 in der Zellmembran der EBs dargestellt (braune Färbung). Die Kerne wurden mit Hämalaun blau gegengefärbt. Maßstab 30µm Transkription von Oct-4 unter Glukosemangel Oct-4 ist ein Transkriptionsfaktor, der in undifferenzierten embryonalen Stammzellen der Maus hoch exprimiert ist. Während der Differenzierung nimmt die Oct-4-Menge ab. Oct-4 und SSEA-1 sind Marker für undifferenzierte Zellen während der EB-Differenzierung. In EBs kultiviert unter Standard- und Glc-Mangelbedingungen wurde deshalb die Transkriptmenge 53

9 von Oct-4 mittels Real-time PCR quantifiziert (vgl. Abb. 23). In EBs kultiviert für 4 Tage unter Glukosemangel war die Oct-4 Transkriptmenge weniger verringert als in Standard-EBs (vgl. Abb. 23). In 6d und 8d kultivierten EBs ist keine signifikante Änderung in der Oct-4 Expression nachweisbar, was durch die niedrige Expression des Oct-4 in späteren Stadien der EBs bedingt sein könnte. 35 Oct-4 mrna-menge [% zur ES-Zellkontrolle] ,5g Standard-Glc 1g Glukosemangel Kultivierung in Tagen Abb. 23: Quantifizierung des Oct-4 mrna-gehaltes in EBs unter Standard-Glc (4,5g) und Glukosemangel (1g) Die mrna-expression von Oct-4 wurde mittels Real-time PCR quantifiziert (vgl. 2.11). Die Daten wurden relativ zu undifferenzierten ESC D3 berechnet. N=3, n=4-6, p<0, Expression von GLUT mrna und Protein in EB kultiviert unter Glukosemangel Die mrna-expression für GLUT 1, 3 und 4 wurde mittels kompetitiver PCR, für GLUT8 mittels semiquantitativer PCR bestimmt (vgl. Tab. 7; Abb. 24 A). Nach 4d EB- Differenzierung unter Glukosemangel kam es zu einer generellen Minimierung der Expression aller untersuchten GLUT-mRNA. Nach 6 und 8 Tagen wurden die Glukosetransporter 3 und 4 vermehrt exprimiert verglichen mit unter Standardbedingungen (25mM) kultivierten EBs. GLUT1 und GLUT8 zeigten keine signifikanten Änderungen in der mrna-menge. Die GLUT1-Proteinmenge und seine subzelluläre Lokalisation wird nicht durch Glukosemangel beeinflusst (vgl. Abb. 24 B). 54

10 Tab. 7: mrna Quantifizierung für GLUT1, 3, 4 und 8 unter Glukosemangel Relative RNA Mengen [% der Kontrolle] 4d 6d 8d GLUT1 47,53+9,26 99,45+1,18 126,84+10,69 2 GLUT3 74,98+30,22 187,25+23,18 172,13+52,69 GLUT4 44,96+5,09 193,725+37,13 355,16+42,88 2 GLUT8 50,86+8,75 93,51+28,57 105,38+52,69 N=2, n=2-3; p 0,001, 2 p 0,05 Signifikanz zu den EBs kultiviert mit 25mM Glc GLUT3 wurde mittels Immunfluoreszenz in der Zellmembran der inneren und äußeren Zellen des EBs lokalisiert (vgl. Abb. 24 B). Unter Glukosemangel kam es zu einem geringen Anstieg der Expression in den inneren EB-Zellen, was mit dem Anstieg der GLUT3-Transkriptmenge korreliert. Glukosemangel hat keinen sichtbaren Einfluss auf die Verteilung von GLUT3 in den EBs und auf seine membranständige Lokalisation. GLUT4 war in den untersuchten EB-Stadien hauptsächlich in den äußeren Zellen nachweisbar. In EBs unter Glukosemangel war das GLUT4-Fluoreszenzsignal deutlich stärker als in der Kontrolle (vgl. Abb. 24 B). Der Anstieg der Immunfluoreszenz korreliert mit dem Transkriptionsanstieg. Das zeigt, dass es unter Glukosemangel in EBs zu einer erhöhten Expression von GLUT4 vor allem in den äußeren Zellschichten kommt. 55

11 A B + relative mrna-menge [%] d 6d 8d 4d 6d 8d A B C GLUT1 GLUT3 GLUT4 GLUT8 GLUT1 - D E F GLUT3 + A B C D E F - A B C + GLUT4 D E F - Abb. 24: Einfluss von Glukosemangel auf die mrna- und Protein-Expression von GLUT1, 3 und 4 A Die Quantifizierung von GLUT1, 3 und 4 wurde mittels crt-pcr durchgeführt. EBs wurden über die gleiche Zeit in normalem (25mM) Glukosemedium kultiviert und als Kontrollen (100%) benutzt. N=2 n=2 Signifikanz: p<0.001; p<0.05. B A-C: EBs kultiviert in Standardglukose-Medium (25mM) (+); D-F: mit Glukosemangel-Medium (5mM) (-). A,D: 4d EB; B,E: 6d EB; C,F: 8d EB. Immunfluoreszenz mit anti-glut1 (grün), anti-glut3 (grün) und anti-glut4 (rot). Die Kerne sind bei GLUT1 und GLUT4 blau durch Hoechst-Färbung, bei GLUT3 rot durch 7-AAD-Färbung. Maßstab 50µm. 56

12 3.2 Einfluss von auf P19-ECC Wirkung von auf die Zellproliferation Die Einwirkung von auf die Zellproliferation von P19-ECC wurde nach dem mitochondrialen Toxizitätstest (MTT) bestimmt (vgl. 2.6, Abb. 25). Unbehandelte P19-Zellen haben eine Proliferationsrate von 100%. Abhängig von der -Konzentration ist bei hohen Konzentrationen (10-100nM) die Proliferation um ca. 10%, bei 1nM um 5% verringert. Im Gegensatz dazu nimmt die Proliferation der nur mit DMSO-behandelten Kontrollzellen um ca. 30%, abhängig von der zugeführten DMSO-Menge, zu. Bei DMSO Konzentration von 6,25x10-4 bzw. 6,25x10-3 %ig (entsprechend der Kontrollmenge bei 10nM und 100nM ) erhöht sich die Proliferation um 24% bzw. 31%. In Bezug auf die DMSO-Kontrollzellen wirkt proliferationshemmend (ca. 30% bei 10nM, 40% bei 100nM). Gegenüber unbehandelten P19-ECC ist die Abnahme durch bei der Proliferation nicht signifikant, wobei DMSO allein die Proliferation signifikant erhöht (vgl. Abb. 25). Zellproliferation [% der unbehandelten Kontrolle] ,1 nm 1 nm 10 nm 100 nm Konzentration 2 2 DMSO Abb. 25: Zellproliferation von P19-ECC unter Zugabe von P19-ECC wurden mit 0,1nM bis 100nM in DMSO und den entsprechenden DMSO-Kontrollen kultiviert und die Zellproliferation bestimmt (vgl. 2.6). Die Zellproliferation unbehandelter P19- Kontrollzellen wurden 100% gesetzt. n=8; p 0,05 Signifikanz zu P19; 2 p 0,001 Signifikanz zu DMSO Einfluss von auf die Apoptose von P19-ECC Der Einfluss von auf die Apoptose der P19-ECC wurde im Kaspase-3/7-Assay untersucht (vgl. 2.5.). Die Aktivität der Kaspasen wurde nach Zugabe von 0,1-100nM im Zellysat bestimmt, wobei die Kaspaseaktivität unbehandelter P19-ECC als 100% gesetzt wurde (vgl. Abb. 26). Bei niedrigen Konzentrationen von 0,1 und 1nM bewirkt eine Erhöhung der Kaspaseaktivität um 138% bzw. 124%. Mit hoher -Konzentration (10, 100nM) verringert sich die Aktivität um 29% (10nM ). Die Aktivität der Kaspasen 3 und 7 wird als Maß für die Apotoserate bewertet. Die Auswertung der Aktivitätsbestimmung zeigt, dass durch die Apoptose konzentrationsabhängig beeinflusst wird, während 57

13 DMSO allein keinen Einfluss hat. Bei geringen -Konzentration (0,1nM) kommt es zum Anstieg der Apoptoserate, während es unter höheren Konzentration (10-100nM) zu einer Verringerung der Apoptose kommt. Die Aktivität der Kaspasen der DMSO-Kontrollen ist nicht signifikant um ca % erhöht. wirkt auf P19-ECC zytotoxisch und beeinflusst die Apoptoserate. Kaspase 3/7-Aktivität [% zur unbehandeltent Kontrolle DMSO 0,1 nm 1 nm 10 nm 100 nm -Konzentration Abb. 26: Bestimmung der Kaspaseaktivität in P19-ECC P19-ECC wurden mit 0,1nM bis 100nM in DMSO und den entsprechenden DMSO-Kontrollen kultiviert und die Zellproliferation bestimmt (vgl. 2.5). Die Zellproliferation unbehandelter P19- Kontrollzellen wurden 100% gesetzt. N=1, n=3; p 0,05, 2 p 0,001 Signifikanz zu P19; p 0,05, 2 p 0,001 Signifikanz zu DMSO Wirkt in P19-ECC über die AhR-Signalkaskade? Um zu klären, ob die Wirkung von über den AhR in P19-Zellen vermittelt wird, wurde die AhR-Signalkaskade (vgl. Abb. 27) genauer analysiert. Dafür wurde untersucht: a) die mrna-expression des CYP1A1-Gens konzentrations- und zeitabhängig (vgl ) b) die mrna-expression des CYP1A1-Gens unter Inhibitorzugabe (vgl ) c) die Translokation des zytoplasmatischen AhR in den Kern (vgl ) d) die CYP1A1-Induktion durch die Aktivierung der XRE-Promotorregion (vgl ) Charakterisierung von D3-ESC und P19-ECC auf die Expression von AhR-Zielgenen Um einen Überblick über die Ausstattung der beiden Zelllinien mit AhR-Zielgenen und deren Expression während der spontanen Differenzierung (D3) und kardiomyogenen Differenzierung (P19) zu erhalten, wurden die Transkripte von AhR, ARNT, CYP1A1 und CYP1B1 durch RT-PCR detektiert. Alle Zielgene sind in beiden Zellinien konstitutiv exprimiert. Es gibt keine Unterschiede in D3- und P19-Zellen. Die CYP1B1-mRNA-Menge nimmt während der myogenen Differenzierung zu. Beide Zelllinien zeigen ähnliche Expressionsmuster. 58

14 AhR-Ligand - α NF AhR ARNT P + AhR Hsp90 Hsp90 + AhR Hsp90 Hsp90 AhR ARNT + P CYP1A1 Abb. 27: Schema der AhR-Signalkaskade ES ESC D3 EB 2d 6d 9d 15d 20d ECC P19 ECC EB -- 2d 5d 5+5d -- AhR AhR ARNT ARNT CYP1A1 CYP1B1 Abb. 28: RT-PCR-Analyse der AhR-Signalmoleküle in D3- und P19-Zellen Die Expression von AhR, ARNT, CYP1A1 und CYP1B1 wurde in D3-ES-Zellen und EBs nach 2, 6, 9, 15, 20 Tagen (d) Kultur und in P19-EC-Zellen (ECC) und kardiomyogener Differenzierung für 2, 5, 5+5 Tagen (d) bestimmt. ES= embryonale Stammzellen, ECC= embryonale Karzinomzellen, d=kultivierungsdauer in Tagen, --=Wasserkontrolle Konzentrations- und zeitabhängige Expression von CYP1A1 in P19-EC-Zellen unter -Zugabe Die Expression des AhR-Zielgens CYP1A1 wurde mittels Real-time PCR untersucht (vgl. Abb. 29). erhöht bei 1nM, 10nM und 100nM die CYP1A1 mrna-menge signifikant. Die Expression steigt bei 100nM um ca. das 85fache an (vgl. Abb. 29). Bereits ab 1nM erhöht sich die Transkriptmenge signifikant. CYP1A1-mRNA wird nach 2h Kultur mit konzentrationsabhängig induziert. Die Konzentration von 10nM wurde für die 59

15 nachfolgenden Experimente als Konzentrationsoptimum gewählt. 10nM ist eine übliche Konzentration, die auch in Studien anderer Zelllinien eingesetzt wird. CYP1A1 mrna-menge [rel. E.] P19 DMSO 0,1nM 1 nm 10 nm 100 nm Abb. 29: Relative mrna-menge von CYP1A1 in Abhängigkeit von der -Konzentration Durch Real-time PCR (vgl. 2.11) wurde die relative CYP1A1-mRNA-Menge nach 2 Stunden Inkubation mit 0,1; 1; 10 und 100nM quantifiziert. N=3 n=2; p 0,05 Signifikanz zu P19 Das Expressionsprofil der CYP1A1-Induktion durch wurde anhand einer Zeitreihe von 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 24h erstellt. Die CYP1A1-mRNA-Menge wurde mittels Real-time PCR in P19-EC-Zellen quantifiziert (vgl. 2.11). Die CYP1A1-Menge der behandelten Zellen wurde relativ zum CYP1A1-Gehalt unbehandelter P19-ECC (=1 rel. E.) berechnet (vgl. Abb. 30). Sie erhöht sich nach 10nM für 1 bis 3 Stunden mit einem Maximum (ca. 21,1facher Erhöhung) nach 2h. Der Anstieg der CYP1A1-Transkriptmenge durch verläuft damit sehr schnell. Nach 4h fällt die Transkriptmenge unter die der P19-Kontrolle ab und liegt somit unterhalb der konstitutiven CYP1A1-Expression der P19-Zellen. Ab 24h steigt die CYP1A1- Menge auf 1,55 rel. E. an. Die Induktion der CYP1A1-Transkriptmenge in P19-ECC ist abhängig von der Einwirkzeit und Konzentration des CYP1A1 mrna-menge [rel. E.] DMSO Zeit in Stunden [h] Abb. 30: Relative CYP1A1-Transkriptmenge nach 1 bis 24h in Kultur mit 10nM in P19-ECC Durch quantitative PCR (vgl. 2.11) wurde die CYP1A1 Menge unter Gabe von 10nM nach 1-24h Kulturdauer in P19-ECC bestimmt. N=3 n=2; p 0,05, 2 p 0,001 Signifikanz zu P19-ECC 60

16 Inhibierung des AhR mittels α-naphthoflavon α-naphthoflavon inhibiert die Translokation des AhR in den Kern und unterbindet dadurch die AhR-vermittelte Aktivierung der CYP1A1 mrna-synthese (vgl. Abb. 27). Durch Zugabe von α-naphthoflavon zu den P19-Zellen vor der Exposition mit und der anschließenden Bestimmung der CYP1A1-Expression kann bestimmt werden, ob die - Wirkung über den AhR-Signalweg erfolgt oder davon unabhängig ist (vgl. Abb. 27). 2h vor der Inkubation mit (10nM) wurde α-nf in Konzentrationen von 0,1-100µM in das Zellkulturmedium gegeben. Nach weiteren 2h wurde die mrna-menge von CYP1A1 mittels Real-time PCR bestimmt. Mit steigenden α-nf-konzentrationen kommt es zu einer Abnahme der CYP1A1-Transkriptmenge in -behandelten P19-ECC. Die Induktion der CYP1A1-mRNA-Menge durch -Wirkung wird durch Zugabe von 0,1µM α-nf auf ca. die Hälfte reduziert (vgl. Abb. 31). Die Zugabe von µM α-nf inhibiert die CYP1A1- Induktion vollständig. Durch den Inhibitor α-nf wird die Induktion von CYP1A1 durch konzentrationsabhängig inhibiert, was mit einer kompetitiven Bindung von α-nf und Blockierung der -Bindung erklärbar ist. CYP1A1 mrna-menge [rel. E.] P19 DMSO 10nM 0,1µM a-nf 1µM a-nf 10µM a-nf 100µM a-nf + 10nM Abb. 31: Quantifizierung der mrna-menge von CYP1A1 nach Inhibierung des AhR mit α-nf Die CYP1A1-Transkriptmenge wurde mittels Real-time PCR (vgl. 2.11) bestimmt. P19-ECC wurden mit dem Inhibitor α-naphthoflavon (α-nf, 0,1µM-100µM) behandelt und anschließend mit 10nM exponiert. N=3 n=2; p 0,05, 2 p 0,001 Signifikanz zu P19; p 0,05, 2 p 0,001 Signifikanz zu DMSO Translokation des AhR nach -Wirkung Nach Aktivierung des AhR durch Bindung des Liganden transloziert der Rezeptor vom Zytoplasma (inaktiv) in den Kern (aktiv) (vgl. Abb. 27). Um diese Wanderung des Rezeptors untersuchen zu können wurde ein enhanced green fluorescence protein (EGFP)-AhR Fusionsprotein konstruiert (vgl. 2.7), was die Detektion des AhR anhand der grünen Fluoreszenz (488nm) des Reporterproteins ermöglicht. Die vollständige CDS wurde am C-Terminus mit EGFP in den Vektor pegfp und in P19-ECC 61

17 transfektiert (vgl. 2.7; 2.4). Nach 4h wurden die transient transfizierten P19-Zellen mit 10nM bzw. mit DMSO inkubiert und nach 45min mit 4%PFA fixiert. Die Auswertung erfolgte mittels Konfokaler Laser Scanning Mikroskopie (KLSM) (vgl. Abb. 32). Bei Versuchsbeginn lag der AhR hauptsächlich im Zytoplasma der P19-Zellen und es war nur ein schwaches Fluoreszenzsignal im Kern detektierbar. Nach 40minütiger Inkubation mit (10nM) befindet sich das Fluoreszenzsignal im Zellkern. Dies wird vor allem in der Doppelmarkierung deutlich, wo der grün markierte AhR mit der roten Kernfärbung übereinanderliegt (vgl. Abb. 32). Die resultierende gelbe Mischfarbe zeigt die Kolokalisation von EGFP-AhR und der Kerne an. Nur EGFP allein lag dagegen in der gesamten Zelle verteilt vor, im Zytoplasma wie auch im Kern, und zeigte keine Veränderung in der Lokalisation nach -Zugabe. Dieser Versuch zeigt, dass der AhR in P19-ECC durch innerhalb von 40 min vom Zytoplasma in den Kern wandert und somit aktiviert wird. EGFP-AhR 7-AAD Gesamt 0h 40 min DMSO Kontrolle P P P 40 min EGFP- Vektor Kontrolle + Abb. 32: Detektion der AhR-Translokation nach -Wirkung 62 Der AhR wurde durch Klonierung mit dem enhanced green fluorescence protein (EGFP) fusioniert und in P19-ECC transient transfektiert. Das Fluoreszenzsignal (grün) wurde bei 488nm im KLSM detektiert. In den linken Bildern ist nur das EGFP-Signal in grün, in der mittleren Bildreihe die Kerngegenfärbung mit 7-AAD in rot und in den rechten der Overlay der beiden Abbildungen dargestellt. EGFP als Vektorkontrolle ist überall in der Zelle verteilt und zeigt keine Lokalisationsveränderung nach -Zugabe. Maßstab 16µm.

18 Untersuchung der Bindung des AhR/ARNT-Transkriptinsfaktorkomplexes an das XRE-Element Im Kern dimerisiert der AhR mit ARNT. Nur dieser Heterodimerkomplex ist in der Lage, an die spezifische XRE-Sequenzen zu binden. Der AhR/ARNT-Transkriptionsfaktorkomplex aktiviert die Transkription von Zielgenen mit XRE-Erkennungssequenzen in der Promotorregion (vgl. Abb. 27). Um die Induktion der Zielgene durch die spezifische Bindung an das XRE untersuchen zu können, wurde ein XRE-Luziferase-Reportervektor konstruiert (vgl. 2.8) und transient in die P19-Zellen transfiziert. Die Bindung der XRE wurde über den Substratumsatz des Reporterenzyms firefly luciferase nachgewiesen. Als Kontrolle der Transfektionseffizienz und des Zellwachstums wurde ein Vektor mit konstitutiv exprimierender renilla luciferase kotransfiziert. Die Aktivität der firefly luciferase wurde im Vergleich zur renilla luciferase ausgewertet (vgl. Abb. 33). Die Luziferaseaktivität ist nach -Zugabe signifikant um 117,06% erhöht. Nur DMSO allein führt auch zu einer Steigerung der Luziferaseaktivität um ca. 15%. Die Steigerung der Luzifreaseaktivität in -behandelten Zellen ist ein Marker für eine XRE-Aktivierung durch den AhR Luziferaseaktivität [%] P19-ECC DMSO 10nM Abb. 33: Luziferaseaktivität von stimulierten P19-ECC In der Grafik ist die relative Luziferaseaktivität der firefly luciferase und renilla luciferase von unbehandelten P19-ECC, -stimulierten P19-ECC (10nM ) und der DMSO-Kontrolle (DMSO) gezeigt. Die Aktivität in den transfizierten P19-ECC wurde mit 100% Aktivität als Kontrolle berechnet. Die Aktivität der DMSO- und -Gruppen wurde in Relation zu den P19-ECC berechnet (firefly luciferase Aktivitäten/ renilla luciferase Aktivität). N=2 n=3 p 0,05, 2 p 0,001 Signifikanz zu P19; p 0,05 Signifikanz zu DMSO 63

19 Wirkung auf die myogene Differenzierung der P19-ECC P19-ECC können nach einem etablierten Zellkulturprotokoll in myogene Zellen differenziert werden. An diesem in vitro Differenzierungsmodell soll untersucht werden, ob einen Einfluss auf Entwicklungs- und Differenzierungsprozesse hat. Bei den P19 Zellen wurde durch 1%DMSO die kardiomyogene Differenzierung induziert, wobei nicht alle Zellen in Kardiomyozyten differenzieren. In der Kultur entwickeln sich zu einem geringeren Anteil auch Skelettmuskelzellen und neuronale Zellen. Der Einfluss von auf die Differenzierung von P19-Zellen wurde durch a) mikroskopische Analyse und Auszählung schlagender Zentren (vgl ) b) Expression des induzierbarem CYP1A1 (vgl ) c) Expression der muskelspezifischen Gene α-mhc, MyoD (vgl ) d) Expression von Mash-1 als Marker der neuronalen Differenzierung (vgl ) e) Expression von Glukosetransportern (vgl ) untersucht Lichtmikroskopische Untersuchung der Bildung kardiomyogener Zentren in 64 plattierten EBs Eine 2-tägige Exposition mit 10nM während der Formierung der EBs (0-2d) beeinflusst die anschließende Differenzierung der EBs zu Kardiomyozyten nicht. Es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen mit kultivierten EBs und den Kontrollen festgestellt werden (vgl. Abb. 34 A). Um einen DMSO-Effekt (Inducer der kardiomyogenen Differenzierung) ausschließen zu können, wurde der Versuch ohne die 1%ige DMSO-Gabe (Standardprotokoll) wiederholt. Dazu wurden die EBs während der ersten 2 Tage der Differenzierung nur mit 10nM in DMSO (6,25x10-4 %ig) inkubiert. Die Zellen formieren auch bei einer niedrigeren Konzentration des DMSO schlagende Herzmuskelzellen. Die Anzahl der Zentren beträgt bei 6,25x10-4 %igem DMSO nur 15% gegenüber 75% dem Standarddifferenzierungsprotokoll mit 1%iger DMSO-Gabe nach einem Tag (5+1d). Nach 5+5d sind bei reduzierter DMSO- Konzentration nur ca. 80% der Zellen in Kardiomyozyten differenziert. Auffällig war aber, dass bei der Kultivierung der EBs von 2d-5d sich ca. 70% der EBs (trotz Verwendung der bakteriologischen Petrischalen) anhefteten. Deshalb war es nicht möglich, alle EBs auszuplattieren und zu differenzieren. Die plattierten EBs dagegen hatten keine signifikanten Abweichungen bei der Ausbildung schlagender Zentren (vgl. Abb. 34 B) Expression von CYP1A1 während der myogenen Differenzierung Eine Expression von undifferenzierten P19-Zellen führt zur signifikanten Erhöhung der CYP1A1-Expression, wobei diese Induktion innerhalb von 3h erfolgte (vgl ). Während der myogenen Differenzierung von P19 kommt es nach 2d zu einem geringen, nach 5, 5+5d zum drastischen Anstieg (13 fach) der CYP1A1-Menge (vgl. Abb. 35) in behandelten Zellen gegenüber unbehandelten Kontrollzellen.

20 A %DMSO Kontrolle 10nM / 1%DMSO Anteil schlagender EBs [%] d 5+2d 5+3d 5+4d 5+5d myogene Differenzierung in Tagen [d] B ,25x10-4 % DMSO Kontrolle 10nM ohne DMSO Anteil schlagender EBs [%] d 5+2d 5+3d 5+4d 5+5d myogene Differenzierung in Tagen [d] Abb. 34: Bestimmung der Anzahl kontraktiler Kardiomyozytenzentren während der myogenen Differenzierung von P19-ECC A Kultur der P19-ECC nach Standardprotokoll (vgl ) der Differenzierung mit 1%DMSO und Zusatz von 10nM N=2 n=72 B Differenzierung nur mit 10nM oder 6,25x10-4 %iger DMSO (Kontrolle) N=3 n=24 65

21 Nach 15 Tagen (5+10d) der Differenzierung erreicht die Transkriptmenge das Ausgangsniveau, vergleichbar auch mit der Menge in undifferenzierten Zellen. Obwohl nur für 2 Tage im Medium vorhanden war (0-2d, während der hanging-drop Phase), führt es zu einer signifikant erhöhten CYP1A1-Expression in den sich myogen differenzierenden P19-Zellen, was auf einen Langzeiteffekt von hindeutet. 16 CYP1A1 mrna-menge [rel. E.] DMSO-Kontrolle d 5d 5+5d 5+10d myogene Differenzierung [d] Abb. 35: CYP1A1 mrna-expression während der myogenen Differenzierung und unter -Einfluss N=3 n=2; p 0,05, 2 p 0,001 Signifikanz zu P19; p 0,05, 2 p 0,001Signifikanz zu DMSO mrna-expression von α-mhc, MyoD und Mash-1 während der myogenen Differenzierung Das Zytoskelettprotein α-mhc ist ein Marker für Kardiomyozyten, während MyoD1 als ein Transkriptionsfaktor vor allem bei der Differenzierung von Skelettmuskelzellen eine Rolle spielt. Als ein Marker des Neuroektoderms wurde der Transkriptionsfaktor Mash-1 gewählt. Alle 3 Gene werden bereits in den undifferenzierten P19-ECC exprimiert, was einen relativen Bezug bei der Real-time PCR zu undifferenzierten Kontrollzellen ermöglicht (undifferenzierte P19-ECC =1 rel. E., Abb. 36). Expression von α-mhc: Während der myogenen Differenzierung ist die α-mhc-menge bis Tag 5+5 erhöht und verringert sich an Tag 5+10d. Durch -Inkubation ist die α-mhc- Menge an 5+5d signifikant ca rel. E. erhöht und nach 5+10d signifikant um ca rel. E. verringert. Die Mengenverhältnisse im Kurvenverlauf zeigen eine Verschiebung des Anstieges zugunsten der -induzierten Zellen, was darauf hindeutet, dass die Differenzierung unter -Einfluss im Vergleich zur normalen Differenzierung schneller 66

22 abläuft. Die α-mhc-menge hat mit rel. E. einen sehr hohen Zuwachs während der Differenzierung. Expression von MyoD: Die MyoD-Menge steigt an Tag 5 der Differenzierung kontinuierlich an (max. 38,70 relative Einheiten). Dabei kommt es zu keinem signifikantem Unterschied zwischen Kontroll- und - behandelten Zellen. Expression von Mash-1: Die Induktion von Mash-1 an Tag 5 der Differenzierung fiel durch signifikant geringer aus (32 rel. E.) als in den unbehandelten Zellen mit 52 rel. E., was auf eine verringerte neuronale Differenzierung hindeutet. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die Expression von α-mhc, MyoD und Mash-1 beeinflusst Einfluss von auf die Expression der Glukosetransporter in P19-ECC In adulten Geweben sind die Glukosetransporter-Isoformen zellspezifisch exprimiert, wobei meist 1-2 Isoformen pro Zelltyp ausreichend sind, um den Transport von Glukose zu gewährleisten. So haben z.b. Skelett- bzw. Herzmuskelzellen 2 Isoformen (GLUT1, 4), wobei GLUT1 den basalen Glukoseumsatz transportiert, während bei Insulinstimulation zusätzlich GLUT4 aktiviert wird. Im Gegensatz dazu besitzen undifferenzierte ES- und EC-Zellen 3-4 GLUT-Isoformen (vgl. 3.1). Der Vergleich der Transkriptmengen ermöglicht es, die Expression der Isoformen während der myogenen Differenzierung zu betrachten. beeinflusst den Glukosemetabolismus und stört den Energiestoffwechsel. Diese Wirkung kann mit Veränderungen in der mrna- und Proteinexpression von GLUT1 und GLUT4 korreliert werden (Liu und Matsumura, 1995; Phillips et al., 1995). Am Stammzellmodell P19-ECC wurde deshalb untersucht, wie sich auf die Expression von GLUT1, 3, 4 und 8 während der myogenen Differenzierung auswirkt. Dazu wurde in -exponierten Zellen: a) Die mrna-mengen von GLUT1, 3, 4, 8 mittels Real-time PCR ermittelt (vgl ). b) Die Proteinmengen für GLUT1, GLUT3 und GLUT4 mittels quantitativem Western Blot untersucht (vgl ). c) Das Protein von GLUT1, GLUT3 und GLUT4 nach 5+5d myogener Differenzierung mittels Immunfluoreszenz lokalisiert (vgl ). d) Die Translokation von GLUT1 und GLUT4 wurden mittels EGFP-full-size Klone untersucht. Es wurden GLUT1 und GLUT4 ausgewählt, da diese Transporter zwischen Zytoplasma und Membran translozieren (vgl ). e) Die Phosphorylierung von Akt durch Insulin wurde mittels Western Blot mit Akt/ phospho Akt Antikörpern bestimmt (vgl ). f) Die Aufnahme von Glukose in 2d und 5d EBs wurde mittels Tritum markierter 3-OMG quantifiziert (vgl ). 67

23 1e+5 α-mhc α-mhc mrna-menge [Logarithmus rel. E.] 1e+4 1e+3 1e+2 1e+1 DMSO-Kontrolle 2 2d 5d 5+5d 5+10d myogene Differenzierung [d] 50 MyoD MyoD mrna-menge [rel. E.] DMSO-Kontrolle d 5d 5+5d 5+10d myogene Differenzierung [d] Mash-1 Mash-1 mrna-menge [rel. E.] DMSO-Kontrolle 0 2d 5d 5+5d 5+10d myogene Differenzierung [d] Abb. 36: mrna-menge von α-mhc, MyoD und Mash-1 während der myogenen Differenzierung von P19-ECC 68 Die relativen mrna-mengen wurden durch Real-time PCR in 2, 5, 5+5 und 5+10 Tagen (d) differenzierten P19-ECC ermittelt. Die Transkriptmenge in undifferenzierten Zellen wurden als Bezugspunkt der Berechnung mit 1 festgelegt. N=3 n=2; p 0,05, 2 p 0,001 Signifikanz zu P19; p 0,05, 2 p 0,001 Signifikanz zu DMSO

24 GLUT1 mrna- und Proteinexpression während der myogenen Differenzierung Die Transkriptmenge von GLUT1 ist in myogen differenzierenden Zellen verschiedener Kulturdauer annähernd konstant und vergleichbar mit dem Niveau in undifferenzierten P19- ECC (=1 rel. E.) (vgl. Abb. 37). Nur eine geringe Steigerung auf das ca. 1,5fache an 5 und 5+5d kultivierten EBs ist zu messen. Mit -behandelte Zellen zeigen signifikante Veränderungen in der GLUT1 mrna-menge, wobei die Transkriptmenge an Tag 2 der Differenzierung erhöht ist (ca. 1,5fach) und dann kontinuierlich bis auf die Hälfte abfällt. Auf der Proteinebene führt dagegen zu einer signifikanten Verringerung um ca. 20% (5+5d) und 100% (5+10d) GLUT3 mrna- und Proteinexpression während der myogenen Differenzierung GLUT3 ist ein Transporter mit hoher Glc-Affinität, der im adulten Organismus hauptsächlich in neuronalen Zellen vorkommt. Während der spontanen Differenzierung von embryonalen Stammzellen wird er differentiell exprimiert. Während der Differenzierung der P19-Zellen war dieser Transporter konstitutiv exprimiert. Die Wirkung von auf die GLUT3-Menge wurde sowohl auf mrna-(vgl. Abb. 38 A), als auch Proteinebene (vgl. Abb. 38 B) ermittelt. Dabei wird deutlich, dass zu Abweichungen in der Transkriptmenge abhängig von der Kulturphase führt. Während die Transkriptmenge im Vergleich zu undifferenzierten Zellen nach 2 Tagen stark verringert war, stieg sie dann bis Tag 5 an und hatte dort ein Maximum mit 1,698 rel. E.. Danach verringerte sich die Expression wieder bis auf 0,789 rel. E.. Bei der Zugabe von kam es zu einem signifikanten Anstieg der Expression nach 2d, aber nach 5+10d zu einer Expressionsverringerung um 0,5 rel. E.. Diese Expressionsabnahme korrelierte mit den Daten des neuronalen Markers Mash-1, dessen Expression unter -Einfluss nach 5+10d signifikant reduziert war (Kontrolle 7,58 rel. E.; 4,586 rel. E.). Auf der Proteinebene führt dagegen zu einer signifikanten Verringerung um ca %. Generell steigt die Menge des GLUT3 Proteins von Tag 2d bis 5+10d an GLUT4 mrna- und Proteinexpression während der myogenen Differenzierung Die Expression von GLUT4 unter -Einfluss wurde mittels Real-time PCR für die mrna-expresssion (vgl. Abb. 39 A) und Western Blot für die Proteinexpression (vgl. Abb. 39 B, C) untersucht. Während der ersten Phase der myogenen Differenzierung (2-5d) steigt sowohl die mrna- als auch die Proteinmenge von GLUT4 an. führt in dieser Phase zur Verringerung von GLUT4 (2d: RNA um 50%, Protein 20%). Ab Tag 5 der Differenzierung nimmt die Transkriptmenge kontinuierlich ab, wobei die Proteinmenge konstant bleibt. Nach 5+10d ist die GLUT4 mrna-menge wieder gleich den unbehandelten P19-ECC, während das GLUT4- Protein in den DMSO-differenzierten Zellen stark erhöht ist (vgl. Abb. 39 B). 69

25 A 2,0 GLUT1 mrna-menge [rel. E.] 1,6 1,2 0,8 0,4 DMSO-Kontrolle 2 0,0 2d 5d 5+5d 5+10d myogene Differenzierung [d] B GLUT1 β-aktin ECC 2d 5d 5+5d 5+10d T K T K T K T K 55kd 43kd C 1,6 DMSO-Kontrolle GLUT1 Proteinmenge [rel. E.] 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 2d 5d 5+5d 5+10d myogene Differenzierung [d] Abb. 37: Expression von GLUT1-mRNA (A) und -Protein (B) in myogen differenzierenden P19-ECC A: Quantifizierung der GLUT1 mrna-menge mittels Real-time PCR B: Western Blot für GLUT1 mit Aktin als Ladekontrolle C: Densiometrische Auswertung des Western Blots zum GLUT1-Proteingehalt von in behandelten und Kontroll-EBs im Vergleich zu P19-ECC. N=3 n=2; p 0,05, 2 p 0,001 Signifikanz zu P19; p 0,05, 2 p 0,001 Signifikanz zu DMSO 70

26 A 2,0 DMSO-Kontrolle GLUT3 mrna-menge [rel. E.] 1,6 1,2 0,8 0,4 2 0,0 2d 5d 5+5d 5+10d myogene Differenzierung [d] B GLUT3 β-aktin ECC 2d 5d 5+5d 5+10d T K T K T K T K 45kd 43kd C 4 DMSO-Kontrolle GLUT3 Proteinmenge [rel. E.] d 5d 5+5d 5+10d myogene Differenzierung [d] Abb. 38: GLUT3 mrna- und Proteinexpression während der myogenen Differenzierung A: Quantifizierung der GLUT3 mrna-menge mittels Real-time PCR B: Western Blot für GLUT3 mit Aktin als Ladekontrolle C: Densiometrische Auswertung des Western Blot zum GLUT3-Proteingehalt von behandelten und Kontroll-EBs im Vergleich zu P19-ECC. N=3 n=2; p 0,05, 2 p 0,001 Signifikanz zu P19; p 0,05, 2 p 0,001 Signifikanz zu DMSO 71

27 A 4 DMSO-Kontrolle GLUT4 mrna-menge [rel. E.] d 5d 5+5d 5+10d myogene Differenzierung [d] B GLUT4 2d 5d 5+5d 5+10d T K T K T K T K 54kd β-aktin 43kd C 2,0 DMSO-Kontrolle GLUT4 Proteinmenge [rel. E.] 1,5 1,0 0,5 0,0 2d 5d 5+5d 5+10d myogene Differenzierung [d] Abb. 39: GLUT4 mrna- und Proteinexpression während der myogenen Differenzierung A: Quantifizierung der GLUT4 mrna-menge mittels Real-time PCR B: Western Blot für GLUT4 mit Aktin als Ladekontrolle C: Densiometrische Auswertung des Western Blots zum GLUT4-Proteingehalt von behandelten und Kontroll-EBs im Vergleich zur 2d EB-Kontrolle. N=3 n=2; p 0,05, 2 p 0,001 Signifikanz zu P19; p 0,05, 2 p 0,001 Signifikanz zu DMSO 72

28 GLUT8 mrna-expression während der myogenen Differenzierung Die GLUT8 Transkriptmenge ist während der myogenen Differenzierung der P19-Zellen differentiell reguliert (vgl. Abb. 40). Im Vergleich zu undifferenzierten Zellen ist sie an Tag 2 erhöht (ca. 2,4 fach) und nimmt während des weiteren Differenzierungsprozesses wieder ab. An Tag 5+10 steigt sie wieder signifikant an. verändert das Expressionsprofil während der Differenzierung kaum, führt aber zur Verringerung der Transkriptmengen, insbesondere an Tag 5+10, wo die Expression um das 2,5 fache niedriger liegt als bei der Kontrolle. Zusammenfassend ist die mrna-expression von GLUT8 während der Differenzierung durch signifikant verringert, wobei sich das Expressionsprofil nicht ändert. 3,0 GLUT8 mrna-menge [rel. E.] 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 2 DMSO-Kontrolle 2 0,0 2d 5d 5+5d 5+10d myogene Differenzierung [d] Abb. 40: GLUT8 mrna-expression während der myogenen Differenzierung GLUT8 mrna-expression mittels Real-time PCR bezogen auf P19-ECC (=1 rel.e.). N=3 n=2; p 0,05, 2 p 0,001 Signifikanz zu P19; p 0,05, 2 p 0,001 Signifikanz zu DMSO Lokalisation von GLUT1, 3 und 4 in in vitro myogen differenzierten P19 5+5d EBs Die Lokalisation von GLUT1, 3 und 4 wurde in 5+5d differenzierten P19-ECC untersucht. Um die differenzierten Muskelzellen zu lokalisieren, wurden die myogenen EB-Zellen mittels Desmin-Antikörper markiert. Desmin ist ein Filament kardiomyogener Zellen. GLUT1 liegt in 5+5d myogen differenzierten Zellen in Zytoplasma und Membran der Zellen vor. In den -behandelten Zellen ist die GLUT1-Fluoreszenz in den Kardiomyozyten schwächer als in den Kontrollen. GLUT1 ist im Zytoplasma der Zellen kernnah detekierbar (vgl. Abb. 41 A, B). GLUT3 liegt im Gegensatz zu undifferenzierten (Membranfärbung, Daten nicht gezeigt) in den 5+5d differenzierten Zellen im Zytoplasma unmittelbar um den Zellkern (vgl. Abb. 41 C). In -behandelten Zellen ist das GLUT3-Protein auch im Zytoplasma kernnah lokalisiert, aber es nimmt eine gerichtete Lage innerhalb der Zellen um den Zellkern ein (vgl. Abb. 41 C, 73

29 3 Ergebnisse D). GLUT4 liegt in den 5+5d differenzierten Zellen im Kern und Zytoplasma der Kardiomyozyten vor. In den -behandelten Zellen befindet sich GLUT4 hauptsächlich im Kern (vgl. Abb. 41 E, F). Unter -Einfluss kommt es am Tag 5+5 der Differenzierung von EB-Zellen zu Kardiomyozyten zu Veränderungen der subzellulären Lokalisation der Glukosetransporterisoformen. -A GLUT1/ Desmin + B GLUT1/ Desmin GLUT1 C GLUT3/ Desmin D GLUT3/ Desmin GLUT3 E GLUT4/ Desmin F GLUT4/ Desmin GLUT4 Abb. 41: Einfluss von auf die GLUT1-, GLUT3- und GLUT4-Lokalisation in 5+5d myogen differenzierten EBs GLUT1 (A, B), GLUT3 (C, D) und GLUT4 (E, F) wurden in 5+5 Tage differenzierten Kardiomyozyten lokalisiert. Die P19-ECC wurden ohne (A, C, E) und mit (B, D, F) differenziert. Die Kardiomyozyten wurden mittels anti-desmin kolokalisiert (rot bei GLUT1, GLUT3, grün bei GLUT4). Durch Doppelmarkierung mit den spezifischen GLUT-Antikörpern wurden die Verteilung der GLUT in den Kardiomyozyten gezeigt. Die Kerne sind zur besseren Orientierung blau gefärbt, die Negativkontrollen in der rechten Ecke dargestellt. Maßstab 20µm. 74

30 Lokalisation von GLUT1 und GLUT4 mittels pegfp-c3 full size Klone in P19-ECC in vitro GLUT1 und GLUT4 liegen im Zytoplasma in Vesikeln vor und können in die Membran translozieren. Um Studien in vitro durchführen zu können, wurden die P19-ECC mit full-size Klonen für GLUT1 und GLUT4 transfektiert (vgl. 2.4). So konnte die Lokalisation dieser Transporter mittels des EGFP im KLSM bestimmt werden. Expression und Lokalisation von EGFP-GLUT1 in P19-ECC Die Zellen wurden mit EGFP-GLUT1 und den entsprechenden Kontrollen transfektiert und nach 4h mit (10nM) behandelt (Versuchsschema vgl. 2.4, 2.7). Die Zellen wurden für 5, 15 und 25h kultiviert und mikroskopisch ausgewertet (vgl. Abb. 42). Ca. 30% der Zellen zeigten eine grüne Fluoreszenz. Das Fluoreszenzsignal markierte in unbehandelten und DSMO-behandelten Zellen stark die Zellmembran und zu einem geringen Anteil auch das Zytoplasma. Eine deutliche Veränderung zeigt sich bei -behandelten Zellen. Hier liegt das EGFP-GLUT1 Signal in den meisten Zellen nur im Zytoplasma (vgl. Abb. 42, I). Das Signal ist punktförmig und gibt den Zellen ein gekörntes Aussehen, was vermuten lässt, dass sich EGFP-GLUT1 in zytoplasmatischen Vesikeln befindet. Der Einfluss von auf die Lokalisation des GLUT1 wurde durch eine immunhistochemische Detektion bestätigt (vgl ; Abb. 47). 5h P19 P19 + DMSO P19 + A B C 15h D E F G H I 25h Abb. 42: Lokalisation von EGFP-GLUT1 nach 5h, 15h und 25h Nach transienter Transfektion der P19-ECC mit EGFP-GLUT1 wurde die Inkubation mit für 5h (C), 15h (F) und 25h (I) durchgeführt. Unbehandelte Zellen sind in (A, D, G), DMSO Kontrollzellen in (B, E, H) abgebildet. Nach Fixierung in 4% PFA wurde die Fluoreszenz am KLSM bei 488 nm ausgewertet. Die grüne Fluoreszenz ist das EGFP markierte GLUT1. Die Zellkerne wurden mit 7-AAD rot gegengefärbt. 75

31 Einfluss von Insulin auf die Lokalisation des EGFP-GLUT1 Die Assoziation der Glukosetransporter mit zytoplasmatischen Vesikeln führt vor allem bei Stimulation mit Insulin zur Auflösung dieser Strukturen und Ausschüttung der Transporter in die Zellmembran. Um zu untersuchen, ob es sich bei der ungewöhnlichen Lokalisation von GLUT1 nach -Zugabe um eine Speicherung in Insulin-sensitiven Vesikeln handelt, wurden die Zellen mit Insulin stimuliert (vgl ). Eine Insulinzugabe verändert die Lokalisation des EGFP-GLUT1 nicht (vgl. Abb. 43). Sowohl in den Kontrollen, in denen EGFP-GLUT in der Zellmembran ist (vgl. Abb. 43 A, B, D, E) als auch in den behandelten Zellen mit dieser ungewöhnlichen Lokalisation, waren keine Unterschiede sichtbar. Es konnte gezeigt werden, dass GLUT1 nach 25h mit 10nM nicht mehr in der Zellmembran, sondern im Zytoplasma vorliegt. Insulin hat keinen Einfluss auf die Lage des EGFP-GLUT1, der hauptsächlich in Vesikeln in Umgebung des Kernes vorliegt. P19 DMSO A B C - Insulin D E F + Insulin EGFP- Kontrolle G H I Abb. 43: Insulin-Einfluss auf die Lokalisation von EGFP-GLUT1 in P19-ECC nach 25h Die Translokation des EGFP-GLUT1 Konstruktes wurde nach 25h Inkubation mit (C), DMSO (B) und der unbehandelten Kontrolle (A) mittels Insulingabe für 2h (vgl ) untersucht. Insulininkubierten P19-ECC sind in D-F, unbehandelte EGFP-Vektor-Kontrollzellen in G, DMSO-behandelte in H und -behandelte in I abgebildet. Die Kerne sind rot gefärbt (7-AAD). Maßstab 20µm. Einfluss von α-nf auf die Lokalisation des EGFP-GLUT1 Zur Untersuchung der α-nf-wirkung wurde der AhR vor -Stimulation mit 10µM α NF blockiert. In den behandelten Zellen lag GLUT1 nach α NF Inhibierung des AhR membranständig vor (vgl. Abb. 44 A), während er perinukleär in nur mit inkubierten Zellen lokalisiert war (vgl. Abb. 44 B). 76

32 A B + α NF 10µm Abb. 44: α NF-Einfluss auf die Lokalisation von EGFP-GLUT1 in P19-ECC nach 25h Die Translokation des EGFP-GLUT1 Konstruktes wurde nach Inkubation für 2h mit α NF und anschliessender 25h Inkubation mit am Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die behandelten Zellen sind in (A), die α NF und inkubierten in (B) dargestellt. Die Kerne sind rot gefärbt (7-AAD). Maßstab 10µm. Lokalisation von GLUT4 in P19-ECC mittels EGFP-GLUT4 Überprüfung der Translation des GLUT4-EGFP: Nach Transfektion der P19-Zellen mit dem GLUT4-EGFP bzw. dem EGFP-Vektor (Kontrolle) wurde nach 4h das Zelllysat mittels Western Blot untersucht (vgl. Abb. 45). Bei der Translation eines GLUT4-EGFP- Fusionsproteins muss ein dimäres Protein von ca. 73 kd entstehen (wie in Abb. 45 A, B Spur1 gezeigt), wohingegen nur EGFP mit ca. 28 kd vom Kontrollplasmid translatiert wird (wie in Abb. 45 A, B Spur2). Die Detektion mit einem anti-egfp-antikörper (vgl. Abb. 45 A) und einem anti-glut4-antikörper (vgl. Abb. 45 B) ergab übereinstimmende Ergebnisse, was die Translation eines vollständigen Fusionsprotein der entsprechenden Größe (GLUT4- EGFP, 72kDA) beweist. A kd M 1 2 B kd M ,2 57,9 42 GLUT4-EGFP 66,2 57,9 42 GLUT4-EGFP GLUT4 EGFP Abb. 45: Expression von GLUT4-EGFP in P19-ECC unter - und Insulin-Einfluss A: In Spur1 ist das Gesamtprotein der GLUT4-EGFP transfizierten Zellen aufgetragen, in Spur2 das Gesamtprotein der EGFP transfizierten Kontrollzellen. Durch Detektion mit dem GFP-Antikörper wurde das GLUT4-EGFP bei 73kD in Spur1 (GLUT4 Maus: 45kD plus EGFP:28kD) und das EGFP in Spur 2 bei 28kD detektiert. B: Durch Stripping des Western Blot aus A und Inkubation mit dem GLUT4 Antikörper wurde das endogene GLUT4 (54kd) und das GLUT4-EGFP detektiert. 77

33 Zelluläre Expression von GLUT4-EGFP: GLUT4-EGFP liegt nahe am Kern, während nur EGFP (Kontrolle) in der gesamten Zelle homogen verteilt vorliegt (vgl. Abb. 46 A: a, c). Nach Zugabe von 1µg/ml Insulin (2h) translokiert der Transporter in die Zellmembran (vgl. Abb. 46 A: b). Die Insulinstimulation wurde auch an exponierten (25h) Zellen durchgeführt (vgl. Abb. 46 B). Während vor Insulininkubation relativ viel Protein noch im Zytoplasma vorlag, translozierte der Hauptteil nach Insulin-Zugabe in die Membran. Es waren keine signifikanten Unterschiede in der Lokalisation in -exponierten und der Kontrolle (DMSO) zu erkennen, was beweist, dass die Insulin-stimulierte GLUT4-Translokation nicht beeinflusst. A a b c d DMSO B a b - Insulin c d + Insulin Abb. 46: Expression von GLUT4-EGFP in P19-ECC unter - und Insulin-Einfluss Nach transienter Transfektion der P19-ECC mit EGFP-GLUT4 wurde die Translokation von GLUT4 durch Insulin (A) und die Translokation nach 25h -Behandlung mit Insulin (B) untersucht. Nach Fixierung in 4%PFA wurde die Fluoreszenz am KLSM bei 488nm ausgewertet. Die grüne Fluoreszenz ist das EGFP markierte GLUT4. Die Zellkerne wurden mit 7-AAD rot gegengefärbt. Maßstab 8µm. A: Lokalisation von GLUT4 in unbehandelten P19-ECC (a), nach Zugabe von Insulin (2h, b), unbehandelter Kontrolle (d) und EGFP-Kontrolle (c). B: Lokalisation von GLUT4 nach 25h Inkubation (a) und nachfolgender Inkubation für 2h mit Insulin (c). Die DMSO- Kontrolle nach 25h ist in (b) und mit 2h Insulinbehandlung in (d) dargestellt. 78

34 Immunhistochemische Lokalisation von GLUT1 nach Kultur mit Neben der Markierung des GLUT1-Proteins mit EGFP (vgl ; Abb. 42) wurde die GLUT1-Lage nach -Zugabe mittels anti-glut1 Antikörper in der Immunfluoreszenz untersucht. In den behandelten Zellen befindet sich GLUT1 verstärkt im Zytoplasma (vgl. Abb. 47 B, D), aber in einigen Kontrollzellen auch unverändert in der Membran (vgl. Abb. 47 F). Die Anzahl der Zellen, die GLUT1 in der Membran exprimieren, ist in exponierten Zellen deutlich geringer als in unbehandelten Zellen (vgl. Abb. 47 A, C, E). A DMSO B C D E F Abb. 47: GLUT1 Immunfluoreszenz in P19-ECC nach Inkubation Detektion von anti-glut1 (grün, 488nM) mittels KSLM in P19-ECC (grüne Fluoreszenz). Die Zellen wurden für 25h mit DMSO (A, C, E) oder 10nM (B; D, F) behandelt. Nach - Behandlung ist GLUT1 hauptsächlich im Zytoplasma (, B, D) aber auch in einigen Zellen membranständig lokalisiert (, F). Die Zellkerne sind mit 7-AAD rot gefärbt. Maßstab 20µm. 79

35 Einfluss von auf die Phosphorylierung von Akt Die Verteilung der Glukosetransporter in die entsprechenden zellulären Kompartemente (Zellmembran, Vesikel) wird durch spezifische Signalwege reguliert. Die zytoplasmatische Phosphatase Akt ist ein Schlüsselprotein für die Translokation von GLUT4. Da eine Hemmung der Aktivierung von Akt zur Fehlsortierung der GLUT führen könnte, wurde untersucht, ob die Phosphorylierung von Akt in P19-ECC beeinflusst. Weiterhin sollte festgestellt werden, ob die Akt-Phosphorylierung durch über den AhR erfolgt. Dazu wurde eine Versuchsgruppe vor -Zugabe mit dem AhR-Inhibitor α-nf behandelt. Die Phosphorylierung von Akt wurde durch phosphospezifische Antikörper im Western Blot detektiert (vgl. Abb. 48). In allen Versuchsgruppen (DMSO,, + α-nf) kommt es durch Insulin zur Aktivierung von Akt. Die Phosphorylierung von Akt ist durch nicht beeinflusst. DMSO + Insulin - Insulin + IH DMSO +IH pakt 60 kd Akt 60 kd Abb. 48: Detektion der Phosphorylierung von Akt in P19-ECC Nach 25h Inkubation mit wurde die Phosphorylierung von Akt bestimmt. Zur Induktion der Phosphorylierung wurden die einzelnen Versuchsgruppen für 5min mit Insulin behandelt. Das 60kD große Protein wurde mittels Western Blot detektiert. Zur Kontrolle wurde nach Stripping der Membran nicht phosphoryliertes Akt bestimmt. IH steht für den AhR-Inhibitor α-nf Bestimmung der Wirkung von auf die Glukoseaufnahme in 2d und 5d P19-80 EBs Die Aufnahme von Glukose in 2d und 5d differenzierte EBs wurde durch die Messung der Inkorporation von 3 H-OMG bestimmt. Die Messwerte der einzelnen EBs hatten eine weite Streuung ( nmol/cm 3 /3min). Die relative Glukoseaufnahme des EBs wurde nach Formel [1] (vgl. 2.15) berechnet. Von den EBs einer Versuchsgruppe wurde der Mittelwert berechnet (vgl. Abb. 49). Die durchschnittliche Glukoseaufnahme eines EBs liegt bei ca nmol/cm 3 /3min, wobei keine signifikante Änderung in der untersuchten Kulturzeit gemessen wurde. führt sowohl bei 2 als auch bei 5d EBs zur Verringerung der Glc-Aufnahme. Bei 2d kultivierten EBs ist die Verringerung der Glukoseaufnahme nicht signifikant durch verändert (vgl. Abb. 49). Erst in 5d kultivierten EBs kommt es zur signifikanten Verringerung der Glukoseaufnahme um 25%.