Stäbchen und Kügelchen symbolisieren Teile der essentiellen Serin- und Histidin- Reste des aktiven Zentrums, während sich die essentiellen Aspartat

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1 1 Enzym-Mechanismen (Abb. 1) Bei den letzten Vorlesungen haben wir uns mit einigen allgemeinen Prinzipien bezüglich Enzymwirkungsweise und Enzymkinetik befasst. Im Folgenden werden wir uns mit drei wichtigen Enzymen, und zwar α-chymotrypsin, Hexokinase und Enolase beschäftigen, um ihre Wirkungsmechanismen kennen zu lernen und weitere allgemeine Prinzipien bezüglich Enzymfunktionsweise und Enzymkinetik zu erhalten. Um den Wirkungsmechanismus eines isolierten und gereinigten Enzyms vollkommen zu verstehen, sollte Folgendes bekannt sein, und zwar: (1) aus wie vielen Phasen die Reaktion besteht, (2) die chemische Zusammensetzung der Substrate, Zwischenprodukte, Übergangszustände, Produkte, Cofaktoren und Regulatoren (die Natur der Übergangszustände und die Funktion der Regulatoren werden noch heute diskutiert), (3) die Konformation des Enzyms, das heisst seine primäre, sekundäre, tertiäre und quartäre Struktur, (4) die Konformation des aktiven Zentrums, das heisst seine funktionellen Gruppen und ihre räumliche Anordnung, (5) wie sind die einzelnen funktionellen Gruppen des Aktiven Zentrums in Bindung und Veränderung des Substrats, der Übergangzustände, der Zwischenprodukte und des Produkts beteiligt, (6) wie verändert sich die Konformation des aktiven Zentrums durch den Einfluss des gebundenen Substrats, der Zwischenprodukte und Übergangszustände, (7) wie verändert sich die Konformation des Enzyms durch den Einfluss von Coenzymen und Regulatoren, (8) die Kinetik der einzelnen Reaktionsphasen, (9) die Energieverhältnisse der einzelnen Reaktionsphasen, (10) und für das betrachtete Enzym spezifische Eigenschaften. Man muss gestehen, dass es kein Enzym gibt, bei dem alles Wissenswerte bekannt ist. (Abb. 2) Das erste zu diskutierende Enzym, das α-chymotrypsin, ist eine Protease, das die hydrolytische Spaltung von solchen Peptidbindungen katalysiert,

2 2 die einem aromatischen Aminosäurerest benachbart sind. Über α-chymotrypsin haben Sie schon gehört, dass es die Peptidbindung durch eine kovalente, nukleophile, allgemeine Säure-Base Reaktion hydrolysiert. Die Primärstruktur des α-chymotrypsin besteht aus einer kurzen Kette zwischen den Aminosäureresten 1 und 13, und zwei langen Ketten zwischen den Aminosäureresten 16 und 146, beziehungsweise 149 und 245. In der dargestellten Primärstruktur fehlen vier Aminosäurereste, 14., 15., 147. und 148. Der Grund dafür wird bei den regulatorischen Enzymen erklärt. Diese drei Ketten sind durch zwei Disulfid- Brücken miteinander verknüpft. Drei andere Disulfid-Brücken bilden intramolekulare Ringe innerhalb der langen Ketten. Die für die Katalyse essentiellen Aminosäurereste und zwar Histidin, der 57., Aspartat, der 102., Glycin, der 193. und Serin, der 195. Aminosäurerest sind mit roter Farbe gekennzeichnet. Obwohl diese Aminosäurereste in der Primärstruktur weit voneinander entfernt existieren, sind sie in der dreidimensionalen Struktur des Enzyms im aktiven Zentrum benachbart. In dem Kalottenmodell des α-chymotrypsin ist die so genannte hydrophobe Tasche des Aktiven Zentrums, wo die fragliche aromatische Aminosäure- Seitenkette gebunden wird, grün. Die essentiellen Aminosäureresten befinden sich im roten Teil des aktiven Zentrums. Abbildungsteil c stellt das Molekulargerüst des Enzyms schematisch dar. Die hier verwendete Farbkodierung ist gleich der Farbkodierung der Primärstruktur. Abbildungsteil d ist eine Nachaufnahme des aktiven Zentrums mit dem Stäbchen-Kügelchen-Modell eines Abschnittes des Substrats, dessen Teile unterschiedlich gefärbt sind; die fragliche aromatische Aminosäure Seitenkette in der hydrophoben Tasche und das Stickstoffatom der aufzuspaltenden Peptidbindung sind blau, das Sauerstoffatom der Peptidbindung in dem Oxanion- Loch violett und ein nicht-reagierender Teil der des Substrats grün. Die rotfarbigen

3 3 Stäbchen und Kügelchen symbolisieren Teile der essentiellen Serin- und Histidin- Reste des aktiven Zentrums, während sich die essentiellen Aspartat und Glycin Reste an unsichtbaren Stellen befinden. Die Rolle des orangefarbigen Oxanion- Lochs des Aktiven Zentrums wird in der nächsten Abbildung erklärt. (Abb. 3) Die von α-chymotrypsin katalysierte hydrolytische Spaltung einer Peptidbindung besteht aus vier Phasen. In der ersten Phase bildet sich ein Enzym- Substrat-Komplex. Dies wandelt sich in der zweiten Phase über einen Übergangszustand zu einem Enzym-Acyl-Komplex und dem Produkt-1, das ein Teil des Substrats mit einer endständigen Aminogruppe ist. In der dritten Phase wandelt sich der Enzym-Acyl-Komplex über einen Übergangszustand zu einem Enzym-Produkt-2-Komplex. In der letzten Phase spaltet sich von dem Enzym Produkt-2 ab, das der andere Teil des Substrats mit einer endständigen Carboxylgruppe ist. Aus energetischem Gesichtspunkt befinden sich sowohl das Substrat und die Produkte als auch die drei Komplexe des Enzyms entweder mit dem Substrat oder mit seinen Derivaten in einem metastabilen Zustand. Bei allen Übergängen aus einem dieser Zustände zum anderen muss je eine Energiebarriere überwunden werden. Die dazu benötigten freien Aktivierungsenthalpien können von der durchschnittlichen thermischen Energie der Lösungsmittel-Moleküle geliefert werden, im Gegensatz zu der großen freien Aktivierungsenthalpie der unkatalysierten Reaktion, die von den schnellsten Lösungsmittelmolekülen geliefert werden können, durch produktive Zusammenstösse mit den Peptidbindungen. Außerdem könnten alle Peptidbindun-Arten gelöst werden, nicht nur diejenigen, die einem aromatischen Aminosäurerest benachbart sind. Über die Übergangszustände, die auf den Spitzen von zwei Energiebarrieren existieren, werden Sie später vieles hören.

4 4 In der siebenteiligen Abbildung ist α-chymotrypsin hellblau, sein aktives Zentrum dunkelblau. Das aktive Zentrum besteht aus einer hydrophoben Tasche, einem Oxanion-Loch und einem langen Kessel. Die Seitenketten der essentiellen Aminosäurereste des Enzyms, und zwar Aspartat, Histidin, Serin und Glycin, sind hervorgehoben. Die Hydroxyl-Gruppe des Serinrests und die Carboxyl-Gruppe des Aspartatrests sind über intramolekulare Wasserstoffbrücken mit den Stickstoffatomen des Imidazol-Rings des Histidinrests gekoppelt, wobei eines der Stickstoffatome als Protonendonator, das andere als Protonenakzeptor fungiert. Was das Substrat betrifft, ist sein Carbonyl-Teil schwarz, sein Amid-Teil blau, die nicht-reagierenden Peptid-Teile werden mit den Buchstaben AAn symbolisiert. Die Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes besteht darin, dass die fragliche aromatische Seitenkette des Substrats in der hydrophoben Tasche des aktiven Zentrums durch hydrophobe Wechselwirkungen festgebunden wird, während das Stickstoffatom des Serinrests in dem Oxanion-Loch mit dem Sauerstoffatom der Carbonylgruppe der aufzuspaltenden Peptidbindung eine Wasserstoffbrücke herstellt. Unreagierende Substrat-Teile finden im Kessel Platz. In dem Enzym-Substrat-Komplex befindet sich das Kohlenstoffatom der Carbonylgruppe der aufzuspaltenden Peptidbindung in richtiger Position für die Herstellung einer kovalenten Bindung mit dem Sauerstoffatom der Hydroxyl- Gruppe des Serinrests, und zwar auf dem nukleophilen Reaktionsweg, weil das fragliche Kohlenstoffatom eine positive Partialladung und das fragliche Sauerstoffatom eine negative Partialladung besitzen. Dabei spaltet sich das rote Wasserstoffatom in Form eines Wasserstoffions aus der Serin-Hydroxylgruppe ab, und stellt eine kovalente Bindung mit einem der Imidazol-Stickstoffatome her. Seine positive Ladung wird zu dem anderen Stickstoffatom des Imidazol-Rings verschoben, während sein am Serin-Sauerstoffatom hinterlassenes Bindungselektron zu dem Sauerstoffatom in dem Oxanion-Loch verschoben wird.

5 5 Inzwischen bilden sich zwei neue Wasserstoffbrücken, eine zwischen dem Sauerstoffatom im Oxanion-Loch und dem Stickstoffatom des Glycinrestes des Enzyms, und die andere zwischen dem Stickstoffatom der aufzuspaltenden Peptidbindung und einem Stickstoffatom des Imidazol-Rings über das rote Wasserstoffatom. In dem so entstandenen Übergangszustand spaltet sich danach die Kohlenstoff-Stickstoff-Bindung der fraglichen Peptidgruppe unter Freiwerden eines Substratteils mit einer endständigen Aminogruppe, die sowohl das rote Wasserstoffatom und die positive Ladung vom Imidazol-Ring, als auch die negative Ladung vom Sauerstoffatom im Oxanion-Loch mitnimmt. Das zurückbleibende Zwischenprodukt ist ein kovalent gebundener Enzym-Acyl- Komplex. Acyl bedeutet, wie Sie wissen, eine Carboxylgruppe ohne ihren Hydroxyl-Teil. Inzwischen bindet das freigewordene Stickstoffatom des Imidazol- Rings eine Wasserstoffbrücke mit einem Wassermolekül durch das rote Wasserstoffatom. Der Hydroxylion-Teil dieses Wassermoleküls bindet sich danach auf dem nukleofilen Weg an das Kohlenstoffatom der Carbonyl-Gruppe des Enzym-Acyl- Zwischenprodukts, während sein roter Wasserstoffion-Teil von dem Stickstoffatom des Imidazol-Rings kovalent gebunden wird. Die positive Ladung dieses Wasserstoff-Ions wird zu dem anderen Stickstoffatom des Imidazol-Rings verschoben, während die negative Ladung des Hydroxyl-Ions zu dem Sauerstoffatom im Oxanion-Loch verschoben wird. Zwei neue Wasserstoffbrücken bilden sich dabei, eine zwischen diesem Sauerstoffatom und dem Stickstoffatom des Glycinrestes im Oxanion-Loch, die andere zwischen einem Stickstoffatom des Imidazol-Rings und dem Sauerstoffatom des Serinrests über das rote Wasserstoffatom.

6 6 In dem so entstandenen Übergangszustand spaltet sich die Sauerstoff- Kohlenstoff-Bindung zwischen dem Acyl-Teil des Substrats und des Serinrests, wobei die negative Ladung aus dem Oxanion-Loch zum Serin-Sauerstoff verschoben wird. Währenddessen wird von dem Imidazol-Ring das rote Wasserstoffatom und eine positive Ladung, das heisst ein Wasserstoffion, an den Serin-Rest des Enzyms abgegeben, wo die erwähnten positiven und negativen Ladungen einander ausgleichen. Der so entstandene Substrat-Teil mit einer endständigen Carboxylgruppe bleibt für eine kurze Zeit über schwache Wechselwirkungen an das Enzym gebunden, danach verlässt er das Enzym als Produkt-2. Es ist bemerkenswert, dass Schritte 2 und 5 ähnlich sind. In beiden leitet ein nicht-bindendes Elektronenpaar einer Hydroxyl-Gruppe, das heisst eine Base, die Reaktion ein. Dagegen werden die Reaktionen in den Schritten 3 und 6 von einem Wasserstoffion, das heisst einer Säure, eingeleitet. Das ist also eine Säure-Base- Katalyse. Das α-chymotrypsin katalysiert also nicht die direkte Reaktion zwischen einer Peptidbindung und einem Wassermolekül, sondern bahnt einen neuen Weg, auf dem das an der Hydrolyse beteiligte Wasserstoffion aus dem Serin-Rest des Enzyms stammt, wie es in Abbildungsteilen 2-4 zusehen ist. Dann bekommt dieser Serin-Rest auf dem in Abbildungsteilen 5-7 demonstrierten Weg ein Wasserstoffion aus einem Wassermolekül zurück. Der Histidin-Rest spielt direkt, und der Aspartatrest indirekt mit dem Serin-Rest bei der Vermittlung der fraglichen Wasserstoffatomen zusammen. Diese drei Aminosäurereste heißen katalytische Triade. Der Glycinrest spielt durch vorübergehende Stabilisierung der negativen Ladung des Sauerstoffatoms im Oxanion-Loch in den Übergangszuständen eine Nebenrolle. (Abb. 4) Neben der Hydrolyse solcher Peptidbindungen, die einem aromatischen Aminosäurerest benachbart sind, katalysiert das α-chymotrypsin die

7 7 Hydrolyse von Peptidgruppen anderer Aminosäurereste, aber um Größenordnungen langsamer. Darüber hinaus katalysiert das α-chymotrypsin die hydrolytische Spaltung von Carbonsäure-Estern und Carbonsäure-Amiden, die - wie Peptidbindungen - eine Acyl-Gruppe enthalten. Die Untersuchung der Reaktionskinetik ihrer Hydrolyse hat wichtige Hinweise für den Wirkungsmechanismus von α-chymotrypsin geliefert. Der erste Hinweis auf eine kovalente Enzym-Acyl-Bindung stammt von einem Experiment, bei dem p-nitrophenylacetat, eine farblose Substanz, von α- Chymotrypsin zu Essigsäure und p-nitrophenol, eine farbige Substanz, hydrolysiert wurde. Die Menge des entstehenden p-nitrophenols wurde anhand seiner Farbe fotometrisch gemessen. Es stellte sich heraus, dass die Geschwindigkeit der p- Nitrophenol-Entstehung in der ersten Sekunden der Reaktion viel größer war, als später. Daraus wurde geschlossen, dass bevor sich ein Fließgleichgewicht zwischen der Bildung und der Spaltung des Enzym-Acyl-Komplexes einstellt, eine schnelle Acylierung stattfindet, danach bestimmt die langsame Deacylierug die Geschwindigkeit der Reaktion. Bei der Hydrolyse des eigentlichen Substrats von α- Chymotrypsin kann man dieses Phänomen nicht beobachten, weil die Anfangsperiode, während der sich das Fließgleichgewicht einstellt, unmessbar kurz ist. (Abb. 5) Unter Übergangszustand versteht man die Struktur eines extrem kurzlebigen Substrat-Derivats, das auf der Spitze einer Energiebarriere existiert. In diesem Zustand ist die Komplementarität, das heisst die Wechselwirkung zwischen Enzym und Substrat, am grössten. Wegen ihrer extrem kurzen Lebenszeit kann die Struktur des Substrat- Derivats im Übergangszustand nicht experimentell untersucht werden. In Kenntnis des Reaktionsmechanismus ist es jedoch gelungen, langlebige Moleküle mit der vermuteten Struktur der Übergangszustände zu synthetisieren. Sie werden Analoga

8 8 der Übergangszustände genannt. Die projizierte Abbildung demonstriert die vermuteten Übergangszustände und ihre Analoga bei der Esterhydrolyse und Carbonat-Hydrolyse. In beiden Analoga befindet sich ein fünfwertiges, und deshalb stabiles Phosphoratom an der intramolekularen Stelle, an der in den entsprechenden Übergangszuständen ein fünfwertiges und deshalb sehr labiles Kohlenstoffatom sitzt. Heutzutage gibt es einige Übergangszustand-Analoga, die sich tausendmal stärker als das eigentliche Substrat an das aktive Zentrum des Enzyms binden können, und daher als Inhibitor wirkende, sehr spezifische Medikamente verwendet werden. Wenn man ein Übergangszustand-Analogon an ein Polypeptid bindet, kann man gegen den Analogon-Polypeptid-Komplex mithilfe der monoklonalen Technik einen Antikörper herstellen, der als künstliches Enzym wirkt. Die heutigen künstlichen Enzyme, die als katalytischer Antikörper bezeichnet werden, erreichen die katalytische Wirksamkeit der entsprechenden natürlichen Enzyme noch nicht. Sie haben aber viel versprechende industrielle und medizinische Einsatzmöglichkeiten. Bei ärztlicher Behandlung von Kokain-Abhängigen wäre ein künstliches Enzym für den Abbau von Kokain äußerst nützlich. (Abb. 6) Das zweite zu diskutierende Enzym ist die Hexokinase. Sie katalysiert die Übertragung einer Phosphorylgruppe aus Adenosintriphosphat an das 6. Kohlenstoffatom der D-Glukose. Hexokinase bindet zwei Substrate. Eines davon ist ein Mg ++ -ATP-Komplex. Das andere Substrat kann nicht nur D-Glucose sein, sonder auch Wasser, mit dem der Mg ++ -ATP-Komplex unter Bildung von Mg ++ -ADP-Komplex und Phosphatanion reagiert. Wassermoleküle haben ungehinderten Zugang in das aktive Zentrum der Hexokinase. Trotzdem fällt auf die Bildung von 10 6 D-Glucose-6-phosphat-Molekülen nur die Bildung eines einzigen Phosphatanions. Der Grund dafür ist, dass Hexokinase eine Konformationsänderung erfährt, sobald D-Glucose, das rote Molekül in der

9 9 projizierten Abbildung, in ihrem aktiven Zentrum gebunden wird. Dadurch nimmt die Komplementarität zwischen Hexokinase und D-Glucose erheblich zu, die eine beachtliche Erhöhung ihre Aktivität verursacht. Die Konformationsänderung besteht darin, dass sich die Arme des U-förmigen Enzyms zusammendrängen. Auf Englisch heisst dieses Phänomen "induced fit". Im aktiven Zentrum gebundene Wassermoleküle verursachen keine solchen Konformationsänderung im Enzym. Die Tatsache der erwähnten Konformationsänderung und der dadurch erhöhten Aktivität der Hexokinase wurde mit einem Experiment bewiesen, in dem zu einer wässrigen Lösung von ATP-Mg ++ -Komplex und Hexokinase D-Xylose zugegeben wurde. Dadurch wurde die Geschwindigkeit der Reaktion zwischen ATP und Wasser erheblich erhöht. D-Xylose ist eine Pentose, die in stereochemischer Hinsicht der Struktur von D-Glucose ähnelt. Deshalb passt sie präzise in das aktive Zentrum der Hexokinase und verursacht die gleiche Konformationsänderung, wie D-Glucose. D-Xylose bleibt aber unphosphoryliert, weil Hexokinase nur das sechste Kohlenstoffatom eines Zuckermoleküls phosphorylieren kann. Die von der Konformationsänderung aktivierte Hexokinase katalysiert dann die Reaktion zwischen ATP und Wasser um Größenordnungen schneller, als ihre unveränderte Konformation. Induced fit ist nur ein Aspekt für die katalytische Aktivität von Hexokinase. Viele andere Aspekte, die ich Ihnen schon auseinandersetzte, wie Säure-Base- Katalyse, gelten auch bei Hexokinase. (Abb. 7) Das dritte zu diskutierende Enzym ist Enolase. Sie katalysiert einen Schritt der Glykolyse, die Dehydratisierung von 2-Phosphoglycerat zu Phosphoenolpyruvat unter Freiwerden eines Wassermoleküls. Dies stammt aus einer Hydroxyl-Gruppe am dritten Kohlenstoffatom und einem Wasserstoffatom am zweiten Kohlenstoffatom des 2-Phosphoglycerats. An ihrer Stelle entsteht eine Doppelbindung.

10 10 Die Reaktion beginnt mit Bindung des 2-Phosphoglycerats vm Enzym, bei der zwei im aktiven Zentrum des Enzyms befindliche Magnesium-Ionen essenziell sind. Danach zieht das Stickstoffatom eines Lysinrestes des Enzyms ein Wasserstoffatom vom zweiten Kohlenstoffatom des 2-Phosphoglycerats in Form eines Wasserstoffions zu sich. Außerhalb des aktiven Zentrums ist eigentlich diese Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindung nicht polarisiert, weil beide beteiligten Atome eine ähnliche Elektronegativität besitzen. Es sind die positiv geladenen Magnesium-Ionen, die diese Bindung im aktiven Zentrum polarisieren und ihre Spaltung durch Anziehung eines Elektrons, das heisst eine negative Ladung, ermöglichen. Die blauen Pfeile zeigen die Richtung der Elektronenverschiebung. Das dabei entstandene instabile Enzym-Enol-Zwischenprodukt wird dadurch stabilisiert, dass sich seine in der Abbildung rote Hydroxyl-Gruppe in Form eines negativ geladenen Hydroxid-Anions mit dem Wasserstoffion eines Glutamatrestes des Enzyms zu einem Wassermolekül vereinigt. Die an dem Enzym-Enol- Zwischenprodukt zurückbleibende positive Ladung wird mit einer der negativen Ladungen an seinen Carboxyl-Sauerstoffatomen durch Elektronenhüpfen ausgeglichen. Schließlich spaltet sich das Phosphoenolpyruvat aus dem Enzym. Diese Reaktion ist ein Beispiel nicht nur für die Metallion-Katalyse, sondern auch für die allgemeine Säure-Base-Katalyse, weil im aktiven Zentrum des Enzyms die Aminogruppe eines Lysinrests als Protonenakzeptor und eine Carboxylgruppe eines Glutamatrests als Protonendonator in der Reaktion essenzielle Rolle haben.