Enzym-Regulation (Abb. 1) Heute werde ich mich mit dem Thema Enzym-Regulation auseinandersetzen. Im Stoffwechsel von lebenden Zellen arbeiten Gruppen

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1 1 Enzym-Regulation (Abb. 1) Heute werde ich mich mit dem Thema Enzym-Regulation auseinandersetzen. Im Stoffwechsel von lebenden Zellen arbeiten Gruppen von Enzymen nacheinander in dem Sinne, dass das Produkt eines vorstehenden Enzyms das Substrat des nächsten Enzyms wird. Solche Enzymgruppen heissen Multienzymsysteme. Die Gesamtgeschwindigkeit eines Multienzymsystems wird von der Geschwindigkeit der langsamsten enzymatischen Reaktion bestimmt. Die geschwindigkeitsbestimmenden Enzyme heißen regulatorische Enzyme. In einem Multienzymsystem ist immer das erste Enzym regulatorisch. Die anderen Enzyme eines Multienzymsystems können das Produkt des vorstehenden Enzyms sofort weiter verarbeiten. Die regulatorischen Enzyme haben die Fähigkeit, auf die Wirkung bestimmter chemischen Verbindungen, die als Modulator bezeichnet sind, ihre Aktivität erhöhen oder erniedrigen. Dadurch kann eine lebende Zelle auf wechselnden Bedarf von ihren Funktionen optimal reagieren. Es gibt zwei Hauptklassen der regulatorischen Enzyme: allosterisch modulierte und kovalent modulierte. Bei allosterisch modulierten, regulatorischen Enzymen bindet sich der Modulator über nicht-kovalente Wechselwirkungen reversibel an das Enzym. Ein allosterischer Modulator ist oft ein kleines Metabolit oder ein Kofaktor, weniger häufig ein Protein. Allosterisch modulierte Enzyme regulieren im Allgemeinen solche Prozesse, die zum Leben einer Zelle kontinuierlich, aber auf unterschiedlichem Niveau nötig sind. Bei der anderen Hauptklasse wird die Aktivität des regulatorischen Enzyms von einer Verbindung moduliert, die mit ihm eine kovalente aber meistens reversible Bindung eingeht. Der häufigste kovalente Modulator ist die Phosphorylgruppe, weniger häufig sind Proteine, Kofaktoren oder Metabolite.

2 2 Kovalent modulierte Enzyme regulieren häufig Alles-oder-Nichts Reaktionen, wie der hydrolytische Abbau von Proteinen. Für einen Modulator gibt es an dem regulatorischen Enzym eine als modulatorisches Zentrum bezeichnete Bindungsstelle, meistens weit entfernt von dem aktiven Zentrum. Manchmal befinden sich aktives Zentrum und regulatorisches Zentrum in unterschiedlichen Protein-Untereinheiten des Enzyms. Die chemische Zusammensetzung und räumliche Anordnung der Modulator- Bindungsstellen sind hochgradig spezifisch für die chemische Zusammensetzung und räumliche Anordnung des Modulators. (Abb. 2) Allosterische Modulatoren wirken dadurch, dass sie eine Konformationsänderung in dem Enzymmolekül hervorrufen. Die veränderte Konformation kann sowohl aktiver, als auch weniger aktiv sein als die originale Konformation. Dementsprechend unterscheidet man hemmende und aktivierende allosterische Modulatoren. Bei aktivierend modulierter allosterischer Regulation kommt es häufig vor, dass der Modulator selbst das Substrat ist. Solche Modulation wird homotrop genannt. Wenn das Substrat und der Modulator unterschiedlich sind, spricht man von heterotroper Modulation. Die linke Seite der projizierten Abbildung schematisiert die Wirkung eines allosterischen, heterotropen, aktivierenden Modulators auf ein hypothetisches regulatorisches Enzym, das aus einer blaufarbigen katalytischen und einer rotfarbigen regulatorischen Untereinheit besteht. Das aktive Zentrum ist mit einer rechteckigen Einwölbung symbolisiert, das regulatorische Zentrum ist trapezförmig. Das aktive Zentrum ist mit dem dreieckigen Substrat nicht komplementär. Wenn sich der kreisförmige Modulator an das Enzym bindet, verändert sich nicht nur die Konformation seiner Bindungsstelle, sondern auch die Konformation des ganzen Enzyms, einschließlich seines aktiven Zentrums. So wird das aktive Zentrum mit dem Substrat komplementär, und dadurch das Enzym

3 3 reaktionsfähig. Auf dem umgekehrten Weg wird das Enzym inaktiviert. Eine allosterische, heterotrope und hemmende Regulation findet ähnlicherweise statt. Allosterisch modulierte regulatorische Enzyme sind im Allgemeinen grösser und komplexer als die kovalent modulierten regulatorischen Enzyme. Aspartat- Transcarbamoylase zum Beispiel, die die Nukleotid-Polymerisation reguliert, besteht aus zwölf Protein-Untereinheiten, von denen die drei blauen und drei violetten katalytische Einheiten, und die drei roten und drei gelbgrünen regulatorische Einheiten sind. Die projizierte Abbildung zeigt zwei Ansichten der Quartärstruktur dieses Enzyms. Im Allgemeinen besitzen allosterisch modulierte regulatorische Enzyme mehrere Bindungsstellen nicht nur für gleiche Modulatoren, sondern auch für unterschiedliche Modulatoren, unter denen sowohl aktivierende als auch hemmende Modulatoren repräsentiert werden können. (Abb. 3) Bei allosterisch, heterotrop und inhibierend modulierten Enzym- Regulation kommt es vor, dass das Endprodukt eines Multienzymsystems, das heisst, das Produkt seines letzten Enzyms ein inhibierender Modulator seines ersten Enzyms, das heisst des regulatorischen Enzyms ist. Diese Art Regulation heißt Rückkopplungs-Inhibition, auf Englisch "feedback" Inhibition. Die projizierte Abbildung stellt ein fünfteiliges Multienzymsystem dar, das in Bakterien L-Threonin zu L-Isoleucin umändert. Das erste Enzym, L-Threonin- Dehydratase ist von L-Isoleucin, das Produkt der fünften enzymatischen Reaktion allosterisch und heterotrop gehemmt. Die Produkte der ersten vier enzymatischen Reaktionen haben keine Wirkung auf die Aktivität des regulatorischen Enzyms. Nimmt also die Konzentration von L-Isoleucin in dem Bakterium zu, so wird die Aktivität der Threonin-Dehydratase inhibierend moduliert, und dadurch die Aktivität des Multienzymsystems, und letztendlich die Entstehung des als inhibierender Modulator wirkenden L-Isoleucins unterdrückt; und umgekehrt: nimmt die Konzentration von L-Isoleucin in dem Bakterium ab, so wird das Maß

4 4 der inhibierenden Modulation des Multienzymsystems verkleinert, und dadurch das Maß der Entstehung des L-Isoleucins erhöht. (Abb. 4) Die Michaelis-Menten-Kinetik beruht auf der Tatsache, dass die Anfangsgeschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion von der anfänglichen Substratkonzentration nach einer hyperbolischen Sättigungskurve abhängt. Bei allosterisch modulierten, regulatorischen Enzymen ist es aber nicht der Fall. Bei ihnen folgt die Abhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeit von der anfänglichen Substratkonzentration einer sigmoiden Sättigungskurve. So gelten die bisher erlernten kinetischen Prinzipien bei allosterisch modulierten regulatorischen Enzymen nicht. Der Grund für die sigmoide Form der Sättigungskurve ist ein kooperatives Verhalten der Protein-Unterneinheiten des Enzyms. Bei allosterisch und homotrop modulierten, regulatorischen Enzymen, bei denen der aktivierende Modulator das Substrat selbst ist, bedeutet das kooperative Verhalten ihrer Protein-Untereinheiten das Folgende. Wird ein Substratmolekül von der Modulator-Bindungsstelle in einer der Protein-Untereinheit des Enzyms gebunden, so erfährt diese Protein-Untereinheit eine günstige Konformationsänderung und dadurch eine Zunahme ihrer katalytischen Aktivität. Diese Konformationsänderung verursacht sofort eine günstige Konformationsänderung und dadurch eine weitere Zunahme der katalytischen Aktivität in einer benachbarten Protein-Untereinheit. Auf diese Weise verbreiten sich die günstige Konformationsänderung und dadurch die Aktivität-Zunahme auf allen Protein-Untereinheiten des Enzyms. Bei sehr niedrigen Substratkonzentrationen kann diese enorm erhöhte Kapazität zur Katalyse nicht genutzt werden, weil das Enzym mit dem Substrat nicht gesättigt werden kann. Dementsprechend kann sich bei sehr niedriger Substratkonzentration kein Fließgleichgewicht einstellen, dessen Einstellung die Grundlage der Michaelis- Menten-Kinetik ist.

5 5 Allosterisch und heterotrop modulierte, regulatorische Enzyme, bei denen Modulator und Substrat unterschiedliche chemische Verbindungen sind, besitzen zwei Klassen. Bei der ersten Klasse ist die maximale Anfangsgeschwindigkeit unabhängig von der Modulatorkonzentration, die Steigung der sigmoiden Kurve wird aber auf die Wirkung der Steigerung der Modulator-Konzentration bei aktivierenden Modulatoren erhöht, bei hemmenden Modulatoren gesenkt. Bei der zweiten Klasse verändern sich sowohl die Steigung der sigmoiden Kurve, als auch die maximale Anfangsgeschwindigkeit auf die Wirkung der Modulatorkonzentration. Allosterisch und heterotrop modulierte, regulatorische Enzyme können Bindungstellen sowohl für aktivierende als auch für inhibierende Modulatoren besitzen. (Abb. 5) Die kovalente Modulation besteht darin, dass an das regulatorische Enzym ein anderes Enzym über eine kovalente aber reversible Bindung eine Phosphorylgruppe, eine Adenylgruppe, eine Uridylgruppe, eine Adenosindiphosphat-ribosylgruppe oder eine Methylgruppe bindet, beziehungsweise diese Gruppen abspaltet. Die Phosphorylierung erfolgt mittels Adenosintriphosphat. Diese Reaktion wird von Proteinkinasen katalysiert, während die Entfernung einer bereits gebundenen Phosphorylgruppe von Proteinphosphatasen. Vmi hiányzik a mondatból? Die anderen kovalenten Modulationen erfolgen entweder mittels Adenosintriphosphat oder seinen Derivaten, wie Uridyltriphosphat, Nicotinamidadenin-dinucleotid und S-Adenosyl-Methionin. Von der Tabelle können Sie ablesen, an welche Aminosäurereste des regulatorischen Enzyms sich diese Modulatoren anbinden können. Zum Beispiel kann ein Tyrosinrest in einem regulatorischen Enzym sowohl phosphoryliert, als auch adenyliert oder uridyliert werden. Andererseits können mehr als eine Art von Aminosäureresten phosphoryliert oder ADP-ribosyliert werden. Phosphorylierung mittels ATP und

6 6 Proteinkinasen wird von lebenden Zellen auch für andere Zwecke verwendet. Infolgedessen sind mehr als die Hälfte der Proteine in eukaryotischen Zellen auf einer oder mehreren Stellen phosphoryliert. (Abb. 6) Phosphorylierung kann die Aktivität eines regulatorischen Enzyms auf unterschiedlichen Wegen modulieren. Isocitrat-Dehydrogenase, die die Umwandlung von Isocitrat zu α-ketoglutarat reguliert, liefert ein einfaches Beispiel. Phosphorylierung einer Hydroxyl-Gruppe in dem aktiven Zentrum von Isocitrat-Dehydrogenase bringt negative Ladungen hinein. Diese Ladungen verhindern die Bindung des negativ geladenen Isocitrats von dem aktiven Zentrum durch elektrostatische Abstoßung. Viel komplizierter ist die von Glycogen-Phosphorylase regulierte Abspaltung eines Glucose-Moleküls in Form von Glucose-1-Phosphat aus einem Glycogen- Molekül. Dieses Enzym existiert in zwei Formen, die als Phosphorylase-a und Phosphorylase-b bezeichnet werden. Phosphorylase-b hat je eine Serin- Hydroxylgruppe in ihren zwei gleichen Protein-Untereinheiten, während in der viel aktiveren Phosphorylase-a sind die beiden Serin-Hydroxylgruppen phosphoryliert. Phosphorylierung der fraglichen Serin-Hydroxylgruppen ist von dem Phosphorylase-Kinase-Enzym mittels Adenosintriphosphat katalysiert. Dephosphorylierung von Phosphorylase-a ist von dem Phosphorylase-Phospatase- Enzym mittels Wassermolekülen katalysiert. Auf die Wirkung der Phosphorylierung nehmen beide Protein- Untereinheiten der Glycogen-Phosphorylase eine für die Katalyse günstige Konformation auf. Der Grund für diese Konformationsänderung besteht darin, dass in der Phosphorylase-b jede der Serin-Hydroxylgruppen sich in einer Region befindet, wo positiv geladene Aminosäureseitenketten dominieren. Jede Protein- Untereinheit besitzt auch eine negativ geladene Region. Die Konformation der Phosphorylase-b ist durch die Anziehungskraft zwischen diesen entgegengesetzt

7 7 geladenen Regionen stabilisiert. Phosphorylierung der Serin-Hydroxylgruppen bringt negative Ladungen in beide positiv geladenen Regionen, und dadurch senkt die erwähnte elektrostatische Anziehungskraft zwischen den fraglichen Regionen in einem Ausmaß, das ihre Trennung ermöglicht. (Abb. 7) Die Aktivität von Glycogen-Phosphorylase wird nicht nur durch die gerade diskutierte kovalente Phosphorylierung moduliert, sondern auch auf einem allosterischen Weg, mittels Adenosinmonophosphat. Darüber hinaus braucht Glycogen-Phosphorylase ein Koenzym, Piridoxalphosphat, um katalytische Aktivität ausüben zu können. Beachten Sie, dass die in der projizierten Abbildung dunkelblaue beziehungsweise gelbgrüne Bindungsstellen für die allosterischen beziehungsweise kovalenten Modulatoren dicht nebeneinander, aber weit von den zwei rotfarbigen aktiven Zentren liegen, während sich die hellblauen Kofaktor- Bindungsstellen in der unmittelbaren Nähe der aktiven Zentren befinden. (Abb. 8) Solche Aminosäurereste eines Proteinmoleküls können mittels einer Proteinkinase phosphoryliert werden, die eine Hydroxyl-Gruppe enthält. Die sind Serin, Threonin und Tyrosin. Diese Aminosäurereste können aber nur in dem Fall phosphoryliert werden, wenn sie sich innerhalb bestimmter Aminosäurerest- Sequenzen der Primärstruktur befinden. Diese Primärstruktur-Sequenzen werden als Konsensus-Sequenzen bezeichnet. Im Allgemeinen kann jede dieser Konsensus- Sequenzen von einer einzigen Proteinkinase erkannt, und phosphoryliert werden. In der projizierten Tabelle sind einige Konsensus-Sequenzen und ihre spezifischen Kinasen aufgeführt. Die Aminosäurereste sind mit den Ein-Buchstabenkoden symbolisiert, wobei die rotfarbigen Buchstaben S, T und Y die zu phosphorylierenden Serin, Threonin und Tyrosin Reste bedeuten. S/T bedeutet entweder Serin oder Threonin. Schwarzfarbiger Sp, Tp und Yp bedeuten bereits phosporylierte Serin, Threonin und Tyrosin Reste. Weitere Ausnahmen sind X, der

8 8 einen beliebigen Aminosäurerest, und B, der einen beliebigen hydrophoben Aminosäurerest symbolisieren. Die Konsensus-Sequenz ist nicht der einzige entscheidende Faktor, ob ein Serin Threonin oder Tyrosin Rest phosphoryliert werden kann. Bestimmte Aminosäurereste, die in der Primärstruktur weit von der Konsensus-Sequenz liegen, aber in der dreidimensionalen Struktur benachbart sind, können den Zutritt einer Proteinkinase zu ihrer spezifischen Konsensus-Sequenz verhindern. (Abb. 9) Einige regulatorische Enzyme können in mehreren Stellen mittels ATP und Proteinkinasen phosphoryliert werden. Zum Beispiel besitzt Glycogen- Synthase 9 unterschiedliche Stellen in fünf Regionen ihrer Primärstruktur, die von den in der projizierten Tabelle eingeführten Proteinkinasen phosphoryliert werden können. Einige dieser Proteinkinasen können nur eine einzige dieser Stellen phosphorylieren, andere können zwei, drei oder alle neun Stellen. Wenn die Stelle 5 phosphoryliert wird, wird Glycogen-Synthase inaktiviert. Phosphorylierung an anderen Stellen hat eine aktivierende Wirkung. Ist aber eine aus den Stellen 1A, 1B, 2A, 2B oder 4 bereits phosphoryliert, kann die Phosphorylierung einer anderen dieser Stellen die enzymatische Aktivität nicht weiter erhöhen. Dagegen ist die aktivierende Wirkung der Phosphorylierung in den Stellen 3A, 3B und 3C kumulativ. Bei der mehrfachen Phosphorylierung anderer regulatorischen Enzyme kommt es vor, dass eine Proteinkinase ihre spezifische Stelle nur danach phosphorylieren kann, wenn eine andere Stelle von einer anderen Proteinkinase bereits phosphoryliert ist. Dieses Phänomen heisst hierarchische Phosphorylierung. Mittels mehrfacher Phosphorylierung lässt sich die Aktivität einiger regulatorischen Enzyme auf eine fein abgestimmte Weise regulieren. (Abb. 10) Es gibt einen Regulationsmechanismus ohne die Verwendung eines Modulators. Solche regulatorischen Enzyme haben inaktive Vorstufen, die als

9 9 Zymogen bezeichnet werden. Das aktive Enzym entsteht aus einem Zymogen durch eine spezifische Spaltung seiner Primärstruktur mittels eines anderen Enzyms. Diese Spaltung wird mit einer Konformationsänderung gefolgt, die das aktive Zentrum des Enzyms zugänglich macht. Da diese Art Entstehung regulatorischer Enzyme irreversibel ist, ist besteht immer eine Inaktivierungsmöglichkeit. Dies wird meistens mittels eines irreversiblen Inhibitors verwirklicht. In der projizierten Abbildung ist die Entstehung von α-chymotrypsin beziehungsweise Trypsin aus ihren Zymogenen, Chymotrypsinogen beziehungsweise Trypsinogen dargestellt. Katalysiert von Trypsin wird das inaktive Chymotrypsinogen zuerst zwischen den Aminosäureresten 15 und 16 seiner Primärstruktur gespalten. Danach werden aus dem entstandenen π- Chymotrypsin die Aminosäurereste 14, 15, 147 und 148 mittels eines bereits existierenden α-chymotrypsin-moleküls abgespalten. Die drei Aminosäurerest- Ketten des α-chymotrypsins, wie Sie bereits wissen, werden durch Disulfid- Brücken zusammengehalten. Im Falle der Entstehung der aktiven Form von Trypsin werden die ersten 6 Aminosäurereste aus dem inaktiven Trypsinogen von dem Enzym Enteropeptidase entfernt. (Abb. 11) Aufgrund der Erwähnten kann man feststellen, dass die Regulierung der enzymatischen Reaktionen äußerst kompliziert ist. Man muss gestehen, dass die Wirklichkeit noch komplizierter ist als unsere heutigen, bezüglichen Kenntnisse. Es kann daher die Frage gestellt werden: was der Vorteil der dargestellten Komplexität der Regulation von enzymatischen Prozessen ist. Die Antwort besteht im Folgenden: würden in einer Zelle alle möglichen Reaktionen gleichzeitig und unkontrolliert verlaufen, würde die Zelle durch enzymatischen Abbau der Makromoleküle rasch getötet. Es ist die Regulierung der enzymatischen Katalyse,

10 10 die ermöglicht, dass immer nur solche Reaktionen gefördert werden, die für die Zelle zu einem gegebenen Zeitpunkt wichtig sind. Kann die Zelle auf umfangreiche Vorräte extrazellulärer chemischer Bausteine und chemischer Energie zugreifen, wird sie intrazelluläre Vorräte von den für sie wichtigen Stoffen aufbauen und speichern. Herrscht dagegen Mangel an extrazellulären chemischen Bausteinen oder chemischer Energie, können die gespeicherten Vorräte zum Vorgang des zellulären Stoffwechsels eingesetzt werden. Sowohl die ökonomische Aufnahme und Verarbeitung extrazellulärer chemischer Verbindungen, als auch der ökonomische Verbrauch der intrazellulären Vorräte werden je nach Bedarf der Zelle durch das Regulationssystem der enzymatischen Katalyse verwirklicht. Zusammenfassend in einem Satz: Die Regulation der enzymatischen Katalyse ist ebenso wichtig wie die enzymatische Katalyse selbst. Damit beende ich meine letzte Vorlesung in diesem Semester. Für meine mangelhaften Deutschkenntnisse möchte ich mich bei Ihnen entschuldigen. Ich bedanke mich für Ihre Aufmerksamkeit.