1. Biotechnologie-Tag an der Universität Leipzig 22. Mai 2002 ABSTRACTS. Herausgeber: Helmut Papp Annette G. Beck-Sickinger Svenne Eichler

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1 1. Biotechnologie-Tag an der Universität Leipzig 22. Mai ABSTRACTS Herausgeber: Helmut Papp Annette G. Beck-Sickinger Svenne Eichler

2 Herausgeber Lektorat und Datenaufbereitung Umschlaggestaltung und Layout Druck Prof. Dr. Helmut Papp Prorektor für Forschung und wissenschaftlichen Nachwuchs der Universität Leipzig Prof. Dr. Annette G. Beck-Sickinger Direktorin des Institutes für Biochemie, Fakultät für Biowissenschaften, Pharmazie und Psychologie, Universität Leipzig Dr. Svenne Eichler Geschäftsführerin des Biotechnologisch-Biomedizinischen Zentrums, Universität Leipzig Dezernat für Öffentlichkeitsarbeit und Forschungsförderung wpunktw kommunikation + werbung gmbh, Leipzig Jütte-Messedruck Leipzig GmbH Redaktionsschluss

3 INHALT VORWORT 11 1 MOLEKÜLDESIGN: VOM MOLEKÜL ZUM PATIENTEN Die zunehmende Resistenz gegen Antibiotika als Aufforderung zur Entwicklung neuartiger Antibiotika Peter Welzel Moenomycin-Aptamere Ulrich Hahn Biokristallographie in der Wirkstoffentwicklung und im Protein-Design Norbert Sträter Recombinant antibodies for therapy - achievements and feasibilities Stefan Dübel Cellular Internalisation of Calcitonin derived Carrier Peptides Investigation of Mechanism and Applications Ulrike Krauss, Annette G. Beck-Sickinger Funktion und Fehlfunktion von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren Ansätze für neue Therapieprinzipien Torsten Schöneberg Entwicklung und biologische Untersuchung von Inhibitoren der Angiogenese Athanassios Giannis 26

4 2 ZELLTECHNIK Biohybride Systeme vom 3D in vitro Gewebe-Mikrokapillar-Array zum invasiven Biomonitoring Andrea A. Robitzki, Hagen Thielecke, Alexandra Reininger-Mack Lasers in Cell Biology from Early Cancer Diagnosis to a Brain in Bottle Timo Betz, Allen Ehrlicher, Kristian Franze, Jochen Guck, Andreas Reichbach, Josef Käs Immunologische Toleranz und ihre klinischen Implikationen Frank Emmrich, Rüdiger Laub, Kai Kohlhaw Regenerative Medizin Technologische und Klinische Perspektiven Augustinus Bader Von supramolekularen Strukturen zu Wirkstoffträgern und künstlichen Zellen Edwin Donath 38 3 VOM PATIENTEN ZUM MOLEKÜL Von Interleukin-12 zur p40-zytokinfamilie wichtige Moleküle für die Infektabwehr Gottfried Alber Molekulare Ätiologie von Schilddrüsenerkrankungen Ralf Paschke Die vernetzte Zelle Die Analyse komplexer zellulärer Informationsverarbeitung und ihre Bedeutung für das Verständnis (patho)physiologischer Prozesse Friedemann Horn, Katja Heidrich Modellbasierte Optimierung von Tumortherapie Markus Loeffler, Dirk Hasenclever Analyse posttranslationaler Modifikation am Beispiel des Tau-Proteins Ralf Hoffmann 50

5 3.6 Eingriff in die Zellteilungskontrolle von Nervenzellen eine neuroprotektive Strategie Thomas Arendt Vom natürlichen zum maßgeschneiderten Effektor für Signaltransduktion und pathologischen Zielprozess Rolf Gebhardt 54 4 POSTER Auf dem Weg von der Spirale zur Zyste mögliche Überlebensstrategie von Borrelia burgdorferi Reinhard K. Straubinger, Samiya Al-Robaiy Phänotyp-Genotyp Assoziationen in komplexen Krankheiten Peter Ahnert, Holger Kirsten, Kathleen Hofmann Optimal enzymes for single molecule sequencing Petra Nieckchen, Sylvia Löbermann, Susanne Brakmann Membrane Binding of a Lipidated ras Peptide Studied by Solid-State NMR, Neutron Diffraction, and FTIR Spectroscopy Daniel Huster, Alexander Vogel, Hans Binder, Olaf Zschörnig, Thomas Gutberlet, Catherine Katzka, Herbert Waldmann, Klaus Arnold Rationales Design und in vitro Evolution einer thermostabilisierten Exonuclease III Sven Pfeifer, Thomas Greiner-Stöffele Proteome Analysis using Nano-HPLC Nano-ESI Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry Christian Ihling, Gry H. Dihazi, Andrea Sinz Percutaneous Penetration of Local Anesthetic Bases Pharmacodynamic measurements Claudia S. Leopold, Howard I. Maibach Proteine mit neuen Eigenschaften durch rationales und semirationales Protein-Design Rico Czaja, Katja Höschler, Ulrich Hahn 72

6 4.9 Selektion von RNA-Aptameren für den Y 5 -Rezeptor Heiko Fickert, André Hansen, Martin Höfliger, Annette G. Beck-Sickinger, Ulrich Hahn Stabilimere Eine neue Zukunft für den Einsatz von RNA-Aptameren in lebenden Organismen André Hansen, Heiko Fickert, Michael Geiling, Thomas Greiner-Stöffele, Ulrich Hahn Pro-NPY and truncated analogues are substrates for prohormone convertase PC1/3 Regula von Eggelkraut-Gottanka, Zuzana Machova, Richard Söll, Noureddine Brakch, Eric Grouzmann, Annette G. Beck-Sickinger Studying the Conformation of Neuropeptide Y in Solution by Fluorescence Resonance Energy Transfer Andrea Bettio, Michaela Dinger, Jochen Sieber, Annette G. Beck-Sickinger Molecular Characterization of the Neuropeptide Y Y 2 -Receptor Interaction Martin Höfliger, Annette G. Beck-Sickinger NMR-Diffusionsmessungen an komplexen Systemen vom Stofftransport zur medizinischen Diagnostik Jörg Kärger, Frank Stallmach, Wilfried Heink Interaktions- und Faltungsstudien an einzelnen Biomolekülen mit Hilfe der Optischen Pinzette Friedrich Kremer, Marc Struhalla, Mathias Salomo, Heike Lippold, Ulrich Hahn, Jörg Reinmuth, Wiktor Skokow Characterization of a Drug Carrier System in Cubic Liquid Crystalline Phase Using HR MAS NMR Spectroscopy André Pampel, Dieter Michel, Regina Reszka Charakterisierung von Polysaccharidgelen mit NMR-Techniken Jürgen Schiller, Lama Naji, Daniel Huster, Klaus Arnold HR-MAS-NMR-Spektren zur Untersuchung von Hirngewebe bei neurodegenerativen Erkrankungen Ralf Schober, Stefan Berger 92

7 4.19 Wechselwirkungen der Untereinheiten bei der Ausbildung eines enzymatisch aktiven Hetero-Oligomers Anke Edelmann, Jürgen Kirchberger, Jörg Bär MALDI-TOF Mass Spectrometry a versatile tool for proteome analysis Hassan Dihazi, Klaus Eschrich The usefulness of a transgenic animal approach as tool to study pathogenic aspects of Alzheimer s disease and to test for therapeutic and diagnostic strategies Reinhard Schliebs Liganden für den vesikulären Acetylcholin-Transporter auf der Basis neuartiger Vesamicolderivate Matthias Scheunemann, Dietlind Sorger, Margrit Klingner, Reinhard Schliebs, Jörg Steinbach Anpassungsqualifizierung arbeitsloser Akademiker/innen im Biotechnologiebereich Andrea Tannapfel Molecular analysis of the TBX5 gene in patients with Holt-Oram syndrome Andrè Moschik, Annegret Kujat, Ursula G. Froster A novel, fast progredient fibroblast-driven cartilage destruction model in SCID mice Ulrich Sack, Astrid Hirth, Franziska Krahnert, Benjamin Funke, Katharina Wiedemeyer, Franka Kahlenberg, Jörg Lehmann, Frank Emmrich Vaskulär-stromale Matrix als Modell für das Engineering weichgewebiger Transplantate Bernhard Frerich, Nico Lindemann, Jens-Peer Kuska, Kerstin Zückmantel, Stephan Müller, Jan Kurtz-Hoffmann Glatte Muskelzellen der humanen Harnblase exprimieren H1-, H2- und H3/H4-Histaminrezeptoren in Zellkultur Jochen Neuhaus, Jens-Uwe Stolzenburg, Thilo Schwalenberg, Wolfgang Dorschner 110

8 4.28 Candidate IBD vaccine: Generation of recombinant serotype 1-/serotype 2-strains of infectious bursal disease virus by reverse genetics Yvonne Oberländer, Rüdiger Raue, Kati Zierenberg, Hermann Müller Das zusätzliche Strukturprotein VP4 im Kapsid des aviären Polyomavirus APV ein Pathogenitätsfaktor? Reimar Johne, Hermann Müller Expression von Proteinen des Virus der infektiösen Bursitis im homologen Wirtszellsystem mit Hilfe rekombinanter Influenzaviren Katja Wiedemann, Reimar Johne, Hermann Nieper, Hermann Müller Das Interdisziplinäre Zentrum für Klinische Forschung (IZKF Leipzig) IZKF Leipzig Schwerpunkt A: Rheumatologie und Immunologie Frank Emmrich, Friedemann Horn IZKF Leipzig Schwerpunkt B: Endokrinologie Ralf Paschke, Wieland Kiess IZKF Leipzig Schwerpunkt C: Neurowissenschaften Yves D. von Cramon, Thomas Arendt IZKF Leipzig Schwerpunkt D: Molekulare Onkologie Christian Wittekind, Kurt Engeland IZKF Leipzig Schwerpunkt Z: Zentraler Funktionsbereich Michael Cross, Knut Krohn IZKF Leipzig Schwerpunkt Z: DNA-Technologien (Z03) Knut Krohn IZKF Leipzig Schwerpunkt Z: Peptid-Technologien (Z04) Sabine Tschiedel IZKF Leipzig Schwerpunkt Z: Fluoreszenz-Technologien (Z10) Ulrich Sack, Jan Richter, Jens Grosche, Andreas Reichenbach Neuroimmunologische Zellbiologie Gerald Münch Stammzellbiologie Zoe McIvor, Minyao Wu, Matthias Hoja, Sethu Narayanan, Michael Cross 138

9 4.42 Advanced Glycation Endproducts change glucose utilisation and cause ATP depletion in SH-SY5Y neuroblastoma cells Susana García de Arriba, Claudia Loske, Winnie Deuther-Conrad, Reinhard Schinzel, Gerald Münch Neurotoxicity of Methylglyoxal on Human SH-SY5Y Neuroblastoma Cells Synergism Among Glycation, Oxidative Stress and NMDA receptors Overactivation Susana Garcia de Arriba, Gabrielle Oehme, Gerald Münch Proinfl ammatory signal transduction pathways in N11 mouse microglia cell line activated by Advanced Glycation Endproducts (AGEs) Sladjana Dukic-Stefanovic, Jovana Gasic-Milenkovic, Winnie Deuther-Conrad, Gerald Münch Synergistic upregulation of inos expression and NO production by Amyloid β and Advanced Glycation Endproducts (AGEs) Amanda Wong, Sladjana Dukic-Stefanovic, Jovana Gasic-Milenkovic, Gerald Münch Interdisziplinäres Zentrum für Bioinformatik (IZBI) Ein Überblick On the temporal-spatial organisation of in vitro epithel-cell populations Jörg Galle, Markus Löffler, Dirk Drasdo Gene Expression Warehousing in Leipzig Toralf Kirsten, Hong Hai Do, Erhard Rahm, Knut Krohn Pfl anzenzellkultivierung zur Wirkstoffgewinnung Berit Döscher, Ilona Skinfill Rivera, Gerhard Kerns Biotechnologische Erzeugung von Polyhydroxyalkanoaten (PHA) zur Entwicklung biofunktionaler Zellträgersysteme für das Tissue Engineering Gisela Mothes, Jörg-Uwe Ackermann Transgene Hefen als Wirte für die Synthese von Polyhydroxyalkanoaten Uta Breuer, Wolfgang Babel, Yaroslav Terentiev, Gotthard Kunze 158

10 4.52 Mikrobielle Produktsynthesen aus toxischen Substraten eine kalorimetrisch ermöglichte Gratwanderung zwischen maximaler Syntheserate und einsetzender Vergiftung Thomas Maskow, Wolfgang Babel Oligomer-Nanopartikel Wirkstoff und Wirkstoff- Carrier Andreas Heppe Biotechnische Produktion pfl anzlicher Wirkstoffe André Gerth, Annette Hohe, Dirk Wilken Leistungsfähige Bioreaktoren mit polymeren Hohlfasermembranen für die Kultivierung von Zellen und Mikroorganismen Mathias Zachlod, Wolfgang Loettel, Monika Heinrich, Regine Eibl, Dieter Eibl 166 BIOTECHNOLOGISCH-BIOMEDIZINISCHES ZENTRUM EIN ÜBERBLICK 169

11 VORWORT Das Interesse, das dem ersten Leipziger Biotechnologie-Tag entgegengebracht wurde, war Ausdruck dafür, als wie wichtig ein wissenschaftlicher Gedankenaustausch erachtet wird und verdeutlichte gleichzeitig das aufeinander Zugehen von Wissenschaft und Wirtschaft. Europa steht vor der wichtigen politischen Entscheidung, die Biotechnologie so zu akzeptieren, wie sie von Nicht-Europäern gestaltet wird, oder selbst Konzepte zu ihrer verantwortungsbewussten Nutzung zu entwickeln. Je länger Europa zögert, um so weniger erscheint die zweite Option realistisch. Die Europäische Gemeinschaft zum führenden wissensbasierten Wirtschafts raum werden zu lassen, erfordert auf diesem Gebiet große Anstrengungen. Dabei sollen Zentren wissenschaftlichen Fachwissens wie es auch das Biotechnologisch-Biomedizinische Zentrum ist den Kern von regionalen Clustern der Biotechnologieentwicklung bilden. Bereits 1998 haben die Stadt Leipzig und die Universität Leipzig erste Gespräche geführt, wie dieses neue Arbeitsfeld der Lebenswissenschaften an der Universität entwickelt und für die wirtschaftliche Profilierung der Region fruchtbar gemacht werden kann. Das Miteinander von Wirtschaft und Wissenschaft ist dabei ein Abbild des guten Verhältnisses zwischen Stadt und Universität und ein Zeugnis für die hohe Verantwortung, die alle Partner füreinander empfinden. Die Universität will ihren Beitrag leisten, Leipzig noch attraktiver zu machen und mittels qualitativ hoher biomedizinischbiotechnologischer Forschung diesen Standort als Innovationszentrum zu profilieren. Das Potenzial der Biowissenschaften und Biotechnologie wird immer intensiver genutzt und es wird einen neuen Wirtschaftszweig hervorbringen, der mehr qualifizierte Arbeitsplätze und damit mehr Wohlstand schafft. Der 1. Biotechnologie-Tag an der Universität Leipzig hat dazu beigetragen eine Antwort auf die Frage nach der Spezifik des Forschungs- und Wirtschaftsstandortes Leipzig im Vergleich zu zahlreichen anderen deutschen Biozentren zu finden. Prof. Dr. Helmut Papp Prorektor für Forschung und wissenschaftlichen Nachwuchs Dipl.-Ing. Detlef Schubert Beigeordneter für Wirtschaft und Arbeit der Stadt Leipzig

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13 1. MOLEKÜLDESIGN: VOM MOLEKÜL ZUM PATIENTEN

14 MOLEKÜLDESIGN: VOM MOLEKÜL ZUM PATIENTEN 1.1 Die zunehmende Resistenz gegen Antibiotika als Aufforderung zur Entwicklung neuartiger Antibiotika Peter Welzel Das Auftreten von Resistenzen gegen die meisten der in der Therapie eingesetzten Antibiotika hat sich zu einem ernst zu nehmenden Problem entwickelt. Insbesondere bei Infektionen mit gram-positiven Erregern wie Staphylococcen, Streptococcen oder Enterococcen wird ein Rückfall in die präantibiotische Zeit, in der einige Infektionen unheilbar waren, zur drohenden Gefahr oder ist schon Realität. Deshalb ist die Entwicklung von Antibiotika mit neuen Wirkmechanismen, die keine Kreuzresistenz zu eingeführten Verbindungen zeigen, dringend geboten. Die einzelnen Schritte der Biosynthese des Peptidoglycans, der Stützsubstanz der Bakterienzellwand, sind als Targets für neuartige Antibiotika von besonderem Interesse, weil sie für Bakterien spezifisch sind. Dadurch verliert das Problem der Nebenwirkungen an Bedeutung. In dem Vortrag wurden die Moenomycin-Antibiotika vorgestellt, die den vorletzten Schritt der Peptidoglycan-Biosynthese (eine Glycosyltransfer- Reaktion) inhibieren, und die zu den aktivsten antibiotisch wirksamen 14

15 Verbindungen gehören, die man kennt. Ziel des Vortrags war, das Potenzial, das in Leipzig für die Beantwortung von Fragen im Forschungsfeld zwischen Chemie und Biowissenschaften / Medizin aufgebaut worden ist, darzustellen. Dies betrifft das Studium der Struktur-Wirkungs-Beziehungen in in-vivo- und in-vitro-testsystemen mit Hilfe synthetischer Strukturanaloga, Bestätigung dieser Befunde durch NMR-Messungen, die gezielte Einführung von Reportergruppen, das Studium von Interaktionen mit Membranen durch Fluoreszenz-Messungen, die Isolierung des inhibierten Enzyms mit Hilfe der Affinitätschromatographie, die Bestimmung der Bindungsstelle des Inhibitors am Enzym durch Photoaffinitätsmarkierung. Literatur K. Stembera, ChemBioChem 2002, 3, Prof. Dr. Peter Welzel Universität Leipzig Fakultät für Chemie und Mineralogie Institut für Organische Chemie welzel@organik.chemie.uni-leipzig.de 15

16 MOLEKÜLDESIGN: VOM MOLEKÜL ZUM PATIENTEN 1.2 Moenomycin-Aptamere Ulrich Hahn Aptamere sind Oligonucleotide, die in ihren Eigenschaften monoklonalen Antikörpern ähneln. Sie sind in der Lage, Liganden mit Bindungskonstanten im micro- bis pico-molaren Bereich zu binden. Aptamere werden in einem SELEX-Verfahren (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) aus einer Bibliothek von bis individuellen Molekülen angereichert. Wir haben in Zusammenarbeit mit den Arbeitsgruppen von M. Famulok (Bonn) und P. Welzel (Leipzig) eine Kollektion von Nucleaseresistenten 2 -Amino-modifizierten RNA-Aptameren selektiert, die das Antibiotikum Moenomycin mit Bindungskonstanten von nm binden 1, fluoreszenz-korrelations-spektrometrische Messungen ergaben einen Wert von ca. 440 nm 2. Moenomycin interagiert wahrscheinlich mit einer Domäne des Penicillin-Bindungs-Proteins (PBP) und inhibiert auf diese Weise die bakterielle Zellwandsynthese. 16

17 Wir wollen die Strukturen der von uns selektierten Aptamere im Komplex mit Moenomycin analysieren (NMR-Studien in Zusammenarbeit mit D. Patel, New York; Kristallisation in Leipzig, Röntgenstrukturanalyse zusammen mit N. Sträter). Darüber hinaus soll getestet werden, ob die Aptamere die in vivo-funktionen von Moenomycin beeinflussen können. Die Selektion weiterer auch biotechnologisch relevanter Aptamere in Zusammenarbeit mit Leipziger Gruppen und/oder im Rahmen des SFB 610 wurde angegangen und hat bereits zu ersten Erfolgen geführt. Anmerkungen 1 Schürer, H., Stembera, K., Knoll, D., Mayer, G., Blind, M., Förster, H.-H., Famulok, M., Welzel, P., and Hahn, U. (2001). Aptamers that bind to the antibiotic Moenomycin A, Bioorg Med Chem 9, Schürer, H., Buchynskyy, A., Korn, K., Famulok, M., Welzel, P., and Hahn, U. (2001). Fluorescence correlation spectroscopy as a new method for the investigation of aptamer/ target interactions, Biol Chem 382, Prof. Dr. Ulrich Hahn Universität Leipzig Fakultät für Biowissenschaften, Pharmazie und Psychologie Institut für Biochemie uli.hahn@uni-leipzig.de 17

18 MOLEKÜLDESIGN: VOM MOLEKÜL ZUM PATIENTEN 1.3 Biokristallographie in der Wirkstoffentwicklung und im Protein-Design Norbert Sträter Raumstrukturen besitzen eine herausragende Bedeutung für das Verständnis der Funktionsweise von Proteinen und Nukleinsäuren auf molekularer Ebene. So können beispielsweise Strukturen eines Enzyms im Komplex mit Substraten, Intermediaten und Komplexen untersucht werden, um ein Modell für den Katalysemechanismus zu entwickeln. Die Bestimmung von Strukturen von Proteinkomplexen ermöglicht es, die Interaktion von Proteinen zu verstehen. Auch dynamische Prozesse, wie z. B. Domänen bewegungen oder die Bewegung von Untereinheiten in allosterisch regulierten Proteinen können durch Strukturbestimmung der einzelnen Konformationszustände verstanden werden. 3D-Strukturen spielen aber auch in industriell wichtigen Verfahren wie der rationalen Wirkstoffentwicklung oder dem strukturbasierten Protein- Design eine wichtige Rolle. Allerdings haben sich die anfänglich sehr optimistischen Hoffnungen, alleine auf der Grundlage einer atomaren Raumstruktur pharmakologisch relevante Inhibitoren als neue Wirkstoffe direkt berechnen zu können, bisher nicht erfüllt. Vielmehr ist es möglich, bei Vorhandensein einer Leitstruktur, die z. B. aus kombinatorischen Substanzbibliotheken stammen kann, die Anbindung dieser Leitstruktur an das Target strukturell zu charakterisieren und neue, besser bindende Derivate zu entwerfen. Proteine können aber auch selber von biotechnologischer oder pharmakologischer Bedeutung sein, z. B. als Katalysatoren spezieller Syntheseschritte oder in der Lebensmittelindustrie. Hier kann auf der Grundlage der Struktur des aktiven Zentrums eine neue Reaktivität oder Spezifität durch Protein-Design erzeugt werden. Therapeutische Proteine, z. B. Antikörper, können mit Hilfe ihrer Raumstruktur hinsichtlich Stabilität oder Bindungseigenschaften optimiert werden. Neben der NMR-Spektroskopie können nur mittels Röntgenkristallographie routinemäßig Strukturen biologischer Makromoleküle zu atomarer Auflösung bestimmt werden. Die NMR-Spektroskopie ist mit der Arbeits- 18

19 gruppe Prof. Berger im Institut für Analytische Chemie in Leipzig bereits etabliert. Ergänzend dazu werde ich zukünftig die Biokristallographie im BBZ vertreten. Dabei sollen in neuen Projekten Schwerpunkte auf das Gebiet Metalloprotein Design und auf die bereits genannten medizinisch oder biotechnologisch relevanten Anwendungsaspekte gesetzt werden. Prof. Dr. Norbert Sträter Universität Leipzig Biotechnologisch-Biomedizinisches Zentrum (BBZ) Professur für Strukturanalytik von Biopolymeren und Fakultät für Chemie und Mineralogie

20 MOLEKÜLDESIGN: VOM MOLEKÜL ZUM PATIENTEN 1.4 Recombinant antibodies for therapy - achievements and feasibilities Stefan Dübel 100 years after the first identification of antibodies as potential therapeutics by Paul Ehrlich, not more than nine specific antibody therapeutics have been approved. The reason is the immunogenicity of antibodies produced in animals. Consequently, the major motivation for developing recombinant antibody technologies resulted from the possibility to generate human antibodies, which were not accessible by the conventional polyclonal or monoclonal approaches. In 1997, the first recombinant antibody (Rituxan) was approved for clinical use in cancer treatment by the United States FDA, only followed by a few more until the end of the millennium (e.g. Zenapax, Synagis, Herceptin). These antibodies still have not yet been generated using combinatorial approaches such as phage display technology, but are first generation chimeric or humanised variants of mouse hybridoma antibodies. However, more than 100 clinical studies are underway. Keeping in mind the delay between research and even first clinical trials and the approval as a drug, it can be expected that recombinant antibody based therapies will be a widespread and acknowledged tool in the hands of the physicians of the year The rise of antibody-based therapeutics further illustrates the substantial change in the paradigms of pharmaceutical development, by utilising the body s own capabilities as a source for a drug rather than the chemists reagents vessel. As a consequence, antibody therapeutics already represent the most abundant substance class in the FDA future approval pipeline. This growth will continue, and we will soon see the advent of a novel generation of antibody drugs, based on fusion proteins expanding the capability of native antibodies to allow entirely new therapeutical approaches. Our work in Heidelberg for the last 10 years was focussed on the technological aspects of generation and production, as well as manipulation of the molecular architecture of recombinant antibodies. Following pioneering contributions to antibody phage display (see e.g. US Patent ) and to the construction of antibody libraries with randomised CDRs (see e.g. US 20

21 Patent ), we have developed novel bispecific antibody formats and antibody fusion proteins. Further, a novel helper phage system (hyperphage) was developed which increases the efficiency of panning steps in antibody phage display screenings by one to two orders of magnitude. Selected recent publications Kontermann, R. & Dübel, S. (Eds.) (2001) Antibody Engineering. Springer Verlag; Heidelberg, New York. ISBN: Breitling, F. & Dübel, S. (1999) Recombinant Antibodies. John Wiley and Sons, New York. ISBN Rondot, S., Koch, J., Breitling, F. & Dübel, S. (2001) A helperphage to improve single chain antibody presentation in phage display Nature Biotechnol. 19, Liang, M., Dübel, S., Li, D., Queitsch, I., Li, M. & Bautz, E.K.F. Baculovirus expression cassette vectors for rapid production of complete human IgG from phage display selected antibody fragments J. immunol. Meth. 247, Koch, J., Breitling, F., & Dübel, S. (2000) Rapid Titration of filamentous Bacteriophage (M13) on nitrocellulose membranes BioTechniques, 29, Schmiedl, A., Breitling, F. & Dübel, S. (2000) Expression of a bispecific dsfv-dsfv antibody fragment in E. coli. Protein Engineering 13, Chakravarty, S., Mitra, N., Queitsch, I., Surolia, A., Varadarajan, R. & Dübel, S. (2000) Protein stabilization through phage display. FEBS Letters, 476, Schmiedl, A., Breitling, F., Winter, C. Queitsch, I. & Dübel, S. (2000) Effect of engineered Cysteines on yield, solubility and activity in various recombinant antibody formats expressed in E. coli. J. Immunol. Meth. 242, Kneissel, S., Queitsch, I., Petersen, G., Behrsing, O., Micheel, B. & Dübel, S. (1999) Epitope structures recognised by antibodies against the major coat protein (g8p) of filamentous bacteriophage fd (Inoviridae) J. Mol. Biol. 228, PD Dr. Stefan Dübel Lifebits AG s.duebel@lifebits.de 21

22 MOLEKÜLDESIGN: VOM MOLEKÜL ZUM PATIENTEN 1.5 Cellular Internalisation of Calcitonin derived Carrier Peptides Investigation of Mechanism and Applications Ulrike Krauss, Annette G. Beck-Sickinger The therapeutic potential of biopolymers, e.g., peptides, proteins or oligonucleotids, for the treatment of numerous human diseases is very promising. However, since most of these compounds show only poor bioavailability, it is difficult to establish effective therapeutic strategies. Examples of limiting factors are the hydrophobicity and charge selectivity of the lipid membrane, tight junctional and enzymatic barrier functions of the biomembranes as well as the large molecular size and high charge density or polarity of the biopolymers. Various attempts to overcome these problems have been made so far, e.g., chemical modifications or galenical formulations. Carrier peptides with membrane translocating ability are considered as very promising tools for drug delivery systems. Carrier peptides are also helpful tools for investigations of signal transduction, intracellular trafficking or cell-cell communication. Currently used methods are either harmful to the cells (disrupting the cell membrane) or can only be applied to a limited number of cells (e.g. microcapillary injection). With little or no effect on cell viability carrier peptides can shuttle their cargoes (e.g., peptides, proteins or nucleotides) across cell membranes. Several sequences are currently used as carrier peptides, e.g. HIV Tat-protein derived peptides, penetratin or transportan. We study the suitability of human Calcitonin (hct) derived carrier peptides 1. Due to its physiological origin as a human peptide hormone, intrinsic toxicity or antigenicity are not expected. Since the N-terminal part of the hormone, that is responsible for the activation of the hct-receptor, hormone side effects are unlikely with respect to a future therapeutic application. The mechanism of uptake of carrier peptides is still not completely understood. However, different mechanisms seem to be involved for the different sequences, also the size of the cargo could influence the cellular uptake. Former studies revealed that hct and its C-terminal fragment hct (9-32) are internalised by the nasal epithelium and various cell lines via an endocytotic pathway 1. We further examined the uptake and intracellular 22

23 fate of a hct-derived carrier peptide by fluorescence microscopy and confocal laser scanning microscopy (CLSM), constructed an enzymatic cleavage site for rapid release of the cargo once internalised and added a nuclear translocation sequence (NLS). We also coupled the anti-tumor drug daunorubicin via two different linkers to the carrier peptide, one linker acid-labile, and the other stable at ph 5. Daunorubicin coupled via the acid-labile linker was active, while in the other case no cytotoxic activity could be determined. This confirms the endocytotic uptake, release of the acid-labile conjugated drug in the endosomal compartments (ph 5-6), while the stable conjugate is inactive. Furthermore, the uptake of proteins 2 and DNA has been shown by using the green fluorescent protein (GFP) covalently linked to hct (9-32) or in a GFP reporter gene assay. Notes 1 Maria Christiane Schmidt, Barbara Rothen-Rutishauser, Beate Rist, Annette G. Beck- Sickinger, Heidi Wunderli-Allenspach, Werner Rubas, Wolfgang Sadée, Hans Peter Merkle (1998) Translocation of human calcitonin in respiratory nasal epithelium is associated with self-assembly in lipid membrane, Biochemistry 37, Zuzana Machova, Christiane Mühle, Ulrike Krauss, Rahel Trébin, Annette Koch, Hans- Peter Merkle, Annette G. Beck-Sickinger (2002) Cellular Internalization of Enhanced Green Fluorescent Protein Ligated to Human Calcitonin-based Carrier Peptide, ChemBiochem, in press. Prof. Dr. Annette G. Beck-Sickinger, Ulrike Krauss Universität Leipzig Faculty of Biosciences, Pharmacy and Psychology Institute of Biochemistry beck-sickinger@uni-leipzig.de 23

24 MOLEKÜLDESIGN: VOM MOLEKÜL ZUM PATIENTEN 1.6 Funktion und Fehlfunktion von G-Proteingekoppelten Rezeptoren Ansätze für neue Therapieprinzipien Torsten Schöneberg Mutationsbedingte Veränderungen der Struktur von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) verursachen eine Vielzahl von Erkrankungen, die endokrine Funktionsstörungen, Blindheit und sogar Tumore einschließen. Für wenige dieser Erkrankungen ist derzeit eine kausale Therapie möglich. Die häufigste molekulare Ursache für solche Erkrankungen ist der Funktions verlust eines GPCR. Die molekulargenetische und funktionelle Charakterisierung bildet eine wichtige Grundlage, das pathomechanistische Verständnis für GPCR-bedingte Erkrankungen zu erweitern und darauf auf bauend neue therapeutische Strategien für diese Krankheiten zu entwickeln. Therapeutisch problematisch sind vor allem Rezeptor inaktivierungen, die durch eine Proteintrunkierung hervorgerufen werden. Exemplarisch für diese Gruppe von GPCR-bedingten Erkrankungen wurde eine transgene Mauslinie etabliert, die ein vorzeitiges Stopp-Codon in ihrem V 2 -Vasopressin-Rezeptor (V 2 -R) trägt. Der Funktionsverlust des V 2 -R führt zu einem Phänotyp, wie er beim X-chromosomal vererbten 24

25 renalen Diabetes insipidus (NDI) des Menschen beobachtet wird. An diesem Tiermodell werden derzeit neue Therapieprinzipien auf ihre Effizienz überprüft, die auf der Translations- und Proteinebene angreifen und in in vitro-systemen bereits erfolgreich eingesetzt wurden. So erhöhen z. B. Aminoglykoside die Überleserate von vorzeitigen Stopp-Codons, so dass durch Nonsense-Codons unterbrochene mrnas zu funktionsfähigen Rezeptoren translatiert werden können. In in vitro Systemen wurden die Effizienz und Potenz verschiedener Aminoglykoside getestet und Applikationsintervalle und notwendige Dosierungen optimiert. Diese Erkenntnisse werden nun auf das NDI-Mausmodell übertragen. In einem weiteren Ansatz soll auf Proteinebene die Rezeptorfunktion des mutierten Rezeptors mittels eines komplementären V 2 -R-Fragments wiederhergestellt werden. Es wird erwartet, dass die mit dem NDI-Mausmodell gewonnenen Erfahrungen bei anderen durch Mutationen in GPCR und weiteren Membranproteinen hervorgerufene Erkrankungen ge nutzt werden können. PD Dr. Torsten Schöneberg Freie Universität Berlin Universitätsklinikum Benjamin Franklin Institut für Pharmakologie schoberg@zedat.fu-berlin.de 25

26 MOLEKÜLDESIGN: VOM MOLEKÜL ZUM PATIENTEN 1.7 Entwicklung und biologische Untersuchung von Inhibitoren der Angiogenese Athanassios Giannis Die Angiogenese (Neovascularisation) ist der Prozess der Bildung neuer Blutkapillaren aus einem bereits existierenden Blutgefäß. Sie ist von fundamentaler Bedeutung bei einer Reihe physiologischer und pathologischer Vorgänge wie z. B. Embryonalentwicklung, Wundheilung, chronischen Entzündungen und malignen Prozessen. Inhibitoren der Angiogenese kommen sowohl als Antikrebsmittel in Betracht als auch als Mittel zur Behandlung von Erkrankungen, bei denen die Neovas cula ri sation mit einer Verschlechterung der allgemeinen gesund heitlichen Lage verbunden ist. Dazu gehören insbesondere die diabetische Retinopathie und rheumatoide Arthritis. In den letzten Jahren wurden zahlreiche endogene Regulatoren der Angiogenese isoliert und identifiziert. Zu den wichtigen positiven Regulatoren zählen Wachstums faktoren wie z. B. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), basic Fibroblast Growth Factor (bfgf), Epidermal Growth Factor (EGF), Platelet Derived Growth Factor (PDGF). Aktuell konzentriert sich meine Forschung auf das Design, die Synthese und die biologische Unter suchung folgender Naturstoff-Analoga: a) Fumagillin- und Ovalicin-Derivate als Inhibitoren der MetAP-2 und somit der Angiogenese, b) Peptidmimetika (u.a. aus der Benzodiazepin-Klasse) als α v β 3 -Integrin-Antagonisten, 26

27 c) ATP-Analoga als Inhibitoren verschiedener Rezeptor-Tyrosinkinasen, d) Ceramid-Analoga als Blocker der Ceramid-vermittelten Signaltransduktion z. B. durch die Modulation der PKB-Aktivität und der Apoptose, e) Trichostatin-Analoga als Inhibitoren der Histondeacetylase: Über die Unterdrückung der Bio synthese des Wachstumsfaktors VEGF soll auch die Tumor- Angiogenese blockiert werden. Die Eignung dieser Verbindungen als Angiogenese-Inhibitoren wird mit Hilfe verschiedener Assays in unserem Labor untersucht. Dazu gehören u.a. der Migrations-, Proliferations-, Adhäsions- und Apoptose-Assay. Dadurch beabsichtigen wir Beiträge zur Entwicklung neuartiger Antikrebsmittel, Adhäsions blocker sowie antiproliferativer und antiinflammatorischer Wirk stoffe zu leisten. Prof. Dr. Athanassios Giannis Universität Leipzig Fakultät für Chemie und Mineralogie Institut für Organische Chemie

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29 2. ZELLTECHNIK

30 ZELLTECHNIK 2.1 Biohybride Systeme vom 3D in vitro Gewebe- Mikrokapillar-Array zum invasiven Biomonitoring Andrea A. Robitzki, Hagen Thielecke, Alexandra Reininger-Mack Die Proteomforschung fordert verstärkt Methoden und Technologien, die eine rasche, effektive Analyse von Proteinen bzw. molekularen Ziel strukturen sowie deren Funktion in lebenden Systemen ermöglichen. Derzeit besteht diesbezüglich ein Engpass an der Schnittstelle Zell- und Gewebe-basierter Analytik und Evaluation in repräsentativen Tiermodellen, die beide zeitund kostenintensiv sind. Dreidimensionale organotypische Gewebe modelle oder Zell-gekoppelte 3D-Polymermatrizes können als komplexe Zielstrukturen entwickelt und mit der modernen Biochip technologie (z. B. Mikrokapillar-Arrays) für ein automatisiertes, funktionelles Biomonitoring kombiniert werden. Multi-Mikrokapillar-Arrays können mit verschiedenen dreidimensionalen in vitro Gewebemodellen, z. B. Biopsie material von Patienten, Zell-gekoppelte 3D-Polymermatrizes, Tumor sphäroide, 3D- Herzmuskelzellaggregate etc. für ein funktionelles bioelektro nisches Monitoring (Impedanzspektroskopie, Potenzialableitung) generiert werden. Ein exemplarischer Anwendungsbereich für 3D in vitro Gewebebasierte Biosensoren ist z. B. die Tumorforschung bzw. Tumor-Diagnostik und Therapiekontrolle. Das frequenzabhängige Verhalten der elektrischen Impedanz von Einzelzellen oder Zellverbänden bzw. Geweben spiegelt 30

31 wesentlich strukturelle und elektrische Eigenschaften wider. Es wurde eine Antisense-Gentransferstudie an Brustkrebs-Tumorsphäroiden mit dem Ziel der Inhibition der Genexpression des Proliferations markers Butyryl cholin este rase durchgeführt. Die Konsequenz war eine Proliferations inhibition sowie eine Apoptose-Induktion in diesem genmodifizierten in vitro Tumormodell. Für ein funktionelles, bioelektronisches Monitoring dieser physiologischen Vorgänge wurden Kontroll- und genmanipulierte Tumor sphäroide hydrodynamisch in ein Kapillarmesssystem mit einer 4-Elektroden konfiguration positioniert und einer Impedanzspektroskopie unterzogen. Signifikant war der deutlich erniedrigte extrazelluläre Widerstand (R ext ) antisense-behandelter Sphäroide unabhängig von ihrer Größe, jedoch korrelierend mit der geringeren Zellzahl pro Volumeneinheit. Die Technologievorteile ergeben sich somit durch eine rasche, zerstörungsund markierungsfreie Echtzeit- und Langzeitmessung an vitalen organo typischen Gewebemodellen unter physiologischen Bedingungen. Das Prinzip der Impedanzspektroskopie kann ebenso für ein in vivo Bio monitoring in Gefäßen, Geweben oder Organen des Organismus via implantierbarer Mikrostrukturen eingesetzt werden. PD Dr. Andrea A. Robitzki, Hagen Thielecke, Alexandra Reininger-Mack Fraunhofer-Institut für Biomedizinische Technik Abteilung Biohybride Systeme andrea.robitzki@ibmt.fhg.de 31

32 ZELLTECHNIK 2.2 Lasers in Cell Biology from Early Cancer Diagnosis to a Brain in Bottle Timo Betz, Allen Ehrlicher, Kristian Franze, Jochen Guck, Andreas Reichbach, Josef Käs Since any biological cell more advanced in evolution than a bacterium, depends in its internal structure and organization on the cytoskeleton a highly dynamic polymer network within the cell interior our group strives to understand the physics of the cytoskeleton 1. We have developed novel laser-based nanomanipulation tools to take a look into cells and to investigate the cytoskeleton 2. We particularly examine to which extent changes in the cytoskeleton characterize the progression of cancer from precancer to metastasis and how the cytoskeleton can be used to control neuronal growth 3,4. Our ultimate goal is the development of a tabletop device for quick cancer diagnosis, which accomplishes cancer s earliest detection and precise determination of its stage existing techniques fail in both aspects. Moreover, our research group plans to build wellcontrolled circuits of genuine neurons 5 and to develop novel therapies in neuroprothetics. 32

33 Notes 1 D. Humphrey, C. Duggan, D. Saha, D. Smith, J. Käs, Active fl uidization of polymer networks through molecular motors, Nature, 416, (2002) 2 J. Guck, R. Ananthakrishnan, T.J. Moon, C.C. Cunningham and J. Käs, Optical deformability of soft dielectric materials, Phys. Rev. Lett., 84(23), (2000) 3 J. Guck, R. Ananthakrishnan, T.J. Moon, C.C. Cunningham and J. Käs, The Optical Stretcher A Novel, noninvasive tool to manipulate biological materials, Biophys. J., 81, (2001) 4 J. Guck, R. Ananthakrishnan, C.C. Cunningham, and J Käs, Stretching Biological Cells with Light, Jour. of Phys.: Cond. Mat., 14, (2002) 5 A. Ehrlicher, T. Betz, B. Stuhrmann, D. Koch, V. Milner, M. Raizen and J. Käs, Guiding neuronal growth with light, PNAS, in press (2002) Prof. Dr. Josef Käs, Timo Betz, Allen Ehrlicher, Jochen Guck Universität Leipzig Fakultät für Physik und Geowissenschaften Institut für Experimentelle Physik I Abteilung für die Physik der weichen Materie jkaes@physik.uni-leipzig.de Prof. Dr. Andreas Reichbach, Kristian Franze Universität Leipzig Medizinische Fakultät Paul-Flechsig-Institut für Hirnforschung reia@medizin.uni-leipzig.de 33

34 ZELLTECHNIK 2.3 Immunologische Toleranz und ihre klinischen Implikationen Frank Emmrich, Rüdiger Laub, Kai Kohlhaw Wir haben ein Verfahren entwickelt, bei dem mit Hilfe von Antikörpern gegen das Differenzierungs-Antigen CD4 auf Helfer-T-Lymphozyten in Verbindung mit Antigen-Gabe spezifische Immuntoleranz induziert werden kann. Das Prinzip wurde erstmals in den 80er Jahren in tierexperi mentellen Systemen beschrieben und konnte bisher noch nicht klinisch eingesetzt werden, da es nicht möglich war, das toleranzinduzierende Potenzial eines monoklonalen Anti-CD4-Antikörpers im Humansystem zu testen. Antikörper, die gegen menschliches CD4 hergestellt werden, reagieren nicht mit den vergleichbaren Molekülen in Versuchstieren. Es ist uns in mehrjähriger Arbeit gelungen, ein tierexperimentelles Testsystem zu entwickeln, bei dem transgene menschliche Moleküle das gentechnische ausgeschaltete Maus-CD4 ersetzen. Wir konnten zeigen, dass in diesen Mäusen das menschliche CD4-Molekül unter dem korrekten Promoter auch in gleicher Organverteilung exprimiert wird, wie im Wildtyp. Gegenüber einem Modell-Antigen (Tetanustoxoid- Impfstoff) gelingt es in diesem Modell, eine langanhaltende spezifische Immuntoleranz zu erzeugen. Das Versuchstier bleibt dabei immunologisch voll funktionstüchtig und erhält keine medikamentöse Immunsuppression. Bei Antigen-Stimulation werden sowohl transgenes humanes CD4 wie auch transgenes humanes HLA-DR3 für die Erkennung durch den T- Zellrezeptor benutzt. Dies konnte durch nahezu vollständige Blockierung der in vitro Immunantwort mit Hilfe von Antikörpern gegen beide Moleküle nachge wiesen werden. Als Modell einer klinischen Anwendung wurde die Lebertransplantation bei der Ratte untersucht. Hierbei wurde ein spezieller Anti-CD4-Antikörper gegen Ratten-CD4-Moleküle eingesetzt. Es konnte demonstriert werden, dass eine kurzzeitige Behandlung mit lediglich zwei Antikörper- Injektionen zum Zeitpunkt der Transplantation zu einer lebenslangen Akzeptanz des Organtransplantates ohne die Notwendigkeit für zusätzliche immun suppressive Medikation führte. 34

35 Um den klinischen Einsatz vorzubereiten, wurde eine Laboreinheit aufgebaut, die im vorigen Jahr die pharmazeutische Herstellungs genehmigung für monoklonale Antikörper erhalten hat. Insofern sind die Voraussetzungen für klinische Pilotbehandlungen und die klinische Prüfung des Konzeptes gegeben. Literatur Laub, R., Dorsch, M., Wedekind, D., Meyer, D., Schröder, S., Ermann, J., Lehmann, J., Mähler, M., Emmrich, F., Hedrich, H.J. Replacement of murine by human CD4 and introduction of HLA-DR17 in mice: A tripletransgenic animal model to study human MHC II-CD4 interaction in situ J. Exp. Animal Sci. 39 (1999) Laub, R., Dorsch, M., Wenk, K., Emmrich, F. Induction of immunologic tolerance to tetanus toxoid by anti-human CD4 in HLA-DR3(+)/ human CD4(+)/murine CD4(-) multiple transgenic mice. Transplant. Proc. 33 (2001) Prof. Dr. Frank Emmrich, Dr. Rüdiger Laub, Dr. Kai Kohlhaw Universität Leipzig Universitätsklinikum Institut für Klinische Immunologie und Transfusionsmedizin emmf@medizin.uni-leipzig.de 35

36 ZELLTECHNIK 2.4 Regenerative Medizin Technologische und Klinische Perspektiven Augustinus Bader Durch weitreichende Weiterentwicklungen im Bereich der Biotechnologie entsteht derzeit die Regenerative Medizin als neue Disziplin, die gegen wärtige therapeutische Methoden erheblich verändern könnte. Sowohl Medizin, Stammzellbiologie, Tissue Engineering, Nanotechnologie, Genom forschung, Materialwissenschaften als auch die Bioverfahrenstechnik werden in Zukunft stärker zusammenarbeiten, um diese neuen therapeutischen Prinzipien entwickeln zu können. Es ist das langfristige Ziel individualisierte und zellbasierte Therapieverfahren zu entwickeln, die eine autologe Regeneration ermöglichen werden. Am Beispiel der 36

37 Entwicklung kardio vaskulärer Implantate (Gefäße und Herzklappen), einer bioartifiziellen Leber und eines biologischen Knochenersatzes werden die Zusammenhänge zwischen den technologischen und klinischen Erfordernissen aufgezeigt. Die extrazelluläre Matrix stellt hierbei einen wesentlichen Differenzierungsfaktor dar, der durch die chemische Zusammensetzung der Matrix, deren räumliche Anordnung und durch mechanische Faktoren an die Zellen übertragen wird. Diese Trias hat eine permissive Funktion für die dreidimensionale Gewebe züchtung. Prof. Dr. Augustinus Bader Eberhard-Karls-Universität Tübingen Institut für Anatomie Sektion Tissue Engineering 37

38 ZELLTECHNIK 2.5 Von supramolekularen Strukturen zu Wirkstoffträgern und künstlichen Zellen Edwin Donath Polyelektrolytmultischichten werden auf kolloidale Template durch Adsorption unterschiedlich geladener Polyelektrolyte schichtweise aufge bracht. Der kolloidale Kern kann danach abgebaut bzw. herausgelöst werden. Man erhält eine Hohlkapsel in kolloidalen Abmessungen. Größe und Form der Kapsel entsprechen den Abmessungen des Templates. Die Zusammensetzung der Schicht lässt sich in radialer Richtung nanometergenau kontrollieren. Polymere oder auch Nanopartikel mit unterschiedlichen Funktionen können eingebaut werden. Z. B. ist es möglich, Polyelektrolyte und Biopolyelektrolyte, fluoreszierende und magnetische Nanopartikel, Tenside, Farbstoffe, Lipide miteinander zu kombinieren. Auf diese Art und Weise lassen sich multifunktionale Kapseln herstellen. Verschiedene Template können verwendet werden. Von besonderer Bedeutung sind biologische Zellen. Die entstehenden Kapseln sind form- und größengenaue Repliken der Ausgangspartikel. Besondere Bedeutung für Anwendungen besitzt die Permeabilität der Wände. Diese wird mit konfokaler Mikroskopie und spektroskopischen Techniken gemessen. Durch Schalten der Permeabilität über Veränderungen der Lösungsparameter lassen sich Kapseln mit Wirkstoffen beladen. Die Freisetzung des Wirkstoffes kann durch die Wandeigenschaften kontrolliert werden. Die Ausschlusseigenschaften der Kapseln für Polymere werden genutzt, um im Inneren Polymerisation und enzymatische Reaktionen durchzuführen. Die Kapselwand kann als Auflage für Lipidmembranen dienen. Diese wiederum können mit Biomembranfunktionen ausgerüstet werden. Man erhält eine biomimetische Struktur, die in Aufbau und Funktion zelluläre Eigenschaften nachbildet. 38

39 Prof. Dr. Edwin Donath Universität Leipzig Medizinische Fakultät Institut für Medizinische Physik und Biophysik

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41 3. VOM PATIENTEN ZUM MOLEKÜL

42 VOM PATIENTEN ZUM MOLEKÜL 3.1 Von Interleukin-12 zur p40-zytokinfamilie wichtige Moleküle für die Infektabwehr Gottfried Alber Bei vielen Infektionskrankheiten gibt es immer noch keine befriedigende Chemotherapie oder Impfstoffe. Die molekulare Untersuchung der Immunregulation bei Infektionen könnte zur Entwicklung weiterer Vakzine führen. Durch T-Helfer(Th)1-Zellen induzierte zellvermittelte Immun reaktionen sind essentiell für Infektionen mit einer Reihe bakterieller, fungaler und protozoärer intrazellulärer Erreger. Nur durch die Wirkung der von Th1-Zellen sezernierten Zytokine Interferon(IFN)-γ und Tumor nekrosefaktor(tnf)-α gelingt es infizierten Makrophagen, auch solche Erreger zu eliminieren, die Strategien zum intrazellulären Überleben entwickelt haben. Th1-Zellen differenzieren aus verschiedenen Vorläufer stadien durch den Einfluss von Interleukin(IL)-12. IL-12 besitzt eine für Zytokine atypische heterodimere Struktur. Es besteht aus zwei glykosylierten Untereinheiten (35 kd und 40 kd), die durch eine Disulfidbrücke kovalent miteinander verknüpft sind. Beide Ketten werden durch verschiedene Gene kodiert. Das häufig kurz als IL-12 bezeichnete heterodimere IL-12p75 wird von aktivierten antigenpräsentierenden Zellen (APC) synthetisiert. Interessanterweise sezernieren stimulierte APC parallel zu IL-12p75 in fachem Überschuss auch freies monomeres und homodimeres p40. Unsere Gruppe hat sich in den letzten Jahren vor allem mit der Rolle von IL-12p75 und weiterer p40-abhängiger Zytokine in der Immunität gegen zwei verschiedene intrazelluläre Erreger beschäftigt: Cryptococcus neoformans (C. neoformans), ein AIDS- assoziierter Errreger, und Salmonella Enteritidis (S. Enteritidis), ein Erreger mit lebensmittelhygienischer Bedeutung. Durch den Vergleich von infizierten Wildtypmäusen mit IL- 12p35-gendefizienten (IL-12p35 -/- )-Mäusen konnten wir in beiden Infektions modellen die essentielle Rolle von IL-12p75 nachweisen. Interessan terweise erwiesen sich infizierte IL-12p35/40 -/- -Mäuse, die weder IL-12 noch freies p40 bilden können, als noch empfindlicher als IL-12p35 -/- - Mäuse (die noch freies p40 bilden). Da wir durch Gabe von rekombinantem 42

43 monomeren oder homodimeren p40 die Defekte von infizierten IL-12p35/ 40 -/- -Mäusen nicht kompensieren konnten, postulierten wir bereits 1998 weitere p40-abhängige Heterodimere, was sich im Jahr 2000 mit der Publikation von IL-23 auch bewahrheitete. IL-23 ist ein Heterodimer aus der p40-untereinheit und einer neu entdeckten 19 kd-polypeptidkette. Es wurde gezeigt, dass IL-23 in der Immunantwort z. T. ähnliche Funktionen wie IL-12 ausübt (IFN-γ-Produktion), z. T. aber auch von IL-12p75 verschiedene Funktionen (Aktivierung von T-Gedächtniszellen) hat. Weitere Untersuchungen zur Abklärung der Rolle von endogenem IL-23 sollen im Rahmen einer Kooperation mit R. A. Kastelein (DNAX Research Institute, USA) unter Verwendung von p19 -/- -Mäusen vorgenommen werden. Was mit der Entdeckung von IL-12 als Th1-Differenzierungsfaktor begonnen hat, setzt sich nun mit einer ganzen Familie von Molekülen, die die p40-untereinheit mit IL-12 gemeinsam haben, fort. In Zusammenhang mit ihrer Rolle in der Infektabwehr sind wir an der möglicherweise erregerspezifischen, zeit- und dosisabhängigen Induktion von p40, p35 und p19 im Mausmodell interessiert. Die bisherigen Daten weisen auf eine biologische Funktion dieser Proteinfamilie bei chronisch verlaufenden Infektionen mit niedrigen Erregerzahlen hin. Möglicherweise sind zu den bisher bekannten p40-familienmitgliedern auch noch neue Mitglieder zu erwarten. Prof. Dr. Gottfried Alber Universität Leipzig Veterinärmedizinische Fakultät Institut für Immunologie

44 VOM PATIENTEN ZUM MOLEKÜL 3.2 Molekulare Ätiologie von Schilddrüsenerkrankungen Ralf Paschke Mittels Ultraschall sind bei einem Drittel der deutschen Normalbevölkerung Schilddrüsenknoten detektierbar. In bis zu 5% findet man in diesen Schilddrüsenknoten ein Schilddrüsenkarzinom. Daher ist bei Schilddrüsen knoten in der Regel eine Abklärung mittels der Feinnadelaspirationszytologie erforderlich. Diese wird bisher nach rein morphologischen Aspekten ausge wertet und hat daher beschränkte Aussagemöglichkeiten. Auf Grund dieser und anderer diagnostischer Unzulänglichkeiten wird daher schließlich nur bei wenigen Patienten, welche wegen eines Schilddrüsenknotens operiert werden, ein Schilddrüsenkarzinom gefunden. Daher ist es erforderlich, die diagnostische Aussagekraft der Feinnadelaspirationszytologie zu verbessern. Ziel unserer Untersuchungen ist daher die Aufklärung der molekularen Ätiologie des Schilddrüsenknotens, um mittels molekularer Methoden die Aussage kraft der Feinnadelaspirationsbiopsie-Diagnostik des Schilddrüsen knotens zu erhöhen. 44

45 Hierzu werden drei Strategien verfolgt: 1. Durch cdna-array-untersuchungen von heißen (bekannte molekulare Ätiologie) und kalten (unbekannte molekulare Ätiologie) Schilddrüsen knoten sollen die für die Genese kalter Schilddrüsenknoten verantwort lichen Signalkaskaden identifiziert werden. 2. Durch Proteomuntersuchungen kalter Schilddrüsenknoten sollen differentiell exprimierte bzw. phosphorilierte Proteine identifiziert werden. 3. Durch Mikrosatellitenkopplungsuntersuchungen in Familien mit euthyreoten Strumen haben wir eine Kandidatengenregion identifiziert, welche in mehreren Familien für die Struma-Ätiologie und die nach folgende Knotenentwicklung verantwortlich ist. Diese Strategien sollen gemeinsam zur Identifizierung von für die Prognose von Schild drüsen knoten relevanten Genen führen, welche zukünftig für die molekulare Analyse von Schilddrüsenfeinnadelpunktaten eingesetzt werden können. Prof. Dr. Ralf Paschke Universität Leipzig Universitätsklinikum Medizinische Klinik und Poliklinik III

46 VOM PATIENTEN ZUM MOLEKÜL 3.3 Die vernetzte Zelle Die Analyse komplexer zellulärer Informationsverarbeitung und ihre Bedeutung für das Verständnis (patho)physiologischer Prozesse Friedemann Horn, Katja Heidrich Zellfunktionen wie Wachstum, Differenzierung oder der programmierte Zelltod werden durch eine Vielzahl extrazellulärer Signale (Hormone, Zytokine u.v.m.) gesteuert. Intrazellulär werden diese Stimuli durch Signaltransduktions-Kaskaden und die Regulation der Genexpression in entsprechende zellphysiologische Antworten übersetzt. Die Mechanismen vieler intrazellulärer Signalwege sind inzwischen gut untersucht. Zunehmend wird aber eine komplexe Vernetzung der Signalwege untereinander und mit den die Genexpression steuernden Proteinen (Transkriptionsfaktoren) deutlich, und es zeichnet sich ab, dass viele Krankheiten ihre Ursachen in einer Fehlregulation solcher Netzwerke haben. Die Funktionsweise dieser Signal- und Transkriptionsnetzwerke ist dabei noch wenig verstanden. Wir nähern uns dieser Problematik experimentell dadurch, dass wir die Auswirkungen gezielter Störungen von Signalkaskaden auf Physiologie 46

47 und Genexpressionsmuster von Zellen untersuchen und miteinander korrelieren. Dadurch analysieren wir die funktionelle Architektur der Netzwerke. Derzeit wird dies am Beispiel des Zytokins Interleukin-6 (IL-6) untersucht, das auf Zellen des Multiplen Myeloms als Wachstumsfaktor wirkt. Der von unserer Arbeitsgruppe zuerst beschriebene IL-6- Signalweg über den Transkriptionsfaktor Stat3 kontrolliert die Expression verschiedener Gene in Myelomzellen. Jedoch ist nicht bekannt, wie hieran auch andere IL-6-initiierte Signalwege beteiligt sind noch welche Zielgene relevant für Wachstum und Überleben der Zellen sind. Durch Einführen von Mutationen in den IL-6-Rezeptor konnten wir gezielt bestimmte Signalwege ausschalten. Die Analyse der Expressionsmuster durch die DNA-Microchip-Technik an den so manipulierten Zellen zeigte die zentrale Bedeutung des Stat3-Signals für sowohl die Kontrolle der meisten IL-6-Zielgene als auch die zellulären Wirkungen. Prof. Dr. Friedemann Horn, Dr. Katja Heidrich Universität Leipzig Universitätsklinikum Institut für Klinische Immunologie und Transfusionsmedizin

48 VOM PATIENTEN ZUM MOLEKÜL 3.4 Modellbasierte Optimierung von Tumortherapie Markus Löffler, Dirk Hasenclever Eine wesentliche Behandlungsstrategie bei Tumorerkrankungen ist die multizyklische Chemotherapie mit zytotoxischen Substanzen. Neben der Auswahl der relevanten Zytostatika spielt bei der Optimierung eines Behandlungsprotokolls die Wahl der Dosierung und die Wahl der Applikationszeitpunkte und -intervalle eine wesentliche Rolle. Das Ziel unserer Arbeiten liegt darin, eine quantitative Theorie zu formulieren, wie Dosierung und Zeitpunkte zu wählen sind, so dass der Behandlungserfolg bei einer spezifischen Tumorerkrankung optimiert werden kann. Dies wird am Beispiel zweier chemosensitiver Erkrankungen aus dem Bereich der malignen Lymphome dargestellt. Das populationsbezogene statistische Modellkonzept basiert auf drei wesentlichen Annahmen: (1) Die Chemosensitivität variiert zwischen den Erkrankten, (2) sie ist dosisabhängig und (3) die Latenzzeit des Wachstums von einem subklinischen Tumor bis zur klinischen Manifestation ist ebenfalls variant. Das Modell lässt sich parametrisieren und an tumorspezifische Überlebenszeitdaten anpassen. 48

49 Eine solche Anpassung an Daten der HD6-Studie der Deutschen Hodgkin Lymphom Studiengruppe konnte erfolgreich vorgenommen werden. Eine Modellierung eines zeitlich verkürzten und etwa um 30% in der Dosis gesteigerten Chemotherapieschemas ergab die Vorhersage, dass eine relevante Verbesserung der tumorfreien Überlebensraten um mindestens 10% möglich sein sollte. Eine randomisierte klinische Studie mit dem BEACOPP-Schema konnte inzwischen an über 1000 Patienten nachweisen, dass dieser Zugewinn tatsächlich deutlich höher liegt (ca. 20%). Eine ähnliche Modellierung erfolgte auch für das aggressive Non- Hodgkin-Lymphom (NHL). Hier wurde abgeleitet, dass vornehmlich eine Verkürzung der Therapieintervalle zu therapeutischen Gewinnen führen sollte. Die NHL-B-Studie der deutschen NHL-Studiengruppe hat inzwischen an ca. 800 Patienten zeigen können, dass eine Beschleunigung des üblichen CHOP-Schemas von 3- auf 2-wöchige Applikationen bei älteren Patienten mit einem Überlebensvorteil assoziiert ist. Wir verfügen somit über ein theoretisches Instrument, das bei der Optimierung zytotoxischer Chemotherapie bei chemosensitiven Tumoren in der Planung von Therapiestudien eingesetzt werden kann. Prof. Dr. Markus Löffler, Dr. Dirk Hasenclever Universität Leipzig Medizinische Fakultät Institut für Medizinische Informatik, Statistik und Epidemiologie loeffl 49

50 VOM PATIENTEN ZUM MOLEKÜL 3.5 Analyse posttranslationaler Modifikationen am Beispiel des Tau-Proteins Ralf Hoffmann Die Alzheimer-Krankheit ist die häufigste Demenzerkrankung und in der westlichen Welt die vierthäufigste Todesursache der über 85jährigen, wobei die Zahl der erkrankten Patienten in Deutschland auf etwa 1 Million geschätzt wird. Diese Krankheit ist durch zwei histopathologische Veränderungen geprägt: die Alzheimer-Plaques (senile plaques, SP) und die Alzheimer-Fibrillen (neurofibrillary tangles, NFT). Eine gesicherte Diagnose ist nur durch Autopsie unter Identifizierung beider neuropathologischer Veränderungen möglich. Daher arbeiten weltweit eine Vielzahl von Forschergruppen an einer spezifischen Diagnose zu einem möglichst frühen Stadium der Erkrankung. Wir konnten erstmals Alzheimer-spezifische Veränderungen am PHF-Tau, einer in den NFT abgelagerten, stark phosphorylierten Variante des Tau- Proteins, mittels monoklonaler Antikörper nachweisen. Die identifizierten PHF-Tau- (und damit wahrscheinlich auch Alzheimer-) spezifischen Epitope enthalten jeweils zwei benachbarte Phosphorylierungsstellen [R. Hoffmann et al. (1997) Biochemistry 36: ; G.A. Jicha et al. (1997) J. Neurochem. 69: ]. 50

51 Gegenwärtig versuchen wir mit den modernen Methoden der Proteinanalytik (2D-Gelelektrophorese, hochauflösende Massenspektrometrie mit ESIund MALDI-Quellen) weitere Alzheimer-spezifische posttranslationale Modifi kationen auf molekularer Ebene zu identifizieren. Dabei bietet sich im PHF-Tau ein sehr komplexes Phosphorylierungsmuster, das sich nicht zuletzt in der Identifizierung von mehr als 40 phosphorylierten tryptischen Spalt peptiden unserer PHF-Tau-Präparation widerspiegelt. Zusätzlich sind bestimmte Sequenzabschnitte unterschiedlich stark phosphoryliert. So konnten wir auf einer Länge von 15 Resten neben der unphosphorylierten Sequenz auch einfach, zweifach, dreifach und sogar vierfach phosphorylierte Peptide nachweisen, wobei jeder Phosphorylierungsgrad offenbar durch ein Phosphorylierungsmuster dominiert wird. Teilweise konnten die analysierten Phosphorylierungsmuster bereits durch Vergleich mit synthetischen Phosphopeptiden bestätigt werden. Ein Vergleich dieser Phosphorylierungsmuster im PHF-Tau Protein mit Tau-Protein aus Kontrollen sollte uns eine Identifizierung weiterer Alzheimer-spezifischer Modifikationen des Tau-Proteins ermöglichen und könnte so neue Ansätze für eine Tau-gerichtete Diagnose eröffnen. Prof. Dr. Ralf Hoffmann Universität Leipzig Biotechnologisch-Biomedizinisches Zentrum (BBZ) Professur für Bioanalytik und Fakultät für Chemie und Mineralogie

52 VOM PATIENTEN ZUM MOLEKÜL 3.6 Eingriff in die Zellteilungskontrolle von Nervenzellen eine neuroprotektive Strategie Thomas Arendt Die neurofibrilläre Degeneration bei der Alzheimerschen Erkrankung betrifft vorrangig Hirnregionen, die an der Realisierung höherer zerebraler Leistungen beteiligt sind, und dementsprechend im Verlaufe der phylogenetischen Entwicklung in ihrer relativen Ausdehnung zunehmen. Die Funktion in diesen Regionen beruht auf einer lebenslangen adaptiven Reorganisation der neuronalen Konnektivität. Dementsprechend sind von der Degeneration in erster Linie solche Neuronen betroffen, die im erwachsenen Nervensystem durch ein besonders hohes Maß an struktureller Plastizität gekennzeichnet sind. Die Neurodegeneration ist mit Mechanismen der Reaktivierung der mitogenen Signaltransduktion und des Zellzyklus verbunden. Im Zuge der phylogenetischen Höherentwicklung und dem steigenden Bedarf an hochkomplexen neuronalen plastischen Netzwerken nehmen die Prozesse der dynamischen Stabilisierung und Destabilisierung 52

53 synaptischer Kontakte einen zunehmend höheren Stellenwert ein und bilden damit zugleich auch die Grundlage für eine Zunahme der ihnen inherenten Fehlfunktionen. Es wird ein Konzept vorgestellt, wonach es im adulten zentralen Nervensystem einen neuronalen Zustand der labilen Zelldifferenzierung gibt, dessen Regulation und Erhaltung eine Reihe von morphoregulatorischen Prozessen umfasst, die insbesondere während der Hirnentwicklung relevant sind, in diesen Zellsystemen jedoch auch im adulten Nervensystem persistieren. Diese entwicklungsbiologische Unreife bedingt zugleich die hohe neuronale Vulnerabilität dieser Nervenzellen. Das Eingreifen in die neuronale Differenzierungs- und Zellteilungskontrolle stellt daher einen erfolgversprechenden Ansatz zur neuroprotektiven Einfluss nahme und zur Therapie der Neurodegeneration dar. Prof. Dr. Thomas Arendt Universität Leipzig Medizinische Fakultät Paul-Flechsig-Institut für Hirnforschung 53

54 VOM PATIENTEN ZUM MOLEKÜL 3.7 Vom natürlichen zum maßgeschneiderten Effektor für Signaltransduktion und pathologischen Zielprozess Rolf Gebhardt Die Regulation zellulärer Funktionen und Reaktionen vollzieht sich üblicherweise im Rahmen komplexer Signalübertragungswege, die molekulare Reize von außen (etwa durch Hormone) in veränderte Reaktionen von Zielstrukturen umwandeln. Häufig beinhalten diese Signalwege niedermolekulare Botenstoffe, eine oder mehrere Kinasen, Phosphatase und Adapterproteine, die oft mit Gerüst -Proteinen zu umfangreichen Proteinkomplexen verbunden sind. Viele Naturstoffe interagieren an spezifischen Stellen mit Bestandteilen dieser Signalwege und greifen durch Hemmung teilweise aber auch Aktivierung einzelner Komponenten in die Regulation der Zellen ein. Bedeutsam sind solche Eingriffe besonders dann, wenn sich Signalwege in pathologischen Situationen so verändern, dass sie beherrschend werden und die Pathologie auslösen oder zumindest unterstützen. Dann können solche Inhibitoren zu einer Unterbrechung oder Begrenzung der Pathogenese führen. Es ist das Ziel unserer Untersuchungen, ausgehend von natürlich vorkommenden Inhibitoren deren Wirkort zu ermitteln, Struktur-Wirkungs-Beziehungen herzustellen und die Moleküle dann so chemisch zu verändern, dass sie besonders wirksam und spezifisch sind. 54

55 Beispiele hierfür sind für uns die Stress-Regulation über die AMPabhängige Kinase (AMPK) und der β-catenin Signalweg, der bei vielen Tumoren durch Mutationen permanent aktiviert ist und das unkontrollierte Wachstum befördert. Bei der AMPK finden wir eine komplexe Beeinflussung durch AMP und dessen Analoga, die zu einer Aktivierung führen. Verschiedene Flavonoide interagieren mit den Bindungsstellen für AMP und können strukturabhängig eine Aktivierung, manchmal auch eine Hemmung bewirken. Durch gezielte Synthese von Derivaten können wir diese unterschiedlichen Eigenschaften wunschgemäß beeinflussen. Beim β-catenin-weg ist downstream eine Kinase, die CK II, beteiligt, deren Hemmung die durch β-catenin-mutationen ausgelöste Wachstums - stimulation unterbinden kann. Antrachinonderivate (z. B. Emodin) sind als Inhibitoren der CK II bekannt. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Pharmazie (Prof. Eger) konnten neue Derivate synthetisiert werden, die als äußerst potent erkannt wurden. Dies eröffnet neue Chancen für Substanzen mit tumorhemmender Wirkung. Prof. Dr. Rolf Gebhardt Universität Leipzig Medizinische Fakultät Institut für Biochemie rgebhardt@medizin.uni-leipzig.de 55

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57 4. POSTER

58 POSTER 4.1 Auf dem Weg von der Spirale zur Zyste mögliche Überlebensstrategie von Borrelia burgdorferi Reinhard K. Straubinger, Samiya Al-Robaiy Grundlagen und Ziele Im Wirt (Mensch, Hund etc.) etabliert das Bakterium Borrelia burgdorferi nach dem Eintritt in die Haut mittels Zeckenbiss eine persistierende (fortdauernde) Infektion. Im flüssigen Kulturmedium stellt sich der Erreger der Lyme-Borreliose als Spirochät in der typischen Spiralenform dar. Das Bakterium kann aber auf von außen einwirkende Stressbedingungen reagieren und kugelt sich dabei ab. Dieses Projekt soll klären, ob diese Veränderung des Phänotyps die Grundlage für eine persistierende Infektion im Wirt ist und welche molekularen Mechanismen Borrelia burgdorferi benutzt, um von der spiraligen in eine kugelartige Form zu wechseln. 58

59 Ergebnisse Kugelförmige Borrelia burgdorferi-organismen konnten mit Hilfe der Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie in Zusammenarbeit mit dem Institut für Histologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Univer sität Leipzig nachgewiesen werden. Durch die Vervielfältigung kurzer, spezifischer DNA-Fragmente wurden zwei für die Virulenz wichtige Plasmide in selektierten Kolonien von Borrelia burgdorferi sensu stricto B31 MI mit Hilfe der Polymerase ketten - reaktion (PCR) nachgewiesen. Damit ist sichergestellt, dass in späteren Untersuchungen infektiöse und somit aussagekräftige Borrelia burgdorferi- Stämme verwendet werden. Dr. Reinhard K. Straubinger, Dr. Samiya Al-Robaiy Universität Leipzig Biotechnologisch-Biomedizinisches Zentrum (BBZ) Nachwuchsgruppe Molekulare Infektionsmedizin und Veterinärmedizinische Fakultät Institut für Immunologie straubinger@vetmed.uni-leipzig.de 59

60 POSTER 4.2 Phänotyp-Genotyp Assoziationen in komplexen Krankheiten Peter Ahnert, Holger Kirsten, Kathleen Hofmann Eine der großen Herausforderungen der modernen Biologie und Medizin ist es, die komplexen, miteinander vernetzten Vorgänge im menschlichen oder anderen Organismus ganzheitlich zu verstehen. Um diesem Ziel ein kleines Stück näher zu rücken, beschäftigen wir uns mit der Analyse des Einflusses von interindividuellen Unterschieden im Genom auf die spezifische Aus prägung von Merkmalen in Individuen. Man nimmt an, dass komplexe Krankheiten durch das Zusammenwirken einer Vielzahl genetischer Faktoren mit Umweltfaktoren entstehen. Dabei hat jeder einzelne Faktor möglicher weise nur einen geringen Einfluss. Zur Identifikation der genetischen Faktoren werden Mappingstudien und Assoziationsstudien angewandt. Keine der beiden Strategien ist allein in der Lage, die Zusammenhänge in komplexen Krankheiten aufzuklären. Mappingstudien können Regionen im Genom finden, in denen relevante Gene mit größerem Einfluss auf den Phänotyp liegen. In Assoziationsstudien wird der Einfluss bestimmter Allele getestet, allerdings meist nicht genomweit. Heute versucht man meist die Ergebnisse einer Mappingstudie durch Feinmapping und Assoziationsstudien zu präzisieren. 60

61 Wir schlagen eine Strategie vor, welche auf Assoziationsstudien mit Kandidatengenen bei gleichzeitigem regionalen Feinmapping beruht. Eine an die Systembiologie angelehnte Analyse der in ein biologisch-medizi nisches Problem involvierten Prozesse führt zu einer Liste von Kandidaten genen mit Polymorphismen, welche in einer von uns entwickelten Datenbank abgelegt, verwaltet und annotiert werden. Es ergeben sich genomische Regionen, welche in entsprechenden Populationen getestet werden. Wir verfolgen diese Strategie am Beispiel rheumatoide Arthritis und suchen nach weiteren klinisch interessanten Problemen sowie nach Unterstützung auf dem Gebiet der Bioinformatik zur Entwicklung und Verbesserung der notwen digen Software Tools. Dr. Peter Ahnert, Holger Kirsten, Kathleen Hofmann Universität Leipzig Biotechnologisch-Biomedizinisches Zentrum (BBZ) Nachwuchsgruppe Molekulare Diagnostik - Mikroarray Techniken und Medizinische Fakultät Institut für Klinische Immunologie und Transfusionsmedizin ahnert@uni-leipzig.de 61

62 POSTER 4.3 Optimal enzymes for single molecule sequencing Petra Nieckchen, Sylvia Löbermann, Susanne Brakmann Over the past 15 years, there has been a group of chemists who have worked to develop a novel strategy for DNA sequencing based on single-molecule detection techniques. In single-molecule sequencing, it is proposed that a strand of DNA is synthesized with each nucleotide labeled with a characteristic fluorescent tag. An exonuclease would then be used to successively cleave nucleotides from the labeled strand, and the cleaved nucleotide would be detected using an ultrasensitive fluorescence spectrometer. There are two challenging biochemical steps involving hitherto unknown enzymatic activities that are required for the realization of singlemolecule DNA sequencing. First, a strand of DNA must be synthesized that incorporates a fluorescently modified base at each position. This step requires that a DNA polymerase is found that can incorporate the sterically and electronically demanding nucleotides during the synthesis of a complementary strand of DNA. Recently, we identified a natural polymerase which retained activity in the sole presence of rhodaminemodified nucleotides and furthermore, reported the preparation of DNA in which one strand is synthesized with complete substitution of the pyrimidine (T, C) nucleotides by their rhodamine-labeled analogs. 62

63 The second challenging step in single-molecule sequencing is the enzymatic digestion of the labeled strand which must be performed by an exonuclease, that is, directly from one end, sequentially processing along the strand. Endonuclease activity is undesired, which would digest nucleotides at random positions within the strand. Recently, we discovered that a natural exonuclease degrades a DNA duplex wherein one of the strands is synthesized with rhodamine-labeled cytosine and thymine - despite some unusual physical characteristics of the substrate DNA. We also performed a series of experiments to demonstrate that the activity is processive under the conditions chosen so far. Susanne Brakmann Universität Leipzig Center for Biotechnology and Biomedicine (BBZ) Junior Research Group Applied molecular Evolution and Faculty of Biosciences, Pharmacy and Psychology Institute for Zoology sbrakma@rz.uni-leipzig.de Petra Nieckchen Max-Planck-Institute for Plasma Physics petra.nieckchen@ipp.mpg.de Sylvia Löbermann Max-Planck-Institute for Biophysical Chemistry sloeber@gwdg.de 63

64 POSTER 4.4 Membrane Binding of a Lipidated ras Peptide Studied by Solid-State NMR, Neutron Diffraction, and FTIR Spectroscopy Daniel Huster, Alexander Vogel, Hans Binder, Olaf Zschörnig, Thomas Gutberlet, Catherine Katzka, Herbert Waldmann, Klaus Arnold Membrane binding of a doubly lipid modified ras peptide was studied by a combination of physical methods. FTIR measurements reveal that incorporation of the peptide leads to a small decrease in lipid chain phase transition temperature. The phase transition of the 16:0 acyl chains of the peptide follow the phase transition of the 14:0 chains of the DMPC host matrix indicating that the peptide chains insert into the membrane. Form the shape of the amide bands there are no typical signatures of peptide secondary structure elements in the FTIR spectra. The amide protons exchange strongly with water. Neutron diffraction spectra show significant peak intensity changes in the presence of the ras peptide. Neutron scattering length density profiles agree for the acyl chains but show decreased scattering length density in the headgroup/interface zone of the bilayer where the peptide backbone is located. Two-dimensional NOESY spectra recorded under magic angle spinning show various intermolecular lipid-peptide crosspeaks. Quantitative analysis of lipid-peptide crosspeaks reveals a location of the peptide backbone in the lipid water interface. Hydrophobic peptide side chains extend into the nonpolar interior of the membrane. The polar backbone of the peptide interacts strongly with the aqueous phase. 64

65 2 H NMR order parameter investigations reveal that the peptide hexadecyl chains show significantly smaller order compared to the DMPC chains. However, converted into acyl chain length, the hexadecyl peptide and the myristoyl lipid chain have approximately the same length indicating that the peptide is well incorporated into the lipid bilayer. Similar to phospholipid chain dynamics, the ras acyl chain relaxation can be explained in terms of a dominant contribution from collective bilayer motions that modulate local ordering by the rapid acyl chain fluctuations. Dr. Daniel Huster, Alexander Vogel Universität Leipzig Center for Biotechnology and Biomedicine (BBZ) Junior Research Group Structure Determination of Membrane-associated Proteins by Solid-state NMR and Faculty of Medicine Institute of Medical Physics and Biophysics husd@medizin.uni-leipzig.de Prof. Dr. Klaus Arnold, PD Dr. Hans Binder, Dr. Olaf Zschörnig Universität Leipzig Faculty of Medicine Institute of Medical Physics and Biophysics arnold@medizin.uni-leipzig.de physik/index.htm Thomas Gutberlet Hahn-Meitner-Institute gutberlet@hmi.de Prof. Dr. Herbert Waldmann, Catherine Katzka Max-Planck-Institute of Molecular Physiology herbert.waldmann@mpidortmund.mpg.de 65

66 POSTER 4.5 Rationales Design und in vitro Evolution einer thermo-stabilisierten Exonuclease III Sven Pfeifer, Thomas Greiner-Stöffele Die Erhöhung der Thermostabilität von Enzymen hat eine große Bedeutung für das molekularbiologische und biotechnologische Anwendungsspektrum dieser Proteine. Hierbei ist die Veränderung von mesophilen Enzymen ein Weg, spezifische funktionelle Adaptionen von Proteinen zur Erhöhung der Thermo stabilität zu erforschen. Für die homologe in vitro Rekombination von Proteinen wurde am MPI für biophysikalische Chemie Göttingen eine neue Methode entwickelt 1. Grundlage dieser Technik ist die Verwendung der Exonuclease III aus E. coli. Für eine vollständige Automatisierung dieser Methode wird eine Exonuclease III -Variante benötigt, welche beim wieder holten Aufheizen auf 94 C unter Erhalt der katalytischen Aktivität im unteren Temperaturbereich (25-40 C) reversibel denaturiert. Wir haben begonnen eine solche thermostabilisierte Exonuclease III -Variante durch rationales Protein-Design und in vitro Evolutionsansätze zu generieren. In den Genbanken finden sich 6 zu Exonuclease III aus E. coli homologe Gene aus thermophilen Organismen (Archaeoglobus fulgidus; Methano thermobacter thermautotrophicus; Sulfolobus solfataricus; Sulfolobus tokodaii; Thermoplasma acidophilum; Thermoplasma volcanium). Durch Struktur vergleiche konnten wir mehrere Positionen für 66

67 wahrscheinlich erfolgreiche Disulfidbrücken in Exonuclease III bestimmen und haben begonnen diese in das Protein einzufügen. Außerdem konnten wir mit dem Programm SSBOND 34 theoretisch mögliche Disulfidbrücken berechnen und haben diese Möglichkeiten durch Ausschluss von Mutationen an stark konservierten Positionen auf 6 Varianten eingeschränkt. Auch hier haben wir mit der Generierung der Protein-Varianten begonnen. Weiterhin ist es uns gelungen, das zu Exonuclease III homologe Protein aus Archaeoglobus fulgidus rekombinant in E. coli zu produzieren und eine erste Charakteri sierung dieses Proteins durchzuführen. Anmerkungen 1 M. Eigen, U. Kettling, A. Koltermann, Patent DE / WO Dr. Thomas Greiner-Stöffele, Sven Pfeifer Universität Leipzig Biotechnologisch-Biomedizinisches Zentrum (BBZ) Nachwuchsgruppe Protein-Engineering und Fakultät für Biowissenschaften, Pharmazie und Psychologie Institut für Biochemie tgs@uni-leipzig.de 67

68 POSTER 4.6 Proteome Analysis using Nano-HPLC Nano-ESI Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry Christian Ihling, Gry H. Dihazi, Andrea Sinz Accurate mass determination of peptides resulting from enzymatic protein digestions - typically carried out with trypsin - followed by comparison to theoretically digested protein sequences from databases is a powerful method for protein identification, which is being used extensively in proteome analysis. The reliability of this peptide mass fingerprinting depends on both mass accuracy and sensitivity of the mass spectrometer. We are using a FTICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance) mass spectrometer, which is known for its excellent mass accuracy in the low ppm range. Mass accuracy and sensitivity have been evaluated for an onlinenanoelectro spray setup. We coupled an UltiMate Nano-HPLC system (LC Packings/Dionex) to an Apex II FTICR mass spectrometer (7 Tesla) equipped with Nanospray source (Bruker Daltonik), and analyzed tryptic in-gel digests of bovine serum albumin, carbonic anhydrase, and myoglobin using a 75 µm reversed phase column under gradient elution conditions (flow rates of 200 nl/min). Database searches were performed using the Mascot software (Matrix Science). 68

69 For tryptic peptide map analysis, we readily obtain mass accuracies smaller than 3 ppm. The effect of mass accuracy on the confidence of database results of peptide mass fingerprint search shows that high mass accuracy is essential for confidently identifying proteins even with a small number of peptides. Currently, our practical working limit for correct protein identification is in the fmol range of in-gel digest loaded on-column. These results demonstrate that nano-hplc nano-esi FTICR MS is an extremely attractive approach for proteome analysis. Dr. Andrea Sinz, Christian Ihling, Gry H. Dihazi Universität Leipzig Center for Biotechnology and Biomedicine (BBZ) Junior Research Group Protein-Ligand Interaction by Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry and Faculty of Chemistry and Mineralogy Institute of Analytical Chemistry sinz@chemie.uni-leipzig.de 69

70 POSTER 4.7 Percutaneous Penetration of Local Anesthetic Bases Pharmacodynamic measurements Claudia S. Leopold, Howard I. Maibach Introduction If local anesthetics are applied to the skin in their base form, various effects such as a decrease in pricking pain and a change in burning, itch, and thermal sensations may be observed indicating significant skin penetration. These effects may be attributed to the action of the anesthetics on nociceptors and thermoreceptors, i.e., on C and Aδ nerve fibers respectively. Purpose This study was con ducted to characterize various local anesthetics pharmaco dynamically by measuring thermal thresholds over time with a thermal sensory analyzer. Methods Local anesthetic bases were applied as organic solutions to the ventral site of the forearm of eight subjects. After evaporation of the solvent, cold and warm sensations (CS, WS) as well as cold and heat pain thresholds (CP, HP) were repeatedly measured non-invasively on the uncovered application sites over 4-5 h with a thermal sensory analyzer. From the thermal thresholds versus time profiles the following response parameters were ob tained: the maximum change in CS and CP (Δ CS, Δ CP) as intensity-related parameters, the CS slope as a combined time- and intensity-related parameter, and the lag time of onset of the anesthetic action. Drug penetration measurements were done with a glass cell system, which allows the measurement of drug disappearance rates under occlusion conditions. Results The results show that the investigated local anesthetics affect thermal thresholds to a different extent, with tetracaine and lidocaine being most efficient. From the response versus time profiles of all study subjects, various response parameters were ob tained: only the cold sensation 70

71 parameters proved suitable for characterization of the local anesthetics, possibly because cold receptors are lo cated in the epidermis and can easily be reached. Lag times of onset are short and the maximum anesthetic effect is reached within 2-3 h. Conclusion Because cold sensation parameters correlate linearly with the solubility of the local anesthetic bases in medium chain triglycerides and with the drug flux of 50% saturation, it appears that medium chain triglycerides may have similar properties with regard to the solubility of the investigated compounds as the stratum corneum lipids. Prof. Dr. Claudia S. Leopold Universität Leipzig Faculty of Biosciences, Pharmacy and Psychology Institute of Pharmacy Pharmaceutical technology Dr. Howard I. Maibach University of California at San Francisco School of Medicine Department of Dermatology

72 POSTER 4.8 Proteine mit neuen Eigenschaften durch rationales und semirationales Protein-Design Rico Czaja, Katja Höschler, Ulrich Hahn Protein-Design ist die Generierung von Proteinen mit neuen Eigenschaften. Wichtig dabei ist die enge Zusammenarbeit zwischen Molekularbiologie, Strukturanalyse und theoretischer Moleküldynamik. Wir untersuchen Ribonuklease T1, ein Enzym (Protein), welches einzelsträngige Ribonukleinsäuren hochspezifisch nach der Base Guanosin spaltet. Unser spezielles Interesse gilt der Substratspezifität und der Katalyse. Ein Ziel von uns ist es, die Basenspezifität von RNase T1 von Guanosin nach Adenosin zu ändern. Aufgrund der bekannten Kristallstruktur konnten mit Hilfe molekular dynamischer Berechnungen Vorhersagen für Aminosäure substitutionen gemacht werden. Jedoch wurden auf diesem rationalen Weg bisher keine RNase T1-Varianten mit veränderter Substratspezifität gewonnen. Eine weitere Möglichkeit Proteine gezielt in ihren Eigenschaften zu verändern, ist die Zufalls-Mutagenese mit anschließendem Screening nach den gewünschten neuen Eigenschaften. Nach Zufalls-Mutagenese der Substratbindungstasche erzielten wir eine Vielzahl aktiver Enzym- Varianten mit z. T. stark veränderten Bindungsmotiven, die jedoch 72

73 immer noch dieselbe Spezifität wie der Wildtyp (das Ausgangs-Enzym) aufwiesen. Ausgehend von einer Variante dieser Bibliothek konnte per erneuter rationaler Mutagenese eine RNase-T1 Variante dargestellt werden, deren Substratspezifität eine deutliche Veränderung im Vergleich zum Wildtyp zeigt. Literatur Arni, R., Heinemann, U., Tokuoka, R., and Saenger, W. (1988) J Biol Chem 263(30), Backmann, J. Doray, C. C., Grunert, H. P., Landt, O., and Hahn, U. (1994) Biochem Biophys Res Commun 199(1), Granzin, J., Puras-Lutzke, R., Landt, O., Grunert, H. P., Heinemann, U., Saenger, W., and Hahn, U. (1992) J Mol Biol 225(2), Hirono, S., and Kollman, P. A. (1991) Protein Eng 4(3), Höschler, K., Hoier, H., Hubner, B., Saenger, W., Orth, P., and Hahn, U. (1999) J Mol Biol 294(5), Hubner, B., Haensler, M., and Hahn, U. (1999) Biochemistry 38, Steyaert, J. (1997) Eur J Biochem 247(1), Prof. Dr. Ulrich Hahn, Rico Czaja, Dr. Katja Höschler Universität Leipzig Fakultät für Biowissenschaften, Pharmazie und Psychologie Institut für Biochemie uli.hahn@uni-leipzig.de 73

74 POSTER 4.9 Selektion von RNA-Aptameren für den Y -Rezeptor Y 5 Heiko Fickert, André Hansen, Martin Höfliger, Annette G. Beck-Sickinger, Ulrich Hahn Aptamere sind Ribonucleinsäuren, die mit hoher Affinität und Spezifität an ihre Zielmoleküle binden. Ausgehend von Nukleinsäurebibliotheken mit einer Komplexität von Molekülen können durch Systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) Aptamere für die verschiedensten Moleküle isoliert werden. Das Zielmolekül der Selektion dieser Arbeit ist der Y-Rezeptor, 5 ein Mitglied der Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren. Im Gehirn von Säugetieren ist er unter anderem auch an der Kontrolle der Nahrungsaufnahme beteiligt, sein Ligand ist das Neuropeptid-Y. Um die Wechselwirkung des G-Proteins 74

75 mit der zweiten cytosolischen Schleife des Y 5 -Rezeptors untersuchen zu können, wurde ein Peptid mit der Aminosäuresequenz dieser Schleife im SELEX-Experiment eingesetzt, so dass die Aptamere an diese Schleife binden sollten, und so die Signaltransduktion unterbinden könnten. Nach sieben Selektionsrunden konnten zwölf Sequenzen identifiziert werden. Prof. Dr. Ulrich Hahn, Heiko Fickert, André Hansen, Martin Höfliger, Prof. Dr. Annette G. Beck-Sickinger Universität Leipzig Fakultät für Biowissenschaften, Pharmazie und Psychologie Institut für Biochemie uli.hahn@uni-leipzig.de 75

76 POSTER 4.10 Stabilimere Eine neue Zukunft für den Einsatz von RNA-Aptameren in lebenden Organismen André Hansen, Heiko Fickert, Michael Geiling, Thomas Greiner-Stöffele, Ulrich Hahn Aptamere sind Nucleinsäuren, die aufgrund ihrer definierten Struktur Zielmoleküle mit hoher Spezifität und Affinität binden können. Sie werden durch in vitro-selektion in einem SELEX-Verfahren angereichert. Analog zu Antikörpern eignen sich Aptamere bei analytischen oder diagnostischen Fragestellungen zur Identifizierung von Zielmolekülen sowie bei therapeutischen Ansätzen auch zu deren Inhibierung. Aptamere können auch intrazellulär exprimiert werden, so dass bestimmte Proteinzustände intrazellulär gebunden werden und die Interaktion mit anderen Partnern inhibiert wird. Dadurch wäre die Unterbrechung von Signalkaskaden möglich. Ein wesentliches Problem bei der Verwendung von RNA-Aptameren in lebenden Systemen ist der rasche Abbau durch RNasen innerhalb weniger Sekunden. Um somit den Einsatzbereich von Aptameren wesentlich zu verbessern, ist es unerlässlich, die Lebensdauer dieser Moleküle deutlich zu erhöhen. 76

77 In unserer Arbeitsgruppe sind verschiedene RNA-Moleküle (sogenannte Stabilimere) angereichert worden, welche eine wesentlich erhöhte Resistenz gegenüber dem Abbau durch RNasen aufweisen. Die Lebensdauer beträgt dabei mehr als 12 Stunden unter physiologischen Bedingungen. Durch die Verknüpfung einer RNase-stabilen RNA mit einem Aptamer soll die so konstruierte RNA ebenfalls eine erhöhte RNase-Stabilität aufweisen. Damit wären RNA-Aptamere auch für dauerhafte Anwendungen in lebenden Organismen geeignet. Prof. Dr. Ulrich Hahn, André Hansen, Heiko Fickert, Michael Geiling, Dr. Thomas Greiner-Stöffele Universität Leipzig Fakultät für Biowissenschaften, Pharmazie und Psychologie Institut für Biochemie Dr. Thomas Greiner-Stöffele Universität Leipzig Biotechnologisch-Biomedizinisches Zentrum (BBZ) Nachwuchsgruppe Protein-Engineering und Fakultät für Biowissenschaften, Pharmazie und Psychologie Institut für Biochemie

78 POSTER 4.11 Pro-NPY and truncated analogues are substrates for prohormone convertase PC1/3 Regula von Eggelkraut-Gottanka, Zuzana Machova, Richard Söll, Noureddine Brakch, Eric Grouzmann, Annette G. Beck-Sickinger Neuropeptide Y (NPY) is derived from a 97 amino acid precursor protein, the pre-pro-neuropeptide Y 1. After removal of the 28 amino acid signal sequence, the 69-amino acid pro-npy is cleaved at a single paired basic site (Lys38-Arg39). Pro-NPY 1-39 is C-terminally further processed by a carboxy peptidase like enzyme to yield NPY 1-36-Gly37, which is used as substrate of an amidating enzyme peptidyl-glycine-amidatingmonooxygenase (PAM), to yield the mature NPY. Coexpression of recombinant pro-npy with each of the prohormone convertases PC1/3, PC2, furin and PACE4 in Neuro2A and NIH 3T3 cell lines showed that especially PC1/3 can cleave pro-npy at the dibasic site. Cleavage in vitro of shortened pro-npy substrates suggests that substrate length discriminates PC1/3 and PC2 processing activity, several positions within the sequence of the peptide play a crucial role for interaction with converting enzyme 1. In order to subsequently characterize the specific prohormone-enzyme interaction, the approach is to investigate full length analogues of chemically modified pro-npy. Chemical ligation allows such a large and chemically modified peptide to be assembled by a synthetic approach. An unprotected peptide α-carboxy thioester either obtained by solidphase synthesis (native chemical ligation) or molecular biology (expressed protein ligation) reacts with a second peptide containing an N-terminal cysteine residue. The in vitro digestion of shortened pro-npy substrates, namely pro-npy and pro-npy 28-43, by PC1/3 demonstrates that Arg residues within the sequence are most important for processing by converting enzyme. Substrate length influences the efficiency of enzyme cleavage and sensitivity to amino acid exchange. For the chemical ligation of full length pro-npy, pro-npy 1-37 or 1-40 are generated as the α-carboxy thioester and [C38] pro-npy or [C41] pro-npy as the N-terminal cysteine fragment. Both segments could 78

79 be obtained by Fmoc/tBu-based solid-phase synthesis. Native chemical ligation reactions were performed using standard ligation conditions 2. For expressed protein ligation, the method of intein-mediated protein ligation (IPL) 3 was used to specifically generate the reactive thioester group on recombinant protein pro-npy Thioester formation of the purified protein initiated by addition of thiol allowed further chemical ligation with synthetic peptide [C41] pro-npy Further investigations of the prohormone-enzyme interaction will be performed with full length and chemically modified pro-npy including fluorescent labelled groups in various positions, NMR, photoaffinity and spin-labels. Notes 1 Brakch, N., Rist, B., Beck-Sickinger, A. G., Goenaga, J.,Wittek, R., Bürger, E., Brunner, H. R. Grouzmann, E. J, Biochemistry, 36 (1997) Dawson, P.E., Muir,T.W., Clark-Lewis, I.,Kent,S.B., Science, 266(5186) (1994), Severinov, K., Muir,T.W., J.Biol.Chem., 273(26) (1998) Prof. Dr. Annette G. Beck-Sickinger, Regula von Eggelkraut-Gottanka, Zuzana Machova Universität Leipzig Faculty of Biosciences, Pharmacy and Psychology Institute of Biochemistry beck-sickinger@uni-leipzig.de Dr. Richard Söll ETH Zurich Department of Applied Biosciences richard.soell@roche.com Noureddine Brakch University of Lausanne University Hospital Division of Hypertension nourreddine.brakch@chuv.hospvd.ch Eric Grouzmann University of Lausanne Department of Biology eric.grouzmann@chuv.hospvd.ch 79

80 POSTER 4.12 Studying the Conformation of Neuropeptide Y in Solution by Fluorescence Resonance Energy Transfer Andrea Bettio, Michaela Dinger, Jochen Sieber, Annette G. Beck-Sickinger Neuropeptide Y is a 36 amino acid neuropeptide that mediates a number of highly important physiological effects by activation at least three distinct G-protein coupled receptors 1. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) is a photochemical phenomenon that has already been extensively used to investigate the conformation of biomolecules. We have synthesized by fully automated solid phase peptide synthesis a set of NPY analogues labelled with the FRET-pair indole (donor)/dansyl (acceptor) at different positions. This is a well established FRET pair that offers the advantage that the indole moiety is provided by tryptophane while the dansyl group can be attached to the side chain amino group of the nonnatural amino acid Dpr (2,3-diaminopropionic acid), leading to a derivative in which the fluorophore is very close to the C α carbon atom and thus to the peptide scaffold. Tryptophane has been inserted in the C-terminal part of NPY while the position of the dansyl has been varied within the sequence. Binding studies and circular dichroism investigations showed that despite of the introduction of the labels, these analogues maintain partially the characteristic conformation of NPY and affinity 2. Fluorescence emission spectra of all analogues were recorded in different buffers at the same concentration (10-5 M). By comparing the intensities of the peaks generated by the two fluorophores in the different analogues, it has been possible to observe a quenching of the tryptophane signal and a corresponding increase of the dansyl emission. We could prove that this quenching effect is due to intra- and not to intermolecular interactions and its modulation within this set of analogues leads to information on the three dimensional structure. Accordingly, these data are in agreement with previously reported NMR data 3,4. Molecular characterisation of a molecule in diluted concentrations will allow identifying the bioactive conformation and may lead to highly selective ligand design 5. 80

81 Notes 1 Andrea Bettio and Annette G. Beck-Sickinger (2002) Biophysical Methods to Study Peptide Protein Interaction, Biopolymers, in press. 2 Andrea Bettio, Michaela C. Dinger and Annette G. Beck-Sickinger (2002) The Neuropeptide Y Monomer in Solution is Not Folded in the PP-Fold,. Protein Science., in press. 3 Reto Bader, Andrea Bettio, Gerd Folkers, Annette G. Beck-Sickinger, and Oliver Zerbe (2001) Structure and Dynamics of Micelle-bound Neuropeptide Y: Comparison with unligated NPY and Implications for Receptor Selection, J. Mol. Biol. 305, Reto Bader, Gabriela Ryth, Mirjam Lerch, Annette Beck-Sickinger, Oliver Zerbe, (2002) The Key Motif to Gain Selectivity at the Neuropeptide Y 5 -Receptor II: Solution Structure and Dynamics of [Ala 31, Pro 32 ]-NPY, Biochemistry, accepted. 5 Chiara Cabrele, Heike A. Wieland, Norman Koglin, Carsten Stidsen, Annette Beck- Sickinger (2002) Ala 31 -Aib 32 : Identification of the Key Motif for High Affinity and Selectivity of Neuropeptide Y at the Y 5 -Receptor, Biochemistry, accepted. Prof. Dr. Annette G. Beck-Sickinger, Andrea Bettio, Michaela Dinger, Jochen Sieber Universität Leipzig Faculty of Biosciences, Pharmacy and Psychology Institute of Biochemistry beck-sickinger@uni-leipzig.de 81

82 POSTER 4.13 Molecular Characterization of the Neuropeptide Y Y 2 -Receptor Interaction Martin Höfliger, Annette G. Beck-Sickinger Neuropeptide Y (NPY) a 36 amino acid peptide binds to the Y 1 -, Y 2 - and Y 5 -receptor with nanomolar affinity 1. All subtypes belong to the rhodopsin like G-protein-coupled receptors. NPY is widely distributed in the central and peripheral nervous system and plays an important role in various physio logical and pathophysiological processes such as the regulation of blood pressure, cognitive skills, sexual behaviour, regulation of circadian rhythm, anxiety, feeding behaviour (obesity, diabetes), and epilepsy. The different signals are assumed to be transmitted by selective binding of different conformations of NPY to the Y-receptor subtypes. Human Y 2 -receptors expressed in COS 6 cells have been photocrosslinked with NPY [N α -Biotin, Ahx 5-24, Tmd(Phe) 27 ], a centrally truncated, photo affinity marked NPY analogue which shows selectivity for the Y 2 - receptor 2. In this study the crosslinked receptors were solubilized out of the cell membranes, separated by SDS-PAGE and blotted onto a nitrocellulose membrane. The bands were stained with streptavidin (ligand specific) and with anti-receptor antibodies. The identified receptor bands were cut from the gel, the pieces were in gel digested with trypsin and subsequently extracted from the gel to perform Maldi-MS. We could identify first receptor fragments which will allow the identification of the ligand receptor binding site. 82

83 Notes 1 Chiara Cabrele, Annette G. Beck-Sickinger (2000) Molecular characterisation of the ligand receptor interactions of the NPY/PP peptide family, J. Peptide Sci. 6, Nikolaus Ingenhoven, Christophe Eckard, Donald Gehlert, Annette G. Beck-Sickinger (1999) Molecular characterisation of the human Y 2 receptor, Biochemistry 38, Prof. Dr. Annette G. Beck-Sickinger, Martin Höfliger Universität Leipzig Faculty of Biosciences, Pharmacy and Psychology Institute of Biochemistry beck-sickinger@uni-leipzig.de 83

84 POSTER 4.14 NMR-Diffusionsmessungen an komplexen Systemen vom Stofftransport zur medizinischen Diagnostik Jörg Kärger, Frank Stallmach, Wilfried Heink Das Verfahren der magnetischen Resonanz mit gepulsten Feldgradienten (PFG NMR) nutzt neben einem starken Magnetfeld und Hochfrequenzim pulsen Gradientenimpulse, die eine ortsabhängige Resonanzfrequenz be wirken. So wird die Echointensität davon abhängig, ob innerhalb der Mess zeit die signalgebenden Teilchen ihren Ort verändern oder nicht, womit Diffusions messungen möglich sind 1. Dieses Messprinzip wurde bisher vor allem zur Untersuchung von Transportprozessen in Molekular sieben (vor allem Zeolithen 1 ) einschließlich ihrer Richtungs abhängigkeit 2 sowie Problemen der fraktalen und single-file-diffusion 3 eingesetzt. Die PFG NMR bietet auch gute Möglichkeiten zur Bearbeitung einer Reihe von biologischen und medizinischen Fragestellungen. Für den Stoffwechsel im Knorpel ist die Wasserdiffusion von Bedeutung. Durch Vergleich der Messwerte von unterschiedlichen Knorpeln können Aussagen über die Struktur des Kollagennetzwerkes und somit über Alterungsprozesse und den enzymatischen Abbau derselben getroffen werden 4. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Biotechnologie des Forschungszentrums Jülich erfolgen 84

85 in vivo-untersuchungen zum Wasserhaushalt in Bakterien 5. Diese Arbeiten sind für den möglichen Einsatz bei der mikrobiellen Erzeugung industriell bedeut samer Aminosäuren wichtig. Am Anfang der Entwicklung stehen Unter suchungen, inwieweit eine Version der Magnetischen Resonanz tomographie, des diffusion tensor imaging, zur Aufklärung der Wirkungsweise des Informationsaustausches zwischen Neuronen beitragen kann 6. Literatur 1 Kärger, J.;Ruthven,D.M.: Diffusion in Zeolites. New York:John Wiley & Sons, Stallmach, F. et al.: J. Am. Chem. Soc. 122 (2000) Kukla, V. et al.: Science 272 (1996) Knauss, R. et al.: Magn. Reson. in Medicine 36 (1996) Schoberth, S. et al.: Analyt. Biochem. 279 (2000) Prof. Dr. Jörg Kärger, Dr. Frank Stallmach, Dr. Wilfried Heink Universität Leipzig Fakultät für Physik und Geowissenschaften Institut für Experimentelle Physik I kaerger@physik.uni-leipzig.de 85

86 POSTER 4.15 Interaktions- und Faltungsstudien an einzelnen Biomolekülen mit Hilfe der Optischen Pinzette Friedrich Kremer, Marc Struhalla, Mathias Salomo, Heike Lippold, Ulrich Hahn, Jörg Reinmuth, Wiktor Skokow Mittels eines gebündelten Laserstrahls 1-7 ist es möglich, einzelne Kolloide oder Mikropartikel (10 nm 5 µm) in einem photonischen Kraftfeld zu halten ( Optische Pinzette ) und über einen X,Y,Z-Präzisionstisch mit Nano meter auflösung im dreidimensionalen Raum zu bewegen. Kombiniert man diesen Aufbau mit einer Anordnung, um die Brown`sche Fluktuation einzel ner Teilchen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zu detektieren (Einzel-Teilchen-Verfolgung), so können direkt Wechsel wirkungs kräfte auf einer Piko-Newton-Skala gemessen werden. Darüber hinaus kann man durch einfache Videomikroskopie die Bewegung und die Interaktion einzelner Mikro partikel, an die geeignete Bindungspartner gekoppelt sind, auf einer Zelloberfläche 8 bzw. an modifizierten Oberflächen 9 studieren. Das beschriebene Messprinzip soll im Rahmen der hier vorgestellten Kooperation eingesetzt werden, um biomolekulare Wechselwirkungen (Moenomycin A / Aptamer-Interaktion) und Faltungsvorgänge (RNase T1, RNA-Aptamere) auf der Ebene einzelner Moleküle zu untersuchen. 86

87 Literatur 1 P. Debye, Annalen der Physik, 1909, 30, A. Ashkin and J.M. Dziedzic, Appl. Physics Letters, 1976, 28, A. Ashkin and J.M. Dziedzic, PNAS, 1989, 86, St. M. Block, Nature, 1992, 360, B. Schnurr et. al., Macromolecules, 1999, 30, F. Gittes et. al., Phys Rev. Lett., 1997, 79, F.L. Florin et. al., Structural Biology, 1997, 119, Y. Sako et. al., J. of Cell Biology, 1998, 140, M.N. Liang et. al., PNAS, 2000, 97, Prof. Dr. Friedrich Kremer, Jörg Reinmuth, Wiktor Skokow Universität Leipzig Fakultät für Physik und Geowissenschaften Institut für Experimentelle Physik I kremer@physik.uni-leipzig.de Prof. Dr. Ulrich Hahn, Marc Struhalla, Mathias Salomo, Heike Lippold Universität Leipzig Fakultät für Biowissenschaften, Pharmazie und Psychologie Institut für Biochemie uli.hahn@uni-leipzig.de 87

88 POSTER 4.16 Characterization of a Drug Carrier System in Cubic Liquid Crystalline Phase Using HR MAS NMR Spectroscopy André Pampel, Dieter Michel, Regina Reszka Here we present a research project that aims at the development of a double release system for anti cancer drugs in cubic liquid crystalline phases. So-called cubic bicontinuous phases are composed by minima surfaces forming lipid bilayer that are interlaced by water channels. Such porous system can be used as a host system for drugs because it forms a stiff structure that exists even in excess of water. For medical applications the cubic phase is prepared from drug-containing water, which fill the channel system (e.g. Carboplatin). The dispersion can be spread as an ointment or implanted in the body, whereas the porous structure allows a slow continuous release of the included compounds. Besides one could use the lipid matrix as host for water-insoluble drugs (e.g. Paclitaxel) to form a double release system, which would have many advantages, especially in anti-cancer therapy. 88

89 To develop such a release system it is essential to determine its physicochemical properties, before clinical tests can be performed. The production of a cubic phase is a critical process, if several drugs have to be incorporated in the different compartments. The behavior of the cubic phase matrix as well of the drugs cannot be predicted. Experiments and their interpretation on the basics of theoretical models are necessary. It is shown, that NMR experiments can provide sufficient information to develop the proposed double release system. New developments of the NMR methods and their usability are discussed. Support by the Deutsche Forschungsgemeinschaft in the framework of the SFB 294 ( Molecules in Interaction with surfaces ) is gratefully acknowledged. Prof. Dr. Dieter Michel, Dr. André Pampel Universität Leipzig Faculty of Physics and Earth Science Institute of Experimental Physics I michel@uni-leipzig.de Dr. Regina Reszka Max Delbrück Center for Molecular Medicine reszka@mdc-berlin.de 89

90 POSTER 4.17 Charakterisierung von Polysaccharidgelen mit NMR-Techniken Jürgen Schiller, Lama Naji, Daniel Huster, Klaus Arnold Polysaccharidgele spielen eine wichtige Rolle in vielen Bereichen der Medizin, Bio chemie und Biotechnologie. So werden z. B. Alginate zur Verkapselung von Zellen bei Transplantationen verwendet, während Dextran-Derivate vor allem als Füllmate rialien bei der Gelchromatographie eingesetzt werden. Sehr wesentlich ist in diesem Zusammenhang die resul tierende Porengröße, da dies sowohl für den Transport von Nährstoffen wie auch für die Ausschlussgrenzen des Gels von großer Bedeutung ist. Wir haben sowohl Methoden der hochauflösenden NMR-Spektroskopie wie auch der pulsed-field gradient (PFG)-NMR zur Untersuchung derartiger Gele ein ge setzt. Im Falle der Alginate lässt sich durch Zugabe zweiwertiger Ionen (z. B. Ba 2+ ) sehr ein fach die Bildung von Alginat-Beads erreichen. Untersucht man das Diffusionsver halten unterschiedlicher Metabolite (Wasser, Lactat usw.) in diesen Beads so be obachtet man deutlich geringere Diffusions koeffi zienten im Vergleich zur Diffusion in reiner Lösung. Diese verminderte Meta bolit-diffusion wie auch die NMR-spektroskopisch eindeutig nachweis baren Verunreinigungen in vielen Alginat-Chargen könnten zu den Immun reaktionen bei Alginat-Implantationen beitragen. Im Gegensatz zu den Alginaten lässt sich im Falle des Dextrans die Bildung eines Gels durch Zugabe von KCI erreichen. Dextrane sind außerdem als Modellsysteme besser geeignet, da sie in größerer Reinheit und verschiedenen Molekular gewichten kommerziell verfügbar sind. 90

91 Obwohl die 13 C-NMR-Spektren bei Gelbildung unverän dert bleiben, so resultiert doch eine erhebliche Abnahme der einzelnen Resonanzen in Abhängigkeit von der Konzentration des eingesetzten KCI, was auf eine zuneh mende Immobi li sierung der einzelnen Dextranmoleküle hinweist. Das Gelbildungs-Verhalten des Dextrans kann weiterhin mittels PFG- NMR untersucht werden. Hier ist besonders bemerkenswert, dass die ermittelten Diffusionskoeffizienten des Polymers wie auch des Wassers bei Gelbildung von der jewei ligen Beobachtungszeit Δ abhängig werden. Dieses Phänomen unterscheidet sich jedoch von der in porösen Materialien auftretenden behinderten Diffusion und wird deshalb als anormale Diffusion bezeichnet. Prof. Dr. Klaus Arnold, Dr. Jürgen Schiller, Lama Naji Universität Leipzig Medizinische Fakultät Institut für Medizinische Physik und Biophysik Dr. Daniel Huster Universität Leipzig Biotechnologisch-Biomedizinisches Zentrum (BBZ) Nachwuchsgruppe Strukturaufklärung membranassoziierter Proteine mittels Festkörper-NMR und Medizinische Fakultät Institut für Medizinische Physik und Biophysik

92 POSTER 4.18 HR-MAS-NMR-Spektren zur Untersuchung von Hirngewebe bei neurodegenerativen Erkrankungen Ralf Schober, Stefan Berger Gewebliche Untersuchungen bei neurodegenerativen Erkrankungen um fassen neben der konventionellen Histologie in erster Linie Untersuchungen mit immunhistochemischer Methodik. Hier haben die Isolierung spezifischer Proteine wie des β-amyloids und des τ-proteins bei der Alzheimerschen Erkrankung oder des Prion-Proteins bei den übertragbaren spongiformen Encephalopathien sowie die Verwendung spezifischer Antikörper mit ortsgerechter Markierung zu entscheidenden diagnostischen Fortschritten geführt. In wissenschaftlicher Hinsicht beanspruchen abnorme Faltungs zustände dieser Proteine besonderes Interesse. Obwohl es sich überwiegend um transmembranöse Proteine handelt, sind bislang Veränderungen assozi ierter Lipidstrukturen wenig untersucht worden. Bei der Alzheimerschen Erkrankung wurde von mehreren Arbeitsgruppen über eine Verminderung des N-Acetyl- Aspartats (NAA) als Ausdruck einer neuronalen Schädigung sowie über Veränderungen von Phosphomono- und -diestern in NMR-Spektren berichtet (Literatur siehe Klein J, J Neural Transm 107: , 2000). Diese Untersuchungen wurden überwiegend an Perchlor säure-extrakten mittels Proton- und 31 P-MR-Spektroskopie vorgenommen. Ein neues Verfahren bedient sich der High Resolution Magic Angle Spinning NMR-Spektroskopie, wobei sowohl 1 H- als auch 13 C-Spektren gewonnen werden können. Ein wesentlicher Vorteil dabei ist, dass die Proben direkt bzw. ohne vorbereitende Aufarbeitungsschritte wie Extraktion und Fraktionierung bearbeitet werden können. Wir haben mit dieser Methode erste Pilotuntersuchungen an archiviertem Hirngewebe von Patienten mit Alzheimerscher Erkrankung, Creutzfeldt-Jakobscher Erkrankung und Normal kontrollen vorgenommen. Sowohl die 1 H-NMR-Spektren als auch die 13 C-NMR-Spektren zeigen deutliche Veränderungen, erstere bei den Cholin-Signalen und letztere bei den ungesättigten Fettsäuren, wo ein Signal ganz fehlt. Im Gegensatz zu den deutlichen Unterschieden bei den pathologischen Proteinablagerungsmustern sind hier die Veränderungen 92

93 jedoch relativ gleichförmig bzw. offenbar nicht krankheitsspezifisch wie bei der gleich zeitig vorgenommenen Immunhistochemie. Bei der Interpretation dieser Veränderungen können zwei Möglichkeiten in Betracht gezogen werden. Entweder sind sie Ausdruck einer generellen Membranschädigung, oder sie stellen artifizielle Veränderungen im Gefolge der Gewebsfixation durch Formalin und Wässerung dar. Eine Abklärung bedarf daher weiterer Unter suchungen mit andersartigen Asservierungsarten oder auch der Untersuchung von Nativgewebe. Es kann allerdings erwartet werden, dass die Kenntnis von Alterationen im Lipidstoffwechsel und in Lipidstrukturen, wie sie mit den hier vorgestellten neuen technologischen Verfahren gewonnen wird, zu einem besseren Verständnis auch der proteinchemischen Struktur veränderungen führt. Prof. Dr. Ralf Schober Universität Leipzig Universitätsklinikum Selbstständige Abteilung für Neuropathologie Prof. Dr. Stefan Berger Universität Leipzig Fakultät für Chemie und Mineralogie Institut für Analytische Chemie

94 POSTER 4.19 Wechselwirkungen der Untereinheiten bei der Ausbildung eines enzymatisch aktiven Hetero- Oligomers Anke Edelmann, Jürgen Kirchberger, Jörg Bär Am Beispiel des Glycolyse-Enzyms 6-Phosphofructo-1-kinase (Pfk-1) aus Saccha romyces cerevisiae haben wir untersucht, ob sich die Untereinheiten bei der kor rekten Faltung bedingen und welche Faktoren für die Assemblierung zu einem funk tionsfähigen oligomeren Protein erforderlich sind. Das Hefe-Enzym ist ein Hetero-Oktamer (α 4 β 4 ; 835 kda) dessen Unter einheiten durch die beiden unabhängigen Gene PFK1 und PFK2 kodiert werden. Es erfolgte 1) die Generation des Enzyms in einem zellfreien System (in vitro Translation), 2) die Analyse der Rückfaltung chemisch denaturierter Pfk-1 und 3) ein Strukturvergleich genetisch C- terminal modifizierter Pfk-1 mit einer Enzymform, die durch limitierte Proteolyse erhalten wurde. Die Ergebnisse der einzelnen Untersuchungen können wie folgt zusammengefasst werden: - Die korrekte Faltung der beiden Untereinheiten erfolgt unabhängig voneinander. - C-terminale Verkürzungen einer Untereinheit in vivo verändern primär die Faltung dieser Polypeptidkette. - In vitro und in vivo Veränderungen der Primärstruktur eines Proteins beeinflussen die Eigenschaften des Moleküls auf unterschiedliche Weise. Die hetero-oktamere Form der nativen Pfk-1 stellt hinsichtlich der terminalen Abspaltung von Aminosäuren eine stabilere Struktur dar. 94

95 - Die Assemblierung der Untereinheiten unter Ausbildung eines enzyma tisch aktiven Proteins ist ein ATP-abhängiger Prozess, der über nachweisbare Zwischenstufen führt. Die Assemblierungsfähigkeit der getrennt gefalteten Untereinheiten ist zeitlich begrenzt. - Nicht-assemblierungsfähige Untereinheiten werden proteolytisch abge baut oder aggregieren. Die Bildung von Aggregaten kann in vitro durch künstliche Chaperone reduziert werden. - Fru 6-P und ATP wirken stabilisierend auf die oktamere Pfk- 1 - Struktur. - Die Bildung einer aktiven hetero-oktameren Hefe-Pfk-1 ist auch in Säugerzellen möglich, obwohl für diese eine homo-tetramere Enzymform charakteristisch ist. Dr. Anke Edelmann, Dr. Jürgen Kirchberger, PD Dr. Jörg Bär Universität Leipzig Medizinische Fakultät Institut für Biochemie scha@medizin.uni-leipzig.de 95

96 POSTER 4.20 MALDI-TOF Mass Spectrometry a versatile tool for proteome analysis Hassan Dihazi, Klaus Eschrich MALDI-TOF MS (matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry) is a technique that proves extremely powerful in proteome analysis. By MALDI-TOF MS the absolute molecular weight of protein subunits can be determined with high accuracy and the purity of protein preparation can be analyzed. Proteins obtained as bands after SDS-PAGE or as spots after 2D gel electrophoresis can be identified by digesting them proteolytically and determine the masses of the produced 96

97 peptides. A comparison of the obtained peptide fingerprint with publicly available databases using publicly available search algorithms allows in most cases the unambiguous identification of the protein. MALDI-TOF MS is also a powerful technique to analyze all kinds of covalent modifications of proteins, which may either have been induced in vitro or represent the products of in vivo post-translational modifications. Prof. Dr. Klaus Eschrich, Hassan Dihazi Universität Leipzig Medical Faculty Institute of Biochemistry eschrich@uni-leipzig.de 97

98 POSTER 4.21 The usefulness of a transgenic animal approach as tool to study pathogenic aspects of Alzheimer s disease and to test for therapeutic and diagnostic strategies Reinhard Schliebs β-amyloid peptides derived by proteolytic cleavage of a much larger amyloid precursor protein (APP), play a major role in the pathogenesis of Alzheimer s disease by forming aggregated, fibrillary complexes that have been shown to be neurotoxic. Thus, preventing formation and/or β-amyloid deposition may be potential in suppressing neurodegeneration in Alzheimer s disease. β-amyloid is generated by two putative endoproteolytic activities: amino terminal cleavage mediated by β- secretase and carboxy terminal cleavage mediated by γ-secretase. To study the mechanisms underlying β-amyloid-mediated neurodegeneration as well as to test for strategies to interfere in the cascades of β-amyloidinduced toxicity, transgenic mice that overexpress various clinical mutants of the human APP and presenilins should represent appropriate approaches. Recently, transgenic mice (Tg2576) have been developed that overexpress 98

99 the Swedish mutation of the human APP and produce human β-amyloid peptides from birth and progressively develop β-amyloid plaques in the aged brain starting at ages of around 12 months. Aged transgenic Tg2576 mice with significant brain amyloid plaque load demonstrate β-amyloid plaque-induced micro- and astrogliosis including upregulation of pro- and anti-inflammatory cytokines, nitric oxide synthases and cell adhesion molecules, impaired glucose metabolism, as well as alterations in various cortical neurotransmitter systems including the basal forebrain cholinergic system, which at least partly mimic the situation in Alzheimer s diseased brain. Therefore, transgenic Tg2576 mice represent an appropriate animal approach to study aspects of the pathogeneses of Alzheimer s disease in vivo and to derive and to test therapeutic and diagnostic strategies. Prof. Dr. Reinhard Schliebs Universität Leipzig Faculty of Medicine Paul-Flechsig-Institute for Brain Research Department of Neurochemistry schre@medizin.uni-leipzig.de 99

100 POSTER 4.22 Liganden für den vesikulären Acetylcholin- Transporter auf der Basis neuartiger Vesamicolderivate Matthias Scheunemann, Dietlind Sorger, Margrit Klingner, Reinhard Schliebs, Jörg Steinbach Ziel Ein Kennzeichen der Pathophysiologie neurodegenerativer Erkrankungen wie Morbus Alzheimer ist die Abnahme der kortikalen Synapsendichte, insbesondere der Verlust von cholinergen Neuronen. Die Erfassung quantitativer Änderungen des vesikulären Acetylcholin-Transporters (VAChT) mit PET ist eine Möglichkeit, den Krankheitsverlauf zu erfassen. Bisher untersuchte radioaktiv markierte Transporterliganden sind für die Bildgebung unbefriedigend. Die vorliegende Arbeit dient der Gewinnung von 18 F-markierten Radiotracern, die mit höherer Spezifität am VAChT binden, was durch eine stereoselektive Monosubstitution des Cyclohexyl rings des prototypischen VAChT-Liganden Vesamicol erreicht werden soll 1. Methodik Sterisch einheitliche 4-substituierte Derivate des Vesamicols sollten zu einer Leitstruktur mit verbesserter spezifischer Affinität zum VAChT führen 1. Diesbezügliche Untersuchungen blieben aufgrund der inhärenten stereo chemischen Problematik weitgehend aus. Mit Hilfe regioselektiver Ringöffnungen können wir nun einen Weg zu den gewünschten radiofluorierten Liganden aufzeigen. Die Affinität der synthetisierten Verbindungen zum VAChT wurde über ihr Potenzial, [ 3 H]Vesamicol (AH5183) aus seiner Bindung zu verdrängen, an Homogenaten und Schnitten des Rattenhirns untersucht und mit der des L-(-)Vesamicols verglichen. Ergebnisse (±)-cis-3-(4-fluorbenzyloxy)-7-oxa-bicyclo[4.1.0]heptan und das Desfluorderivat lieferten mit 4-Phenyl-piperidin die 4-substituierten (Ia, Ib) und die 5- substituierten Vesamicole (IIa, IIb). Das fluorhaltige Ia ist eines unserer Targetmoleküle, während die Desfluorverbindung (Ib) als Intermediat 100

101 für die Radiofluorierung dient. Alle vier Aminoalkohole verdrängen das [ 3 H]Vesamicol aus seiner Bindung. Ihre IC 50 -Werte liegen mit 10-8 M in der Größenordnung des IC 50 von L-(-)Vesamicol. Ia, Ib und IIb zeigten dabei sowohl am Hirnschnitt als auch am Hirnhomogenat einen deutlicheren Hemmeffekt der [ 3 H]Vesamicol-Bindung als IIa. Schlussfolgerungen Die Aminoalkohole Ia und Ib zeigen eine gute Bindung am VAChT und dienen als Ausgangsbasis für neue Radiotracer für die in vivo-detektion cholinerger Transmissionsdefizite. Literatur 1 Efange et al., J.Med.Chem. (1993) 36, 1754 Dr. Dietlind Sorger Universität Leipzig Universitätsklinikum Klinik und Poliklinik für Nuklearmedizin sord@medizin.uni-leipzig.de Prof. Dr. Jörg Steinbach, Dr. Matthias Scheunemann Institut für Interdisziplinäre Isotopenforschung (IIF) steinbach@iif-leipzig.de Prof. Dr. Reinhard Schliebs, Margrit Klingner Universität Leipzig Medizinische Fakultät Paul-Flechsig-Institut für Hirnforschung schre@medizin.uni-leipzig.de 101

102 POSTER 4.23 Anpassungsqualifizierung arbeitsloser Akademiker/innen im Biotechnologiebereich Andrea Tannapfel Qualifizierter Wissenschaftler zur Durchführung molekularbiologischer Untersuchungsmethoden auf Mikrochip-Basis gesucht Mit dieser Stellenanzeige in nationalen und internationalen Wissenschafts journalen sollte eine langfristig geschaffene Drittmittelstelle im Institut für Pathologie der Universität Leipzig besetzt werden. Entgegen aller Erwartungen fand sich kein geeigneter Kandidat. Rückfragen bei zuständigen regionalen und überregionalen Arbeitsämtern ergaben demgegenüber eine relativ große Zahl an arbeitslosen Biowissenschaftlern, deren Qualifikation oder Abschluss schon längere Zeit zurücklag. Da allerdings ohne hochqualifiziertes wissenschaftliches Personal jede technische Innovation zum Scheitern verurteilt ist, musste zügig Abhilfe geschaffen werden. Die Idee, das vor Ort vorhandene wissenschaftliche Potenzial so auszubilden, dass es die Anforderungen der neuen modernen Verfahren der Gentechnologie erfüllt, war geboren. Der Europäische Sozialfonds (ESF) konnte als geeigneter finanzieller Mittelgeber gefunden und von der Idee, besonders qualifizierte Frauen zu fördern, überzeugt werden. 102

103 Die Anpassungsqualifizierung Genexpressionsanalyse für arbeitslose Akademikerinnen biowissenschaftlicher Studiengänge konnte beginnen. Das Projekt, zu dem international ausgewiesene Dozenten insbesondere aus der Medizinischen Fakultät und den übrigen Fachbereichen gewonnen werden konnten, wird innerhalb eines Jahres zwanzig Wissenschaftlerinnen in 1650 Unterrichtsstunden zu verständigen Experten auf dem Gebiet der Genanalytik ausbilden. Unterrichtseinheiten in Gentechnik-Recht, Fachenglisch und Computeranalytik sowie Statistik sind ebenfalls im Lehrplan enthalten. Ziel ist die Ausbildung von optimal qualifizierten Wissenschaftlern, die die neuen, Computer-gesteuerten Verfahren der molekularen Chip-gestützten Genanalytik verstehen und anwenden. Inzwischen ist eine Folgemaßnahme ähnlichen Qualifizierungsinhalts angelaufen, da die meisten Teilnehmer einen Arbeitsplatz gefunden haben. In Einzelfällen ist es gelungen, intelligente Beschäftigungsmodelle zu finden. Dabei ist an die Teilung von Stellen mit flexibler Arbeitszeitgestaltung gedacht, was einerseits in diesem relativ neuen Tätigkeitsfeld möglich ist, andererseits von Müttern und Familienmitgliedern gleichermaßen gefordert wird. Prof. Dr. Andrea Tannapfel Universität Leipzig Universitätsklinikum Institut für Pathologie

104 POSTER 4.24 Molecular analysis of the TBX5 gene in patients with Holt-Oram syndrome Andrè Moschik, Annegret Kujat, Ursula G. Froster Holt-Oram syndrome (OMIM #142900, McKusick 1986, syn: Heart-Hand syndrome) is a rare disorder involving developmental defects of heart and upper limbs. Main symptoms include ASD, VSD and defects of the thumb and radius. Malformations of the lower limbs never were described. The syndrome follows an autosomal dominant pattern of inheritance with complete penetrance and variable expression. This developmental disorder is associated with mutations in the TBX5 gene which plays an important role in the morphogenesis of heart and limbs in vertebrates. The TBX5 gene contains a highly conserved T-box DNA binding domain. The Holt-Oram phenotype results from haploinsufficiency of TBX5. 104

105 We performed the mutation analysis of the TBX5 gene by direct automated sequencing of the coding region (exons 2 to 9) and the exon-intron boundaries in 20 unrelated patients with various malformations of the upper limbs and heart, clinically diagnosed as Holt-Oram syndrome. In three cases a familiarity of the heart-hand defects occured. This analysis of the TBX5 gene identified four different mutations in five unrelated families. Three mutations were identified for the first time, only one mutation was described previously. All patients with disease related mutations in the TBX5 gene presented variable defects of the heart and upper limbs. Further studies involving clinical and genetic investigations are necessary to correlate specific mutations in the TBX5 gene with phenotype expression of the heart and hand defects. Prof. Dr. Ursula G. Froster, Annegret Kujat, Andrè Moschik Universität Leipzig Medical Faculty Institute of Humangenetics reichsi@medizin.uni-leipzig.de 105

106 POSTER 4.25 A novel, fast progredient fibroblast-driven cartilage destruction model in SCID mice Ulrich Sack, Astrid Hirth, Franziska Krahnert, Benjamin Funke, Katharina Wiedemeyer, Franka Kahlenberg, Jörg Lehmann, Frank Emmrich Fibroblasts are considered to be a crucial cell population for disease progression, as well as joint destruction in rheumatoid arthritis (RA). Recent data underline the potency of rheumatoid synovial fibroblast-like cells to induce the destruction of cartilage and bone, e.g. following intraarticular injection into SCID mice. We have isolated a rapid destructive fibroblastoid cell line which induces a rapid destruction of articular cartilage following intraarticular instillation. 500,000 cells were injected directly into SCID mouse knee joints to induce cartilage destruction. Mice were monitored for joint swelling, serological parameters and by radiological methods. Furthermore, the effects of immunosuppressive drugs such as Cyclosporine A, Methotrexat, and FK 506 were investigated in this model. In addition, transfection of LS48 was performed with IL-11, IL-12 and IL-15 prior to arthritis induction to investigate influence on cartilage destruction. Finally, the histology of cartilage destruction was explored. 106

107 Rapid progressive cartilage destruction within 10 days was induced by instillation into SCID mouse knee joints. Morphology revealed invasion of fibroblast-like cells into the articular cartilage. Destruction could be reduced by Methotrexate but not by Cyclosporine A or FK 506, indicating a fibroblast-directed action of Methotrexate connected to reduction of joint destruction in RA patients. Transfection with cytokines did not act on cartilage destruction, but IL-11 reduced apoptosis of chondrocytes. Induction of cartilage destruction by intraarticular application of murine fibroblast-like cells, in particular LS48, is a rapid and highly reproducible model for investigating invasive arthritis and can be modulated by drugs or gene transfer. This provides the opportunity to check novel therapeutic strategies for the treatment of arthritis, especially focussing on the reduction of cartilage erosion. Prof. Dr. Frank Emmrich, Dr. Ulrich Sack, Astrid Hirth, Franziska Krahnert, Benjamin Funke, Katharina Wiedemeyer, Franka Kahlenberg Universität Leipzig University Hospital Institute of Clinical Immunology and Transfusion Medicine mail@ulrichsack.de Dr. Jörg Lehmann Labor Diagnostik GmbH Leipzig jl@lab-leipzig.de 107

108 POSTER 4.26 Vaskulär-stromale Matrix als Modell für das Engineering weichgewebiger Transplantate Bernhard Frerich, Nico Lindemann, Jens-Peer Kuska, Kerstin Zückmantel, Stephan Müller, Jan Kurtz-Hoffmann Fettgewebe stellt ein einfaches Modell für das Tissue engineering (T.-e.) weichgewebiger Transplantate dar, dem für die plastisch-rekonstruktive Chirurgie wesentliche Bedeutung zukommt. Allerdings ist die Konzeption eines Fettgewebetransplantats mit den Methoden des T.-e. an ein versorgendes Gefäßsystem gebunden. Es stellen sich folgende Fragen, die wir zusammen mit anderen Arbeitsgruppen bearbeiten: - Oxygenation und Ernährung größerer Gewebsformationen - Anbindung an Vaskularisation, Stabilisierung des kapillarartigen Netz werks in vitro - Differenzierung unterschiedlicher Zielgewebe und Charakterisierung der Interaktion zwischen (adipozytärer) Differenzierung und vaskulärstromaler Komponente Die Konzeption des von uns entwickelten Modells einer vaskulär-stromalen Matrix beruht auf dem T.-e. von Fettgewebe, kann aber auch auf andere Gewebetypen übertragen werden. Unter dem Gesichtspunkt des T.-e. ist vor allem die Stabilisierung kapillarartiger Strukturen von Bedeutung, weshalb der Einfluss diverser Wachstumsfaktoren und Hormone untersucht wurde. Dabei diente die Länge kapillarartiger Strukturen als Parameter. Kapillar artige Strukturen wurden mittels CLSM dargestellt und ihre Länge in diesem Gewebe volumen interaktiv am Bildanalyseplatz ausgemessen. Von besonderer Bedeutung für Stabilisierung und Maturation gefäßartiger 108

109 Strukturen ist zudem die kontrollierte Applikation hydrodynamischer (mechanischer) Belastung. Unter Perfusionsbedingungen zeigte sich eine Vermehrung und verstärkte Rekrutierung α-actin positiver Perizyten / SMC. Diese Rekrutierung kann als Maturationsvorgang gewertet werden und entspricht der Stabilisierung unreifer Kapillaren in vivo. Das resultierende Modell kann auch für das T.-e. anderer vaskularisierter Gewebe und allgemein als Modell für die Interaktion zwischen Parenchym und Gefäßstroma genutzt werden. PD Dr. Dr. Bernhard Frerich, Dr. Nico Lindemann, Kerstin Zückmantel, Stephan Müller, Jan Kurtz-Hoffmann Universität Leipzig Universitätsklinikum Klinik für Mund-, Kiefer- und Plastische Gesichtschirurgie frerich@medizin.uni-leipzig.de Dr. Jens-Peer Kuska Universität Leipzig Fakultät für Mathematik und Informatik Institut für Informatik kuska@informatik.uni-leipzig.de 109

110 POSTER 4.27 Glatte Muskelzellen der humanen Harnblase exprimieren H1-, H2- und H3/H4- Histaminrezeptoren in Zellkultur Jochen Neuhaus, Jens-Uwe Stolzenburg, Thilo Schwalenberg, Wolfgang Dorschner Einleitung Histamin ist ein biogenes Amin, das von aktivierten Mastzellen sezerniert wird und so auch in der Harnblase als Mediator entzündlicher Veränderungen und allergischer Reaktionen fungiert. Wie wir bereits zeigen konnten, löst Histamin in kultivierten glatten Muskelzellen der Meer schweinchen- Harnblase intrazelluläre Kalziumtransienten aus (Neuhaus et al. (2000), Akt. Urol. 31:41-48). Material und Methode Humane Harnblasenmuskulatur wurde nach radikalen Zystektomien steril entnommen. Insgesamt wurden 12 Patienten in die Untersuchung einge schlossen (9 männlich, 3 weiblich). Die glatten Muskelzellen wurden nach kurzem Verdau oder als Fragmentkultur auf Collagen A-beschichteten 35 mm Plastikkulturschalen in DMEM mit 10% FCS und 1% Antibiotika- Lösung unter 5% CO 2 kultiviert. Die Ca 2+ -Messungen erfolgten in Bereichen mit min. 60% Konfluenz. Ein Kalziumanstieg um mindestens 10 nm wurde als positive Reaktion gewertet. Ergebnisse 51% der Zellen reagierten auf 100 µm Carbachol (Kontrolle für glatte Muskelzellen; N=759). 85% der Zellen reagierten auf Stimulation mit 100 µm Histamin (N=994) mit einem transienten Kalziumanstieg. Auf den H1R-spezifischen Agonisten HTMT reagierten 17% (N=513), auf Dimaprit (H2R) 20% (N=487) und auf (R-)-α-Methylhistamin (H3R) 18% (N=567) dieser Zellen. In Blockierungsexperimenten wurden durch Pyrilamin (H1R- Antagonist) 91,2% (N=319) und durch Famotidin (H2R) 61,4% (N=319) der Zellen in ihrer Reaktion auf 100 µm Histamin geblockt. Thioperamid (H3R) hatte dagegen keine inhibitorische Wirkung (N=319). 110

111 Diskussion Wir konnten zeigen, dass humane glatte Harnblasen-Muskelzellen in Kultur auf Carbachol, Histamin und histaminrezeptorspezifische Agonisten mit einem transienten Kalziumanstieg reagieren. Unsere Daten sprechen dafür, dass 1. unterschiedliche Histaminrezeptoren auf ein und derselben Zelle vorliegen können und 2. alle untersuchten Rezeptoren einen Kalziumanstieg bewirken können. Die H1R bzw. H3R-spezifischen Agonisten HTMT und MTH können jedoch auch zu einem Absinken der Kalziumkonzentration führen. Auch diese Reaktion ist transient. Wir interpretieren diese Ergebnisse dahingehend, dass diese Rezeptoren sowohl an einen die Kalzium konzentration senkenden (z. B. über Adenylatzyklase) als auch an einen den Ca 2+ -release stimulierenden second messenger Weg (IP3-Weg) angekoppelt sind. Wie Experimente in Ca 2+ -freien Ringer zeigten, wird die Histamin reaktion vollständig durch Ca 2+ -release aus intrazellulären Pools getragen. Extrazelluläres Kalzium spielt keine Rolle. Im Gegensatz zu glatten Muskelzellen aus dem Meerschweinchen reagiert ein signifikanter Anteil humaner Zellen in Kultur auch auf den H3R-spezifischen Agonisten Methylhistamin. Diese Reaktion wird durch den H3R-spezifischen Anta gonisten nicht blockiert. Dies könnte auf einen weiteren Subtyp des Histaminrezeptors (z. B. H4R) oder auf eine Variation des H3R hinweisen. Diese Daten halten wir insbesondere im Hinblick auf die interstitielle Cystitis-Therapie für interessant, die mit massiver Freisetzung von Histamin aus aktivierten Mastzellen einhergeht. Danksagung Die Autoren danken Frau Annett Weimann und Herrn Dr. W. Dawood für die hervorragende technische Unterstützung. Prof. Dr. Wolfgang Dorschner, Dr. Jochen Neuhaus, Dr. Jens-Uwe Stolzenburg, Thilo Schwalenberg Universität Leipzig Universitätsklinikum Klinik und Poliklinik für Urologie

112 POSTER 4.28 Candidate IBD vaccine: Generation of recombinant serotype 1-/serotype 2-strains of infectious bursal disease virus by reverse genetics Yvonne Oberländer, Rüdiger Raue, Kati Zierenberg, Hermann Müller Infectious bursal disease virus (IBDV) is the causative agent of an acute disease of chickens with high morbidity and mortality rates. Two serotypes are known; all pathogenic strains belong to serotype 1. Besides necrosis, B-lymphocytes also undergo apoptotic cell death. Both, IBDV virulence markers and apoptotic inducers, are not yet well defined. To investigate the structural basis of pathogenicity, recombinant IBDV strains of the serotype 1 strain Cu-1 and the serotype 2 strain 23/82 were constructed. The genomic region of VP2 and of VP5, which partially overlaps VP2, in segment A full-length clones of both serotypes was cut out using restriction enzymes and ligated vice versa into the strain of the other serotype. Using the reverse genetics approach, infectious progeny was obtained after in vitro transcription and transfection of chicken embryo cells (CEC): Cu-1(23/ 112

113 82VP2/5) and 23/82(Cu-1VP2/5), respectively. Recombinations within these strains were identified by immunofluorescence assay using serotypespecific monoclonal antibodies directed against VP2 and sequencing. To investigate their biological characteristics, plaque tests and growth curves were performed in CEC. The induction of apoptosis was investigated by TUNEL assay and DNA laddering. In summary, the replication rate of Cu-1(23/82VP2/5) is comparable with that of Cu-1 and Cu-1(mc), but 23/82(Cu-1VP2/5) showed significant lower replication rates compared to Tu and Tu(mc). Plaque diameters and the induction of apoptosis of the recombinant viruses are reduced indicating a reduction in pathogenicity in tissue culture. Therefore, these strains may be possible candidates for the development of a safe and efficient IBDV vaccine. Prof. Dr. Hermann Müller, Yvonne Oberländer, Rüdiger Raue, Kati Zierenberg Universität Leipzig Faculty of Veterinary Medicine Institute of Virology virology@vetmed.uni-leipzig.de 113

114 POSTER 4.29 Das zusätzliche Strukturprotein VP4 im Kapsid des aviären Polyomavirus APV ein Pathogenitätsfaktor? Reimar Johne, Hermann Müller Das aviäre Polyomavirus APV besitzt im Vergleich zu den Polyomaviren der Säuger ungewöhnliche biologische und strukturelle Eigenschaften. Während Infektionen mit den Säuger-Polyomaviren im permissiven, immun kompetenten Wirt ohne klinische Symptome verlaufen, ruft APV bei einer Vielzahl unterschiedlicher Vogelarten eine akute, multisystemische Erkrankung mit hoher Mortalitätsrate hervor. Polyomaviren sind unbehüllte ikosaedrische Partikel mit einem Durchmesser von ca. 45 nm, die das doppelsträngige DNA-Genom, assoziiert mit zellulären Histonen, enthalten. Das virale Kapsid der Säuger-Polyomaviren ist aus dem Hauptstrukturprotein VP1 und den Strukturproteinen VP2 und VP3 aufgebaut. Wir haben kürzlich gezeigt, dass APV-Virionen ein zusätzliches Strukturprotein besitzen, das als VP4 bezeichnet wird. VP4 induziert Apoptose, die bei Infektionen mit Säuger-Polyomaviren nicht beobachtet wird. VP4 (vormals Agnoprotein 1a), das von der 5 -Region der späten polycistronischen mrna kodiert wird, besitzt 176 Aminosäuren mit 114

115 einem errechneten Molekulargewicht von 18,6 kda; in der SDS-PAGE hat es allerdings ein apparentes Molekulargewicht von kda. VP4 interagiert mit VP1 und bindet sequenzunspezifisch dsdna. Ein Leuzin- Zipper-Motiv könnte die DNA-Bindung vermitteln. Die Expression der für VP4 kodierenden Region ist essentiell für die Virusreplikation. Die damit verbundene Induktion von Apoptose könnte für die Virusausbreitung in APV-infizierten Vögeln und damit als Pathogenitäts faktor für die hohen Mortalitätsraten verantwortlich sein. In APV-infizierten Zellen kommt eine zusätzliche mrna vor, in der das Leucin-Zipper-Motiv von VP4 deletiert ist. Die biologischen Eigenschaften einer gentechnologisch hergestellten APV-Mutante, die nur noch diesen Typ der mrna exprimiert, wurden in der Zellkultur untersucht. Dabei zeigte sich eine langsamere Replikation dieses Virus und eine verminderte Apoptose-Induktion im Vergleich zum Wildtyp-Virus. Die Eignung der APV-Mutante als Lebend impfstoff wird derzeit getestet. Prof. Dr. Hermann Müller, Dr. Reimar Johne Universität Leipzig Veterinärmedizinische Fakultät Institut für Virologie 115

116 POSTER 4.30 Expression von Proteinen des Virus der infektiösen Bursitis im homologen Wirtszellsystem mit Hilfe rekombinanter Influenzaviren Katja Wiedemann, Reimar Johne, Hermann Nieper, Hermann Müller Das Virus der infektiösen Bursitis (IBDV) verursacht bei Hühnern eine akute Infektion mit hoher Morbidität und hoher Mortalität oder bei chronischem Verlauf Immunsuppression, wodurch der Geflügelindustrie weltweit erhebliche Verluste entstehen. Ziel unserer Experimente war es, Proteine des IBDV in Hühnerembryofibroblasten (HEF) als dem homologen Wirtszell system mit Hilfe rekombinanter Influenzaviren zu synthetisieren, um für die Impfstoffherstellung und die Diagnostik optimale Antigene zur Verfügung zu haben. Mit Hilfe eines RNA-Polymerase I-Systems wurden rekombinante Influenzaviren generiert, die ein zusätzliches Gensegment mit der Information für die beiden Hauptstrukturproteine VP2 und VP3 oder deren Vor läufer protein VP0 von IBDV enthalten. Hierzu wurden die kodierenden Regionen in einen Expressionsvektor kloniert, der Steuerelemente für die zelluläre RNA-Polymerase I und für die Influenza A-Helferviren enthält. Nach Transfektion der Plasmid-DNA wird mit Hilfe 116

117 der zellulären RNA-Polymerase I eine RNA gebildet, die von Influenza- Helferviren verpackt und exprimiert wird. Nach Passagierung der rekombinanten Influenzaviren in Kulturen von HEF konnten VP2, VP3 und VP0 mittels Immunoblot nachge wiesen werden. Durch Immunpräzipitation der nativen Proteine mit mono klonalen Antikörpern wurde die funktionell wichtige Konformation dieser Proteine festgestellt. Die Ausbeute an rekombinanten Proteinen differierte deutlich, wobei VP3 die höchste und VP0 die niedrigste Expressions rate aufwies. Die erwartete Bildung Virus-ähnlicher Partikel (VLP) wurde mittels Elektronenmikroskopie untersucht. VLP wurden nach Expression des VP0 nachgewiesen, während die Expression von VP3 zur Bildung tubulärer Strukturen führte. Die gereinigten Proteine sollen nun zur Immunisierung von Hühnern eingesetzt werden. Prof. Dr. Hermann Müller, Katja Wiedemann, Dr. Reimar Johne, Hermann Nieper Universität Leipzig Veterinärmedizinische Fakultät Institut für Virologie virology@vetmed.uni-leipzig.de 117

118 POSTER 4.31 Das Interdisziplinäre Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) Leipzig 118

119 Das IZKF Leipzig wurde 1996 im Rahmen des Regierungsprogramms Gesundheitsforschung 2000 vom Bundesministerium für Wissenschaft, Forschung und Technologie an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig mit dem Ziel gegründet, international vergleichbare Spitzen forschung zu initiieren. Die mit der Gründung verbundenen wissenschafts politischen Ziele sind der Aufbau effizienter und leistungsstarker Strukturen für die interdisziplinäre klinische Forschung, die Entwicklung eines hochschulspezifischen Forschungsprofils mit internationaler Ausstrahlung und die gezielte Förderung wissenschaftlichen Nachwuchses. Die Medizinische Fakultät begreift das IZKF als Motor dieser Entwicklung. Prof. Dr. Frank Emmrich (Sprecher), Cornelia Borchers (Geschäftsführung) Universität Leipzig Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (IZKF)

120 POSTER 4.32 IZKF Leipzig Schwerpunkt A: Rheumatologie und Immunologie Frank Emmrich, Friedemann Horn Die Projekte sind nicht nur inhaltlich, sondern auch methodisch stark miteinander und mit anderen Arbeitsgruppen im Zentrum, in der Medi zinischen Fakultät und in den Fakultäten für Biowissenschaften, Pharmazie und Psychologie, für Physik und Geowissenschaften sowie für Chemie und Mineralogie verzahnt. NMR-Techniken (A02, A05, A17), Peptidanalytik bzw. -synthese (A02, A05, A18) und Microarray techniken (A13, A18, A02, A05) werden gemeinschaftlich und im Erfahrungs austausch benötigt und entwickelt. Beträchtliche Expertise ist in den letzten Jahren durch die tier experimentellen Modelle im Schwerpunkt A gesammelt worden. Unter Nutzung dieser Erfahrungen soll eine tierexperimentelle Plattform entwickelt werden, mit deren Hilfe ein funktions tüchtiges menschliches Immunsystem in SCID-Mäusen etabliert werden kann und die als Basis für neuartige Pathogenesemodelle dient. Ab 2003 steht das im Schwerpunkt entwickelte Verfahren zur Induktion immunologischer Toleranz für den klinischen Einsatz bei Organtrans plantationen den Leipziger Transplantationszentren zur Verfügung. 120

121 Abb.1 Inhaltliche Zielsetzung des Schwerpunktes A für die Förderperiode 2002/03 Prof. Dr. Frank Emmrich, Prof. Dr. Friedemann Horn Universität Leipzig Universitätsklinikum Institut für Klinische Immunologie und Transfusionsmedizien emmf@medizin.uni-leipzig.de 121

122 POSTER 4.33 IZKF Leipzig Schwerpunkt B: Endokrinologie Ralf Paschke, Wieland Kiess Zu Beginn der laufenden Förderphase wurde der Schwerpunkt Endokrinologie personell und thematisch völlig neu zusammengesetzt und strukturiert. Durch die Fokussierung auf das gemeinsame Ziel der Aufklärung von Signaltransduktionsprozessen auf verschiedenen Rezeptor ebenen konnten neue produktive Interaktionsstrukturen entwickelt werden, welche zu gemeinsamen Publikationen und gemeinsamen weiterführenden Projekten führten. 122

123 Auf dieser Basis wurde als gemeinsames Ziel für die kommende Förderphase die Identifizierung neuer Hormonsignalwege definiert. In vier Projekten soll mit sich gegenseitig ergänzenden, klassischen Methoden nach weiteren, neuen Signalwegen für bekannte Rezeptoren gesucht werden, um heterogene Endpunkte für Erkrankungen besser verstehen zu können. Zudem sollen in zwei weiteren Projekten neue Mechanismen der Signalwegaktivierung und die atomare Ebene der Signalaktivierung identifiziert werden. Der gemein same Fokus und die Ausrichtung aller Projekte auf die Identifizierung neuer Signalwege soll zwangsläufig zur weiteren Intensivierung der bisherigen Kooperationsstrukturen führen. Prof. Dr. Ralf Paschke Universität Leipzig Universitätsklinikum Medizinische Klinik und Poliklinik III Prof. Dr. Wieland Kiess Universität Leipzig Universitätsklinikum Klinik und Poliklinik für Kinder und Jugendliche

124 POSTER 4.34 IZKF Leipzig Schwerpunkt C: Neurowissenschaften Yves D. von Cramon, Thomas Arendt Aufbauend auf den in den Vorjahren erarbeiteten Befunden und geschaffenen Strukturen wird in den nächsten zwei Jahren der IZKF-Schwerpunkt C Neurowissenschaften auf die Neurodegeneration fokussiert bleiben. Wesentliches Anliegen ist die Aufklärung der inter- und intra zellulären Signal-Pathways im Verlauf der Neurodegeneration. Im Rahmen dieses Anliegens werden die beiden im bisherigen Förderzeitraum bewährten Modelle der Alzheimerschen Erkrankung und der Netzhautdegeneration beibehalten und um ein neues Modell (RGS9 knockout-mäuse) erweitert. Zur Bearbeitung der Problematik der Alzheimerschen Erkrankung werden die klinischen Projekte weitergeführt und auf eine breitere diagnostische Basis gestellt; dies fördert das zweite Anliegen des Schwerpunktes, die Verbesserung der Diagnostik neuro degenerativer Erkrankungen. 124

125 Prof. Dr. Yves D. von Cramon Max-Planck-Institut für neuropsychologische Forschung Prof. Dr. Thomas Arendt Universität Leipzig Medizinische Fakultät Paul-Flechsig-Institut für Hirnforschung 125

126 POSTER 4.35 IZKF Leipzig Schwerpunkt D: Molekulare Onkologie Christian Wittekind, Kurt Engeland Die vier Teilprojekte des Schwerpunktes Molekulare Onkologie untersuchen zell- und molekularbiologische Aspekte des Zell zyklus und der zellulären Interaktion von Tumorzellen. Allen Projekten gemeinsam ist ein interdisziplinärer, klinisch orientierter Ansatz mit unterschiedlichen methodisch-instrumentellen Schwerpunkten. Es werden zwei thematisch unterschiedliche, methodisch jedoch konvergierende An sätze verfolgt: Zellzyklusregulation - Zellzyklusregulation im Gastrointestinaltrakt (D02 Engeland) und im hämatopoetischen System (D05 Deininger / Niederwieser) und Zell in ter ak tion - Zelluläre Regulationsmechanismen unter Hypoxie (D03 Höckel / Leo) und Genexpressionsprofiling von Lebertumoren (D01 Tannapfel / Wittekind). 126

127 Allen Antragstellern von Teilprojekten des Schwerpunktes Molekulare Onkologie, Zell zyk lus regulation und Zellinteraktion gemeinsam ist die durch Drittmitteleinwer bung und kompetitive Publikationen dokumentierte Expertise auf dem Gebiet der Tumor for schung, die jetzt sowohl konzeptionell als auch institutionell zusammengefasst und damit die bestehenden Strukturen des IZKF Leipzig verstärken wird. Prof. Dr. Christian Wittekind Universität Leipzig Universitätsklinikum Institut für Pathologie PD Dr. Kurt Engeland Universität Leipzig Universitätsklinikum Medizinische Klinik und Poliklinik II,

128 POSTER 4.36 IZKF Leipzig Schwerpunkt Z: Zentraler Funktionsbereich Michael Cross, Knut Krohn Der Zentrale Funktionsbereich besteht aus drei Elementen: Geschäftsführung, Ser vice und Forschungsgruppen, die sich zu einer Kernstruktur des IZKF Leipzig ent wickelt haben. Die Geschäftsführung über nimmt das Zentrums management, die Organisation interner und externer Veran staltungen, die Gremien- und die Öffentlich keits arbeit und ist Scharnierstelle zwischen Projektträger, Universität, Fakultät, Pro jektleitern und externen Partnern. Die Core Units bieten technische Entwicklungs leistungen und projekt spezifische Beratung an, um spezielle Methoden auf dem neuesten Stand zu halten und für alle Wissenschaftler zugänglich zu machen. Die Ernennung eines Servicekoordinators, und der Ausbau der Gruppe Z 10 zu einer Core Unit für Fluoreszenz Technologie sind Teil des dynamischen Anpassungs prozesses im Zentrum, das, gestützt durch die Kontinuität erworbener Fertigkeiten, stets flexibel auf neue Entwicklungen reagiert. Die Querschnitts- und Nachwuchsgruppen bauen innovative, schwer punkt übergreifende Forschungspro gramme auf, die im Zentrum neue Anstöße geben. Die Bündelung dieser Kompetenzen und verschiedenen Funktionen in einem Schwerpunkt fördert die Interdisziplinarität und verschafft der Fakultät erweiterte Interaktionsflächen für die wissen - schaftliche Kommu ni kation, die Methodenentwicklung und Technologien. 128

129 Dr. Michael Cross, PD Dr. Knut Krohn Universität Leipzig Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (IZKF)

130 POSTER 4.37 IZKF Leipzig Schwerpunkt Z: DNA-Technologien (Z03) Knut Krohn Neue Technologien verändern derzeit das Gesicht der modernen Biowissenschaften und der Medizin. Die Entschlüsselung genetischer Information ist zur Triebkraft des biomedizinischen Fortschritts geworden. Neben der Sequenzierung ganzer Genome kommt der Sequenzanalyse auch im Alltag eines medizinischen Forschungslabors eine wachsende Bedeutung zu, da die Anwendung einer Vielzahl molekularbiologischer Werkzeuge die genaue Kenntnis von DNA-Sequenzen voraussetzt. Neben der Sequenzanalyse steht die Analyse der Genexpression als Grundlage der Funktion biologischer Systeme im Vordergrund. Neue Methoden der Microchip-Technologie erlauben es, Analysen in einem Experiment auf nahezu alle Gene eines Genoms auszudehnen. Der zentrale Funktionsbereich DNA-Technologien trägt als Serviceeinrichtung des IZKF Leipzig dieser Entwicklung Rechnung. Projektübergreifend werden Leistungen in der DNA-Sequenzierung, der Heterozygotenanalyse, der Fragmentanalyse, der Analyse von Mikro- 130

131 satellitenmarkern und der Microchip-Technologie angeboten. Derzeit werden für über 40 Arbeitsgruppen des IZKF, des Universitätsklinikums, der Universität Leipzig und externen Partnern jährlich etwa Sequenzierungen und Fragmentanalysen sowie 300 Microchip-Analysen durchgeführt. Ein Großteil dieser Leistungen wird für die Erforschung krankheitsrelevanter Gene verwendet (z. B. TSH-Rezeptor, Schilddrüsenperoxidase, TNF-alpha, Wilson Gen) und trägt zur Aufklärung der Ursachen für verschiedene Erkrankungen bei (z. B. rheumatische Arthritis, Diabetes, Schilddrüsenerkrankungen, Magen- und Darmerkrankungen, Tumor erkrankungen). Außerdem koordiniert und pflegt der Funktionsbereich DNA Sequenzierung die Methodenbörse des IZKF und organisiert Methodenkurse und Workshops zur molekularbiologischen Weiterbildung (z. B. Einzelzell- PCR, Bio computing, Microarraytechnologie, Sequenzanalyse). PD Dr. Knut Krohn Universität Leipzig Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (IZKF)

132 POSTER 4.38 IZKF Leipzig Schwerpunkt Z: Peptid-Technologien (Z04) Sabine Tschiedel Als zentrale Einrichtung steht die Core Unit Peptid-Technologie allen Partnern des IZKF und den Fakultäten der Universität offen. Sie führt in enger Zusammenarbeit mit den einzelnen Auftraggebern Synthesen, Reinigung und Analyse von einzelnen Peptiden im mg-maßstab, als auch die Synthese von trägerfixierten Peptiden im ng-maßstab für Screening- Tests durch. Diese Service-Leistungen werden zum Selbstkostenpreis angeboten. Dies bedeutet, dass beispielsweise die Kosten der Peptide in etwa nur 10-20% der Preise kommerzieller Anbieter betragen, was enorme Einsparungen mit sich bringt. So kann qualitativ hochstehende Forschung trotz günstiger Preise betrieben werden. Ebenso stellt die Core Unit eine Anlaufstelle bei peptidspezifischen Problemen und Fragen dar, von deren Know-how das IZKF jederzeit profitieren kann. Die Synthese einzelner Peptide erfolgt nach der Fmoc-Strategie. Bei dieser Methode ist die Herstellung von Peptiden in größeren Mengen (ca

133 60 mg) möglich. Mit dem Peptidsynthesizer AMS von ABIMED können bis zu 48 Peptide zu max. 45 Aminosäuren parallel synthetisiert werden. Spezifische Modifikationen der Peptide sind möglich, wie beispielsweise Einführung von D-Aminosäuren, seltenen Aminosäuren oder Spacern. Der N-Terminus kann frei oder blockiert (z. B. acetyliert) sein, und auch C-terminale Modifikationen sind durchführbar. Zudem kann man viele Markierungsmöglichkeiten nutzen, wie Fluoreszenz-, Lumineszenz- und Biotinylierungsmarker. Nach der Synthese erfolgt die Abspaltung der Schutzgruppen sowie der Peptide vom Trägerharz, und das Rohprodukt wird mit kaltem Diethylether gewaschen. Die getrockneten Peptide werden in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Die erhaltenen Syntheseprodukte werden mittels HPLC auf Reinheit geprüft. Falls erforderlich, werden die Rohpeptide mittels präparativer HPLC aufgereinigt. Die Identität wird mittels korrekter Masse durch MALDI-MS bestimmt. Dr. Sabine Tschiedel Universität Leipzig Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (IZKF)

134 POSTER 4.39 IZKF Leipzig Schwerpunkt Z: Fluoreszenz-Technologien (Z10) Ulrich Sack, Jan Richter, Jens Grosche, Andreas Reichenbach In den letzen Jahren auf dem Gebiet der Mikroskopie und Fluoreszenzbildgebung entwickelte Instrumente eröffnen der Forschung völlig neuartige Perspektiven. Drei Verfahren, welche in diesem Teilprojekt etabliert wurden, stehen Wissenschaftlern des IZKF zur Verfügung: 1. Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (clsm) 2. Laserscanningzytometrie (LSC) 3. Durchflusszytometrie (FC) Die clsm ermöglicht sowohl die dreidimensionale Darstellung markierter Zellen mit komplexer Struktur (Nervenzellen, DC) als auch eine Unter suchung subzellulärer Strukturen, wie die Lokalisation markierter Organellen sogar innerhalb von lebenden Zellen. Mit Farbstoffen, welche sensitiv auf physiologische Parameter reagieren, können auch zeitabhängige Messungen von Funktionszuständen erfolgen. Mit Hilfe der LSC können mit geringen Zellzahlen im histologischen Schnitt oder am Zytospinpräparat in Echtzeit morphologische Daten erhoben und mit Daten über Fluoreszenzmarkierungen kombiniert werden. Kinetische Unter suchungen mit Hilfe der Relokalisierungsfunktion sind auf dem single cell level problemlos möglich. 134

135 Das Durchflusszytometer erlaubt die Bestimmung von bis zu vier verschiedenen Fluoreszenzmarkierungen auf einfache Weise in relativ kurzer Zeit. Damit sind Informationen über Zelloberflächenmoleküle, Aktivierungsmarker, zelluläre Funktionen u.v.a. in einer großen Kombinationsvielfalt an vielen Zellen erfassbar. Die Querschnittsstelle ermöglicht den Mitarbeitern des IZKF den problem losen Zugang zu diesen Techniken durch die Etablierung von Dienst leistungen wie Aufrechterhaltung einer ständigen Einsatzbereitschaft der Geräte, Anleitung und Einarbeitung von Doktoranden und Mitarbeitern, Optimierung der Auswertung und Präsentation von Ergebnissen und Gewährleistung einer möglichst optimalen Geräteauslastung durch Organisation der Zugangszeiten. Dr. Ulrich Sack, Jan Richter Universität Leipzig Universitätsklinikum Institut für Klinische Immunologie und Transfusionsmedizin Prof. Dr. Andreas Reichenbach, Dr. Jens Grosche Medizinische Fakultät Paul-Flechsig-Institut für Hirnforschung 135

136 POSTER 4.40 Neuroimmunologische Zellbiologie Gerald Münch Für die Alzheimer Demenz (AD) sind hochvernetzte, proteaseresistente Proteinablagerungen in Form von neurofibrillären Bündeln (intrazellulär) und β-amyloidplaques (extrazellulär) in vulnerablen Hirnregionen der Patienten charakteristisch. Ein Bestandteil dieser kovalenten Protein-Protein-Vernetzungen sind Advanced Glycation Endproducts (AGEs). AGEs aktivieren phagozytotische Zellen (z. B. Mikroglia) über rezeptorvermittelte Prozesse, induzieren die Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine (IL-1, IL-6, TNF-α) sowie freier Radikale (O 2.-, NO) und könnten so (als Ligand auf β-amyloidplaques) durch die chronische Akutphasenreaktion / Radikal produktion ursächlich neuronalen Dysfunktion, z.b. zum Energiemangel und zur Inhibierung von Transportprozessen, beitragen. Wie AGEs mit den Nervenzellen interagieren und welche Signalwege sie in der Zelle stimulieren, ist noch teilweise ungeklärt. Weiterhin sind die genauen chemischen Strukturen vieler AGEs, vor allem die der physio logisch aktiven, noch nicht aufgeklärt. Die zukünftigen Untersuchungen sollen AGE-Signaltransduktionswege von der Rezeptor- bis zur Transkriptionsebene molekular aufklären, auch die chemische Struktur der aktiven (rezeptor-aktivierenden) Liganden soll in einem Kooperationsprojekt mit externen Gruppen identifiziert werden. Des weiteren sollen die Effekte der von aktivierten Mikro- und Astroglia ausgeschütteten Zytokine/Wachstumsfaktoren auf Neuronen, v.a. auf die Stimulierung von mitogenen Signalen und aberranter Eintritt in den Zellzyklus, untersucht werden. Ziel der Untersuchungen sind einerseits Modellsysteme, in denen therapeutisch vielversprechende anti-inflammatorische und neuroprotektive Substanzen ge testet und ihr Angriffspunkt auf molekularer Ebene identifiziert werden können (Abb. 1). Andererseits soll auch untersucht 136

137 werden, ob die hohen AGE Spiegel im Hirngewebe der AD Patienten sich auch im CSF widerspiegeln und ob spezifische, hoch AGE-modifizierte Liquorproteine als diagnostische Marker herangezogen werden können. Abb. 1: Neuro-inflammatorische Kaskade in der Alzheimer Krankheit PD Dr. Gerald Münch Universität Leipzig Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) Nachwuchsgruppe Neuroimmunologische Zellbiologie

138 POSTER 4.41 Stammzellbiologie Zoe McIvor, Minyao Wu, Matthias Hoja, Sethu Narayanan, Michael Cross Die hämopoetische Stammzelltherapie wird schon seit ca. 30 Jahren in Form von Knochenmarktransplantationen praktiziert. Erst in den letzten Jahren ist es jedoch klar geworden, dass die Stammzellen des Knochenmarks und des Blutes auch eine Vielfalt nicht hämopoetischer Zellarten generieren können. Als potenzielle Zellquelle für die regenerative und reparative Medizin bieten solche Adulten Stammzellen daher eine Alternative zu den umstrittenen Embryonalen Stammzellen. Um die Perspektive der Stammzelltherapie in dieser Art und Weise zu erweitern, wird es aber nötig, die Mechanismen der Selbsterneuerung und Linearfestlegung besser zu verstehen und in vitro beeinflussen zu können. In der Nachwuchsgruppe Molekulare Medizin werden drei komplementäre Aspekte der Stammzellbiologie studiert: die Stammzellspezifische Genregulation; die Einflüsse bestimmter Wachstumsfaktoren und Kulturbedingungen auf das Differenzierungspotenzial und die besonderen metabolischen Eigenschaften von Stammzellen. 138

139 Unsere neuesten Ergebnisse deuten auf ein Netzwerk von Transkriptionsfaktoren hin, die eine multipotente Zelle auf die Linearfestlegung vorbereiten. Sowohl die Differenzierungsrichtung als auch die Entscheidung, nicht zu differenzieren, wird aber letztendlich durch spezifische Wachstumsfaktoren bestimmt. Unter anderem scheint eine Rückkopplung zwischen metabolischen Eigenschaften und Genexpression die Differenzierung zu hemmen, bis die Stammzelle eine passende Umgebung gefunden hat. Auf der Basis dieser Grundlagenforschung werden neue Strategien für die Vermehrung und Differenzierung von Primärstammzellen für klinische Anwendungen entwickelt. Dr. Michael Cross, Zoe McIvor, Minyao Wu, Matthias Hoja, Sethu Narayanan Universität Leipzig Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) Nachwuchsgruppe Molekulare Medizin

140 POSTER 4.42 Advanced Glycation Endproducts change glucose utilisation and cause ATP depletion in SH-SY5Y neuroblastoma cells Susana García de Arriba, Claudia Loske, Winnie Deuther-Conrad, Reinhard Schinzel, Gerald Münch Advanced glycation endproducts (AGEs), protein bound sugar fragmentation products, accumulate on long-lived proteins including β-amyloid (Aβ) plaques in Alzheimer s disease. The toxicity of Aβ has been intensively investigated, but far less is known about the cytotoxic effects of AGEs including a possible effect on cellular energy metabolism. In this study, we have measured the effect of a model-age (BSA-AGE) and the AGE-modified Aβ, on MTT reduction, cellular ATP content, glucose consumption and lactate production in SH-SY5Y human neuroblastoma cells and whether membrane permeable antioxidants could protect them against these metabolic changes. AGEs (24h exposition) reduce both formazan formation and cellular ATP content in a dose-dependent manner. Aβ and Aβ-AGE both reduce formazan formation and cellular ATP content in a dose-dependent manner. Aβ and Aβ-AGE also increase total glucose consumption but did not have any effect on lactate production. The differences of Aβ, Aβ-AGE and 140

141 BSA-AGE in terms of lactate production point out a different extent and mechanism of damage. Glucose/lactate ratio for BSA-AGE (100 µm) was close to 4 and indicate that cells use alternative fuel sources (e.g. amino acids). However, the ratio for Aβ and Aβ-AGE is less than 2, suggesting that glucose is not use for lactate production, but rather for antioxidant defences. The AGE-induced metabolic changes could be attenuated by the membrane permeable antioxidants α-lipoid acid and 17β-estradiol. Glucose metabolism was normalized by pre-treatment of the cells with both antioxidants, and α-lipoid acid was the most effective in reducing the extent of lactate production. Therefore, membrane permeable, especially thiol-based, antioxidants may be considered useful therapeutic drugs against (AGE-mediated) neurodegeneration in Alzheimer s disease not only by passive radical scavenging, but also through their positive effects on cellular energy metabolism. PD Dr. Gerald Münch, Susana García de Arriba, Winnie Deuther-Conrad Universität Leipzig Interdisciplinary Centre for Clinical Research (IZKF) Neuroimmunological Cell Biology Unit gars@medizin.uni-leipzig.de Prof. Dr. Reinhard Schinzel, Dr. Claudia Loske University of Würzburg Physiological Chemistry I Biocenter 141

142 POSTER 4.43 Neurotoxicity of Methylglyoxal on Human SH- SY5Y Neuroblastoma Cells Synergism Among Glycation, Oxidative Stress and NMDA receptors Overactivation Susana Garcia de Arriba, Gabrielle Oehme, Gerald Münch Advanced glycation endproducts, protein bound sugar- or di(carbonyl)- derived compounds, are parts of the pathological intraneuronal protein deposits in Alzheimer s disease, the so called neurofibrillary tangles. The most active dicarbonyl compound is methylglyoxal (MG), which is formed endogenously and accumulated in conditions of: increased influx of glucose into the cell, decreased metabolic degradation, and impaired MG detoxification. The aim of this study was to characterize the cytotoxicity of MG in the human SH-SY5Y neuroblastome cell line, and to further test different carbonyl scavengers, antioxidants, nitric oxide synthase inhibitors, and NMDA receptor antagonists for their ability to protect cells against MGmediated toxicity. MG was tested for toxicity in a range of concentrations from 70 to 2500 µm after 24 hours exposition. MG induces cell death (MTT assay), decreases intracellular ATP content, induces mitochondrial membrane depolarization (Rhodamine-123 fluorescence) and increases formation of mitochondrial reactive oxygen and nitrogen species (Dyhidrorhodamine-123/Rhodamine 123 Fluorescence) in a concentration-dependent manner. LD 50 for MG toxicity was close to 1200 µm. The effect of MG on cells examined 142

143 morphologically verifies a decrease in cell number but also a decrease in number and length of neurites. The high correlation between decreased intracellular ATP concentration with cell death, suggests that impairment of energy metabolism may be the cause of MG-mediated toxicity. The ATP depletion is prevented by the carbonyl scavengers: aminoguanidine, telnisetam, carnosine; by the antioxidants lipoid acid, β-estradiol, by the NOS inhibitor L-NAME, and significantly by all NMDA receptor antagonists: MK-801, Memantine, and AP-7. These results strongly suggest that cell energy impairment leading to toxicity caused by MG is a process mediated by oxidative stress, NOS activity and NMDA receptor stimulation. In the present study, we showed that glycation is harmful to brain cells and its mechanism is possibly synergized with oxidative stress and NMDA receptor over-stimulation. It is difficult to conclude the pathophysiological significance of glycation in neurodegenerative diseases but we could show that the interference with the process by which AGEs formation occurs may provide new therapeutic opportunities to reduce the pathophysiological changes associated with neurodegeneration. PD Dr. Gerald Münch, Susana Garcia de Arriba, Gabrielle Oehme Universität Leipzig Interdisciplinary Centre for Clinical Research (IZKF) Neuroimmunological Cell Biology Unit gars@medizin.uni-leipzig.de 143

144 POSTER 4.44 Proinflammatory signal transduction pathways in N11 mouse microglia cell line activated by Advanced Glycation Endproducts (AGEs) Sladjana Dukic-Stefanovic, Jovana Gasic-Milenkovic, Winnie Deuther-Conrad, Gerald Münch Deposition of AGE-crosslinked insoluble protein aggregates is characteristic for many degenerative diseases of the elderly including Alzheimer s disease. Microglial activation has been shown to play a crucial role in functional degeneration as well as cell death of neurons. AGEs activate specific signal transduction pathways, resulting in the up-regulation of various proinflammatory signals such as cytokines (IL, TNF-α) and inducible nitric oxide synthase (inos). It has been shown that AGEs can induce NO and cytokine production in different cell lines, possibly by its interaction with the AGE-specific receptors. Our goal was to study AGE-activated signal transduction pathways involved in the induction of pro-inflammatory cytokines in the murine microglial cell line N

145 - Chicken egg albumin-age (CEA-AGE), used as model AGE, induces both NO and TNF-α production. - The AGE receptor, RAGE, seems to be involved in both pathways, since both NO and TNF-α production can be inhibited by a neutralizing RAGE antibody. - NO and TNF-α production appears to be regulated independently, since NOS inhibitors did not decrease TNF-α secretion and a neutralizing TNF-α antibody did not reduce NO production. - Inhibition of the MEK and PI 3 K pathway (cause cell survival responses), but not of the MAPK-p38 and SAPK/JNK pathways (promotes cell death), reduced NO and TNF-α significantly, suggesting that simultaneous activation of the first two pathways is necessary for the AGE-induced induction of these pro-inflammatory stimuli. PD Dr. Gerald Münch, Sladjana Dukic-Stefanovic, Jovana Gasic-Milenkovic, Dr. Winnie Deuther-Conrad Universität Leipzig Interdisciplinary Centre for Clinical Research (IZKF) Neuroimmunological Cell Biology Unit duks@medizin.uni-leipzig.de 145

146 POSTER 4.45 Synergistic upregulation of inos expression and NO production by Amyloid-β and Advanced Glycation Endproducts (AGEs) Amanda Wong, Sladjana Dukic-Stefanovic, Jovana Gasic- Milenkovic, Gerald Münch Advanced glycation endproducts (AGEs), protein bound oxidation products of sugars, have been shown to be involved in the pathophysiological processes of Alzheimer s disease (AD). Since AGEs accumulate in brain during time, a gradual increase in the level of AGEs may induce a low level chronic inflammation in the aging brain. AGEs are also causing increased oxidative stress. The goal of our study was to determine the expression and localisation of inos in the temporal cortex of AD brains, as well as the eventual colocalisation of inos and AGEs, or Aβ. Our results suggest that inos is expressed by astrocytes and by some microglia in the AD brain. Colocalisation of AGE and inos in astrocytes and microglia cells not only supports a role for AGEs in nitro-oxidative stress in the AD brain, but also a pathway for AGE-induced glial cells activation through the activation of inos. Colocalisation of AGEs and Aβ, but not inos and Aβ in glia cells suggests that AGEs may induce a more pronounced pro-inflammatory effect than Aβ alone. 146

147 Also, the goal of our study was to test if AGEs effect inos expression in a mouse N11 microglial cell line. Cells were treated with Aβ and glucosemodified Aβ (Aβ-AGE), respectively; alone or in combination with CEA- AGE, LPS and mouse IFN-γ. Our data clearly show that Aβ/Aβ-AGE is a very weak pro-inflammatory signal compared to LPS or IFN-γ. Another AGE-modified protein, CEA-AGE, is an equally strong pro-inflammatory signal as LPS or IFN-γ, supporting the hypothesis that AGE-modification is involved in neuroinflammation, but it seems that the degree of modification is essential. A one hundred fold higher AGE-modification (CML) is present in CEA-AGE, and this high modification could be responsible for the obtained NO production in N11 cells in the presence of CEA-AGE compared to the Aβ-AGE. Incubation of N11 cells with the combination of one of these substances with Aβ or Aβ-AGE resulted in a much higher NO release, assuming a synergistic action of the pro-inflammatory signals with Aβ. PD Dr. Gerald Münch, Amanda Wong, Sladjana Dukic-Stefanovic, Jovana Gasic-Milenkovic Universität Leipzig Interdisciplinary Centre for Clinical Research (IZKF) Neuroimmunological Cell Biology Unit mueg@medizin.uni-leipzig.de 147

148 POSTER 4.46 Interdisziplinäres Zentrum für Bioinformatik (IZBI) Ein Überblick Der Senat der Universität Leipzig fasste im Dezember 2001 den Beschluss zur Gründung des Interdisziplinären Zentrums für Bioinformatik (IZBI). Das IZBI ist eine zentrale Einrichtung der Universität Leipzig, die direkt dem Rektoratskollegium untersteht. Es finanziert sich vorrangig aus Mitteln Dritter, initial aus Mitteln der Deutschen Forschungsgemeinschaft. Ziele Als interdisziplinäre Institution soll das IZBI die enge Zusammenarbeit zwischen biologischen und medizinischen Disziplinen und der Informatik, Mathematik und Biometrie innerhalb der Universität, mit den in Leipzig angesiedelten Max-Planck-Instituten sowie mit weiteren Forschungs ein richtungen und Industriepartnern in der Region stimulieren. Leistungsangebot Das IZBI bietet Kompetenz und Kapazität zur Lösung von Problemen mit bioinformatischem Hintergrund an. Es realisiert wissenschaftlich-relevante Auftragsforschung im Bereich der Biotechnologie und Medizin. Konkrete Aufgabenstellungen werden in zeitlich befristeten Projekten bearbeitet. Dazu stellt das IZBI jeweils ein Team von Wissenschaftlern sowie die notwendige Infrastruktur einschließlich des Managements zur Verfügung. Themenschwerpunkte Methoden der Informatik: Datenbanken und Datenintegration Am IZBI werden ausgewählte Methoden der Informatik entwickelt und projektübergrei fend angewendet, zum Beispiel Data Warehouse Verfahren. 148

149 Gewebsorganisation und mikroskopische Bildverarbeitung Die räumliche und zeitliche Organisation von Geweben wird mittels theoretischer Modelle und mikroskopischer Bildsegmentation untersucht. Die Analysen sollen zum Verständnis wesentlicher Organisationsprinzipien innerhalb der Gewebe dienen, zur Quantifizierung morphometrischer Strukturen beitragen und längerfristig in der klinischen Forschung und der Diagnostik Anwendung finden. Signaltransduktion und Genregulation Durch die kombinierte Analyse von Genexpression und Zellaktivität soll ein Beitrag zum Verständnis der Beziehung zwischen genetischer und proteomischer Aktivität geleistet werden. Die Arbeit des IZBI konzentriert sich zunächst auf die Analyse der Arbeitsweise der zellulären Signal trans duktion. Diese Thematik beinhaltet die Analyse von Genexpressionsdaten sowie die Modellierung von zellulären Signalnetzen. Des weiteren wollen wir zur Aufklärung der Heterogenität von Krankheitsbildern mittels Gen expressions analysen beitragen. Genetische Evolution Das Verständnis der genetischen Variabilität erfordert die Analyse großer DNA-Datensätze. Methoden der Informatik sind beim Aufbau und der Hand habung geeigneter Datenbanken und der statistischen Bearbeitung der Datensätze erforder lich. Konkrete Fragestellungen be ziehen sich auf die Lokalisierung von Krankheiten im menschlichen Genom, auf Zusammen hänge zwischen der genetischen Vielfalt und der Evolution von Wirbeltier populationen bzw. Viren und auf die Anwendung evolutionärer Prinzipien bei der Entwicklung von Wirkstoffen. Prof. Dr. Markus Löffler (wiss. Koordinator) PD Dr. Hans Binder (Geschäftsführung) Interdisziplinäres Zentrum für Bioinformatik (IZBI)

150 POSTER 4.47 On the temporal-spatial organisation of in vitro epithel-cell populations Jörg Galle, Markus Löffler, Dirk Drasdo The dynamic behaviour of cell monolayers can be considerably influenced by the contact of the individual cells with the underlying substrate. Prominent examples are the interaction of the hyaline and cell layer during blastulation, the interaction of the basal membrane and the cell layer in intestinal crypts or the interaction of growing multicellular in-vitro cultures with their substrate. 150

151 In a first step we study the growth and stationary regime of an epithel-cell monolayer growing in a finite petri dish. For this purpose we introduce a new three-dimensional individual cell-based model similar to that of Drasdo et. al. (1995) which now (1) accounts for the conservation of the cell volume and (2) includes cell-substrate interactions. Reference Drasdo, D., Kree, R. and McCaskill, J.S A Monte Carlo Model to Tissue Cell Proliferation. Phys. Rev. E, 52(6) Dr. Jörg Galle Universität Leipzig Interdisciplinary Centre for Bioinformatics (IZBI) galle@izbi.uni-leipzig.de Prof. Dr. Markus Löffler Universität Leipzig Faculty of Medicine Institute of Medical Informatics, Statistics and Epidemiology (IMISE) loeffl er@imise.uni-leipzig.de Dirk Drasdo Max-Planck-Institute for Mathematics in the Sciences drasdo@mis.mpg.de 151

152 POSTER 4.48 Gene Expression Warehousing in Leipzig Toralf Kirsten, Hong Hai Do, Erhard Rahm, Knut Krohn Microarray-based gene expression profiling is an important issue of genome research in biomedical and basic science. The Interdisciplinary Centre for Clinical Research (IZKF) in Leipzig therefore runs a core facility for microarray analysis to support multiple research groups. As a consequence of up to 500 experiments per year which produce a huge amount of valuable information data handling becomes a major problem and will limit efficient data analysis. In particular, it is often very difficult to compare and analyse data from different sets of experiments. Furthermore, linking measured gene expression with information of the experimental setup and with publicly available data, such as sequences, pathways or other complex biological information will be very helpful. To address these problems we have started to develop a gene expression data warehouse for microarray data at the Interdisciplinary Centre for Bioinformatics (IZBI) Leipzig. At its core it uses a central database to uniformly collect and store microarray measurement data from many experiments. Moreover, it aims at a semantic integration of annotations, 152

153 taxonomies from public resources such as UniGene (NCBI), sequences from dbest (NCBI) and pathways. In addition the database can be used as a platform to integrate published data from other experiments and to validate and use their result sets. Although the process of setting up and organizing a gene expression warehouse is time and effort-intensive it allows a variety of flexible analysis approaches (e.g. interactive queries, comprehensive reports, data mining, visualization of results). We will focus this project to achieve a new quality of data accessibility, analysis and cross comparison that will help to answer important questions in biomedical research. Toralf Kirsten, Hong Hai Do Universität Leipzig Interdisciplinary Centre for Bioinformatics (IZBI) kirsten@izbi.uni-leipzig.de Prof. Dr. Erhard Rahm Universität Leipzig Faculty of Mathematics and Computer Science Institute of Computer Science rahm@informatik.uni-leipzig.de Dr. Knut Krohn Universität Leipzig Interdisciplinary Centre for Clinical Research (IZKF) krok@medizin.uni-leipzig.de 153

154 POSTER 4.49 Pflanzenzellkultivierung zur Wirkstoffgewinnung Berit Döscher, Ilona Skinfill Rivera, Gerhard Kerns Die Pflanzenzellkulturtechnik birgt ein beachtliches Potenzial zur Gewinnung von pflanzlichen Wirkstoffen. Das wohl bekannteste Beispiel hierfür ist die Gewinnung von Taxol - einem Krebstherapeutikum - mittels Eibenkulturen. Die in-vitro-kultivierung besitzt gegenüber dem konventionellen Pflanzenan bau eine Reihe von Vorteilen. Diese bestehen in der Unabhängigkeit von territorialen und jahreszeitlichen Gegebenheiten, der Zugänglichkeit ansonsten schwer kultivierbarer Pflanzen, z. B. Pflanzen aus extremen Standorten oder der sogenannten Roten Liste. Mittels moderner Fermentations techniken lässt sich eine konstante standardisierbare Qualität der Zielprodukte realisieren. 154

155 Im Rahmen eines Verbundvorhabens mit dem Institut für Pharmazie der Universität Leipzig sollen Ergebnisse erzielt werden, welche eine wirtschaft liche Gewinnung ausgewählter pharmazeutischer Wirkstoffe durch Pflanzen zell kultivierung ermöglichen. Am Beispiel von Hypericum perforatum (Hypericin, Hyperforin), Salix alba (Salicin) und Aesculus hippocastanum (Aescin) sollen die mittels Pflanzenzellkultivierung gebildeten Wirkstoffe charakterisiert und entsprechende Verfahrensgrundlagen erarbeitet werden. Zu den genannten Pflanzen wurden Kallus- bzw. Suspensionskulturen ange legt und verschiedene Einflussfaktoren wie Licht, Medien zusammen - setzung und Hormone auf das Zellwachstum untersucht. Dr. Gerhard Kerns, Berit Döscher, Ilona Skinfill Rivera Sächsisches Institut für Angewandte Biotechnologie (SIAB) kerns@rz.uni-leipzig.de 155

156 POSTER 4.50 Biotechnologische Erzeugung von Polyhydroxyalkanoaten (PHA) zur Entwicklung biofunktionaler Zellträgersysteme für das Tissue Engineering Gisela Mothes, Jörg-Uwe Ackermann Für die Nutzung aller aus mesenchymalen Stammzellen gewonnenen Zelltypen in Medizinprodukten der nächsten Generation werden biofunktio na lisierte Zellträgersysteme (Scaffolds) benötigt. Poly(D-3- Hydroxy butter säure) (PHB) ist aufgrund ihrer Eigenschaften besonders interessant für medizinische Anwendungen: - Stereoregulärer, optisch aktiver isotaktischer Polyester - Molmasse bis zu g/mol - In höchstem Reinheitsgrad herstellbar, keine Katalysatorreste - Biokompatibilität - Thermoplastische Eigenschaften - Piezoelektrische Eigenschaften - Abbau in vivo sehr langsam (hydrolytisch), Endprodukt: D-3-Hydroxy buttersäure Von besonderem Interesse sind Copolymere aus D-3-Hydroxybuttersäure (3HB) und 4-Hydroxybuttersäure (4HB) definierter Zusammensetzung. Je nach Anteil der Monomere lassen sich die Polymereigenschaften gezielt verändern: 156

157 Tabelle: Mechanische Eigenschaften von PHB und P(3HB-4HB) Polymer Schmelztemp. ( C) Zugfestigkeit (MPa) Reißdehnung (%) PHB P3HB/3%4HB % 4HB % 4HB % 4HB % 4HB % 4HB Kristallinität (%) Durch Erhöhung des 4-HB-Anteils werden außerdem höhere in-vivo- Abbauraten erreicht. Am SIAB sind fed-batch und kontinuierliche Verfahren zur biotechnologischen Gewinnung von PHB aus Acetat mit Paracoccus denitrifi cans entwickelt worden. Im 100-Liter Fermenter konnte eine Biomasse von 67 g/l mit einem PHB-Gehalt von 65% erzeugt werden. Gegenwärtige Arbeiten zielen auf die Herstellung eines Copolymers von Poly(D-3-HB-co-4-HB). Mit dem Isolat Comamonas acidovorans P4a steht ein Stamm zur Verfügung, der in Abhängigkeit vom Kohlenstoffsubstrat (Mischung aus Acetat und γ-butyrolacton) ein Copolymer mit hohem 4-HB-Anteil synthetisiert. Dr. Gisela Mothes, Dr. Jörg-Uwe Ackermann Sächsisches Institut für Angewandte Biotechnologie (SIAB) mothes@rz.uni-leipzig.de 157

158 POSTER 4.51 Transgene Hefen als Wirte für die Synthese von Polyhydroxyalkanoaten Uta Breuer, Wolfgang Babel, Yaroslav Terentiev, Gotthard Kunze Polyhydroxyalkanoate oder PHA sind bakteriell produzierte Polyester, welche in Bakterienzellen als separate Granula abgelagert werden. Der bekannteste Vertreter ist Polyhydroxybutyrat oder PHB. Seit bekannt ist, dass PHA ähnliche Materialeigenschaften aufweisen wie die konventionellen Kunststoffe, komplett bioabbaubar sind und bis zu 80% der Zelltrocken masse akkumuliert werden können, erschien eine großtechnische Produktion dieser Polyester ökonomisch lohnend. Einer Markteinführung steht der signifikant höhere Preis dieser Biopolymere im Vergleich zu chemosynthetisch erzeugten Polymeren entgegen. In dem Maße, wie es gelingt, die Effizienz, die Geschwindigkeit der Synthese und die intrazelluläre Konzentration zu erhöhen, sollte der Preis günstiger gestaltet werden können, so dass die kommerzielle Akzeptanz steigt und auch die umweltrelevanten Eigenschaften zum Tragen kommen. Hefen für mikrobielle Produktsynthesen einzusetzen, ist vorteilhaft. Sie werden traditionell in biotechnologischen Verfahren eingesetzt, sie sind größer und haben daher Vorteile bei der Aufarbeitung, und sie sind als Wildtypen ökologisch unbedenklich, allerdings auch nicht fähig, PHA zu bilden. Sie müssen gentechnisch verändert werden. Dafür wurde zunächst 158

159 Saccharomyces cerevisiae gewählt. Es ist gelungen, die drei erforderlichen Gene von Ralstonia eutropha bzw. Methylobacterium extorquens einzeln in dieser Hefe zu etablieren. Eine PHB-Bildung, wenn auch in einem ökonomisch noch nicht verwertbaren Maße, konnte bei der rekombinanten Hefe, die das bakterielle PHB-Synthesegen trägt, festgestellt werden. Um die Konzentration an gebildetem Polymer wie auch dessen Synthesegeschwindigkeit zu erhöhen, wurden Kassetten konstruiert, die die drei PHB-Synthesegene tragen, und gemeinsam in Saccharomyces exprimiert. Da die Bildung des Biopolyesters dadurch noch nicht signifikant gesteigert werden konnte, sind weitere phäno- und genotypische Optimierungen notwendig und anzuschließen. Dieses Projekt wird gefördert von der Deutschen Bundesstiftung Umwelt (Az 13048). Prof. Dr. Wolfgang Babel, Dr. Uta Breuer Umweltforschungszentrum (UFZ) Leipzig-Halle GmbH Sektion Umweltmikrobiologie Prof. Dr. Gotthard Kunze, Yaroslav Terentiev Institut für Pfl anzengenetik und Kulturpfl anzenforschung (IPK)

160 POSTER 4.52 Mikrobielle Produktsynthesen aus toxischen Substraten eine kalorimetrisch ermöglichte Gratwanderung zwischen maximaler Syntheserate und einsetzender Vergiftung Thomas Maskow, Wolfgang Babel Die volle Ausschöpfung des Potenzials von Polyhydroxyalkanoaten (PHA) und von compatible solutes, wie Ectoin, als kompostierbarer, biokompatibler Werkstoff im ersten Fall oder als Stabilisator von Biokatalysatoren im zweiten, erfordert die Kostenreduktion durch die Erschließung neuer Rohstoffe und die Erhöhung der Effektivität des gesamten Prozesses. Der bakterielle Syntheseschritt wird generell durch sub- oder superoptimale Bedingungen induziert, das heißt Nährstoffmangel im ersten Fall oder hohe Salinität im zweiten. Die Wirkung von Cytotoxika potenziert sich unter solchen Bedingungen, weshalb sie als ungeeignet für mikrobielle Wertstoffsynthesen mit hohen Raum-Zeitausbeuten betrachtet werden. Wollen wir jedoch Reststoffe aus Industrie und Landwirtschaft oder preiswerte bulk chemicals, die häufig toxisch sind, in PHB oder Ectoin wandeln, müssen wir Verfahren für die Gratwanderung zwischen maximaler Syntheserate des gewünschten Produktes und einsetzender Vergiftung entwickeln. Für diesen Zweck erwies sich die Kalorimetrie als besonders geeignet, da sie metabolische Veränderungen in statu nascendi 160

161 reflektiert, on-line und nicht invasiv messbar ist und quantitative Einblicke in die Kohlenstoffverteilung des assimilierten Substrates erlaubt. Zu diesem Zweck wurden Mikroorganismen kontinuierlich in einem wärmebilanzierten Bioreaktor vermehrt und alle Wachstumsbedingungen mit Ausnahme des C/N-Verhältnisses im ersten Fall und der Salinität im zweiten konstant gehalten. Mathematische Werkzeuge, welche die Quantifizierung der Kohlenstoffverteilung während der Adaptationsphase aus Bilanzen der Enthalpie, der Elemente und einiger Stoffe erlauben, wurden entwickelt. Es wurde gefunden, dass die maximale Syntheserate für PHB oder Ectoin mit einer sprunghaften Veränderung des Wärmeflusses zusammenfällt. An diesem Punkt ist der Substratkohlenstoff so verteilt, dass so viel wie möglich in das Zielprodukt gewandelt wird und der Rest gerade reicht, um den mikrobiellen Katalysator zu reproduzieren und zu erhalten. Da sich mit jedem upscaling das Verhältnis von wärmeproduzierendem Volumen zu wärmeaustauschender Oberfläche erhöht, ist hier ein Prinzip gegeben, um toxische Substrate in Wertstoffe zu wandeln. Prof. Dr. Wolfgang Babel, Dr. Thomas Maskow Umweltforschungszentrum (UFZ) Leipzig-Halle GmbH Sektion Umweltmikrobiologie

162 POSTER 4.53 Oligomer-Nanopartikel Wirkstoff und Wirkstoff-Carrier Andreas Heppe Die Heppe GmbH produziert Chitin/Chitosanprodukte und deren Derivate für unterschiedlichste Anwendungen. Mit einer durchgängigen Qualitätssicherung vom Rohmaterial bis zum Fertigprodukt wird gewährleistet, dass sehr eng toleriertes Material auf Kundenwunsch produziert und geliefert werden kann. Die Produktion von nanopartikulären Produkten eröffnet neue Anwendungen in Technik, Landwirtschaft, Kosmetik und Pharmaindustrie. Die Oligomer-Nanopartikel auf Chitosanbasis verfügen über die Eigenschaft, schnell in Zellstrukturen einzudringen, da 1. sie das Ladungsgleichgewicht auf der Zelloberfläche verändern 2. das Oligomer ähnlich dem Monosaccharid nicht als körperfremder Stoff erkannt wird und sowohl in das Stofftransportsystem der tierischen/ menschlichen Zelle als auch der pflanzlichen Zelle integriert wird. Die hohe kationische Ladung der Oberfläche solcher Nanopartikel begünstigt das Andocken gegenpolig geladener oder neutraler Partikel bzw. Wirkstoffe. Diese Wirkstoffe gelangen über die durch das Oligomer irritierte Zelloberfläche ins Innere der Zelle. Auswirkungen dieser Reaktion sind sichtbar in der Stimulierung des Immunsystems sowie in erhöhter Stoffwechselaktivität. Diese Effekte wurden bereits in größerem Maßstab bei tropischen Pflanzenarten durch erhöhte Krankheitsresistenz und gesteigertes Wachstum nachgewiesen. Untersuchungen der Heppe GmbH zeigten, dass die Stoffwechselaktivität der Haut bei dermaler Applikation von Oligomer-Vitamin-Partikeln stimuliert wird, bei dermaler Applikation von Oligomer-Hormon-Partikeln gelangen die Hormone in kurzer Zeit über die Haut in den Blutkreislauf und erzielen dort die gewünschte Wirkung. Mit dieser neuen Darreichungsform von Oligomer und Wirkstoff ergeben sich vor allem sehr gute Anwendungsmöglichkeiten für Wirkstoffe, die oral nicht gut verfügbar sind bzw. hohe Wirkstoffverluste im Magen-Darm- Trakt auftreten (Abb. 1). 162

163 Abb. 1: Erhöhung des Mannitolflux am Beispiel der Cargo 2-Zelle Hauptanwendungen dieser neuen Werkstoffgruppe können sein: 1. Wachstumsstimulation in der Gemüse- und Feldfruchtproduktion 2. Reduzierung/Ersatz von Antibiotika und Hormonen in der Tierproduktion, neue bioaktive Futtermittel 3. Dermale Darreichung von Medikamenten 4. Anti-aging-Produkte in der Kosmetik 5. Trägersystem für Kosmetika in Pulver- oder Gelform anstatt Alkoholspray 6. Verkapselung bzw. Beschichtung von Oberflächen von Glas oder Kunststofffolien, bioaktive Schichten Prof. Andreas Heppe (Vorsitzender des wissenschaftlichen Beirats) Heppe GmbH - Biotechnologische Systeme und Materialien chitosan@biolog-heppe.de 163

164 POSTER 4.54 Biotechnische Produktion pflanzlicher Wirkstoffe André Gerth, Annette Hohe, Dirk Wilken In der BioPlanta GmbH wurde eine Plattform zur biotechnischen Produktion pflanzlicher Wirkstoffe entwickelt. Im Mittelpunkt des Verfahrens stehen moderne Technologien zur in vitro Kultivierung von ganzen Pflanzen, Pflanzenorganen und -zellen wie z. B. das Temporary Immersion System (reaktor ähnliche Großgefäße mit permanentem Nährstoff- und Gasaus tausch), die für die Produktion von pflanzlicher Biomasse mit hohem Wirk stoff gehalt optimiert wurden. Somit ist es möglich, mit einer wesentlich höheren Produktivität als in der Natur qualitativ hochwertige Drogen, Extrakte und Wirkstoffe herzustellen. Dabei werden die Produkt eigen schaften durch Kontrolle und Variation der Kultivierungsparameter an die spezifischen Anforderungen der weiterverarbeitenden Industrie angepasst. Im Vergleich zur traditionellen Wirkstoffgewinnung durch Feldanbau oder Wildsammlung sind die Vorteile dieses neu entwickelten Verfahrens: - schnellere und zuverlässigere Produktion der Biomasse bei gleichbleibend hohem Wirkstoffgehalt - hohe Qualität der Wirkstoffchargen - kein Schädlings- und Krankheitsbefall der Pflanzen - keine Umwelt- und Herbizidbelastung der Drogen - Ausschluss von Kontaminationen mit Mikroorganismen durch in vitro Produktion - Produktion unabhängig von Jahreszeit, Witterung und Klima - Einflussnahme auf das Wirkstoffspektrum durch Kontrolle der Kulti vierungs bedingungen - Möglichkeit der Produktion gentechnisch veränderter Organismen ohne Freisetzung 164

165 Auf der Basis dieses Verfahrens produziert die BioPlanta GmbH pflanzliche Biomasse, Rohextrakte und gereinigtes Bulk-Material für Tests, klinische Prüfungen und die Produktion von Pharmazeutika. Unsere Leistungen umfassen die Prozessentwicklung, Scale-up und Validierung der Prozesse mit anschließender Produktion unter Beachtung der arzneimittelrechtlichen Rahmen bedingungen. Dr. Dirk Wilken BioPlanta GmbH

166 POSTER 4.55 Leistungsfähige Bioreaktoren mit polymeren Hohlfasermembranen für die Kultivierung von Zellen und Mikroorganismen Mathias Zachlod, Wolfgang Loettel, Monika Heinrich, Regine Eibl, Dieter Eibl Moderne Zellkulturreaktoren müssen im Hinblick auf ihre Produktionstauglichkeit die Möglichkeit einer kontinuierlichen Prozessführung im Langzeitbetrieb sowie ein einfaches Scale up gestatten. Auf der Basis eines Hohlfasermembranmoduls wurde zur Kultivierung von Zellen ein moderner leistungsfähiger Laborbioreaktor entwickelt. On-line Messungen von Temperatur, po 2 und ph-wert sind möglich. Der Bioreaktor wurde in Bezug auf Membranpackungsdichte und Poren größe optimiert und biologisch qualifiziert, indem erste Wachstums untersuchungen mit Zellen durchgeführt wurden. Es werden Hochzelldichten angestrebt. Je nach Anforderung werden Kultivierungsvolumen, Membranmaterial sowie Porengröße kombiniert. Als Membranmatrixmaterial kommen synthetische Polymere wie Polysulfon und Polyethersulfon sowie regenerierte Cellulose und Celluloseacetat zum Einsatz. Durch die ergänzende Integration einer Mikroturbulenzbelüftung werden die Stoff transport- 166

167 prozesse, insbesondere der Stoffaustausch Gas/Liquid, so verbessert, dass in den Bioreaktoren Limitationsvorgänge vermieden werden können. Die Konfektionierung der Hohlfasern erfolgt in standardisierten Kartuschen mit verschiedenen Austauschflächen. Durch Variation der Hohlmembranabmessungen und deren Werkstoffe kann Biofouling in den Membranmodulen verhindert werden. Hohlfaserreaktoren werden heute bereits zur Biomasseproduktion und Herstellung rekombinanter Proteine eingesetzt. Mit der von der Firma BECIT GmbH entwickelten Membranbioreaktoranlage soll nach der erfolgreichen biologischen Qualifizierung ein Hochzelldichtesystem zur Verfügung stehen, was sich gegenüber auf dem Markt bereits etablierten Systemen durch höhere Produkttiter auszeichnet. Mathias Zachlod, Wolgang Loettel, Monika Heinrich BECIT GmbH Wolfen Regine Eibl, Dieter Eibl Hochschule Wädenswil/Schweiz Abteilung Biotechnologie

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169 BIOTECHNOLOGISCH- BIOMEDIZINISCHES ZENTRUM EIN ÜBERBLICK