SS 2005 BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN

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1 SS 2005 BIOCHEMISCHE ARBEITSMETHODEN für Biologen Versuchsvorschriften zum Praktikumsblock BB 01 Version bis Betreuer : Dr. Thomas Jostock ( t.jostock@tu-bs.de) Dipl. Biotech. Bernd Voedisch Dipl. Biotech. Christian Menzel Dipl. Biotech. Nina Strebe BTA Doris Meier BTA Saskia Helmsing stud. biotech. Christoph Otreba

2 Inhaltsverzeichnis 1. Isolierung von Alkohol-Dehydrogenase aus Bäckerhefe Allgemeines Gewinnung eines ADH-Rohextrakts aus Bäckerhefe Aufschluß der Hefezellen Hitzedenaturierung von Fremdprotein Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung Ermittlung des Fraktionierungsbereiches für die Fällung der ADH durch Ammoniumsulfat Dialyse 1.3 Äktaprime: Ein Gerät für die FPLC Anionenaustauschchromatographie (DEAE Sepharose) Allgemeines Aufreinigung von ADH mittels Anionenaustausch-Chromatographie Affinitätschromatographie Allgemeines Aufreinigung von ADH mittels Affinitätschromatographie Aktivitätstest Proteinbestimmung ELISA Allgemeines Lösungen Pipettierschema Durchführung Auswertung Diskontinuierliche Gelelektrophorese und Western Blot Allgemeines Probenaufarbeitung Gelvorbereitung Elektroblot Antikörpernachweis Zweidimensionale (2D)-Gelektrophorese Allgemeines D-Gelelektrophorese Dimension Dimension Silberfärbung 35 2

3 Entsorgungshinweise: Folgende Sammelgefäße (Abzug) nach Versuchsende benutzen: A: Lösungen mit organischen Lösungsmitteln B: Ethidiumbromid- Abfälle C: Schwermetallhaltige Abfälle 3

4 1. Isolierung von Alkohol-Dehydrogenase aus Bäckerhefe 1.1 Allgemeines In diesem Teil des Praktikums soll das Enzym Alkohol-Dehydrogenase aus Bäckerhefe (Saccharomyces sp.) aufgereinigt werden. Da das Enzym relativ temperaturstabil ist, läßt es sich unter Praktikumsbedingungen recht unproblematisch bearbeiten. Die Alkohol-Dehydrogenase gehört laut EC-System (enzyme classification of the International Union of Biochemistry; IUB) der ersten Klasse, den Oxidoreduktasen, an. Die ADH ist bei Hefen ein weitverbreitetes Enzym. Es ist in der Lage, Alkohole in Aldehyde bzw. Ketone umzuwandeln. Diese Oxidation ist Coenzym abhängig. Der bei der Oxidation des Alkohols freiwerdende Wasserstoff wird auf NAD + übertragen: R 2 CHOH + NAD + R 2 C=O + NADH + H + Die Aktivität wird optisch bestimmt. Im NADH ist der aromatische Charakter des Pyrimidinrings aufgehoben; dadurch ändert sich das Absorptionsverhalten. NADH besitzt ein zweites Absorptionsmaximum bei 340nm. Die Zunahme der Absorption pro Zeiteinheit für den Übergang von NAD + zu NADH ist ein direktes Maß für die Reaktionsgeschwindigkeit. Abbildung 1.1: Absorption der oxid. und red. Nicotinamidnucleotide NAD bzw. NADP im UV- Bereich. 4

5 Die katalytische Aktivität eines Enzyms wird nach Empfehlung der IUB in Katal [kat] angegeben. Sie ist definiert als diejenige Enzymmenge, die unter den für das Enzym festgelegten Bedingungen bei 30 0 C den Umsatz von 1 Mol Substrat pro Sekunde katalysiert (1 kat = 1 Mol Substrat s -1 ). Veraltet, aber ein leider noch häufig in der Literatur oder in Chemikalienkatalogen zu findender Begriff, ist das Unit (1 U = 1 μmol Substrat min -1 = nkat). Der die Qualität einer Enzymaufreinigung beschreibende Wert ist die spezifische Enzymaktivität [kat g -1 Protein], da hier die Proteinkonzentration mit berücksichtigt wird. Das Verhältnis der spezif. Aktivität einer Enzymfraktion nach einem Aufreinigungsschritt zur spezif. Aktivität der Ausgangslösung bestimmt den Aufreinigungsfaktor des Aufreinigungsschrittes. Aufreinigungsstufe Spezif. Aktivität [nkat/mg] Aufreinigungsfaktor Ausbeute [%] Rohaufschluß 0,68 1,0 100 Hitze/EtOH-Behandlung 1,17 1,7 54 Dialyse 1,87 2,7 54 Anionenaustauschchr. ph ,0 25,0 12,4 Anionenaustauschchr. ph , ,2 Konzentrierung 153,0 225,0 3,6 Gelfiltration 273,0 401,0 2,3 Abbildung 1.2: Beispiel einer Aufreinigungstabelle Die Ausbeuten einer Enzymaufreinigung werden über die volumetrische Aktivität [kat ml -1 ] berechnet (als Beispiel siehe Aufreinigungstabelle Abbildung 1.2). Wenn also in z.b. 300 ml Rohextrakt 6 nkat/ml Aktivität vorhanden waren ( insgesamt 1800 nkat) und nach einem anschließenden Fällungsschritt das Pellet in 50 ml Puffer mit einer vol. Aktivität von 26.3 nkat/ml aufgenommen wurde ( insgesamt 1315 nkat), so beträgt die Ausbeute nach der Fällung 73.05%. Der Erfolg einer Enzymaufreinigung hängt stark mit den Stabilitätseigenschaften des Enzyms zusammen. Extrazelluläre Enzyme sind naturgemäß stabiler als intrazelluläre und die wiederum stabiler als membrangebundene Enzyme (extr. E > intr. E > membr. E). Dementsprechend versucht man von Beginn an das zu bearbeitende Enzym vor inaktivierenden Einflüssen zu schützen und dessen natürliche Umgebung, in der es aktiv ist, zu imitieren. Das heißt, man hält Enzymlösungen bei konstantem ph-wert solange wie möglich im Eisbad und gibt, je nach Enzym, Zusätze wie a) Zucker ( M), b) EDTA (1.5 mm), c) Salze (in der Zelle liegt die Ionenstärke um M), d) Mercaptoethanol oder Cystein (5-20 mm) und/oder e) spezifische, stabilisierende Agenzien für bestimmte Enzyme wie Zn 2+ für zinkabhängige Proteine oder Pyridoxalphosphat für pyridoxalphosphat-abhängige Enzyme hinzu. 5

6 Zellaufschluß und Entwicklung einer Aufreinigungsstrategie Grundkenntnisse zur Stabilität Abtrennung der Zelltrümmer Grobreinigung (Fällung, Ultrazentrifugation) Feinreinigung (Chromatographische Methoden) Konzentrierung und Konfektionierung Abbildung 1.3: Arbeitsschema zur Aufreinigung eines intrazellulären Enzyms Während des Praktikums sollte darauf geachtet werden, dass die Enzymlösungen gekühlt und die Zusätze langsam zugegeben werden (Vermeidung starker Konzentrationsgradienten). In der Literatur werden eine Vielzahl von verschiedenen Aufreinigungsmethoden beschrieben (z.b. SCOPES 1987). Je mehr Fremdprotein bei größtmöglichem Erhalt der Enzymaktivität abgetrennt wird, desto effektiver der Reinigungsschritt. Für intrazelluläre Enzyme lässt sich das in Abbildung 1.3 gezeigte Arbeitsschema zur Aufreinigung eines neuen Enzyms anwenden. 1.2 Gewinnung eines ADH-Rohextraktes aus Bäckerhefe Jede Praktikumsgruppe wird, ausgehend von ganzen Zellen, die Alkohol-Dehydrogenase über Hitzedenaturierung von Fremdprotein, über eine Fällung und Dialyse sowie über zwei säulenchromatographische Methoden aufreinigen. Die Beurteilung der Qualität dieser Aufreinigung wird anhand einer zu erstellenden Aufreinigungstabelle und einer elektrophoretischen Überprüfung der Aufreinigungsschritte zu bewerten und zu diskutieren sein. Dementsprechend müssen jeweils von den Ausgangs- und Endextrakten der einzelnen Aufreinigungsschritte Proben aufgehoben (beschriften für die Elektrophorese, Proben NIE ohne Rücksprache wegwerfen!) und Aktivitätstests sowie Proteinbestimmungen durchgeführt werden (nötig für die Aufreinigungstabelle). 6

7 Wichtig: Um die Aufreinigung des Enzyms in den einzelnen Schritten überprüfen zu können, wird aus den im nachfolgenden schematischen Versuchsablauf mit * markierten Fraktionen jeweils 1ml entnommen. Diese Proben dienen zur Proteinbestimmung und zum Test auf ADH-Aktivität. Ferner ist es wichtig, die Volumina der Fraktionen zu bestimmen und zu notieren! Aufschluss der Hefezellen Zur Aufreinigung intrazellulärer Enzyme müssen zuerst die Zellwände der Mikroorganismen bzw. der pflanzlichen oder tierischen Zellen zerstört, zumindest jedoch permeabilisiert werden. Gleichzeitig sollte die Aktivität des freigesetzten Enzyms erhalten bleiben. Einen Überblick über die in der Biochemie verwendeten Methoden gibt Abbildung 1.4. Industriell kommen davon hauptsächlich zwei Methoden zum Einsatz; die Nassvermahlung in schnelllaufenden Rührwerkskugelmühlen und der Aufschluss durch drastische Druckdifferenzen in Hochdruckhomogenisatoren. Im Labor können alle hier vorgestellten Methoden zum Einsatz kommen. Zellaufschluß Mechanische Methoden Nicht mechanische Methoden Scherkräfte in Scherkräfte in Festsubstanz Lösung Lyse Trocknung Druck, Vermahlen Rühren, Druck, Schall Physikalisch Biochemisch Osmotischer Schock, Einfrieren- Auftauen Lysozym u.ä. Enzyme, Antibiotika, Phagen, Detergentien Gefriertrocknung, Lufttrocknung, Entspannung, Trocknung mit Lösungsmitteln Abbildung 1.4: Zellaufschlussmethoden Benötigte Lösung: Zellaufschlusspuffer: 50 mm KH 2 PO 4 /K 2 HPO 4, 3 mm EDTA, ph l Eine wässrige Lösung von Dihydrogenphosphat (H 2 PO 4 - ) hat einen sauren, eine Lösung von Hydrogenphosphat (HPO 4 2- ) einen basischen ph-wert. Phosphatpuffer werden durch das Mischen der wässrigen Salzlösungen von H 2 PO 4 - und HPO 4 2- gleicher Molarität hergestellt. 7

8 Da im Praktikum meist Kaliumphosphatpuffer mit basischem ph-wert (ph 8,0) verwendet werden, werden zur Herstellung der Puffer zunächst mindestens 80% des gewünschten Endvolumens in Form von K 2 HPO 4 -Lösung vorgelegt und am ph-meter KH 2 PO 4 -Lösung zudosiert, bis der gewünschte ph- Wert des Puffers erreicht ist. Für den in Versuch 1 verwendeten Zellaufschlusspuffer (50 mm Kaliumphosphatpuffer + 3 mm EDTA, ph 8,0) wird das EDTA in 50 mm K 2 HPO 4 gelöst. Da EDTA selbst ph-aktiv ist, ergibt sich bei diesem Puffer der Endwert direkt die Kontrolle erfolgt am ph-meter. Die Rührwerkskugelmühle wird mit ca. 400 ml Glaskugeln ( mm) gefüllt, anschließend wird eine 20%ige Zellsuspension (ca. 1 l) in Aufschlusspuffer unter Kühlung durch die Rührwerkskammer gepumpt. Dieser Vorgang wird 3x wiederholt, nach jedem Durchlauf wird eine 1 ml Probe entnommen und die Enzymaktivität bestimmt. Insgesamt lassen sich so ca. 800 ml Homogenat gewinnen. Jede Gruppe erhält 100 ml des Homogenats. Schema zum Versuchsablauf: *: Proben nehmen! Proben der einzelnen Durchläufe aus Rührwerkskugelmühle (H1-H4) * 1. aufgeschlossene Hefe in Kaliumphosphatpuffer rühren Homogenat (H) * 2. Zentrifugation Überstand (Ü0) * / Sediment verwerfen 3. Hitzedenaturierung Zentrifugation Überstand (Ü1) * / Sediment verwerfen 4. Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung Zentrifugation Überstand (Ü2) * 5. Sediment in Puffer aufnehmen Enzymextrakt (E) * 6. Dialyse entsalzter Enzymextrakt (EE) * 7. Säulenchromatographie 8

9 1.2.2 Hitzedenaturierung von Fremdprotein Zentrifugation in der Kühlzentrifuge bei > g für etwa 30 Minuten Überstand (Ü0) in einem bereits auf 55 C vorgeheizten Wasserbad (Schüttelwasserbad mit Einsatz für 250 ml Erlenmeyerkolben) schnell erwärmen und 15 Minuten bei dieser Temperatur belassen; unter fließendem Wasser abkühlen lassen Zentrifugation > g für 30 Minuten bei 4 C / Sediment verwerfen Überstand (Ü1) auf Eis kalt stellen und für Ammoniumsulfatfällung einsetzen (Nicht vergessen: Proben zur Bestimmung der Aktivität und Proteingehalt abnehmen) Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung Das Löslichkeitsverhalten eines Proteins in einem Lösungsmittel wird durch die Interaktionen seiner geladenen Oberflächenreste mit den Molekülen des Lösungsmittels bestimmt. Diese Interaktionen können durch folgende Zusätze manipuliert werden, so dass die Proteine als Aggregate aus der Lösung ausfallen: Zugabe anorganischer Salze Zugabe basischer Proteine ph Änderung Zugabe organischer Lösungsmittel Zugabe von Polyethylenglycol Temperaturänderung Die am häufigsten angewandte Methode ist die fraktionierte Fällung durch die Zugabe von anorganischen Salzen, meist (NH 4 ) 2 SO 4. Das Aussalzverhalten eines Proteins wird durch Anzahl und Fläche der hydrophoben Bereiche auf der Proteinoberfläche bestimmt (Seitenketten von Phe, Tyr, Trp, Leu, Ile, Met, Val). Wenn zur Hydratation eines Salzes immer mehr Wassermoleküle benötigt werden, kommt es zu häufigeren hydrophoben Wechselwirkungen der Proteine untereinander und zur Bildung von Aggregaten, die schließlich präzipitieren. Stark apolare Proteine präzipitieren daher bei geringerer Salzkonzentration als solche, deren Polarität groß ist. Durch Co-Präzipitation unterschiedlicher Proteine ist eine völlige Aufreinigung selten möglich. Eine Ausnahme ist die Salzfällung der Glycerinaldehydphosphat- Dehydrogenase (EC ). Bei ph 6.0 ist das Enzym in 3.2 M (NH 4 ) 2 SO 4 löslich. Durch einen ph- Shift auf ph 7.5 oder höher kristallisiert das Enzym aus dem Rohextrakt aus. Benötigte Chemikalien: fein gemörsertes Ammoniumsulfat 10mM Kaliumphosphat-Puffer, ph l Zu 100 ml des erhaltenen Überstandes (Ü1) bei 4 C 21g festes, vorher fein gemörsertes Ammoniumsulfat (40% Sättigung) in kleinen Portionen (insges. auf ca. 20 min verteilen) unter Rühren zugeben. Die Lösung für 30 min. stehen lassen und anschließend mit ca x g = rpm (SS34 Rotor) für 20 Minuten abzentrifugieren. Das Pellet verwerfen und zum Überstand weitere 14,2 g Ammoniumsulfat in kleinen Portionen unter Rühren bei 4 C zugeben (55% Sättigung). Wiederum 30 min. stehen lassen und anschließend bei ca x g (SS34 Rotor) für 20 Minuten abzentrifugieren (nicht vergessen: Probe Ü2). 9

10 Pellet in 10mL 10 mm Phosphatpuffer aufnehmen (= Enzymextrakt E, Probe nehmen!) [um möglichst geringe Verluste zu haben: zunächst das Pellet in einem Teil des Puffers suspendieren; mit einer Plastikpasteurpipette mehrfach aufsaugen, um eine homogene Verteilung zu erreichen] Ermittlung des Fraktionierungsbereiches für die Fällung der ADH durch Ammoniumsulfat Benötigte Chemikalien: Rohextrakt aus dem Hitzeschritt (Ü1) gesättigte Ammoniumsulfatlösung (AS) 66g/100ml 100 ml 10mM Kaliumphosphat-Puffer ph 8.0 (PP) Durchführung: Folgende Testreihe ist unter Nutzung von Eppendorf-Reaktionsgefäße als Inkubationsgefäße anzusetzen: Röhrchen Ü1 PP AS (ml) (ml) (ml) Nach einer Inkubationszeit von 30 min. im Eisbad wird die ADH-Aktivität in jedem Röhrchen durch Entnahme von 10 µl bestimmt. Um Extinktionsänderungen von 0.1 bis 0.2 pro min. zu erzielen, ist eine Verdünnung von 1:20 bis 1:100 notwendig. Danach werden die Gefäße 5 min. bei x g zentrifugiert und die Aktivität in gleicher Weise im Überstand bestimmt. Auswertung: Die Aktivität der ersten Messserie wird in Prozent (bezogen auf Gefäß 1) angegeben. Sie gibt Auskunft über die Stabilität des Enzyms unter den Inkubationsbedingungen. Die Überstandsaktivität der zweiten Messserie wird ebenfalls in Prozent, bezogen auf den jeweiligen Wert vor der Zentrifugation, ermittelt. Hieraus wird der Anteil an ausgefällter ADH (wiederum in [%] angegeben) bestimmt, gegen die Ammoniumsulfatkonzentration (angegeben in %-Sättigung) aufgetragen und das erhaltenen Resultat interpretiert. 10

11 1.2.5 Dialyse der Dialyseschlauch (ca. 30 cm; ca. 1,6 cm, Porengröße kd) liegt eingeweicht in Ethanol vor und muss vor Verwendung gründlich mit Wasser gewaschen werden (Schlauch nur mit Handschuhen anfassen!) anschließend wird ein Ende mit 2 Knoten verschlossen, der Enzymextrakt (E) eingefüllt und auch das andere Ende verknotet der Dialyseschlauch wird in 2L eiskalte Pufferlösung oder dest. H 2 O eingehängt es wird über Nacht auf einem Magnetrührer (Kühlraum) langsam gerührt der Dialyseschlauch wird vorsichtig geöffnet, das Dialysat im Messzylinder aufgefangen und das Volumen bestimmt; dieser entsalzte Enzymextrakt (EE) kann auf die Anionenaustauschersäule aufgetragen werden (Probe von EE nehmen). Aktivitätstests und Proteinbestimmung erfolgen wie in Kap. 1.5 und Kap. 1.6 beschrieben. 1.3 ÄKTAprime: Ein Gerät für die FPLC (Fast Protein Liquid Chromoatography) ÄKTAprime: Ein Gerät für die FPLC (Fast Protein Liquid Chromoatography) FPLC-Anlagen bestehen aus Pumpen, Ventilen und Messsonden. Mit ihrer Hilfe werden Pufferlösungen und flüssige Proben (mobile Phase) über die in Glassäulen gepackten Chromatographiematrices (stationäre Phase) geleitet. Die Maschine dient zur Automatisierung des Prozesses. Im folgenden werden grundlegende Prinzipien der FPLC am Beispiel des Flusspfades der ÄKTAprime erklärt. Abb Aufbau der FPLC-Anlage ÄKTAprime (Amersham/GE Healthcare) 11

12 Benötigte Pufferlösungen werden in Vorlagegefäßen (A, B) vorrätig gehalten. Über Pufferventile (Buffer valve) können mehrere, unterschiedliche Puffer gleichzeitig angeschlossen werden (A1, A2,..., theoretisch, aber an der ÄKTAprime nicht verwirklicht, auch B1, B2,...). An der Pumpe (System pump) wird eine Flussrate eingestellt, mit der die Pumpe die Pufferlösungen durch das System pumpt. Es kann auch eine Mischung der Puffer A und B eingestellt werden. Dazu wird bei der ÄKTAprime der %B-Wert gesetzt. Dieser Wert gibt an, welcher prozentuale Anteil des eingestellten Flusses aus dem Vorlagegefäß B gezogen wird der Rest des Flusses wird aus Vorlagegefäß A gezogen. Das Gradientenventil (Gradient switch valve) schaltet entsprechend zwischen den Vorlagen hin und her. Abb Flusspfad bei der FPLC-Anlage ÄKTAprime Ein Drucksensor (Pressure sensor) überwacht, dass ein eingestellter Maximaldruck nicht überschritten wird. Das ist notwendig, um ein Platzen von Schläuchen und Säulen oder eine Verdichtung des Säulenmaterials zu verhindern. Setzt sich die Säule durch Partikel zu oder steigt die Viskosität der Puffer, so steigt auch der Rückdruck u.u. so weit, dass die Flussrate verringert werden muss. Ein Flussbegrenzer (Flow restrictor) weiter hinten im Flusspfad sorgt für einen Mindestdruck im System, um die Entstehung von Luftblasen zu vermeiden. Eine zentrale Rolle spielt das Injektionsventil (Injection valve, IV), welches bestimmt, ob der Flüssigkeitsfluss über die Säule geleitet wird oder nicht. Abb Flusspfad innerhalb des Injektionsventils bei unterschiedlichen Einstellungen 12

13 Das IV hat sieben unterschiedliche Anschlüsse (Ports), die sich über drei unterschiedliche Ventilstellungen miteinander verbinden lassen. In der Position LOAD liefert die Systempumpe den Flüssigkeitsstrom über Port 7 direkt an Port 1 und von dort auf die Säule. In dieser Position lässt sich über eine Spritze ein chromatographisch zu trennende Probe in die Vorlageschleife (Sample loop) spritzen. Diese ist ein einfaches Schlauchstück von definiertem Volumen, über das die Probe vor ihrer Auftrennung im System gelagert werden kann. In der Position INJECT wird der Strom vom Port 7 zunächst über die Probenschleife umgeleitet und deren Inhalt über Port 1 auf die Säule geleitet, um dort aufgetrennt zu werden. In der dritten Position WASTE gelangt der Flüssigkeitsstrom über Port 7 nicht zum zur Säule führenden Port 1, sondern wird in ein Abfallgefäß umgeleitet. Auf der Säule (Column) erfolgt die chromatographische Trennung der Probe. Hinter der Säule sitzen Messzellen, die z.b. die Leitfähigkeit der von der Säule kommenden Flüssigkeit erfassen. Eine UV- Messzelle erfasst die Absorption bei einer Wellenlänge von 280nm bei dieser Wellenlänge absorbieren bekanntlich Proteine. Die Messzellen leiten ihre Messdaten an Schreiber bzw. Computer zur Protokollierung weiter. Je nach Bedeutung des von der Säule kommenden Stroms kann die Flüssigkeit in Fraktionen aufgefangen werden oder in einem (Abfall-)Gefäß gesammelt werden. Dies wird durch das Fraktionsventil (Flow diversion valve) gesteuert. Ausgefeilte FPLC-System haben weitere Messzellen, lassen sich über Computer ansteuern und programmieren, können u.u. mehrere Säulen gleichzeitig oder in Serie ansteuern u.v.m. Die hier dargestellten Grundzüge sind aber in allen Anlagen wiederzufinden. 1.4 Anionenaustauschchromatographie (DEAE Sepharose) Wichtig: Alle Puffer für die Säulenchromatographie müssen vor Gebrauch mikrofiltriert und entgast werden Allgemeines Ionenaustauscher bestehen aus einem unlöslichen Trägermaterial (Matrix), das positiv oder negativ geladene Gruppen in kovalenter Bindung enthält. Die Ladungen dieser Austauschergruppen werden durch frei bewegliche Gegenionen kompensiert, welche gegen Ionen gleichen Ladungssinns reversibel austauschbar sind. Je nach Art des Gegenions unterscheidet man zwischen Anionen und Kationenaustauscher. Proteine sind amphotere Polyelektrolyte und lassen sich daher sowohl an Anionen als auch an Kationenaustauscher reversibel binden. Im ph-bereich unterhalb seines isoelektrischen Punktes (ph<i.p.) wird ein Protein an Kationenaustauscher gebunden, im ph-bereich oberhalb seines I.P. hingegen an Anionenaustauscher. Am I.P. erfolgt keine Adsorption (s. Abbildung 1.5). 13

14 Die Bindung eines Proteins am Ionenaustauscher wird durch die Ionenstärke erheblich beeinflusst. Eine Erhöhung der Salzkonzentration verstärkt die Konkurrenz der Ionen um die Bindungsstelle des Ionenaustauschers. Gleichzeitig werden die elektrostatischen Eigenschaften des Systems verändert, wobei die Wechselwirkungen zwischen Ionenaustauscher und Gegenion vermindert werden. Durch Erhöhung der Ionenstärke werden somit die Bindungskräfte zwischen Ionenaustauscher und adsorbierten Proteinmolekülen geschwächt. Dieser Effekt wird häufig zur Elution gebundener Moleküle ausgenutzt. Proteine können auch durch eine Änderung des ph-wertes in Richtung des isoelektrischen Punktes vom Ionenaustauscher abgelöst werden. Abbildung 1.5: Ionenaustausch-Chromatographie Aufreinigung von ADH mittels Anionenaustausch-Chromatographie Benötigte Lösungen und Chemikalien: 0,5N HCl (vorhanden) 0,5N NaOH (vorhanden) 2M NaCl (vorhanden) (Silbernitrat) Säulenpuffer A: 5mM Kaliumphosphatpuffer ph l Säulenpuffer B: 200mM Kaliumphosphatpuffer ph l 14

15 Allgemein werden nachfolgende Schritte zur Aktivierung von Anionenaustauschern durchgeführt: Säulenmaterial in 15 Volumina 0,5N HCl aufrühren (bezogen auf Trockengewicht (g/v)) und 30 Minuten rühren lassen Überstand mit Hilfe einer Glasfritte absaugen und Säulenmaterial mit Wasser waschen bis ph 4 erreicht ist Säulenmaterial in 0,5N NaOH weitere 30 Minuten stehenlassen nachfolgend waschen bis der Durchlauf nahezu neutral ist Zur wiederholten Benutzung d.h. Regenerierung des Säulenmaterials kann (in der Säule) mit dem dreifachen Säulenvolumen 2M NaCl (mikrofiltriert und entgast) gewaschen werden. Anschließend wird das Natriumchlorid durch Waschen mit Wasser wieder entfernt (Nachweis mit Silbernitrat: durch Zugabe einer Spatelspitze Silbernitrat zu einer kleinen Menge Waschwasser fällt bei Anwesenheit von Chlorid AgCl 2 aus). Die in diesem Praktikum zu verwendende DEAE Sepharose liegt entweder aktiviert in alkoholischer Lösung oder regeneriert in NaCl-Lösung vor. Somit muss man vor Gebrauch sorgfältig mit dest. Wasser waschen, um das Ethanol bzw. Salz zu entfernen. Packen der Säule: (wird von Betreuer durchgeführt) Die vorbereitete DEAE Sepharose wird bei zunächst geöffnetem Auslauf homogen in eine Glassäule gepackt, bis ein Säulenvolumen von ca. 20 ml erreicht ist anschließend wird mit 2-3 Säulenvolumina Puffer A äquilibriert (Flußrate: 1.5 bis 3 ml / Minute). Ca. 75 ml. Säulenlauf: Der Enzymextrakt wird auf die Säule gepumpt; maximal 300 mg Protein auftragen. Eluat in einem Sammelgefäß auffangen (=Fraktion "Vorlauf ). Nach Probenauftragung 2-3 x waschen mit einem Säulenvolumen des Säulenpuffers A (= Fraktion "Durchlauf"). Anschließend Eluat in Fraktionen weitersammeln. Elution unter einem linearen Phosphatgradienten mit 60 ml Puffer A (Startpuffer) und 60mL Puffer B (Endeluent); mit ca ml reinem Puffer B nacheluieren. Aktivitätstests und Proteinbestimmung erfolgen wie in Kap. 1.5 und Kap. 1.6 beschrieben. Bedingungen: Säulenfüllung: DEAE-Sepharose Fraktionsgröße: 5 ml Enzymauftrags- und Elutionsgeschwindigkeit.: 2mL/min nach Probenauftrag: linearer Gradient mit 60mL Puffer A 60mL Puffer B anschließend restliches Protein mit 100% Puffer B entfernen 15

16 1.5 Affinitätschromatographie Allgemeines Die Reinigung eines Moleküls mit Hilfe der Affinitätschromatographie nutzt eine hervorstechende Eigenschaft der biologischen Makromoleküle aus: Ihre Spezifität. Deshalb ist theoretisch mit dieser Chromatographie eine vollständige Reinigung zu erreichen. Diese Methode ist neben der Reinigung von Proteinen auch für die Reinigung von Antigenen und Antikörpern, Vitaminen, Hormonen und polyribosomalen Komplexen geeignet. Die dreidimensionale Struktur eines Enzyms ist so, dass das aktive Zentrum und das oder die regulatorischen Zentren nur für eine kleine Anzahl von Verbindungen (Liganden), die entweder Substrate oder Effektoren vom reversiblen bzw. irreversiblen Typ sein können, zugänglich sind. Die Reinigung mit Hilfe der Affinitätschromatographie ist möglich, wenn die Affinität des Zentrums für den Liganden hoch und die Bindung reversibel ist. Nach Bindung an den Liganden erfolgt keine weitere Reaktion unter den Trennbedingungen. Bei dieser Technik wird ein Ligand (z.b. kompetitive Inhibitoren oder Strukturanaloge für Cofaktoren) an eine geeignete unlösliche Matrix (z.b. Agarose oder vernetzte Dextrane) kovalent gebunden. Dabei ist der Ligand meist nicht direkt, sondern über einen Spacer (mehrere Methylengruppen) mit dem Polysaccharid verknüpft. Eine Behinderung der Bindung zwischen Ligand und Enzym wird auf diese Weise vermieden. Eine Lösung des zu reinigenden Enzyms wird auf eine Säule mit der ligandenbestückten Matrix im passenden Puffersystem gegeben. Das Enzym wird selektiv zurückgehalten, während andere Proteine ausgewaschen werden (s. Abb. 1.6). Abbildung 1.6: Trennung von Makromolekülen durch Affinitätschromatographie 16

17 Farbstoffe, die eine Affinität zu bestimmten Enzymen haben, können ebenfalls als Ligand benutzt werden. So bindet Blue Sepharose Cl-6B (Fa. Pharmacia, Freiburg; s. Abb. 1.7) Kinasen, Dehydrogenasen und andere Enzyme, die Adenylyl-enthaltende Substanzen (z.b. NAD + ) benötigen. Die Enzyme lagern sich an, weil der Farbstoff eine strukturelle Ähnlichkeit zu den Nukleotidcofaktoren hat. Die Elution erfolgt zumeist mit freiem Cofaktor. Abbildung 1.7: Trennung von Makromolekülen durch Affinitätschromatographie Aufreinigung von ADH mittels Affinitätschromatographie Geräte und Reagenzien: Blue Sepharose Cl-6B (Pharmacia), Glassäule, Äkta Prime Fraktionssammler, Spektralphotometer Benötigte Lösungen: Startpuffer: Phosphatpuffer nach Sörensen 20mM, ph ml 5mM MgCl 2 0,4mM EDTA Elutionspuffer: 60 mg NAD in 15 ml Startpuffer (5mM) Für den in der Affinitätschromatographie verwendeten Startpuffer werden 75% des gewünschten Endvolumens an Puffer in Form von 20 mm KH 2 PO 4 vorgelegt und mit 20 mm Na 2 HPO 4 der ph-wert von ph 6.4 eingestellt. (Nach Sörensen betragen die Volumenanteile idealerweise 73,6% und 26,4%.) Diesem Phosphatpuffer werden dann 5 mm MgCl 2 und 0,4 mm EDTA zugesetzt. Vorbereitung: 1,8 g Blue Sepharose werden in 10 ml Startpuffer für 24 h äquilibriert und dann in die Säule gefüllt (ca. 10 cm Füllhöhe). Bei 10 Tropfen/min lässt man das Gel für ca. 30 min sedimentieren. (Die Säulen werden von den Betreuern vorbereitet) Durchführung: Probenvolumen am Fraktionssammler auf 10 ml pro Reagenzglas einstellen. Der Enzymextrakt wird auf die Säule gepumpt; maximal 300 mg Protein auftragen. Vom Säulendurchlauf eine Probe nehmen. 17

18 Anschließend mit 30 ml Startpuffer ph 6.4 waschen und von der Waschfraktion ebenfalls eine Probe nehmen. Die Elution erfolgt mit 15 ml Elutionspuffer, während der Elution Probenvolumen des Fraktionensammlers auf 3 ml einstellen. Die Säule wird nach der Elution mit 60 ml Startpuffer gewaschen. Da NAD bei UV Licht (280nm) stark absorbiert (Abb. 1.1) kann der Proteingehalt der Elutionsfraktionen nur schlecht durch UV-Absorbtionsmessungen verfolgt werden. Daher werden mit allen Elutionsfraktionen, sowie dem Säülendurchlauf und der Waschfraktion Aktivitätstests durchgeführt. Aktivitätstests und Proteinbestimmung erfolgen wie unter Kapitel 1.5 und 1.6 beschrieben. 1.6 Aktivitätstest Ethanol wird durch NAD in Gegenwart des Enzyms Alkohol-Dehydrogenase (ADH) zu Acetaldehyd oxidiert: ADH Ethanol + NAD + Acetaldehyd + NADH + H + Das gebildete NADH ist die Messgröße (Absorption bei 340 nm). Benötigte Lösungen: Glycinpuffer: 0,1M, ph 9.0 Ethanolpuffer: 100mL 0,1M Glycinpuffer mit 3mL Ethanol versetzen NAD-Lösung: 12mg/mL dest. Wasser BSA-Lösung: 0,1% BSA in 0,1M Glycinpuffer lösen Verfolgt wird die Extinktionszunahme (Zunahme von NADH) bei 340nm. Bei zu stark konzentrierten Enzymlösungen müssen diese mit reinem Glycinpuffer vorverdünnt werden. Testansatz: 0,85ml Ethanolpuffer 0,05ml Enzymlösung 0,05ml BSA-Lösung in Küvette mischen;...nullabgleich am Photometer Start mit 0,05ml NAD Lösung (außer Elutionsfraktionen der Affinitätschromatographie, Start hier mit Probe) gesamt 1,00 ml sofort Extinktionsänderungen mit Hilfe eines Schreibers aufzeichnen. 18

19 Die Zunahme der Extinktion sollte möglichst nicht mehr als 0,05 Extinktionseinheiten pro Minute betragen (sonst weniger Enzym einsetzen bzw. verdünnen). Für die Auswertung der Schreiberdaten ist der Schreibervortrieb zu notieren. Da Schreibersignal und am Photometer gezeigte Extinktion nicht aufeinander kalibriert sind, muss auch notiert werden, welche Extinktion dem Schreiberausschlag zugeordnet ist. Für die Berechnung der Enzymaktivität sind ausschließlich Daten aus dem linearen Bereich der Messung zu verwenden. linearer Bereich Extinktionsänderung ΔE Sprung bei Reaktionsstart Zeit t Schreibervorschub Nulllinie Berechnung der Aktivität Die Aktivitätsmessung erfolgt photometrisch, Grundlage der Messung ist das Lambert-Beer sche Gesetz. Nach diesem Gesetz ist die photometrische Extinktion E proportional zur Schichtdicke der Messlösung d und der Konzentration der gelösten Substanz c. Der Proportionalitätsfaktor ( dekadischer Extinktionskoeffizient ) ist u.a. abhängig von der Substanz und der verwendeten Wellenlänge. Die Enzymaktivität EA wird gemessen in der umgesetzten Teilchenanzahl des Substrates Δn pro Zeit t. E = ε d c (Lambert-Beer) bzw. ΔE = ε d Δc Δn Δc = V Δn EA = t 19

20 Eingesetzt und nach EA aufgelöst ergibt sich dann: erfolgt nach der Formel: EA = ΔE V t ε d mit: EA = Enzymaktivität [kat] t = Zeit [s] ΔE = Extinktionsänderung ε = Extinktionskoeffizient von NADH bei 340 nm = 6300 [L/mol cm] d = Schichtdicke [cm] V = Volumen des Testansatzes [L] Hier gilt: EA = ΔE L mol cm t s L cm ΔE EA = 158,7 [nkat] t Berechnung der Volumenaktivität: EA 20 [nkat/ml EE] Berechnung der spez. Aktivität: auf mg Protein beziehen [nkat / mg] 1.7 Proteinbestimmung Erfolgt nach Bradford mit fertigem Bio Rad Reagenz. Testansatz: 0,8mL Wasser 0,2mL Bio Rad Reagenz 0,02mL Probe Wasser und Bio Rad Reagenz werden vor Zugabe der Probe vermischt. Jeder Ansatz sollte nach Minuten photometrisch vermessen werden (Wellenlänge: 595 nm). Zur Eichung wird BSA (Rinderserumalbumin) verwendet (Konzentrationen: 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,75 und 1g/L). Der Bereich der linearen Extinktionsänderung kann zur Proteinbestimmung der Proben genutzt werden, d.h. die Proben müssen (vor Reagenzzugabe) so verdünnt werden, dass der gemessene Wert in diesem Bereich liegt (!). 20

21 2. ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) 2.1 Allgemeines Der ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) ist eine weitverbreitete, sehr empfindliche Methode, um einzelne Proteine nachzuweisen. Dabei nutzt man die hohe Spezifität der Bindung von Antikörpern an ihr Antigen. Diese sogenannte Antigen-Antikörper-Reaktion wird für den ELISA genutzt und erlaubt die Identifizierung des Zielproteins auch in komplexen Proteingemischen. Soll ein bestimmtes Protein durch ELISA nachgewiesen werden, müssen entsprechende Antikörper verfügbar sein. Diese können entweder durch Immunisierung von Versuchstieren oder gentechnologisch gewonnen werden und sind inzwischen in großer Auswahl kommerziell erhältlich. Der ELISA basiert auf der Immobilisierung der Proteine des zu untersuchenden Gemisches auf einer Trägeroberfläche und anschließendem Nachweis des gebundenen Zielproteins durch einen Antikörper. Dieser kann entweder direkt an ein Enzym gekoppelt sein oder durch einen enzymgekoppelten Zweitantikörper detektiert werden. Eine durch das konjugierte Enzym katalysierte Farbreaktion kann photometrisch gemessen werden und erlaubt die Konzentrationsbestimmung des Zielproteins anhand einer Eichkurve. Eine spezielle Form des ELISA ist der Sandwich-ELISA. Dabei wird das gesuchte Protein durch einen immobilisierten Fänger-Antikörper spezifisch aus einem Proteingemisch herausgefischt. Ein weiterer, gegen das Protein gerichteter (1.) Antikörper, der aus einer anderen Spezies als der Fänger- Antikörper stammt, wird auf den gewaschenen Antigen-Antikörper-Komplex gebracht. Schließlich folgt ein mit Enzym-konjugierter (2.) Antikörper, der gegen den zuletzt aufgebrachten (1.) Antikörper gerichtet ist. Nach einem weiteren Waschschritt führt ein zugegebenes Substrat zum sichtbaren Farbumschlag. Eine photometrische Messung folgt dem Abstoppen der Reaktion und anhand der mitgeführten Eichkurve kann eine Konzentrationsbestimmung erfolgen. In dem nachfolgenden ELISA muss auf ein Fänger-Antikörper verzichtet werden, da es nur Antikörper gegen Alcohol-Dehydrogenase aus Kaninchen gibt. Ein klassischer Sandwich-ELISA ist nicht möglich. Die Proteine bzw. komplexen Proteinmischungen werden direkt an das Trägermedium gebunden, mit dem Nachteil, dass kein Einfluss auf die Art der gebundenen Proteine genommen werden kann. 21

22 2.2 Lösungen 1. Coating buffer 0,1M Carbonatpuffer 4,29g Na 2 CO 3 x 10 H 2 O 2,93g Na 2 HCO 3 auf ph 9.6; ad 1L H 2 O 2. Blocking buffer 2% (w/v) Magermilchpulver 1g ad 50ml 1x PBS 3. Wash buffer 1xPBS, 0,05% (v/v) Tween Proben Eichkurve: Alcohol-Dehydrogenase (Yeast) 1mg/ml 1.Konzentration: 1µg/ml -> geometrische Verdünnungsreihe -> 8. Konzentration: ~7,8ng/ml Proben: H, Ü0, Ü1, Ü2, E, EE -> 1:1.000, 1: Ü3 -> 1:10, 1:100 Durchfluss (DF), Wash(W), Eluate (F) -> , 1:10.000, 1: Verdünnungen in Carbonatpuffer herstellen Antikörper Anti-Alcohol Dehydrogenase (Yeast) [Rabbit] (Fa. Rockland ) 1: in Blocking buffer Antikörper Anti-rabbit IgG (whole molecule) HRP (Fa. Sigma A-0545) 1: in Blocking buffer 7. TMB Lösung A 9,73g Kaliumcitrat (30mmol/l EK) mit ca. 10g (gelöst in ~100ml H 2 0) Zitronensäure auf ph 4,1; ad 1L H 2 O Lösung B 240mg Tetramethylbenzidin (Roth ) + 10ml Aceton + 90ml Ethanol + 907µl 30% H 2 O 2 (80mmol/l EK) beide Lösungen werden gestellt 8. Stopplösung 10% (v/v) Schwefelsäure 2.3 Materialien / Geräte 1. Mikrotiterplatte: Greiner high (Art ) 2. Inkubationskammer: Plastikbox mit feuchten Tüchern ausgelegt 3. Elisa-washer: Columbuswasher (Fa. TECAN) 4. Elisa-reader: Sunrise (Fa. TECAN) 22

23 2.4 Pipettierschema Datum A 1µg/ml H H DF DF DF B 500ng/ml Ü1 Ü1 W W W C 250 Ü2 Ü2 F F F D 125 Ü3 Ü3 F F F E 62,5 E E DF DF DF F 31,23 EE EE W W W G 15,6 Blank1 Blank1 F F F H 7,8 Blank2 Blank2 F F F Coaten Blocken 1. Antikörper 2. Antikörper Substrat Eichkurve (ADH) Inkubation 2.5 Durchführung 1. Coaten: Verdünnungen von allen Proben und der Eichkurve in Carbonatpuffer herstellen; je 100µl/well (Vertiefung) pipettieren (Achtung! Doppelbestimmungen) Blank1 und Blank2 ist nur Carbonatpuffer (zügig arbeiten!) 2. Inkubation: 1h, 37 C in feuchter Kammer 3. Waschen: 3x mit 1x PBS, 0,05% (v/v) Tween 20 (Programm 5) 4. Blocken: je 250µl/well Blocking buffer (auch Blanks) 5. Inkubation: 1h, 37 C in feuchter Kammer 6. Waschen: 3x mit 1x PBS, 0,05% (v/v) Tween 20 (Programm 5) Antikörper: je 100µl/well des 1: in blocking buffer verd. Antikörpers Achtung! In Blank2 nur Blocking buffer einfüllen! 8. Inkubation: 1h, 37 C in feuchter Kammer 9. Waschen: 3x mit 1x PBS, 0,05% (v/v) Tween 20 (Programm 5) Antikörper: je 100µl/well des 1: in Blocking buffer verd. Antikörpers auch in Blank1 und Inkubation: 1h, 37 C in feuchter Kammer 12. Waschen: 3x mit 1x PBS, 0,05% (v/v) Tween 20 (Programm 5) 13. Substrat: je 100µl/well der frisch angesetzten Lösung (10 Teile A + 0,5 Teile B) 14. Inkubation: 10-30min, RT in feuchter Kammer, dunkel 15. Abstoppen: +je 100µl/well 10%ige Schwefelsäurelösung 16. Messung: 450/620nm am Elisareader (Thermo) 2.6 Auswertung Mit Hilfe der Eichkurve können die Konzentrationen der einzelnen Proben ermittelt werden. Die gefundenen Werte stellen nur die Menge, nicht aber die Funktionalität, hier Enzymaktivität, der Alcohol-Dehydrogenase dar. 23

24 3. Diskontinuierliche Gelelektrophorese und Western Blot 3.1 Allgemeines Man schätzt, dass in Eukaryontenzellen etwa verschiedene Strukturgene aktiv sein können, deren Produkte zum größten Teil Polypeptidketten (Translationsprodukte) sind. Diese falten sich zu aktiven Proteinen (Enzyme, Transportproteine, Strukturproteine, Peptidhormone, etc.), wobei kovalente (postranslationale) Modifikationen (Disulfidbrückenbidlung, Peptidabspaltung, Anhängen von Kleinmolekülen, z.b. Phosphorylierungen, Gykosylierungen) und nicht-kovalente Bindungen an andere Moleküle (Kleinmoleküle, z.b. Häm, Proteine, Nukleinsäuren) stattfinden können. Man unterscheidet: Haushaltsproteine = Proteine, die für das Leben jeder Zelle notwendig sind und die deshalb in fast allen Zelltypen eines Organismus vorkommen (z.b. Enzyme der Glykolyse) und zellspezifische Proteine, die für spezialisierte Zellfunktionen notwendig sind (z.b. Hämoglobin, Muskelproteine, Peptidhormone). Abbildung 3.1: Prinzip der diskontinierlichen Elektrophorese. Zum spezifischen Nachweis eines bestimmten Proteins in einem Gemisch bedient man sich häufig eines spezifischen Antikörpers der in einem als Western Blot bezeichneten Verfahren eingesetzt wird. Hierzu wird das Proteingemisch zuerst auf einem diskontinuierlichen SDS Gel elektrophoretisch aufgetrennt (Abb. 3.1). Im Sammelgel liegt ein ph von 6.8 vor, während im Trenngel ein basischer ph von 8.8 vorliegt. Im Sammelgel entsteht ein hoher Spannungsabfall zwischen den langsamen, weil überwiegend ungeladenen Glycinionen und den schnellen Chloridionen. Dadurch bewegen sich die dazwischen befindlichen Proteine relativ schnell im elektrischen Feld. Wenn die Proteine das Trenngel erreichen werden sie durch die geringere Porengröße abgebremst. Die Glycinionen überholen an 24

25 diesem Punkt die Proteine. Durch den ph-shift im Trenngel sind die Glycinionen nun voll geladen und die Feldstärke im Gel ist konstant. Durch die Veränderung der Wanderungsgeschwindigkeit der Glycinionen werden die Proteine in einer scharfen Bande konzentriert, darauf beruht die hohe Trennleistung dieser Elektrophorese-Methode. Nach Beendigung des Laufs wird das aufgetrennte Gemisch auf eine Nitrozellulose-Membran mittels Elektroblot übertragen (Abb. 3.2). Die Membran wird danach mit einem unspezfischen Protein (BSA, oder Milchpulver) abgesättigt und dann mit einem spezifischen Antikörper inkubiert. Dabei bindet der Antikörper an sein Antigen, das dann mit Hilfe einer Nachweisreaktion sichtbar gemacht wird. Ziel des Versuchs ist es die Alkohol-Dehydrogenase mit einem spezifischen polyclonalen Antikörper im Western Blot nachzuweisen. Abbildung 3.2: Schematische Darstellung des Western-Blot Verfahrens. 3.2 Probenaufarbeitung Ziel des Versuchs ist die Alkohol-Dehydrogenase aus Hefe-Rohextrakten und verschiedenen Aufreinigungsschritten über SDS Elektrophorese in einer Coomassie-Färbung und im Western Blot nachzuweisen. Der Proteingehalt der Proben, falls unbekannt, ist durch Proteinbestimmung zu ermitteln, da in jede Spur die gleiche Proteinmenge geladen werden soll. Von jeder Probe werden jeweils 20 μl Proteinlösung mit 5x SDS Ladepuffer (5 μl ) versetzt und bis zur Durchführung des Versuchs bei -20 o C gelagert. 25

26 Durchführung: Proben vor der Elektrophorese auftauen, kurz vortexen und danach für 5 min. auf 95 C erhitzen. Nach Abkühlen auf Eis und einer Zentrifugation in der Eppendorfzentrifuge ist der Überstand gebrauchsfertig. Es werden 10 μl von jeder Probe geladen. 4 x konz. SDS reduzierender Probenpuffer : (Stocklösung) H 2 O dest. 3.8 ml 0.5 M Tris-HCl, ph ml Glyzerin 0.8 ml 10% (w/v) SDS 1.6 ml β-mercaptoethanol 0.4 ml 1% Bromphenolblau 0.4 ml Total 8.0 ml Im Probenpuffer werden die Proteine solubilisiert, dissoziiert, denaturiert (durch Dodecylsulfat und Hitze) und reduziert (β-mercaptoethanol). Das Glyzerin dient der Beschwerung, das Bromphenolblau der Anfärbung und als Referenz bei der Elektrophorese (läuft als Bande vorweg!). 3.2 Gelvorbereitung Platten nach Demonstration gut reinigen und zusammenbauen. Trenngel (12%) H 2 O dest. 2.6 ml 1.5M Tris Cl, ph ml 10% SDS 80 µl Acylamid/bis 3.2 ml APS 80 µl TEMED 4 µl Ergibt 8 ml Lösung. (ausreichend für 2 Gele) Nach der Zugabe von APS und TEMED gut mischen und zwischen die Gelplatten pipettieren. Die Geloberfläche zum Schluß mit H 2 O dest. überschichten. Das Trenngel braucht ca. 45 Minuten bis es polymerisiert ist, anschließend wird das Sammelgel gegossen. Sammelgel H 2 O dest. 2.0 ml 1 M Tris Cl, ph ml 10% SDS 30 µl Acylamid/bis 0,52 ml APS 30 µl TEMED 4 µl Ergibt 3 ml Lösung. (ausreichend für 2 Gele) 26

27 Wasser von der Geloberfläche mit einem Whatman Filterpapier absaugen, dabei nicht die Geloberfläche berühren. Sammelgellösung zwischen die Platten pipettieren; Kamm einsetzen (Luftblasen vermeiden). Nach Minuten ist das Gel polymerisiert. Kamm langsam aus dem Gel ziehen. Die Geltaschen von restlichem unpolymerisierten Acrylamid durch Spülen mit Laufpuffer befreien. Gel in die Kammer einbauen und 5-10-µl Proben auftragen. Jede Probe zweimal auftragen (siehe Schema). Gellauf: 40 ma konstant. Lauf dauert etwa 45 min. M M Coomassie Färbung Western Blot M= Marker Proteine (Molekulargewichtsstandard) Ein Gel direkt färben mit Coomassie Blue. Das andere Gel wird für den Western Blot benötigt. Stock Lösungen 1. Acrylamid/bis (30 % T, 2.6 % C) 87.6 g Acrylamid 2.4 g N N -bis-methylene-acrylamid auf 300 ml mit H 2 O dest. auffüllen. Filtrieren und bei 4 C dunkel lagern. Achtung Acrylamid ist im unpolymersierten Zustand ein Nervengift und ist cancerogen!!! (Es wird eine gebrauchsfertige Acrylamidlösung bereitgestellt) M Tris-HCl, ph g Tris 50 ml H 2 O dest. Mit HCl auf ph 8.8 bringen, auf 100 ml auffüllen mit H 2 O dest. und bei 4 o C lagern M Tris-HCl, ph g Tris 60 ml H 2 O dest. Mit HCl auf ph 6.8 bringen, auf 100 ml auffüllen mit H 2 O dest. und bei 4 o C lagern % APS Lösung. Dazu 1 g Ammoniumpersulfat/10 ml Aqua bist. ansetzen. Für 2 Wochen bei 4 o C lagern. 27

28 5. 10% SDS 10 g SDS in 90 ml H 2 O dest. lösen und auf 100 ml auffüllen. (Einwaage unterm Abzug, da SDS Stäube reizend sind) x Laufpuffer ph 8,3 250 mm Tris 1,92 M Glycin Vor dem Lauf wird der Puffer 1:10 mit Wasser verdünnt und mit SDS versetzt (aus 10% Lösung): Endkonzentration: 0.1 % SDS 7. Molekulargewichte des Proteinmarkers Wir verwenden einen Proteinstandard der Firma Bio Rad (Precision Plus Protein Standards) Mw (daltons) Elektroblot 1. Gel in Blot-Puffer Minuten schütteln 2. PVDF-Membran auf Gelgröße zurechtschneiden 3. Membran kurz in Methanol inkubieren Aufbau des Blots: - Kathodenplatte 3x Whatman Papier Gel Nitrozellulose 3x Whatman Papier Anodenplatte + 28

29 4. Transfer mit der Semidry Apparatur für 40 Minuten bei RT mit 5 ma/cm 2 5. Nach dem Transfer Membran entnehmen und die Position der Proben, sowie Markerbanden auf der Membran markieren. 6. Membran in 1 x PBS spülen. Danach entweder trocknen und zwischen zwei Whatman Papiere lagern oder sofort mit der Antikörper Inkubation beginnen. 3.4 Antikörpernachweis 1. Membran für 30 Minuten in Blocking-Puffer bei RT inkubieren. 2. Waschen der Membran bei RT mit 3 x kurz mit 1 x PBS-T 1 x 5 Minuten 1 x PBS-T 3. Anti-Alkohol-Dehyrogenase (polyclonal, rabbit) 1:1000 in TBS-T verdünnen, 1 h bei RT inkubieren. 4. Waschen der Membran bei RT mit 3x kurz mit 1x PBS-T 1 x 5 Minuten 1xPBS-T 5. Anti-rabbit IgG mit AP gekoppelt 1:2000 in PBS-T verdünnen, 1 h bei RT inkubieren. 6. Waschen der Membran bei RT mit 3 x kurz mit 1x PBS-T 1 x 5 Minuten 1x PBS-T 1 x kurz mit Substratpuffer 1 x 5 Minuten mit Substratpuffer 7. Substrat NBT und BCIP 1:100 in Substratpuffer verdünnen (10 ml) und Blot so lange inkubieren, bis Banden zu sehen sind (2-20 min) 8. Mit Wasser 1x kurz, 1x 5 Minuten gründlich spülen und zwischen Filterpapier trocknen (Achtung: Wenn nicht ausreichend gespült wurde, kommt es beim Trocknen zu einer häßlichen Nachfärbung!) 29

30 Lösungen: 1. Blot-Puffer = Laufpuffer ohne SDS 25mM Tris 192mM Glycin 2. Blocking Puffer 5% Trockenmilch 0.1% Tween-20 1x PBS 3. 20x PBS 170 g NaCl (2.9M) g Na 2 HPO 4 (150mM) 6.9 g NaH 2 PO4 *H2O (50mM) ad 1 L H 2 O 4. 1x PBS-T 1x PBS + 0.1% Tween Coomassie Färbelösung 100 mg Coomassie R ml Ethanol 10 ml Essigsäure 50 ml H 2 O 6. Entfärber 40 ml EtOH 10 ml Eisessig 50 ml H 2 O 10. Substrat-Puffer 100mM Tris HCl ph 9.5 0,5mM MgCl NBT (Nitrotetrazolium blue chlorid) und BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphat) NBT (30 mg NBT in 1 ml 70 % Dimethylformamid) BCIP (15 mg BCIP in 1 ml 100 % Dimethylformamid) 30

31 4. Zweidimensionale (2D)-Gelektrophorese 4.1 Allgemeines Mit Hilfe der zweidimensionalen Elektrophorese nach O Farrell kann eine Mischung von bis zu 5000 Proteinen hinreichend gut in einzelne Spezies aufgetrennt werden. Bei dieser hochauflösenden Technik wird die Mischung erst einer isoelektrischen Fokussierung (IEF) in einer Gel-Kapillare unterworfen (Abb. 4.1a). Die isoelektrische Fokussierung wird in gleicher Weise durchgeführt wie die Elektrophorese, nur mit dem Unterschied, dass vor der Probenauftragung dem Gel beigefügte Ampholyte elektrophoretisch getrennt werden und dabei einen ph-gradienten innerhalb des Gels aufbauen. Nach Beendigung der IEF wird das IEF-Gel auf ein konventionelles SDS-Gel überführt und die Proteine werden nun durch SDS- Gelelektrophorese nach ihrem Molekulargewicht getrennt (Abb. 4.1b). Abbildung 4.1: Prinzip der zweidimensionalen Gelelektrophorese. a) Trennung der Proteine in der IEF nach Ladung. Nach Aufbringen des IEF Gelstäbchens auf das SDS-Gel werden die Proteine dann nach Molekulargewicht getrennt. 31

32 4.2 2D-Gelelektrophorese Dimension Herstellung der Kapillar-Gele für die 1. Dimension Der Gießzylinder wird mit mehreren Lagen Parafilm verschlossen Den Gießzylinder mit Kapillarröhrchen füllen. Die blauen Strichmarkierungen müssen nach oben zeigen. Zugabe von TEMED und APS zur Monomer Lösung. Mit einer Spritze die Lösung aufziehen, Nadel aufsetzen. Nadel in den Gießzylinder einführen und die Kapillaren 3/4 der Länge mit Gellösung füllen. Nach der Polymerisierung Parafilm abnehmen und die Röhrchen aus dem Gießzylinder drücken. Außen an der Kapillare polymerisiertes Acrylamid entfernen. Kapillaren mit Luftblasen verwerfen. Kapillaren in die Apparatur einbauen. Es müssen alle Plätze in der Apparatur mit Kapillaren besetzt sein. Vorlauf: Mit einer Hamilton Spritze oben NaOH Puffer in die Kapillaren füllen und Luftblasen sehr sorgfältig aus den Kapillaren entfernen. In die untere Pufferkammer ein Rührstäbchen legen und mit H 3 PO 4 Puffer bis zur blauen Marke auf den Kapillaren (etwa 800 ml) füllen. Obere Pufferkammer mit NaOH Puffer füllen (etwa 60 ml) Elektroden anschließen und die Kammer auf einen elektrischen Rührer stellen. Präelektrophorese mit 200 V für 10 Minuten 300 V für 15 Minuten 400 V für 15 Minuten Probenbeladung: Nach erfolgtem Vorlauf werden die Laufpuffer verworfen. 800 ml frischen H 3 PO 4 Laufpuffer in die untere Pufferkammer füllen. NaOH Puffer mit Hamilton Spritze aus den Kapillaren entfernen. Darauf achten, daß die Geloberfläche nicht durchstochen wird. Kapillaren mit Hilfe der Hamilton Spritze mit Sample Puffer dreimal spülen µl Probe in die Kapillare füllen und mit µl Sample Overlay Puffer überschichten. Schließlich bis zum Rand mit NaOH füllen. (auf Luftblasen achten!) Vorsichtig mit NaOH Puffer die obere Kammer auffüllen Laufbedingungen: 500 V für 10 Minuten 750 V für 3.5 Stunden Nach Beendigung des Laufs Kapillaren aus der Apparatur ausbauen. Danach entweder direkt die 2. Dimension anschließen, oder die Gele in Parafilm einwickeln und über Nacht einfrieren. 32

33 Lösungen: 1. Erste Dimension Monomer Lösung 9.2 M Harnstoff 5.5 g 4% Acrylamid 1.33 ml von der Acrylamid Stock Lösung 2.0% Triton X ml 10% Triton X-100 Stock 1.6% Bio-Lyte 5/7 Ampholyte 400 µl 0.4% Bio-Lyte 3/10 Ampholyte 100 µl 0.01% Ammonium Persulfat (APS) 10 µl 10% Ammonium Persulfat (frisch ansetzen) 0.1% TEMED 10 µl TEMED 1.97 ml H 2 O Ergibt 10 ml Lösung. Harnstoff einwiegen, dann die anderen Lösungen bis auf APS und TEMED zufügen. Im Wasserbad erwärmen, um den Harnstoff zu lösen. Zum Gießen der Kapillar-Gele APS und TEMED zugeben, kurz umschütteln und dann die Kapillaren füllen 2. Acrylamid Stocklösung (cancerogen, deshalb Handschuhe!) Acrylamid/bis g (30% T/5.4% C) 1.62 g 100 ml (wird gestellt) 3. 10% Triton X-100 Stock Lösung 10 g Triton X-100 mit 100 ml mit H 2 Odest. verdünnen 4. 40% Triton X-100 Stock Lösung 4 g Triton X-100 mit 10 ml mit H 2 Odest. verdünnen 5. Probenpuffer für die erste Dimension 9.5 M Harnstoff 5.7 g 2.0% Triton X ml10% Triton X-100 stock 5% β-mercaptoethanol 0.5 ml 1.6% Bio-Lyte 5/7 Ampholyte 400 µl 0.4% Bio-Lyte 3/10 Ampholyte 100 µl auf 10 ml mit H 2 Odest. verdünnen. Im Wasserbad (<45 C) erwärmen, um den Harnstoff zu lösen. In 0.5 ml Aliquots in Reaktionsgefäße verteilen und bei 70 C lagern. 6. Sample Overlay Puffer 9M Harnstoff 5.41 g 0.8% Bio-Lyte 5/7 Ampholyte 200 µl 0.2% Bio-Lyte 3/10 Ampholyte 50 µl Bromphenol Blau 50 µl einer 0.05% (w/v) BPB stock Lösung auf 10 ml mit H 2 Odest. verdünnen. Im Wasserbad (<45 C) erwärmen, um den Harnstoff zu lösen. In 0.5 ml Aliquots in Reaktionsgefäße verteilen und bei 70 C lagern. 33

34 7. Puffer für die obere Pufferkammer (100 mm NaOH) 1 g NaOH in 250 ml H 2 O dest. lösen und für 30 Minuten entgasen. 8. Puffer für die untere Pufferkammer (10 mm H 3 PO 4 ) 1.36 ml H3PO4 in 2 L H 2 O dest. und für 30 Minuten entgasen Dimension: SDS Gel Gel nach Vorschrift Western Blot (1.4) herstellen. Pro Kapillare wird ein SDS Gel benötigt. Sammelgel ohne Kamm gießen. Für den MG-Marker wird eine Tasche unter Zuhilfenahme eines weiteren Spacers erzeugt. Sammelgel mit Isopropanol überschichten. Kapillargel aus der Kapillare auf ein Stück Parafilm drücken. Wird vom Assistenten durchgeführt. Gel mit Äquilibrierungspuffer beträufeln (Abzug). Mit Hilfe eines Spatels oder Parafilm wird das Gel auf das SDS Gel befördert 1 µl Marker in die Tasche geben. Erwärmter 1%iger Agarose-Probenpuffer vorsichtig mit einer Pasteurpiette auf das Gel träufeln (Abzug). Nach dem Erkalten Kammer mit Laufpuffer füllen. Normale Laufparameter siehe Western Blot Vorschrift. Nach dem Lauf eine Silberfärbung vornehmen. Lösungen für die 2. Dimension 1. Äqulibrierungspuffer M Tris HCl, ph ml 0.5 M Tris/HCl, ph % (w/v) SDS 2.3 ml 10% (w/v) SDS 5% β-mercaptoethanol 500 µl 10% Glycerin (w/v) 800 µl Bromphenolblau 250 µl einer 0.05% (w/v) BPB stock Lösung H 2 O dest. 4.9 ml 10 ml Unter dem Abzug herstellen!!!! 2. 1% Agarose in SDS Probenpuffer 1 g Agarose in einfach konzentriertem SDS Proben Puffer aufkochen H 2 Odest ml 0.5 M Tris-HCl, ph ml Glycerin 2.5 ml 10% (w/v) SDS 5.0 ml 1% Bromphenolblau 1.25 ml Total 100 ml Agarose ist fertig hergestellt und befindet sich im Wasserbad 5 µl β-mercaptoethanol zu 1 ml Agaroselösung in einem Eppendorfgefäß zufügen und im Wasserbad zwischenlagern. 34