Universitätsklinikum Ulm Zentrum für Chirurgie Klinik für Allgemein- und Viszeralchirurgie Ärztliche Direktorin: Prof. Dr. med. D. Henne-Bruns Untersuchung der Expression von Interleukin-10 Rezeptoren, CD 133 und CXCR-4 in kolorektalen Karzinomen und Magenkarzinomen Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm Martin Seidenspinner geb. in Bad Mergentheim 2013
Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Marko Kornmann 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Markus Juchems Tag der Promotion: 22.05.2015
Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis.I Abkürzungsverzeichnis.III 1. Einleitung... 1 1.1 Epidemiologie der gastrointestinalen Tumoren... 1 1.2 Grundlagen des kolorektalen Karzinoms... 1 1.3 Grundlagen des Magenkarkzinoms... 4 1.4 Grundlagen von Interleukin-10 und seinem Rezeptor... 5 1.5 Grundlagen des CD133 Rezeptors... 7 1.6 Grundlagen des CXCR-4 Rezeptors... 7 1.7 Ziel der Studie... 9 2 Material und Methoden... 10 2.1 Untersuchungsmaterial... 10 2.1.1 Kolorektales-Karzinom... 10 2.1.2 Kolonkarzinom mit Chemotherapie... 11 2.1.3 Magenkarzinom... 11 2.2 Methode... 12 2.2.1 Präparateherstellung... 12 2.2.2 Immunhistochemische Färbung... 13 2.2.3 Gegenfärbung mit Mayer s Hämalaun... 21 2.3. Mikroskopische Auswertung... 23 2.4 Statistik... 24 3. Ergebnisse... 25 3.1 Charakterisierung der Patientengruppen... 25 3.1.1 Kolorektale Karzinome... 25 3.1.2 Magenkarzinom... 30 I
3.2 Charakterisierung der Immunhistochemie... 33 3.2.1 Interleukin-10 Rα Antikörper... 33 3.2.2 Interleukin-10 Rβ Antikörper... 35 3.2.3 CD133 Rezeptor Antikörper... 38 3.2.4 CXCR-4 Antikörper... 40 3.3 Korrelation der Immunhistochemie mit klinikopathologischen Parametern. 44 3.3.1 Korrelation der Intensität der Färbung mit IL-10-Rα Antikörper... 44 3.3.2 Korrelation der Intensität der Färbung mit IL-10 Rβ Antikörper... 48 3.3.3. Korrelation der Intensität der Färbung mit CXCR-4 Antikörper... 52 3.3.4 Korrelation der Intensität der Färbung mit CD133 Antikörper... 56 4. Diskussion... 64 4.1 Analyse der Ergebnisse... 64 4.1.1 Allgemein... 64 4.1.2 Alters-und Geschlechtsverteilung... 65 4.1.3 Klinikopathologische Parameter... 66 4.1.4 IL-10 Rα und IL-10 Rβ als Prognosefaktor... 66 4.1.5 CXCR-4 als Prognosefaktor... 72 4.1.6 CD133 als Prognosefaktor... 74 5. Zusammenfassung... 76 6. Literaturverzeichnis. 78 7. Abbildungsverzeichnis 86 8. Tabellenverzeichnis 88 II
Abkürzungsverzeichnis A. Arteria APES 3-Aminopropyltriethoxysilan Aqua dest. Destilliertes Wasser CD Cluster of Differentation (CH³)²CHOH Isopropanol CRC englisch, colorectal carcinom CEA carcinoembryonales Antigen CXC Chemokinin CXCR-4 Chemokinrezeptor 4 DAB 3-3 -Diaminobenzidin DCC Deletet in Colorectal Cancer DNS Desoxyribonukleinsäure Gastritis A autoimmune Gastritis HIV human immunodeficiency virus H 2 O Dest. Destilliertes Wasser H 2 O 2 Wasserstoffperoxid ICD International Classification of Diseases IL Interleukin IgG Immunglobulin K-ras Kirsten rat sarcoma viral oncogene MCP Monocyt chemoattractant protein MIP Marcophage inflammatory protein mrna einzelsträngige Ribonukleinsäure n Größe der Teilstichprobe O 2 PBS ptnm Sauerstoff Phosphate Puffer Solution pathologische Klassifikation hinsichtlich Tumor, Lymphknoten und Metastasen ph Negativer dekadischer Logarithmus der Konzentration von Wasserstoffionen p-wert Wahrscheinlichkeitswert RA Rezeptor alpha III
Rα Rezeptor alpha Rβ Rezeptor beta TNM-Klassifikation Klassifikation hinsichtlich Tumor (T), Lymphknoten (N) und Metastasen (M) UICC Union International Contre le Cancer V. Vena IV
1. Einleitung 1.1 Epidemiologie der gastrointestinalen Tumoren Mit etwa 37000 Neuerkrankungen ist das kolorektale Karzinom bei Männern nach dem Bronchial- und Prostatakarzinom das dritthäufigste Karzinom des Mannes und nach dem Mammakarzinom, mit etwa 36000 Neuerkrankungen pro Jahr, das zweithäufigste Karzinom der Frau (ICD 10 C18-C21). Somit zählt dieses zu den häufigsten Krebserkrankungen sowohl bei Männern als auch bei Frauen [5]. In Deutschland erkranken jährlich etwa 18800 Patienten an Magenkrebs (ICD 10 C 16). Mit 11000 Neuerkrankungen steht es an fünfter Stelle der Krebserkrankung bei Männern und an siebter Stelle bei Frauen. Das mittlere Erkrankungsalter liegt für Magenkarzinome bei 70 Jahren für Männer und 75 Jahre für Frauen [5]. Die 5-Jahres Überlebensraten sind bei Magenkarzinomen mit 35% für Männer und 31% für Frauen eher schlecht. Die Überlebensraten bei Darmkrebs liegen inzwischen bei 60% [5]. Trotz der guten Überlebensrate, zählt speziell das kolorektale Karzinom mit über 70000 Neuerkrankungen und ca. 30000 Todesfällen pro Jahr in Deutschland zu den häufigsten malignen Tumoren sowohl für Männer als auch für Frauen [5,45]. 1.2 Grundlagen des kolorektalen Karzinoms Prinzipiell ist das invasive kolorektale Karzinom eine vermeidbare Erkrankung. Der wichtigste Faktor für die Abnahme der Inzidenz von kolorektalen Karzinomen in industriellen Ländern ist die Früherkennung bei flächendeckend eingeführten Screeninguntersuchungen [54]. Die Ursachen für die Entstehung eines kolorektalen Karzinoms sind multifaktoriell. Es kann sowohl durch äußere Faktoren wie Umwelteinflüsse, als auch durch Entzündungen des 1
Gastrointestinaltraktes verursacht sein. Doch die häufigste Ursache eines kolorektalen Karzinoms liegt in einer genetischen Prädisposition [56]. Es bestehen zurzeit zwei gut dokumentierte Wege zur Entstehung des genetisch bedingten kolorektalen Karzinoms, das sich meist progredient von einer präkanzerösen Veränderung (Adenom) zu einem invasiven Karzinom entwickelt. Der eine ist der Weg der chromosomalen Instabilität, bei dem es zu einem Allel-Verlust auf dem Chromosom 5q kommt, und das Epithel daraufhin hyperproliferiert. Weitere Mutationen in den Chromosomen 12q (K-ras) und 18q (DCC/SMAD4) führen zu einer Inaktivierung der Tumorsuppressorgene [7,51]. DNS- Methylierungsstörungen führen zu dem frühen, ras-mutationen zu dem intermediären und der Verlust des 18q-Allels zu dem späten Adenom [7,51]. Das Karzinom ist durch Deletionen des 17q-Allels bedingt, bei dem es durch Mutationen des P53 Tumorsuppressorgens zu einer Apoptose-Resistenz kommt und diese somit späte Mutationen in der kolorektalen Kanzerogenese sind [13,51]. Der andere Weg ist die Mikrosatelliteninstabilität, die durch eine Zunahme oder Abnahme der Anzahl von Tandem Repeats einfacher DNA Sequenzen charakterisiert ist [51]. Die Metastasierung des kolorektalen Karzinoms erfolgt abhängig von der Invasionstiefe und dem Malignitätsgrad stufenförmig. So metastasiert ein pt1 Karzinom mit einem 4-prozentigem Risiko lymphogen, bei einem pt2 Karzinom steigt das Risiko schon auf 12%. Bei pt3 Karzinomen erfolgt eine Metastasierung mit einem Risiko von 60% [29]. Ebenfalls muss man eine topographische Unterscheidung der Metastasierung machen, deren Regelhaftigkeit Auswirkungen auf das Operationsverfahren hat. Beim Karzinom des Colon transversum findet man Metastasen nicht nur im Bereich der A. colica media. In etwa 15% der Fälle sind auch Lymphknoten im Bereich der A. colica sinistra und bei etwa 25% im Bereich der A. colica dextra befallen. Bei Karzinomen im Bereich der rechten Flexur metastasiert ein Drittel auch in den Bereich der A. colica media. Bei dem Karzinom der linken Flexur erfolgt eine Metastasierung in etwa 25% in den Mediabereich. Selbst bei dem Karzinom der oberen Hälfte des Colon descendens erfolgt eine Metastasierung in den Mediabereich in 7% der Fälle. Bei dem Karzinom des Rektums ist die Metastasierung abhängig von der Lokalisation [24]. Zusätzlich steigt das Risiko einer hämatogenen Metastasierung mit der Anzahl der 2
befallenen Lymphknoten. Primär erfolgt die Metastasierung in die Leber (75%) über die Pfortader, anschließend folgt die Ausbreitung in die Lunge (15%) über die V. cava inferior. Von der Lunge ausgehend erfolgt die hämatogene Metastasierung in andere Organe [59]. Die Prognose des kolorektalen Karzinoms hängt in erster Linie davon ab, ob der Tumor makroskopisch und mikroskopisch komplett entfernt werden konnte. Bei kurativ resezierten Karzinomen stellt das pathologische, postoperative Tumorstadium (UICC-Stadium) den entscheidenden Prognosefaktor dar [46]. Kolon- und Rektumkarzinome werden einheitlich klassifiziert. Die Prognose korreliert mit der Kombination aus klinischen und histopathologischen Untersuchungen zum Zeitpunkt der Diagnose. Zum einen korreliert sie mit der Infiltrationstiefe des Karzinoms in die Darmwand und seiner Ausdehnung in benachbarte Strukturen (Kategorie T ), dem Ausmaß des Lymphknotenbefalls (Kategorie N ) und dem Vorhandensein bzw. Auftreten von Fernmetastasen (Kategorie M ). Zum anderen gibt es morphologische Kriterien wie zum Beispiel die Invasion lymphatischer und venöser Gefäße, eine perineuronale Tumorinfiltration sowie die Entdifferenzierung der Tumorzellen, die für eine ungünstige Prognose sprechen [46]. Weitere klinische Kriterien, die das Überleben von Patienten beeinflussen, sind zum Beispiel ein präoperativer Ileus, ulzeratives Wachstum, Perforation oder ein erhöhtes präoperatives CEA. Doch ist das Vorhandensein von positiven Lymphknoten zweifellos der wichtigste Prognosefaktor. So hat Dukes schon im Jahr 1932 die Wichtigkeit des Lymphkontenstatus erkannt und nahm diesen auch in sein Staging-System für Kolonkarzinome auf [12]. Daher hängt auch die Prognose stark im mit der Anzahl der untersuchten Lymphknoten zusammen, wobei die Überlebenszeit mit zunehmender Anzahl positiver Lymphkonten abnimmt, jedoch die Überlebenszeit bei zunehmender Anzahl untersuchter Lymphknoten zunimmt [29]. Aus den T-, N- und M-Kategorien werden vier UICC-Tumorstadien abgeleitet, die für das Rektum- und das Kolonkarzinom einheitlich klassifiziert sind. Abhängig von diesen Stadien erfolgt die Therapie anhand der S3-Leitlinien der Deutschen Gesellschaft für Verdauungs- und Stoffwechselkrankheiten 2008. 3
1.3 Grundlagen des Magenkarzinoms Das Magenkarzinom ist die zweithäufigste tumorbedingte Todesursache der Welt, wobei es in Europa deutlich seltener ist, als zum Beispiel in Japan oder China [1,37]. Histologisch erfolgt die Einteilung nach Laurèn [1,7]. Mit 95% ist das Adenokarzinom, welches von der Magenschleimhaut ausgeht, am häufigsten. Dieses wird weiter in papilläre, tubuläre, und muzinöse Karzinome, sowie Siegelrinzellkarzinome unterteilt [7]. Mit 4 % deutlich seltener tritt das Adenosquamöses Karzinom auf. Weitere seltene histologische Typen der Klassifikation nach Laurèn sind das Plattenepithelkarzinom und das kleinzellige Karzinom. Weitere, nicht durch Laurèn klassifizierte Karzinome, sind zum einen die seltenen Malignome des mucosaassoziierten Lymphgewebes (Lymphome) und zum anderen Malignome mesenchymaler Herkunft (Sarkome) des Magens [18,37]. Zu den wichtigsten Risikofaktoren des Magenkarzinoms zählen Ernährungsgewohnheiten, mit einem Mangel an Obst und Gemüse, und einem Überschuss an gepökeltem und geräuchertem Speisen [7]. Weiterhin sind Bevölkerungsschichten mit niedrigem sozioökonomischem Status einem erhöhten Risiko ausgesetzt. Daher findet sich eine hohe Inzidenz der Adenokarzinome des Magens in asiatischen Ländern (Japan, China, Korea) sowie in Süd- und Mittelamerika. Dies korreliert auch mit einer, in diesen Regionen erhöhten Durchseuchungsrate mit Helicobacter pylori, für den ein gesicherter Zusammenhang zwischen Infektion, chronischer Gastritis und Magengeschwüren besteht [7]. Weiter Erkrankungen, die mit einem erhöhten Risiko für ein Magenkarzinom einhergehen, sind die Gastritis A, der Morbus Menetrier und eine adenomatäse Polypose des Magens [7]. Die lymphogene Metastasierung erfolgt bei dem Mucosatyp des Magenfrühkarzinomen in 3.9%, beim Submucosatyp in 17,4% der Fälle [7]. Die Prognose der Patienten ist trotz guter diagnostischer Möglichkeiten und operativen Verfahren eher schlecht, da der Tumor zum Zeitpunkt der Diagnose meist schon zu weit fortgeschritten ist, um ihn durch eine radikale Gastrektomie zu therapieren [14]. Dies hängt damit zusammen, dass es meist keine oder nur unspezifische Frühsymptome gibt. Als prognostische Faktoren werden hier vor 4
allem die Tumorgröße, die Lokalisation und die Lauren-Klassifikation gewertet [18]. Lauren teilte die Magenkarzinome anhand ihres Wachstums ein. Der häufigste Typ ist mit 46% der intestinale Typ. Dieser zeichnet sich durch drüsenähnliche, atypische intestinale Zylinderepithelien aus. Der, mit 25-20 % seltenere, diffuse Typ, imponiert durch weit verstreute Tumorzellen, unscharfe Begrenzung und eine geringe Stromareaktion. Weiterhin tritt noch mit 15-20% ein Mischtyp auf [46]. Schon im Jahr 1926 wurden von Borrman verschieden Wachstumsformen beschrieben, die er als polypös (Typ I), ulzerös mit scharfem Rand (Typ II), ulzerös mit Wandinfiltration (Typ III) und als diffus (Typ IV) beschrieb [7]. Seit 1962 weiß man jedoch, dass es sich bei diesen Wachstumsformen nicht um Magenfrühkarzinome handelt. Dies wurde vor allem durch japanische Forscher festgestellt, die ebenfalls eine wichtige morphologische Grenzlinie mit besonderem prognostischem Wert erkannten, nämlich die submuköse Verschiebeschicht zwischen der Submukosa und der Muscularis propria [29,46]. Somit gilt die Invasionstiefe in die Magenwand als wichtiger prognostischer Faktor des Magenkarzinoms, da die meisten Karzinome oberhalb dieser Grenze durch entsprechende chirurgische Maßnahmen heilbar sind. Weiterhin haben bei den, die Grenzschicht durchdringenden Karzinomen, der Status lokaler Lymphknoten und das Vorhandensein von Metastasen einen prognostische Wert [29]. Karzinome, die im distalen oder mittleren Teil des Magens lokalisiert sind, haben eine günstigere Prognose gegenüber Karzinomen im proximalen Magenabschnitt [46]. 1.4 Grundlagen von Interleukin-10 und seinem Rezeptor Das Wort Interleukin leitet sich wie folgt ab: Aus dem lateinischen inter = zwischen, aus dem griechischen leukos = weiß und kinien = bewegen. Interleukine sind somit körpereige Botenstoffe des antigenunspezifischen humoralen Immunsystems, die zwischen den einzelnen Bestandteilen der zellulären Immunantwort, wie Leukozyten, Makrophagen und Monozyten kommunizieren. 5
Die einzelnen Interleukine wurden nach der Reihenfolge Ihrer Entdeckung in durchnummerierte Untergruppen eingeteilt. Sie weisen höchst unterschiedliche Wirkungen auf. Nach der Wirkung kann man sie in inflammatorische Interleukine, zu denen IL-1, IL-6 und IL-8, TNF-α, MCP und MIP gehören, und in die suppressiven Interleukine, zu denen IL-1Rα, IL-10 und TGF-β gehören, einteilen [36,52]. Interleukin-10 (IL-10) ist das wichtigste antiinflammatorisches Zytokin, das zum einen die Antigenpräsentation und zum andere die Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen hemmt. Als erstes wurde es bezüglich seiner Fähigkeit erkannt, die Aktivierung und Effektorfunktion von T-Zellen, Monozyten und Makrophagen zu hemmen, daher wurde es ursprünglich als Zytokinsyntheseinhibitorischer Faktor bezeichnet [15,17]. Der Rezeptor des IL-10 ist ein Oberflächenrezeptor der Zellen, bestehend aus zwei Untereinheiten, die Mitglied der Familie der Interferonrezeptoren (IFNR) sind [31]. Dies ist zum einen die Bindungsstelle (IL-10 Rα) für IL-10 und zum anderen die Untereinheit (IL-10 Rβ), die für die Signaltransduktion verantwortlich ist [31,16]. Der Interleukin-10-Rezeptor α (IL-10-Rα) wird durch die meisten haematopoetischen Zellen exprimiert, wobei es jedoch lediglich einige Hundert pro Zelle sind [30]. IL-10-R1 Expression auf T-Zellen wird sowohl durch Aktivierung der mrna, als auch auf Proteinebene herunter reguliert [30]. Im Gegensatz hierzu ist die Aktivierung von Monozyten mit einer Erhöhung der IL-10-Rα-Expression, entsprechend der Rolle von IL-10 als inhibitorischer Faktor für diese Zellen verbunden. Die Interleukin-Rezeptor-Untereinheit β (IL-10-Rβ) ist verantwortlich für die Signalweitergabe. Diese Weitergabe der Signale über die Zellwand erfolgt über die Jak/Stat Signalkaskade [31]. Hierbei führt die Bindung von IL-10 an den IL-10- Rezeptor zu der Phosphorylierung und der damit verbundenen Aktivierung der Tyrosinkinasen Jak 1 und Tyk 2. Die dadurch aktivierte Tyrosinkinasefunktion führt wiederum zur Aktivierung der im Zytoplasma ruhenden Transkriptionsfaktoren Stat 1, Stat 3 und, in den Zellen die keine Makrophagen sind, dem Transkriptionsfaktor Stat 5 [31]. 6
1.5 Grundlagen des CD133 Rezeptors CD133, ebenso bekannt als Prominin1 oder AC133, ist der Ligand eines transmembranen Proteins, das ursprünglich als ein spezifisches Oberflächenantigen der CD34+ hämatopoetischen Stammzellen, als ein Marker muriner Neuroepithelialer Zellen und einiger anderer embryonaler Gewebe beschrieben wurde [34,46]. Später wurde es ebenfalls auf endothelialen, lymphatischen und myoangiogenetischen Vorläufern nachgewiesen. Obwohl die biologische Funktion von CD133 immer noch unbekannt ist, wurde CD133 als ein Stammzellmarker für normales Gewebe und Gewebe tumorösen Ursprungs festgestellt [23]. CD133, als ein Marker haematopoetischer Stammzellen, ist in malignen Erkrankungen des Hämatopoetischen Systems, wie akute myeloische Leukämie, akute lymphatische Leukämie, chronische lymphatische Leukämie und beim myelodysplastischen Syndrom exprimiert [47]. Zusätzlich wurde festgestellt, dass CD133 auch in einigen soliden Tumoren wie zum Beispiel im Retinoblastom, Glioblastom, Adenokarzinom der Prostata und dem Pankreaskarzinom exprimiert wird [46]. Bei dem kolorektalem Karzinom wird diskutiert ob es eine vermehrte Expression gibt, wobei Shmelkov et al. die Meinung vertreten, dass es ein Marker für Tumorstammzellen des kolorektalen Karzinoms ist [27,47]. 1.6 Grundlagen des CXCR-4 Rezeptors Chemokine sind potente Aktivatoren und chemoattractante Substanzen für verschiedene Leukozyten-Subpopulationen und einige nicht hämatopoetische Zellen, deren Aktivität durch einen G-Protein gekoppelten Rezeptor mit sieben Transmembrandomänen bedingt ist [37]. Besondere Aufmerksamkeit erlangte der CXCR-4-Rezeptor, als ein essentieller Cofaktor von HIV-1 und HIV-2 für die Fusion und Invasion von CD4+ Zellen [28]. Zunächst wurde jedoch die Expression von CXCR-4 auf der Oberfläche der meisten Leukozyten-Populationen 7
nachgewiesen [37,38,49], sowie bei der Mehrheit von T-Lymphozyten, allen B- Lymphozyten und Monozyten, aber eine nur geringe Expression auf natürlichen Killerzellen [37]. Weiterhin ist bekannt, dass Chemokine und deren Rezeptoren für die Akkumulation von T-Lymphozyten im Rahmen von immunologischen oder entzündlichen Vorgängen verantwortlich sind [37]. CXCL-12 (SDF-1), der Ligand des CXCR-4-Rezeptors, ist somit ein Chemoattractant und hocheffektiver Aktivator von T-Lymphozyten und Monozyten im Rahmen von immunologischen Vorgängen des Körpers [6,49]. Aktuelle Daten zeigen, dass immunomodulatorische Zytokine einen Effekt auf den Level der CXCR-4- Expression der T-Zellen haben. So wurde gezeigt, dass IL-4 die CXCR-4- Expression hochregulieren kann, wobei IL-10 die CXCR-4-Expression herab reguliert [24,37]. Seitdem wurde durch intensive Forschung festgestellt, dass diese chemoaktiven Substanzen und deren Rezeptoren eine wichtige Rolle bei der Metastasierung von Karzinomen spielen. Durch die Aktivierung der Chemokine wird das Wachstum, die Adhäsion und die direkte Migration von immunologischen Zellen bei antigeninduzierten Entzündungsreaktionen gefördert [3,48]. Mittlerweile wurde bewiesen, dass Tumorzellen diesen angeborenen Signalweg ausnutzen, um Metastasen mit einem bestimmten Ziel hervorzubringen [31]. So besteht ein bedeutender Zusammenhang zwischen der Höhe der Expression von CXCR-4 und der Prognose bei Patienten mit einem primären Kolorektalen Karzinomen (CRC). Dabei haben primäre CRC mit einer hohen Expression von CXCR-4 ein schlechteres klinisches Outcome als andere [24]. Diese Entdeckung entspricht auch den Erkenntnissen bei anderen Karzinomen. Weiterhin wurde im Vergleich zu den Primärtumoren eine höhere Expression von CXCR-4 in Lebermetastasen nachgewiesen und identifizierten somit eine potentielle chemoattractive Beziehung zwischen CRC-CXCR-4-Rezeptoren und der Leber, die besonders hohe Konzentrationen an CXCL-12 beinhaltet [21,24,25]. 8
1.7 Ziel der Studie Ziel dieser Studie ist die Untersuchung des prognostischen Wertes der Rezeptorexpression von Interleukin-10α, Interleukin-10β, CXCR-4 und CD133 bei Patienten mit einem gastrointestinalen Karzinom. Nicht nur um genauere Einteilungen der Stadien zu erreichen, sondern auch um weitere individuelle molekularbiologische Faktoren zur besseren Einschätzung und Individualisierung der Therapie zu etablieren. Hierfür wurden getrennt Pateinten mit Magenkarzinom und mit kolorektalen Karzinomen untersucht. Um hierfür Daten zu erlangen, wurden im Rahmen dieser Arbeit insgesamt 449 Patienten mit gastrointestinalen Tumoren immunhistochemisch auf die Expression von Interleukin-10-Rezeptor α- Untereinheit, Inerleukin-10-Rezeptor β-untereinheit, CXCR-4-Rezeptor und CD133-Rezeptor untersucht, und die Ergebnisse mit den klinischen und pathologischen Daten sowie dem Verlauf verglichen. Der Einsatz von molekularen Markern mit validiertem prognostischem Wert könnte dabei helfen, Risikopatienten zu identifizieren, die von einer adjuvanten Behandlung profitieren würden und somit den Weg zu einer individualisierten Indikationsstellung einer postoperativen Chemotherapie öffnen. 9
2 Material und Methode 2.1 Untersuchungsmaterial 2.1.1 Kolorektales Karzinom Das Patientenkollektiv dieser retrospektiven Untersuchung entstammt dem Tumornachsorgeregister der Klinik für Allgemein-. Viszeral- und Transplantationschirurgie des Universitätsklinikums Ulm, in dem Patienten mit einem operativ behandelten kolorektalen Karzinom erfasst werden, ohne Radiatio oder Chemotherapie. Als Einschlusskriterium wurden Patienten mit einem kolorektalen Karzinom im Stadium I und II nach der UICC-Klassifikation herausgesucht die lediglich einer operativen Therapie unterzogen wurden. Es wurden ursprünglich 165 Patienten identifiziert, die in der Abteilung Chirurgie I primär operiert wurden, von denen noch bei 99 Patienten Tumorgewebe (in Formalin-fixiertes und Paraffin-eingebettetes Gewebe) zu Verfügung stand. Davon waren 61 männlich und 38 weiblich bei einem durchschnittlichen Alter von 77 Jahren. Folgende weitere Daten wurden erhoben: Name, Vorname, Geburtsdatum, Alter und Geschlecht der Patienten, Lokalisation des Tumors, durchgeführte Operation sowie Datum der Operation, Stadieneinteilung nach UICC Kriterien sowie TNM Klassifikation, histologischer Tumortyp, Differenzierungsgrad (G), Radikalität der Operation (R), Angabe über mögliche adjuvante Therapien, Auftreten und Lokalisation eines Rezidivs, Diagnosedatum des Rezidivs, gesamte und rezidivfreie Überlebenszeit. Der klinische Verlauf der Patienten wurde sowohl anhand des in der Klinik durchgeführten Nachsorgeprogramms als auch durch Befragung der Hausärzte bzw. der Patienten erhoben. Die Studie wurde von der Ethikkommission der Universität Ulm genehmigt (05/02). 10
2.1.2 Kolonkarzinom mit Chemotherapie Die Daten der retrospektiven Untersuchung der Kolonkarzinome entstammen dem Patientenkollektiv der Fogt-IV Studie. Für diese wurden Patienten mit den Einschlusskriterien eines mit Chemotherapie behandelten Kolonkarzinoms im Stadium II und III der UICC-Klassifikation in einer multizentrischen Studie zusammengefasst. Von dieser Studie lag zu dem gegebenen Zeitpunkt von 221 Patienten in Paraffin eingebettetes Tumormaterial vor, welches für diese retrospektive Untersuchung herangezogen wurde. Das Kollektiv der 221 Pateinten teilte sich auf in 130 Männer und 91 Frauen. Das durchschnittliche Alter lag bei 65 Jahren. Folgende weitere Daten wurden erhoben: Patienten Nummer, Initialen, Geburtsdatum, Geschlecht, Zentrumsort, OP-Datum, Tumorlokalisation, TNM- Einteilung, Rezidivdatum, Rezidivlokalisation, Tag der letzten Beobachtung, Todesdatum, Todesursache. Der klinische Verlauf der Patienten wurde sowohl anhand des in der Klinik durchgeführten Nachsorgeprogramms als auch durch Befragung der Hausärzte bzw. der Patienten erhoben. 2.1.3 Magenkarzinom Das Patientenkollektiv entstammt Daten der Universitätsklinik Ulm in dem Patienten mit einem Magenkarzinom der Stadien I bis IV der UICC-Klassifikation erfasst wurden. Es wurden insgesamt 130 Patienten aufgenommen, von denen 72 männlich und 58 weiblich waren bei einem durchschnittlichen Alter von 63 Jahren. Folgende weitere Daten wurden erhoben: Name, Vorname, Geburtsdatum, Alter und Geschlecht der Patienten, Lokalisation des Tumors, durchgeführte Operation sowie Datum der Operation, Art der Rekonstruktion, Erweiterung der Operation, 11
Lymphknoten-Dissektion, Nahttechnik, Radikalität der Operation, Operateur, Liegedauer, Histologischer Typ, TNM-Stadien sowie die UICC-Stadien, genaue Diagnose, Komplikationen und die Letalität bei der Operation, im Krankenhaus, nach 30 Tagen und nach 90 Tagen. 2.2 Methode 2.2.1 Präparateherstellung 2.2.1.1 Silanisieren der Objektträger Die zuvor unbehandelten Objektträger wurden silanisiert, um eine höhere Haftung des Gewebes während des Färbeprozesses zu garantieren. Hierfür werden die Objektträger zunächst mit Aceton gereinigt, um anschließend für 2 Minuten in 2%- iger 3-Aminopropyltriethoxysilan (APES) in Aceton beschichtet zu werden. Darauf folgt eine kurze Spülung in 100% Aceton um überschüssiges APES zu entfernen und zwei weitere Spülungen in destilliertem Wasser. Anschließend werden die Objektträger zum Trocknen in den Trockenschrank bei 37 C gestellt. 2.2.1.2 Herstellung der Gewebsschnitte Die während der Operation entnommenen Gewebeproben wurden für 36 Stunden in zehnprozentiger Formaldehydlösung fixiert und anschließend in einen Paraffinblock eingebettet, um anschließend die Paraffinblöcke mit dem Mikrotom 2030 der Firma Reichert und Jung in 5 µm dicke Scheiben zu schneiden und die entstandenen Präparate auf die silanisierten Objektträger aufzutragen. Anschließend folgte dreimaliges waschen für jeweils 10 Minuten in Xylol um die Präparate zu deparaffinieren. Um den, nun im Gewebe enthaltenen Alkohol, zu entfernen wurden die Präparate für 10 Minuten in 100 % Isopropanol und 12
anschließend daran für jeweils 5 Minuten in absteigenden Isopropanol- Konzentrationen von 100%, 90%, 80%, 70% und zuletzt in 50%iger Lösung gespült. Daraufhin folgte ein letzter Waschgang für 10 Minuten in H 2 O Dest unter mehrmaligem Wechsel. 2.2.2 Immunhistochemische Färbung 2.2.2.1 Prinzip Ziel der Immunhistologie ist es, antigene Strukturen von Zellen und Gewebe durch spezifische Antikörper zu identifizieren und darzustellen. Die ursprünglichen Antikörper zur Markierung der antigenen Struktur des zu untersuchenden Materials stammen aus dem Serum von Tieren die mit der nachzuweisenden Substanz (Antigen) geimpft (immunisiert) wurden. Somit kommt es in dem Tier zu einer Antigen-Antikörper-Reaktion im Sinne einer aktiven Immunisierung, und der Ausbildung von Antikörpern gegen das geimpfte Antigen. Den Grundstein der Immunhistologie legte Coons et al. im Jahre 1941 durch die Verwendung Fluoreszensfarbstoff-gekoppelter Antikörper [9]. Seitdem wurden Sensitivität und Spezifität erheblich verbessert und weitere Markersubstanzen wie verschiedene Enzyme (Peroxidase, alkalische Phosphatase), partikuläres Material (z.b. Goldpartikel) und Isotope etabliert. Heute spielen immunhistochemische Färbemethoden in der medizinischen Forschung und Diagnostik eine unentbehrliche Rolle. Wichtige Voraussetzung für die Qualität der Färbung sind die Spezifität der Antikörper und die Stabilität der Antikörper-Bindungsstellen auf Antigenen (Epitope, Determinanten). Die Stabilität wird durch dessen chemischen Aufbau und der Vorbehandlung des Gewebes bestimmt [33]. Es kommen polyund monoklonale Antikörper sowie Detektionssysteme aus verschiedenen Antikörper-Farbstoff-Kombinationen zum Einsatz. Monoklonale Antikörper werden aus einem einzelnen Plasmazellklon gewonnen. Diese entstehen durch Verschmelzen von B-Lymphozyten mit einem unbegrenzt teilungsfähigen Plasmazelltumors, einem Plasmazytom. Die gebildeten Antikörper richten sich im 13
Gegensatz zu polyklonalen Antikörpern gegen ein einziges Epitop eines Antigens. Somit sind monoklonale Antikörper hoch spezifisch. Sie besitzen allerdings gegenüber polyklonalen Antikörpern eine geringere Sensitivität und Stabilität. polyklonale Antikörper sind natürliche Gemische der Antikörper die im Zuge einer Immunreaktion aus den Plasmazellen freigesetzt werden. Der Nachteil polyklonaler Antikörper besteht in ihrem breiten Reaktionsspektrum, wodurch es zu Kreuzreaktionen mit anderen Antigenen kommen kann [41]. Anschließend folgt die Zugabe eines zweiten, markierten Antikörpers, der als Antiantikörper wirkt, und sich somit spezifisch an den im Antigen-Antikörperkomplex im Gewebe richtet und an den ersten Antikörper bindet. Dieser zweite Antikörper stammt aus dem Serum eines anderen Tieres als der erste Antikörper, um unspezifische Bindungen zu vermeiden. Bei dem Prinzip der immunhistochemischen Färbung handelt es sich um eine Doppelmarkierung, bei der man sich die Affinität von Antikörpern zu einer bestimmten Gewebeeigenschaft, dem Epitop im Sinne einer Antigen-Antikörper Reaktion zu Nutze macht [9]. Dabei verwendet man einen Primärantikörper, der spezifisch an das darzustellende Protein im Gewebe bindet. In einem zweiten Schritt wird der Sekundärantikörper aufgebracht und sich gegen den ersten Antikörper richtet. Zur optischen Darstellung der so entstandenen Antigen- Antikörper-Verbindung bedarf es schließlich noch eines Enzymsystems [30]. Damit sich zwischen dem das zu untersuchende Antigen bindenden ersten Antikörper und dem für die später Farbreaktion wichtigen Enzymsystems eine Bindung herstellen lässt, bedient man sich biotinylierter Sekundärantikörper. Dieses Verfahren nutzt die hohe Affinität (K m = 10-15 M ) von Avidin für Biotin zur Bildung von Komplexen. Hierfür kam die Avidin-Biotin-Methode erneut zur Anwendung. Diese beruht ebenfalls auf der großen Affinität des Hühnereiweiß- Glycoproteins Avidin gegenüber dem ebenfalls mit Biotin markierten Enzymsystems. Um die dabei zuweilen auftretenden unspezifischen Reaktionen zu vermeiden, bedient man sich heute des reineren, gentechnisch hergestellten Streptavidin, welches sich aus dem Bakterium Streptomyces avidinii isolieren lässt [42,43]. Da Avidin vier Bindungsstellen für Biotin besitzt, und nach der Bindung an den biotinylierten zweiten Antikörper noch drei Bindungsstellen frei sind können mehrere Markerenzyme an dem Avidin anlagern, dadurch kommt es zu einer 14
Signalverstärkung und somit zu einer weiteren Steigerung der Sensitivität [43]. Als Enzym wird daher eine ebenfalls mit Biotin konjugierte Meerrettichperoxidase hinzugegeben. Diese Enzym (MW 40kD) wird aus der Meerrettichwurzel gewonnen und enthält als aktives Zentrum eine eisenhaltige Hämgruppe [3]. Nachdem nun der enzymmarkierte Avidin-Biotin-Complex (ABC-Complex) an den sekundären Antikörper gebunden hat fügt man zur Lokalisation des Gewebsantikörpers das Substrat der Merrettichperoxidase hinzu. Abbildung 1: Schematische Darstellung der immunhistochemischen Färbung. Der Primär- Antikörper bindet an das Antigen und wird seinerseits von einem biotinylierten (B) Sekundär- Antikörper gebunden. Streptavidin (SA) dient als Bindeglied zu biotinylierter Peroxidase (P), die als Katalysator zur Umwandlung von löslichem Diaminobenzidine (DAB) in unlösliches DAB dient. Unlösliches DAB ist als typische braune Farbreaktion zu sehen. Der Peroxidase wird Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) als Substrat angeboten, welches primär mit der Hämgruppe einen Komplex bildet und anschließend in Wasser (H 2 O) und molekularen Sauerstoff (O 2 ) zerfällt und so die Übertragung von Elektronen aus 3-3 -Diaminobenzidin (DAB) auf Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) unter Bildung von Wasser katalysiert. Die frei werdenden Protonen oxidieren das vorher fast farblose Chromogen zu seinem farbigen Endprodukt durch Polymerisation. Der dabei gebildete Farbstoff ist unlöslich [19,43]. 15
2.2.2.2 Chemikalien für immunhistochemische Färbung Aminopropyltriethoxysilan Deutschland) (APES, Hersteller: Sigma, Deisenhofen, Xylol Isopropanol ((CH 3 ) 2 CHOH, Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Schweiz) 1%-ige Wasserstoffperoxidlösung (H 2 O 2, Otto Fischer GmbH, Saarbrücken, Deutschland) Methanol (65543 Methanol, Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Schweiz) Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung Universitäts-Klinikum Ulm) (PBS, ph 7,5, Apotheke des Normal blocking Serum Burlingame, CA 94010 USA) ( Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories Inc, 1. Antikörper - Rabbit Polyclonal Antibody to CXC Chemokine Receptor 4 (CXCR4), (Catalog No. : IMG-71223, Imgenex, San Diego, CA 92121 - Mouse Monoclonal Antibody to IL10RA (Clone number: 37607.11) (Abcam plc. 332, Cambridge Science Park, Cambridge, United Kingdom) - Goat Polyclonal Antibody to IL10RB (Abcam plc. 332, Cambridge Science Park, Cambridge, United Kingdom) - Mouse Monoclonal Antibody to CD133 (Clone Number mabcam27699) 16
(Abcam plc. 332, Cambridge Science Park, Cambridge, United Kingdom) 2. Biotinylierter Antikörper: - Anti-Mouse/Anti-Rabbit-Ig G Antikörper (H+L) made in Horse (Catalog Nummer: BA-1400) (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA 94010 USA) - Anti-Goat- IgG Antikörper (H+L) made in Rabbit (Catalog Nummer: BA-5000) (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA 94010 USA) - Anti-Rabbit IgG Antikörper (H+L) made in Goat (Catalog Nummer: BA-1000) (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA 94010 USA) ABC Complex (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA 94010 USA) Diaminobenzidin (DAB) (Catalog No.: SK-4100) (DAB Substrate Kit, Vector Laboratories Laboratories Inc., Burlingame, CA 94010 USA) - Zubereitung: 5 ml H 2 O +2 Tr. Puffer + 4 Tr. DAB-Stock + 2 Tr. H 2 O 2 - keine Verwendung von Nickel, da durch den so entstandenen Braunton eine bessere Abgrenzung zu der Hämalaun-Färbung möglich ist. Mayer s Hämalaun (50%-ige Lösung, Hämatoxylin Solution Gill No. 3, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schweiz) Entellan Germany) ( Merck Art. Nr. 1.07960, Merck KGaA, 64271 Darmstadt, 17
2.2.2.3 Immunhistochemische Peroxidase-Färbung Die auf die Objektträger aufgetragenen und deparaffinierten Schnitte wurden zuallererst für 30 min in einer 1%igen Wasserstoffperoxidlösung (Otto Fischer GmbH, Saarbrücken) in Methanol (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schweiz) auf dem Schüttler inkubiert, um die endogene Peroxidaseaktivität zu hemmen. Anschließend folgte die Entfernung des Alkohols aus dem Präparat durch eine 5- minütige Spülung in PBS ph 7,5 auf dem Schüttler. PBS steht für Phosphat buffered Saline (phosphatgepufferte Salzlösung), einer isotonischen Salzlösung die zur Spülung der Präparate und dem Wiederherstellen eines konstanten, physiologischen ph-bereichs von 7,45 verwendet wurde. Um bei den weiteren Schritten das großflächige Verlaufen der Substanzen zu verhindern, und um eine größtmögliche Konzentration auf den Präparaten zu erhalten, wurden diese mit einem Fettstift umrandet. Somit konnte auch sichergestellt werden, dass die parallel laufenden Kontrollen nicht mit den Seren in Kontakt kommen können. Daraufhin folgte eine erneute Spülung mit PBS ph 7,5 für 5 Minuten. Da Antikörper nicht nur an ihrem Antigen haften, sondern auch über Ladungen oder den konstanten Teil unspezifische Bindungen eingehen, versucht man diese Bindungen zu blockieren, hierfür wurden die Präparate mit Normal Blocking Serum (Vector Laboratories Inc., Burlingame USA) inkubiert, das aus der gleichen Spezies wie der Sekundärantikörper gewonnen wurde und so sicherstellt, dass zwischen diesen keine Bindung stattfinden kann [43]. Nach einer Inkubationszeit des Normal Blocking Serums (Vector Laboratories Inc., Burlingame USA) von 20 Minuten wurden die Präparate erneut mit PBS ph 7,5 für 5 Minuten auf dem Schüttler gespült und so ebenfalls für die Inkubation des ersten Antikörpers (Vector Laboratories Inc., Burlingame USA) bei 4 C über Nacht in einer Feuchtkammer, um das austrocknen der Präparate zu verhindern. Nach der Inkubationszeit von 12 Stunden wurden die Präparate wiederum für zwei mal 5 Minuten auf dem Schüttler gespült, um anschließend den zweiten mit einer Avidinbiotinylierten Merrettichperoxidase konjugierten Antikörper (Vector Laboratories Inc., Burlingame USA) aufzubringen. Während der Antikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur einwirkt, wurde parallel der ABC-Complex (Vector Laboratories Inc., Burlingame USA) angesetzt, da dieser vor Gebrauch mindestens 30 Minuten 18
im Kühlschrank ziehen muss. Folgendes kurzes Spülen für zwei mal 5 Minuten auf dem Schüttler in PBS ph 7,5 bereitete die Präparate auf eine erneute Inkubationszeit von einer Stunde bei Raumtemperatur mit dem ABC-Complex (Vector Laboratories Inc., Burlingame USA) vor. Danach folgte erneutes zweimaliges Spülen auf dem Schüttler in PBS ph 7,5. Während dieser Zeit wurde die Färbung mit 3,3 Diaminobenzidin (DAB) (Vector Laboratories Inc., Burlingame USA) vorbereitet, die etwas anders als im Vector Peroxidase Substrat Kit DAB SK- 4100 angesetzt wurde. Es wurden hierfür 5 ml H 2 O + 2 Tropfen Puffer + 4 Tropfen DAB-Stock + 2 Tropfen H 2 O 2 in ein Tropffläschchen gegeben. Nach mehrmaligem gutem Schütteln, um auch eine gleichmäßige Mischung garantieren zu können, wurden die Präparate damit benetzt und für etwa 10-12 Minuten im Dunklen entwickelt. Anschließend an die Färbung folgte die Alkoholreihe in umgekehrter Reihenfolge, mit Beginn für 10 Minuten in 100% Isopropanol (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schweiz), gefolgt von jeweils 5 Minuten in 100%, 90%, 80%, 70% und 50% Isopropanol-Lösung. 2.2.2.4 Spezieller 2. Antikörper zur CD 133 Antikörper-Färbung Auftragung der monoklonalen Mouse Antikörper für CD133 in einer Verdünnung von 1:250 auf den Gewebeschnitt und Inkubation von 12 Stunden bei 4 C über Nacht in einer Feuchtkammer, um das austrocknen des Präparates zu verhindern. Nach der Inkubationszeit wurden die Präparate für zwei mal 5 Minuten auf dem Schüttler in PBS gespült. Anschließend wird der zweite Antikörper, der mit einer biotinylierten Merrettichperoxidase konjugierten ist, aufgebracht, nachdem durch Zugabe von 2 ml Wasser die zu verwendende Lösung wiederhergestellt wurde. Dieser zweite Antikörper (Biotinylated Anti Mouse/Anti-Rabbit IgG) stammt aus einem Pferd und ist gegen Mäuse und Kaninchen IgG gerichtet. Die geeigneten Antikörpertiter wurden anhand von Verdünnungsreihen ermittelt. Ziel war dabei, eine möglichst klare und spezifische Anfärbung der Antigene bei geringstmöglicher Hintergrundfärbung zu erreichen. 19
2.2.2.5 Spezieller 2. Antikörper zur CXCR-4 Antikörper-Färbung Auftragung des polyklonalen Kaninchen Antikörpers CXCR-4 in einer Verdünnung von 1:1000 auf den Gewebeschnitt und Inkubation von 12 Stunden bei 4 C über Nacht in einer Feuchtkammer, um das austrocknen des Präparates zu verhindern. Nach der Inkubationszeit wurden die Präparate für zwei mal 5 Minuten auf dem Schüttler in PBS gespült. Anschließend wird der zweite Antikörper, der mit einer biotinylierten Merrettichperoxidase konjugierten ist, aufgebracht, nachdem durch Zugabe von 1 ml Wasser die zu verwendende Lösung wiederhergestellt wurde. Dieser zweite Antikörper (Biotinylated Anti-Rabbit IgG) stammt aus einer Ziege und ist gegen Kaninchen IgG gerichtet. Die geeigneten Antikörpertiter wurden anhand von Verdünnungsreihen ermittelt. Ziel war dabei, eine möglichst klare und spezifische Anfärbung der Antigene bei geringstmöglicher Hintergrundfärbung zu erreichen. 2.2.2.6 Spezieller 2.Antikörper zur IL-10-Rα Antikörper-Färbung Nach Auftragung des monoklonalen Maus IL-10-Rα-Antikörpers in einer Verdünnung von 1:200 auf den Gewebeschnitt und einer Inkubationszeit von 12 Stunden bei 4 C über Nacht in einer Feuchtkammer, um das austrocknen des Präparates zu verhindern. Nach der Inkubationszeit wurden die Präparate für zwei mal 5 Minuten auf dem Schüttler in PBS gespült. Anschließend wird der zweite Antikörper, der mit einer biotinylierten Merrettichperoxidase konjugierten ist, aufgebracht, nachdem durch Zugabe von 2 ml Wasser die zu verwendende Lösung wiederhergestellt wurde. Dieser zweite Antikörper (Biotinylated Anti Mouse/Anti-Rabbit IgG) stammt aus einem Pferd und ist gegen Mäuse und Kaninchen IgG gerichtet. Die geeigneten Antikörpertiter wurden anhand von Verdünnungsreihen ermittelt. Ziel war dabei, eine möglichst klare und spezifische Anfärbung der Antigene bei geringstmöglicher Hintergrundfärbung zu erreichen. 20
2.2.2.7 Spezieller 2. Antikörper zur IL-10-Rβ-Antikörper-Färbung Nach Auftragung des polyklonalen Ziegen IL-10-Rβ-Antikörpers in einer Verdünnung von 1:50 auf den Gewebeschnitt und einer Inkubationszeit von 12 Stunden bei 4 C über Nacht in einer Feuchtkammer, um das austrocknen des Präparates zu verhindern. Nach der Inkubationszeit wurden die Präparate für zwei mal 5 Minuten auf dem Schüttler in PBS gespült. Anschließend wird der zweite Antikörper, der mit einer biotinylierten Merrettichperoxidase konjugierten ist, aufgebracht, nachdem durch Zugabe von 1 ml Wasser die zu verwendende Lösung wiederhergestellt wurde. Dieser zweite Antikörper (Biotinylated Anti-Goat IgG) stammt aus einem Kaninchen und ist gegen Ziegen IgG gerichtet. Die geeigneten Antikörpertiter wurden anhand von Verdünnungsreihen ermittelt. Ziel war dabei, eine möglichst klare und spezifische Anfärbung der Antigene bei geringstmöglicher Hintergrundfärbung zu erreichen. 2.2.3 Gegenfärbung mit Mayer s Hämalaun 2.2.3.1 Prinzip Hämatoxylin ist ein natürlicher Farbstoff der aus dem Kernholz des Hämatoxylin campechianum gewonnen wird. Primär wird eine wässrige Lösung hergestellt, aus der dann entweder mit Ether oder auch mit Harnstoff das Hämatoxylin extrahiert werden kann. Alternativ kann es aber auch synthetisch hergestellt werden. Hämatoxylin ist ein schwach negativ geladener Farbstoff, erst durch den Zusatz von Alaunsalzen entstehen durch Komplexbildung die stark positiven Hämatoxylinlacke aus Hämatein und dem entsprechendem Metallion. Diese eignen sich besonders um basophile Strukturen anzufärben. Die Farbe der Hämatoxylinlacke ist abhängig von dem vorherrschendem ph-wert. Bei niedrigen ph-werten (unter ph 3) erscheint die Färbung rotbraun. Bei höheren ph-werten 21
kommt es zu der typischen blauvioletten Farbe, da man meistens in saurem Milieu färbt, führt man anschließend durch spülen mit Leitungswasser (Bläuen) diese ph- Wert Änderung herbei und erreicht so die typische blauviolette Färbung. Zusätzlich führt das Bläuen zu einer Fixierung der Färbung, da die Hämatoxylinlacke bei höherem ph schwerer löslich sind. 2.2.3.2 Ansatz Mayer s Hämalaun - Saures Hämalaun nach Mayer (Stammlösung): 1g Hämatoxylin in 1000ml Aqua dest. lösen, dann genau 0.2 g Natriumjodat und 50 g reinen Kalialaun zugeben. - Hämalaun Gebrauchslösung: Zu 100 ml der Stammlösung werden 5g Chloralhydrat und 0.1 g Zitronensäure zugefügt. Vor Gebrauch filtrieren. 2.2.3.3 Schritte der Gegenfärbung mit Mayer s Hämalaun Als ersten Schritt wurden die Präparate für 10 Minuten auf dem Schüttler unter mehrmaligem Wechsel in Wasser gespült. Zur Gegenfärbung wurde ein 50 %-ige Mayer s Hämalaun Lösung in destilliertem Wasser verwendet, da somit eine stärkere Kontrastierung zu der bräunlichen immunhistochemischen Färbung erreicht werden konnte. Nach einer Einwirkzeit von 15 Sekunden folgte das Bläuen unter fließendem Wasser für mindestens 5 Minuten. Anschließend folgte die Alkohol Reihe in steigender Konzentration. Zuerst für 5 Minuten in einer 50%- igen, 70%-igen, 80%-igen, 90-igen% und 100%igen Isopropanol Lösung, dann erneute 10 Minuten in der 100%-igen Isopropanol Lösung und abschließend für weitere 10 Minuten in Xylol. Abschließend wurden die Präparate mit Entellan ein gedeckelt. 22
2.3. Mikroskopische Auswertung Die Auswertung der Präparate erfolgte an dem Polarisationsmikroskop Axioplan 2 Imaging (Carl Zeiss Vision GmbH, Deutschland). Die Auswertung erfolgte durch zwei unabhängige Betrachter. Die Expressionsintensität der Präparate wurde anhand einer visuellen Skala von 0 bis 3 eingeteilt. Die Einteilung erfolgte entsprechend der höchsten Intensität der Expression. Die Einteilung wurde nach der primären unabhängigen Auswertung verglichen. Abbildung 2: Auswertungsbogen der immunhistochemisch gefärbten Präparate 23
Bei Abweichungen der Beurteilung wurden die Präparate erneut durch beide Betrachter unter Konsensbildung ausgewertet und die Einteilung endgültig festgelegt. Die primäre Übereinstimmung lag im Durchschnitt bei den Präparaten der kolorektalen Karzinome bei 82,4 % (n= 99) bei den Magenkarzinomen bei 78,6% (n= 129) und bei den Karzinomen der Fogt-4 Studie bei 83,1% (n= 221). 2.4 Statistik Die statistische Auswertung erfolgte mit Excel, die graphische Darstellung wurde mit GraphPad Prism Software durchgeführt. Die Ergebnisse wurden für die deskriptive Analyse als Median (Maximum, Minimum) dargestellt. Die Ergebnisse der einzelnen Gruppen wurden anhand des Chi-square-Tests verglichen. Die tumorspezifische Überlebenszeit wurde als Zeitintervall zwischen dem Operationsdatum und dem tumorbedingten Tod (Ereignisse) oder bis zum nicht tumorbedingten Tod bzw. bis zum letzten Beobachtungsdatum für Patienten die am Leben sind (zensierte Ereignisse) definiert. Die rezidivfreie Überlebenszeit wurde als Zeitintervall zwischen dem Operationsdatum und dem Diagnosedatum des Tumorrezidivs oder Tod (Ereignis) dargestellt. Die Überlebenskurven wurden nach der Kaplan-Meier-Methode (Kaplan 1958) dargestellt. Die Signifikanztestung zwischen den einzelnen Kurven wurde mit dem Long-Rank-Test (zweiseitige Fragestellung) durchgeführt. Ein P-Wert < 0.05 wurde als Signifikanzniveau festgelegt (2-seitig). 24
3. Ergebnisse 3.1 Charakterisierung der Patientengruppen 3.1.1 Kolorektale Karzinome Das Gesamtkollektiv der Patienten mit einem kolorektalen Karzinom bestand insgesamt aus 320 Patienten. Hiervon waren 152 (47,5%) Männer und die übrigen 168 Frauen (52,5%). Von diesem Gesamtkollektiv entwickelten 72 (22,5%) ein Rezidiv. Das mediane Alter lag zum Zeitpunkt der Diagnosestellung bei 65 Jahren. Bei den Patienten, die ein Rezidiv entwickelten, lag das mediane Alter bei 61 Jahren. Das Kollektiv der ausschließlich operierten Patienten setzte sich aus 61 Männern (62%) und 38 Frauen (38%) mit einem medianen Alter von 65 Jahren zusammen. Von diesem Kollektiv entwickelten insgesamt 8 (8%) ein Rezidiv. Von diesen waren zu gleichen Teilen jeweils 4 Frauen und 4 Männer. Das mediane Alter zum Zeitpunkt der Diagnosestellung lag bei dem Gesamtkollektiv bei 65 Jahren. Bei den Patienten die ein Rezidiv entwickelten lag das mediane Alter im Vergleich mit 60 Jahren niedriger. Das mediane Überleben bei Patienten mit einem operativ behandelten kolorektalen Karzinom lag bei 46 Monaten. Im Vergleich hierzu lag das mediane Überleben bei Patienten mit einem Rezidiv nur bei 35 Monaten. Das mediane rezidiv freie Überleben lag bei 20 Monaten. 25
Als erstes erfolgte die Darstellung der Gesamtüberlebensrate des Gesamtkollektivs der kolorektalen Karzinome in Abhängigkeit von den UICC- Stadien mittels der Kaplan-Meier Methode. Die Überlebenskurven sind in der Abbildung 3 gezeigt. Abbildung 3: Darstellung des Gesamtüberlebens an Hand der Kaplan-Meier-Kurve für Patienten mit kolorektalem Karzinom. Gesamtkollektiv in Abhängigkeit der UICC (-Stadien: UICC I (n = 64; gestrichene Kurve) und UICC II (n = 35; durchgehende Kurve). UICC: Union International Contre le Cancer; n: Größe der Teilstichprobe 26
Anschließend erfolgte die Analyse der rezidivfreien Überlebenszeit des Kollektivs der kolorektalen Karzinome in Abhängigkeit zu der Färbeintensität. Darstellung in der Abbildung 4. Die rezidivfreie 3- und 5-Jahres-Überlebensrate der Patienten im UICC Stadium I betrugen 95,6%, und 92,6%. Die rezidivfreien 3- und 5-Jahres-Überlebensraten der Patienten betrug im Stadium II jeweils 84,6%. Abbildung 4: Darstellung des rezidivfreien Überlebens an Hand der Kaplan-Meier-Kurve für Patienten mit kolorektalem Karzinom: Gesamtkollektiv in Abhängigkeit der UICC-Stadien: UICC I (n = 64; durchgehende) und UICC II (n = 35; gestrichelte Kurve) UICC: Union International Contre le Cancer; n: Größe der Teilstichprobe Das Kollektiv der zusätzlich zur Operation adjuvant chemotherapierten Patienten setzt sich aus 91 Männern (41%) und 130 Frauen (59%) mit einem medianen Alter von 65 Jahren zusammen. Von diesen entwickelten insgesamt 64 (29%) ein Rezidiv. Dies teilte sich auf in 38 Frauen (59%) und 26 Männer (41%). Das Mediane Alter zum Zeitpunkt der Diagnosestellung lag bei 65 Jahren. Bei den Patienten mit einem Rezidiv lag das mediane Alter im Vergleich mit 62,5 Jahren 27
bei Diagnosestellung niedriger. Das mediane Überleben des Patientenkollektivs lag bei 50 Monaten, wohingegen das mediane Überleben bei den Patienten mit Rezidiv lediglich bei 37 Monaten lag. Das mediane rezidivfreie Überleben lag bei 19 Monaten. Ebenfalls für das Kollektiv der Kolonkarzinome mit Chemotherapie erfolgte als erstes die Darstellung der Gesamtüberlebensrate des Gesamtkollektivs in Abhängigkeit von den UICC-Stadien mittels der Kaplan-Meier Methode. Die Überlebenskurven sind in der Abbildung 5 gezeigt. Abbildung 5: Darstellung des Gesamtüberlebens an Hand der Kaplan-Meier-Kurve für Patienten mit Kolonkarzinom mit Chemotherapie: Gesamtkollektiv in Abhängigkeit der UICC-Stadien: UICC II (n = 31), UICC IIIa (n= 18), IIIb (n= 107) und IIIc+IV (n = 62) UICC: Union International Contre le Cancer; n: Größe der Teilstichprobe Hinsichtlich der rezidivfreien Überlebenszeit der adjuvant therapierten kolorektalen Karzinome erfolgte das gleiche Vorgehen mit der Darstellung der rezidivfreien Überlebenszeit des Gesamtkollektivs in Abhängigkeit von den UICC-Stadien mittels der Kaplan-Meier Methode. Die Überlebenskurven sind in der Abbildung 6 gezeigt. 28
Abbildung 6: Darstellung des rezidivfreien Überlebens an Hand der Kaplan-Meier-Kurve für Patienten mit Kolonkarzinom mit Chemotherapie: Gesamtkollektiv (n=163) in Abhängigkeit UICC- Stadien: UICC II (n = 31), UICC IIIa (n= 18), IIIb (n= 107) und IIIc+IV (n = 62) UICC: Union International Contre le Cancer; n: Größe der Teilstichprobe Die rezidivfreie Überlebensrate betrug nach 3 und nach 5 Jahren im Stadium II 90% und 84,4%. Im Stadium IIIa jeweils nach 3 und nach 5 Jahren 100%. Im Stadium IIIb betrug die rezidivfreie Überlebenszeit nach 3 Jahren 75,4% und nach 5 Jahren 65,3%. In den zusammengefassten Stadien IIIc und IV betrug sie nach 3 und nach 5 Jahren 66% und 61,9%. 29