SOP_022_BioStat-Fermentation Inhalt Version erstellt am erstellt durch freigegeben durch Praktikum BioStat 110703001 03.07.11 Frank Eiden Inhalt: 1. Physiologie der Hefe Saccharomyces cerevisiae 2. Schüttelkolbenversuch / Versuchsbeschreibung (kurz) 1 / 6
1. Physiologie der Hefe Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae ist möglicherweise die am meisten untersuchte Hefe. Dies ist nicht nur eine Folge ihrer Bedeutung in der Industrie, wo sie in erster Linie zur Erzeugung von Alkohol in der Brennerei und Brauerei und als Biomasseproduzent in der Backhefeindustrie eingesetzt wird. Weitere Anwendungsgebiete dieser Zellen liegen in der Gewinnung von Geschmacks- und Aromastoffen, Enzymen, monoklonalen Antikörpern sowie in der Expression von Proteinen [HEYSE, 1995]. Aber auch ihre besondere Art der Glucose - Verstoffwechselung hat die Neugier mancher Wissenschaftler geweckt, so dass Saccharomyces cerevisiae zum Modellorganismus für die molekulargenetische Forschung an eukaryotischen Mikroorganismen geworden ist. Das kleine haploide Genom, die geringe Anzahl der Chromosomen sowie die unter Standardzuchtbedingungen erreichbare Generationszeit von nur 1,5 Stunden tragen mit dazu bei [SCHLEGEL, 1992]. In der Natur findet man Hefen an allen Standorten, an denen vergärbare, zuckerreiche Säfte frei werden: im Nektarsaft der Blüten und auf Blättern sowie auf reifen Früchten. Taxonomisch gehören die Hefen zur Abteilung der Pilze (Fungi) und zur Klasse der Schlauchpilze (Ascomycetes). Die weitere Einteilung der Hefen basiert im wesentlichen auf ihrer Morphologie und der Art ihrer Vermehrung. Die für Saccharomyces cerevisiae typische Art der asexuellen Vermehrung ist die Zellsprossung oder Knospenbildung. Die Sprosszellen können miteinander verbunden bleiben, oder sich völlig voneinander lösen. In Abbildung 1 ist schematisch das Querschnittsbild einer einzelnen Hefezelle dargestellt. Sie hat eine runde bis ovale Form und einen Durchmesser, der zwischen 6 und 14 μm liegt [HEYSE, 1995]. Die im Cytoplasma eingeschlossenen Organellen sind für die anabolischen und katabolischen Stoffwechselvorgänge sowie deren Energiekopplung notwendig. Nachfolgend sollen nur die im Rahmen dieser Arbeit interessierenden biologischen Grundlagen des Stoffwechsels der Hefen in komprimierter Form beschrieben werden. 2 / 6
Abb. 1. Schematische Darstellung einer Hefezelle Das Wachstumsverhalten von Saccharomyces cerevisiae ist typisch für Glucose -sensitive Hefen, bei denen die Glucoseaufnahme nicht über die Atmungsrate kontrolliert ist. Im Anschluss an die Glykolyse, die Umsetzung von Glucose zu Pyruvat, führt der Pyruvat - Stoffwechsel bei einem Überschuss an Glucose zu einer Bildung von Ethanol, anstelle in den Citratzyklus und die Atmungskette zu münden und dort unter Energiegewinnung zu CO2 abgebaut zu werden. Es handelt sich um eine Überlaufreaktion (Crabtree - Effekt), die beim Abbau der Überschüsse durch Wiederaufnahme des Ethanols verschwindet. Maßgebend für den vollständigen Abbau ist die verfügbare Atmungskapazität [FIECHTER, 1994; PRONK ET AL, 1996]. Diese begrenzte respiratorische Kapazität von Hefen der Gattung Saccharomyces ist in Abbildung 2 [nach SONNLEITNER und KÄPPELI, 1986] als Flaschenhals illustriert. Der als respiratorischer Flaschenhals bezeichnete Engpass in Abbildung 2 bestimmt den Weg der Kohlenstoffumsetzung zu Biomasse. Der oxidative Abbau der Glucose ist bevorzugt. Der reduktive Weg wird nur als Ausweg bei entsprechend hohem Glucoseangebot, und damit verbundener Überlastung der Respirationskapazität zugeschaltet. 3 / 6
Abb. 2. Erläuterung der Nutzung des Substrats Glucose bzw. Ethanol bei Hefen der Gattung Saccharomyces als respiratorischer Flaschenhals [nach SONNLEITNER und KÄPPELI, 1986]. Dabei wird das zwangsweise gebildete Ethanol ins Medium ausgeschieden. Dieses kann jedoch bei Unterschreitung der aktuellen Atmungskapazität über den oxidativen Weg von den Zellen verbraucht werden. Solange das Überangebot an Glucose nicht abgebaut ist, bleibt der überschüssige Ethanol unangetastet im Medium [FIECHTER,1994]. Hefen sind fakultativ anaerob, d.h. sie sind auch unter anaeroben Bedingungen lebens-, bzw. wachstumsfähig. Die Glucose wird dann rein reduktiv unter Bildung von Ethanol abgebaut. Bei dieser als alkoholische Gärung bezeichneten Kohlenstoffumsetzung kommt es zu einem nur geringen Wachstum der Hefen. Die Anhäufung des Ethanols im Medium fällt entsprechend stärker aus. Demzufolge werden für Hefen der Gattung Saccharomyces für den Umsatz der Kohlenstoffquellen in Biomasse drei verschiedene Stoffwechselwege unterschieden: oxidatives Wachstum auf Glucose reduktives Wachstum auf Glucose unter Bildung von Ethanol oxidatives Wachstum auf Ethanol 4 / 6
2. Biostatfermenterversuch / Versuchsbeschreibung - Komplexmedium herstellen - 1000ml Komplexmedium in den Biostatfermenter einfüllen - gewünschte Hefemenge hinzugeben (üblich: 1Packung) - Fermenter mit passendem Deckel verschließen - rote Schläuche vom Kryostat an den Fermenter schließen - Begasungsschlauch an die Begasungsöffnung im Deckel anbringen - Rührmotor für integrierten Rührer auf den Deckel oben draufdrehen - BlueInOne-Sensor über einen Schlauch auf eine Öffnung im Deckel befestigen - Programm BacVisSingle auf dem PC starten - kleinen roten Hebel für die Begasung runterdrücken - Bedinungseinheit (BioStat) einschalten und Begasungsrate wählen, sowie die Rührrate, und starten - Kryostat auf 30 C einstellen und starten 5 / 6
2. Anlage Erklärung der Bedienung erfolgt durch das beigestellt Personal. >>> Vergleiche auch SOP 10 und 17 <<< 6 / 6