HLA-Typisierung: - ohne Zweifel - noch dazu als Hochdurchsatz- Sequenzierung Christian Gabriel, Linz
Übersicht Kurze Einführung in die Immungenetik Bisherige Technologien Problemstellung Neue Technologie Umsetzung und Schwierigkeiten Ausblick
Eine kurze Einführung IMMUNGENETIK
MHC Wichtig für: die Erkennung Fremd und Selbst Antigenpräsentation Mehrere Klassen MHC I für die Erkennung virusinfizierter Zellen notwendig MHC I werden durch CD8 erkann MHC II werden durch CD4 Zellen Unterschiedliche Expression in verschiedenen Geweben.
Figure 3-21 part 2 of 2
Figure 3-23
Figure 3-22
Figure 5-17
Figure 5-16
Figure 3-26
Figure 5-12
MEDIZINISCHE BEDEUTUNG
Klinische Bedeutung des HLA-Systems Transplantationsmedizin -Knochenmark- und Stammzelltransplantation -Nierentransplantation Assoziation zwischen HLA-Antigenen und diversen Erkrankungen Abstammungsbegutachtung
Hauptaufgaben im Immungenetik Labor Typisierung der klassischen Transplantationsantigene: HLA-A, HLA-B, HLA-C Klasse I HLA-DRB1, DQB1 Klasse II Identifizierung und Differenzierung von Antikörpern (von Transplantationen, Transfusionen, Schwangerschaft)
HLA Nomenklatur DNA stille Substituierung non- coding Locus HLA- A*02I01I01I02IL Hauptgruppe/ Breite Spezifität /serologische Äquivalente Nebengruppe/ Allelzahl Suffix Suffix: L, S, C, A, Q, N.
Mismatch Nieren-Transplantation Patient MHC I HLA-A*02, 31 HLA-B*44, 56 HLA-C*01, 05 MHC II DRB1*01, 04 DQB1*03, 05 Spender MHC I HLA-A*02, 31 HLA-B*44, 56 HLA-C*01, 07 MHC II DRB1*01, 04 DQB1*03, 05
Mismatch Stammzell Transplantation Patient MHC I HLA-A*0201,3101 HLA-B*4402,5601 HLA-C*0102,0501 MHC II DRB1*0101,0401 DQB1*0301,0501 Spender Allele Mismatch MHC I HLA-A*0205,3101 HLA-B*4402,5601 HLA-C*0102,0501 MHC II DRB1*0101,0401 DQB1*0301,0501 Spender Antigen Mismatch MHC I HLA-A*2401,3101 HLA-B*4402,5601 HLA-C*0102,0501 MHC II DRB1*0101,0401 DQB1*0301,0501
Neue Allele IMGT/HLA Database ImMunoGeneTics http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/index.html
Vielfalt der Allele HLA Allele insgesamt 3,371 HLA Klasse I Allele 2,351 HLA Klasse II Allele 1,020 Andere non-hla Allele 106 25 36 6 2 71 238 451 782 438 43 310 216 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 1 HLA- A HLA- B HLA- C HLA- DRB1 HLA- DQB1 HLA- DRB3 HLA- DRB4 HLA- DRB5
METHODEN
HLA Typisierungsmethoden nach dem Verfahren -serologisch - molekularbiologisch (komplement-vermittelter Zytotoxizitätstest [Terasaki]) PCR-SSO (sequence-specific oligonucleotides) PCR PCR-SSP (sequence-specific primers) basierend Sequenzierung (sequencing-based typing, SBT) DNA-basiert nach Auflösungsgrad - niedrige Auflösung serologisch, molekularbiologisch= 2 stellig - hohe Auflösung molekularbiologisch = 4 stellig
Serologische HLA-Typisierung Komplement-vermittelter Zytotoxizitätstest positives Testergebnis lysierte Zellen negatives Testergebnis intakte Zellen
Nachteile der serologischen Typisierung Niedrigauflösend (low resolution) Hohe Fehlerrate Ergebnis abhängig von der Zellqualität Ergebnis für HLA-A, B und C?
PCR-SSP (sequence-specific primers)
PCR-SSO (sequence-specific oligonucleotides)
Sequenzierung (sequencing-based typing, SBT) R M Atria HLA B (generische Sequenzierung)
Sequenzierung (sequencing-based typing, SBT) Gruppenspezifische Sequenzierung 1 2 3 4 5 6 7 8 M Pos.1: *02 Pos.2: DQ3 Group 1 Pos.3: DQ3 Group2 Pos.4: *04 Pos.5: *05 Pos.6: *06 Pos.7: *0602,*0603 Pos.8: All HLA-DQB1
Sequenzierung (sequencing-based typing, SBT)
Amplifikationsregionen Klasse I Klasse II
Zeit, Menge und Ambiguities PROBLEMSTELLUNGEN
Sequenzierung (sequencing-based typing, SBT) 163.2=Y B*1801,5601 vs. B*1801,5502
Ambiguities Mutationen liegen außerhalb der sequenzierten Bereiche Exon 2 Exon 3 Exon 1 Exon 4 Polymorphic positions Core heterozygous sequence data Beispiel: HLA-B B*0702, 4402 B*0702, 4419N
Ambiguities A+B=D+E Beispiel: HLA-B B*0702, 4402 B*0720, 4416 B*0724, 4421
cis/trans Problematik TGGAGGGCSMGTGCGTGGA S = G und C M = A und T TGGAGGGCSMGTGCGTGGA Number of possible linkages = 2 n n=2; 4 Kombinationen n=4; 16 Kombinationen -------------SM------------- -------------GA-------------- -------------CT-------------- -------------GT-------------- -------------CA-------------- IUB Code K S W M Y R Bases G,T G,C A,T A,C C,T A,G
Workpackage 1. DNA Extraction Time * 3 h 2. Amplicon PCR 6h 3. Purification and Quality Control 3 h Verwandten-KM-Spender Serologische Typisierung SSP-Typisierung 4 digits I+II 4. EmulsionPCR (Cloning PCR) 5. GS Sequencing Run 6. GS Data Analysis 4 h 12 h 3 h 7. HLA Allele Call 2 h 8. Write Report 1 h Σ 34 h * approximative
Workflow Stammzell Transplantation 3-6 W Diagnose Familientypisierung SSP, Serologie Auswahl und Rückstellung od. Entnahme Transplantation kein Familienspender SBT Patient HLA- Typisierung Bestätigung Anmeldung zur Suche Im Register 1-6 M Spender werden geschickt und typisiert (SSP,SBT, Serologie) Auswahl und Rückstellung Oder Pre- Collection Collection / Konditionierung Transplantation
World Marrow Donor Association (WMDA) 45 Länder/ 60 Register, 35 Nabelschnurblut Register 12 000 000 Spender Zentrale Knochenmarkspender- Register Deutschland (ZKRD) European Marrow Donor Information System (EMDIS)
Register weltweit
Register in Deutschland
Neue vs. Laufende Suchen
Suchzeit im Register
Wie wir auf den GS-FLX kamen NEUE TECHNOLOGIEN
Next Generation Sequencing
Einsatzgebiet GS-FLX im HLA Register Typisierung Niedrigauflösend 4 digit (intermediate resolution) A,B,C,DRB1 und DQB1 9-10 Amplicons 100-200pts. Preis: Histogenetics 50-100Euro, GS-FLX 30-120? HSCT Typisierung Hochauflösend 4 digit Ambiguity-free A,B,C,DRB1 und DQB1 16-18 Amplicons Preis: 600Euro, GS-FLX 60-240Euro? 50-100pts.
Lösung durch genome sequencer
Genome Sequencer System.
Workflow: Überblick Prerequisites: Primer, PCR Protocol, Sample DNA Amplicon generation: fusion-primer PCR Emulsion PCR: Sequenz Lauf: Datenanalyse: ~cloning : ein Bead = ein Fragment one bead = ein Fragment = ein Read Assembling, Alignments, Identifikation
emulsion-pcr technical Particularities: Bead Type A Sequencing Primer Type B one microreactor > one bead > one fragment > one clone > one PCR > Sequencing Primer Type A Bead Type B 10 7 Microreactors/ml 10 7 Template Copies/bead
The PicoTiterPlate TM Device. technical Particularities: 70 x 75 cm Plate 60 x 60 cm Chip 1,6 Mio Wells 480 wells/mm² top view
The PicoTiterPlate TM Device. technical Particularities: Ø ~30 µm h ~ 55 µm vol ~ 75 pl cross section
Sequencing by Synthesis. technical Particularities: one microreactor > one bead > one fragment > one clone > Bead Type A Sequencing Primer Type B one sequence > Sequencing Primer Type A Bead Type B
The Pyro-Sequencing. Substrates, Enzymes: (DNA)n + dntp Polymerase (DNA)n+1 + PPi Sulfurylase 0,02-1,5 s APS + PPi adenosine 5 -phosphosulfate ATP 10.000 Photons/Nuc. Luciferin + ATP Luciferase Oxyluciferin + Light dntp / ATP Apyrase dnmp/amp + P
Signal Measurement and Primary Data Treatment. technical Particularities: Light Emission. 4095x4096 Pixel CCD ~ 9 (15µm) Pixel/well 32 Mbytes/image 6 Mio FPGA top view
Flowgram
Global Alignment Plot. The Variation Frequency Plot.
Arbeitsschritte Auswahl der Transplantation-relevant Loci Amplikonproduktion (PCR mit speziellen Primern) über diese Primer werden die Amplifikate an Beads gekoppelt in so hoher Verdünnung, dass pro Bead nur ein Amplifikat gebunden wird. diese Amplikon-beladenen Beads werden in eine Emulsion eingebracht. die Öltröpfchen dienen als Microreaktoren für die emulsion- PCR. nach der emulsion PCR sind die Beads gespickt mit geklonten Amplifikaten. die Beads werden gereinigt und mit den Amplifikaten einzeln in die Wells der PikoTiterplatte eingebracht. Innerhalb dieser Wells läuft dann die eigentliche Sequenzierreaktion ab.
Numbers of HLA Alleles HLA Class I Alleles 2,3 51 HLA Class II Alleles 1,0 20 HLA Alleles Other non-hla Alleles 3,3 71 10 6 Number of Confidential Alleles 7 HLA Class I Ge ne A B C E F G All 73 1,1 39 ele 9 21 42 3 15 2 s Pr 57 94 ote 3 2 ins 30 7 3 4 14 Nul 48 39 9 0 0 2 ls HLA Class I - Pseudogenes Ge ne H J K L P T U V W X All ele 12 9 6 5 4 0 0 3 0 0 s Pr ote 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ins Nul 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ls HLA Class II Ge DR DR DQ DQ DP DP D D DO DO ne A B A1 B1 A1 B1 MA MB A B All ele 3 s 69 7 34 95 27 13 2 4 7 12 9 Pr ote 2 ins 55 9 25 69 16 11 6 4 7 3 4 Nul 0 8 1 1 0 3 0 0 1 0 ls HLA Class II - DRB Alleles Ge DR DR DR DR DR DR DR DR DR ne B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 All 60 ele 1 50 13 18 3 2 1 1 8 s Pr 49 ote 0 40 7 15 0 0 0 0 7 ins Nul ls 3 0 0 3 2 0 0 0 0 Wells ø 50 µm Beads ø 44 µm
AUSBLICK
Vorraussetzungen und Routinefähigkeit des GS-FLX im Bereich HLA Automatisation der Amplicon PCR DNA Extraktion in 96 Well- Format DNA Messung im 96 Well- oder 384Well- Format Pro GS Lauf sind 1000 2000 Amplicons nötig Quantifizierung der Amplicons, Pooling Bioinformatik Programmierung der Präanalytik Rechenleistung Auswerte-Software
Haplotypen
Danksagung Roche applied sciences Penzberg Team Genomics der Blutzentrale Linz: Martin Danzer Johannes Pröll Helene Polin Katja Hofer Stephanie Stabentheiner Christa Hackl