Abbau von Gluten in alkoholfreien Getränken auf Getreidebasis durch Peptidasen 1 Benedict Schwarzl, Herbert Wieser, Peter Köhler, Lichtenberg-strasse 4, 85748 Garching 1 Gefördert von der Wiswsenschaftsgemeinschaft Gottfried-Wilhelm-Leibniz (WGL)
Gliederung Einleitung Zöliakie Gluten Analytik Methoden Glutenbestimmung Herstellung geeigneter Referenzen Gewinnung des Enzymextraktes Ergebnisse Glutengehalte der Getränke Verwendung der Referenzen Vorversuche zum Extrakt Behandlung der Getränke
Zöliakie - Definition Zöliakie: Lebenslange Intoleranz (Immunreaktion) gegen Speicherproteine (Gluten) aus Weizen, Roggen, Gerste und Hafer (?), die mit einer schweren Schädigung der Dünndarmschleimhaut (Zottenatrophie) einhergeht und zur Malabsorption von essentiellen Nährstoffen führt. Prävalenz: 1:100 1:300 (Verwandte 1. Grades: 1:10) normal Darmzotten zöliakiegeschädigt
Zöliakietoxische Proteine Auslöser: Glutamin- und prolinreiche Aminosäuresequenzen von - Gliadinen und Gluteninen (Weizen) - Secalinen (Roggen) - Hordeinen (Gerste) - Aveninen? (Hafer) Beispiele für Zöliakie auslösende Aminosäuresequenzen (Peptide): Position Sequenz Literatur A2(57-68) QLQPFPQPQLPY Arentz-Hansen et al (2000) A2(226 237) PSGQGSFQPSQQ Van de Wal et al (1998) Hor-a9 QQFPQPQQPFPPQQP Vader et al (2002) LMW17 (46-60) QQPPFSQQQQPLPQ Vader et al (2003)
Mechanismus Aufgrund des hohen Prolin-Gehaltes (11-29 %) sind Speicherproteine sehr resistent gegen den vollständigen Abbau durch Verdauungsenzyme Speicherproteine von Getreiden werden daher im Verdauungstrakt nur partiell abgebaut Restpeptide können in das intestinale lymphatische Gewebe eindringen Peptide werden dort durch Gewebe-Transglutaminase desamidiert Diese Peptide binden dann an antigenpräsentierende Zellen (APC) T-Zellen werden durch Peptide mit mehr als acht Aminosäuren stimuliert Schädigung der Dünndarmschleimhaut
Zöliakie - Symptome Erbrechen Durchfälle Blässe Wachstumsstörungen Wesensveränderungen Anämien Avitaminosen Muskelschwund Gewichtsverlust Knochenschmerzen Osteoporose Dermatitis herpetiformis
Gluten: Speicherproteine im Endosperm 10 15 % der Trockenmasse 80 % des Gesamtproteins 2D-Elektrophorese, reduzierte Mehlproteine von Weizen (Tkachuk, 1991) Endosperm
Gluten: Speicherproteine Einteilung in homologe Gruppen Gruppe M r x10-3 Weizen Roggen Gerste HMW 67-88 HMW-Glutenine HMW-Secaline D-Hordeine MMW 34-55 ω-gliadine ω-secaline C-Hordeine LMW α-gliadine - - 28-39 γ-gliadine γ-40k-secaline γ-hordeine (70) LMW-Glutenine γ-75k-secaline B-Hordeine HMW = hochmolekular Prolamine MMW = mittelmolekular Gluteline LMW = niedermolekular
Analytik Gluten Codex Alimentarius Standard for Gluten-Free Foods - Gluten definiert als 2 x Prolamin - Extraktion mit 60 %igem Ethanol ELISA Draft Revised Standard (2006) - Grenzwert: von Natur aus glutenfrei : 20 mg/kg Trockenmasse glutenfrei gemacht : 200 mg/kg Trockenmasse Draft Revised Standard (2008) - Grenzwert: von Natur aus glutenfrei : 20 mg/kg im Produkt glutenfrei gemacht : 100 mg/kg im Produkt (nationaler Beschluss) Beispiel: Speisekleie Weizen (ungekeimt) HPLC: 42800 mg/kg Gluten (Wieser) ELISA: 42100 mg/kg Gluten (Schwarzl)
Analytik Gluten Immunochemische Methode (ELISA): Skerritt-Test (Antikörper gegen ω-gliadin) R5 (Antikörper gegen die Aminosäuresequenz QQPFP) Sandwich Test auf Proteine (mind. zwei Epitope) Referenz: PWG-Gliadin Kompetitiv Test auf Peptide (ein Epitop) Referenz: Peptid mit QQPFP-Sequenz Probleme: hydrolysierte Proben, z.b. Bier, Malzextrakt
Methoden - Glutenbestimmung A: Sandwich-ELISA B: Kompetitiv-ELISA 1 1 2 S S S S 3 S = Enzym-Substrat P P P P P = farbiges Produkt S S S P P S 2 P P = Trägergebundener Antikörper = Enzym an Marker-Antikörper = Antigen (Gluten) = Antigen (QQPFP) mit Enzym
Alkoholfreie Getränke Bionade Fermentation von Gerstenmalz mit einem Bakterienstamm aus dem Kombucha-Pilz (Gluconobacter Oxidans) Stärke Malzzucker Gluconsäure Malztrunk Gerstenmalz, Hefezugabe bei 0 C Brottrunk Milchsäurevergorenes Brot aus Weizen und Roggen Hefe- und Bakterienkulturen
Arbeitsschritte Herstellung und Charakterisierung von Referenzen für den Immunoassay Bestimmung des Glutengehaltes der Getränke Herstellung und Charakterisierung von Peptidasenpräparaten Peptidasenbehandlung der Getränke
Methoden Referenzen Herstellung: Prolaminfraktionen aus Gersten-, Weizen- und Roggenmehlen Abtrennung von Albuminen / Globulinen Extraktion mit 60 %igem Ethanol Dialyse Gefriertrocknung Partialhydrolysate dieser Prolaminfraktionen Verdau mit Pepsin (E/S ratio: 1:200; ph = 1,8; t = 4h) und Trypsin (E/S ratio: 1:200; ph = 7,8; t = 4h) Zentrifugation, Überstand gefriergetrocknet
Methoden Vorversuche mit Referenzen Charakterisierung der Referenzen: Charakterisierung per HPLC (Absorptionsfläche) Bestimmung des Stickstoffgehaltes (Dumas) Berechnung des tatsächlichen Proteingehaltes (N x 5,7) Detektierbarkeit der Referenzen mit beiden ELISA-Tests Zusatzversuche in Getränken Wiederfindungsrate in den ELISA-Tests
Ergebnisse Vorversuche mit Referenzen HPLC: Hydrolysate Säule: Hyper-Clone 5µ ODS C18 Fließmittel: A: Wasser B: Acetonitril Gradient: 0 50 % 1,0 UV [210nm] 0,5 Hydrolysat Weizen Detektion: 1,0 UV [210nm] 0,5 0 UV 210 nm Hydrolysat Gerste 15 Zeit [min] 30 1,0 UV [210nm] 0,5 0 0 Hydrolysat Roggen 15 15 Zeit [min] Zeit [min] 30 30
Ergebnisse Vorversuche mit Referenzen Proteingehalt Prolamine Proteingehalt [%] Proteingehalt Hydrolysate Proteingehalt [%] Prolamin Gerste Prolamin Roggen PWG Prolamin 77 ± 0,4 86 ± 0,2 93 ± 0,5 Hydrolysat Gerste Hydrolysat Roggen Hydrolysat PWG 80 ± 0,2 67 ± 0,6 96 ± 3,2
Ergebnisse Referenzen Sandwich ELISA Tests Prolamingehalte der Referenzen (Konzentration je 1000 mg / kg; kalibriert mit PWG-Gliadin) mg / kg Prolamin 1000 500 0 1174 1122 404 Prolamine Gerste (PG) Prolamine Roggen (PR) PWG 1 1000 437 398 Partialhydrolysiertes PG Partialhydrolysiertes PR Partialhydrol. PWG
Ergebnisse Referenzen Kompetitiv ELISA Tests Prolamingehalte der Referenzen (kalibriert mit PWG-Gliadin, normiert auf 1000 mg / kg) mg / kg Prolamin 1000 500 0 1140 1048 629 Prolamine Gerste (PG) Prolamine Roggen (PR) PWG 1 1000 727 748 Partialhydrolysiertes PG Partialhydrolysiertes PR Partialhydrol. PWG
Ergebnisse Zusatzversuche Sandwich ELISA 50,0 25,6 25,0 20,7 0,0 2,3 "Saxon" PTH Gerste "Saxon" + PTH Kompetitiv ELISA mg / kg Prolamin 50,0 40,5 30,3 25,0 mg / kg Prolamin 7,8 0,0 "Saxon" PTH Gerste "Saxon" + PTH Kalibrierkurven: 1,2 0,9 100 80 60 Absorption Absorption 0,6 0,3 0 20 40 60 80 µg / kg 100 40 20 0 0 5 10 15 mg / kg 20
Ergebnisse Getränke Glutengehalte der Getränke Sandwich-ELISA a [mg / kg Gluten b,c ] Kompetitiv-ELISA a [mg / kg Gluten b,d ] Bionade < 4,0 (NWG) < 7,4 (NWG) Brottrunk 25,4 (± 1,2) 36,0 (± 2,2) Karamalz 20,9 (± 1,4) 32,3 (± 1,8) a Mittelwert aus drei Bestimmungen ± Standardabweichung; NWG = Nachweisgrenze b Glutengehalt berechnet aus Prolamingehalt x 2 c Kalibriert mit dem im Kit enthaltenen PWG d Kalibiriert mit Gerstenprolaminhydrolysat
Gliadinabbau während der Keimung Weizen, ungekeimt Weizen, gekeimt (7 d bei 30 C) Gliadine, ungekeimter Weizen (Mehl) Gliadine, gekeimter Weizen (Mehl) 10 20 30 40 time [min] Abs. 210 nm Abs. 210 nm 10 20 30 40 ω5 ω1,2 α time [min] γ
Keimung und Aufarbeitung KEIMUNG AUFARBEITUNG Weizen, Roggen und Gerste ungekeimtes / gekeimtes Getreide 3 Nassweichen (20 C, 70 % Luftfeuchte) und 2 Trockenweichen (13 C, 100 % Luftfeuchte) Keimung bis zu insgesamt 7 d (15 bzw. 30 C, 100 % Luftfeuchte) Aufarbeitung mit flüssigem Stickstoff behandeln und mit Mühle grob zerkleinern Gefriertrocknung mit Getreidemühle vermahlen Trennung nach Teilchengröße (0,2 mm). Mehl. Kleie Extraktion der Peptidasen mit wässrigem Na-Acetat-Puffer aus Kleie (250 mg Kleie mit 5 ml Extrahieren)
Keimung / Aktivität Getreideart: Roggen > Weizen > Gerste Keimzeit: Maximum = 7 Tage (15-30 C) Kornfraktion: Kleie > Mehl ph-wert: 3-9 (Maximum: 4,0 und 6,5) Temperatur: bis 60 C (Maximum 50-60 C) Stabilität: trockene Kleie: > ½ Jahr Lösung: mind. 8 Tage bei 5 C Substrat: intakte Proteine und Peptide (Hartmann et al., 2006)
Ergebnisse Kleie Vorversuche Behandlung von Hydrolysat Gerste Zusatz von 1 % Kleie-Extrakt auf peptisch tryptisches Hydrolysat von Gerstenhordein bei 50 C und ph 4,8 Messung nach 1 h, 5 h und 24 h Bestimmung mit Kompetitiv ELISA mg / kg Prolamin 60 40 20 0 Behandlung von Hydrolysat Gerste PTH 0 h PTH 1 h PTH 5 h PTH 24 h
Ergebnisse Behandlung der Getränke Behandlung von Brottrunk Behandlung von Karamalz mg / kg Prolamin 60 40 36 mg / kg Prolamin 40 32,3 20 0 20 9,51 < NWG < NWG 20 20 10,35 < NWG < NWG 0 PTH 20 ppm 0,0% 0,1% 1,0% Kleie PTH 20 ppm 0,0% 0,1% 1,0% Kleie Zugabemenge Extrakt 0 %, 0,1 % 1,0 % ph: 4,8 Temperatur: 50 C Dauer: 4 Stunden Referenz: Hydrolysat Gerste
Zusammenfassung Zum immunchemischen Nachweis von partiell abgebautem Gluten wurden als Referenzen die Prolamine und deren enzymatische Hydrolysate der zöliakietoxischen Getreidearten Weizen, Roggen und Gerste hergestellt und charakterisiert. Die drei Getreidearten sprechen in beiden ELISA-Tests gleich stark an. Zur Bestimmung von Glutenabbauprodukten (Peptiden) ist der Kompetitiv-Test deutlich besser geeignet als der Sandwich- Test. Der Gehalt an Gluten wurde in drei Getränken aus fermentiertem Getreide mit beiden ELISA-Tests bestimmt; mit Hilfe geeigneter Referenzen im Kompetitiv-Test wurden erstmals vergleichbare Daten ermittelt. Es konnte in beiden behandelten Getränken der Gehalt an zöliakietoxischen Peptiden bis weit unterhalb des Grenzwertes gesenkt werden.
Danksagung WGL Prof. Dr. Köhler Dr. Wieser meinem Arbeitskreis VIELEN DANK!