Microscopy in Cell Biophysics

Microscopy in Cell Biophysics Contrast Spatial and temporal resolution Environmental conditions Light Microscopy (200 nm) Brightfield Phasekontrast Fluorescence Advanced Electron Microscopy (1 nm) Scanning Transmission Scanning Probe Microscopy (AFM, STM) Rädler SS08 Biophysik der Zelle 1

Nobel prizes directly related to bioimaging 1901 W. C. Röntgen (Germany, 1845-1923) Discovery of X rays 1953 F. Zernike (Netherlands) Phase-Contrast Microscopy bright field phasencontrast (Zernike) 1986 Ernst Ruska (Germany, 1906-1988) Gerd Binnig (Germany) Heinrich Rohrer (Switzerland) Electron microscope and raster tunnel microscope, respectively 2003 Paul C. Lauterbur (USA) Sir Peter Mansfield (United Kingdom) for their discoveries concerning magnetic resonance imaging Rädler SS08 Biophysik der Zelle 2

Grundlagen: optisches Mikroskop Vergrößerung des Sehwinkels Δ: Tubuslänge Rädler SS08 Biophysik der Zelle 3

Optisches Mikroskop Objektiv 2-100x Okular 10-20x

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Immunhistochemie Anfärbung durch Elektroadsorption Schichtdicken ca. 10µm Rädler SS08 Biophysik der Zelle 7

Phase Contrast Microscopy bright field phase contrast Normaski DIC dark field Rädler SS08 Biophysik der Zelle 8

Abbesche Abbildungstheorie Entstehung eines Fourierbildes in der Brennebene einer Linse Darstellung der Hinund Rücktransformation durch Anordnung zweier Linsen Rädler SS08 Biophysik der Zelle 9

Optische Datenverarbeitung im Fourier-Raum Originalbild Bild mit Rasterpunkten Entfernung der periodischen Rasterpunkten durch Blende im Fourierbild Rädler SS08 Biophysik der Zelle 10

Das Phasenkontrastmikroskop 90 Grad verschoben gebeugtes Licht Objektiv Probe Phasenring ungebeugtes Licht Der Phasenring verschiebt das ungebeugte Licht um 90 Grad. Zusätzlich wird das ungebeugte Licht auch noch abgeschwächt, damit die Intensitäten der beiden interferierenden Komponenten ähnlich sind. Kondensor Ringblende Rädler SS08 Biophysik der Zelle 11

http://micro.magnet.fsu.edu/pri mer/java/darkfield/cardioid/ind ex.html Rädler SS08 Biophysik der Zelle 12

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Fluoreszenz Chromophore (Farbstoffe) enthalten große delokalisierte π- Elektronensysteme. Oft sind dies aromatische Ringe. Fluorescnece Intensity Fluorescein Stokes Shift is 25 nm 495 nm 520 nm Wavelength Rädler SS08 Biophysik der Zelle 14

Fluoreszenz Jablonski Termschema Singlet States Triplet States Vibrational energy levels S 2 Rotational energy levels Electronic energy levels T 2 ENERGY S 1 ABS FL I.C. IsC PH T 1 IsC S 0 [Vibrational sublevels] ABS - Absorbance S 0.1.2 - Singlet Electronic Energy Levels FL - Fluorescence T 1,2 - Corresponding Triplet States I.C.- Nonradiative Internal Conversion IsC - Intersystem Crossing PH - Phosphorescence Rädler SS08 Biophysik der Zelle 15

Fluoreszenzmikroskop Bogenlampe EPI-Beleuchtung Anregungsblende Anregungsfilter Okular Dichroitischer Spiegel Objektiv Emissionsfilter Rädler SS08 Biophysik der Zelle 16

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Beugung an einer kreisrunden Öffnung D! Lage des ersten Beugungsminimums " = 1, 22# min Rädler SS08 Biophysik der Zelle 18! D

Auflösungsbegrenzung durch Beugung: Für zwei selbstleuchtende Objekte ist der kleinste auflösbare Abstand Δx : $ x min = 0.61# " n # sin! Wobei λ die Wellenlänge und n sinα die numerische Apertur ist. (α: Öffnungswinkel der Linse) Rädler SS08 Biophysik der Zelle 19

Ölimmersion erhöht die numerische Apertur n = 1.5 Objective n = 1.52 n = 1.0 Air Oil n = 1.52 n = 1.52 Coverslip n=1.33 Water Specimen n=1.52 Rädler SS08 Biophysik der Zelle 20

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Wellencharakter massiver Teilchen: Rädler SS08 Biophysik der Zelle 22

Elektronen Mikroskop h h! = = p mv (de Broglie Beziehung) Elektronenbeschleunigung 2 m = e! U 1 2 v v = 2e!U m e "[ nm] = h 2m e e # U = 1.23 U V [ ] z.b. 100keV λ~3pm! Rädler SS08 Biophysik der Zelle 23

Transmission electron microscopy (TEM) Operates in vacuum Specimen usually fixed, embedded, sectioned, and stained with an electron-dense material typical specimen thickness 50nm Special techniques: Metal shadowing: visualize surface structures, cell components Cryoelectron: visualize unfixed, unstained samples Freeze fracture, freeze etch: visualize membrane interior Freeze etch: visualize cell interior Rädler SS08 Biophysik der Zelle 24

Transmission Electron Microscope (TEM) Rädler SS08 Biophysik der Zelle 25

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Scanning Electron Microscopy (SEM) Can visualize surfaces of tissues, cells, isolated cell parts Specimen is fixed and coated with thin layer of heavy metal Images secondary electrons, resolution = 10 nm Rädler SS08 Biophysik der Zelle 27

STEM Rädler SS08 Biophysik der Zelle 28

Drei Bildgebende Techniken im Vergleich A) REM B) opt. Mic. C) TEM Rädler SS08 Biophysik der Zelle 29

Negative staining and freeze fracture actin filaments Myosin molecules Rädler SS08 Biophysik der Zelle 30

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Helium-Ion Microscope He ++ : ion beam energie : mev The helium ion beam has a DeBroglie wavelength that is approximately 300 times smaller than an electron beam resulting in much less diffraction. Orion He-Ion Microscope (Zeiss) See low-z materials, like carbon nanotubes, with resolution and surface information unavailable from a typical SEM. Quelle: Zeiss Rädler SS08 Biophysik der Zelle 32

TEM Bilder sind Projektionen! Rädler SS08 Biophysik der Zelle 33

A deconvolution algorithm subtracts out-of plane image information using stacks of image data Rädler SS08 Biophysik der Zelle 34

Das Konfokale Mikroskop Laser Anregungsblende Anregunsfilter PMT Objektiv Emissions -filter Emissionsblende Rädler SS08 Biophysik der Zelle 35

Konventionelles Fluoreszenzmikroskop Konfokal Rädler SS08 Biophysik der Zelle 36

Two-Photon Excitation 1.5µm <P> mw P > MW => ps Pulse Virtual level Point-spread function! Rädler SS08 Biophysik der Zelle 37

Two photon excitation is spatially localized Because simultaneous absorption of two photons is required for excitation, the emission depends on the square of the intensity, rather than being linearly proportional. Single-photon excitation (488 nm) Two-photon excitation (900 nm) Femtosecond pulse train @ 80 MHz F 0 5 10 15 20 25I x Significant excitation occurs only in the focal volume (at normal imaging intensities - mw range).

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STED-Mikroskopie schlägt das Beugungslimit STED:Stimulated Emission Depletion Der Anregungsfokus wird maßgeschneidert. Rädler SS08 Biophysik der Zelle 40

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Electron tomography of vitrified cells is a noninvasive three-dimensional imaging technique that opens up new vistas for exploring the supramolecular organization of the cytoplasm. W. Baumeister (MPI Biochemie) Further reading: Macromolecular Architecture in Eukaryotic Cells Visualized by Cryoelectron Tomography SCIENCE VOL 298 (2002) p.1209 Rädler SS08 Biophysik der Zelle 42

Purification of cells and organells by flow cytometry Requires fluorescent tag for desired cell Rädler SS08 Biophysik der Zelle 43

Purification of cell parts Understanding the roles of each each cell component depends on methods to break open (lyse) cells and separate cell components for analysis Cell lysis is accomplished by various techniques: blender, sonication, tissue homogenizer, hypotonic solution Separation of cell components generally involves centrifugation Rädler SS08 Biophysik der Zelle 44

Cell fractionation by differential centrifugation Rädler SS08 Biophysik der Zelle 45

Organelle separation by equilibrium density-gradient centrifugation Rädler SS08 Biophysik der Zelle 46