Photoschaltbare Aminosäuren

Photoschaltbare Aminosäuren Synthese, photochrome Eigenschaften und Einbau in peptidische Grb2-S2 Antagonisten vorgelegt von Diplom-Chemikerin Beate Priewisch aus Berlin der Fakultät II - Mathematik und aturwissenschaften der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der aturwissenschaften - Dr. rer. nat. - genehmigte Dissertation Promotionsausschuß Vorsitzender: Prof. Dr. rer. nat. Thorsten Ressler 1. Berichterin: Prof. Dr. rer. nat. Karola Rück-Braun 2. Berichter: Prof. Dr. rer. nat. Siegfried Blechert Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 17. ktober 2006 Berlin 2006 D 83

Kurzzusammenfassung Der Einbau photoschaltbarer Elemente in Biomoleküle ermöglicht die Modulation ihrer Konformation und damit auch ihrer Aktivität durch Bestrahlung mit Licht. Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand die Entwicklung photoschaltbarer Phosphopeptide, die als Antagonisten der Grb2-S2 Domäne fungieren. Zur Modulation der Struktur und Funktion solcher Peptide wurden in dieser Arbeit neue photochrome ω-aminosäuren auf Azobenzolbasis entwickelt. Es konnte ein Verfahren zur effizienten Synthese elektronenarmer aromatischer itrosoverbindungen mit xon als xidans in einem zweiphasigen Lösungsmittelsystem entwickelt werden, mit dessen ilfe eine Vielzahl unterschiedlich substituierter Azobenzole in guten Ausbeuten zugänglich sind. Des weiteren konnte die Verwendung von Selendioxid als Katalysator zur wasserstoffperoxidvermittelten xidation aromatischer Amine gezeigt werden. In diesem Fall ließ sich die Produktselektivität über die Wahl des Lösungsmittels steuern. In einem thematisch abgegrenzten Teil wurden substituierte Azobenzole zur Untersuchung von molekularen Schaltvorgängen an berflächen aufgebaut und hinsichtlich ihrer photochromen Eigenschaften mittels UV/Vis- und 1 -MR-Spektroskopie untersucht. Auf der Grundlage der hierbei gewonnenen Erkenntnisse konnten neue azobenzolbasierteω-aminosäuren mit verbesserter thermischer Stabilität entwickelt werden, die ebenfalls hinsichtlich ihrer photochromen Eigenschaften charakterisiert wurden. Es konnte eine Gleichung zur Abschätzung der thermischen albwertszeit dieser Verbindungen bei 30 C in Dimethylsulfoxid anhand ihres Absorptionsmaximums gefunden werden. Die Anwendbarkeit dieser neuen Aminosäuren in der Festphasenpeptidsynthese konnte erfolgreich anhand der Synthese zyklischer Phosphopeptide gezeigt werden. Untersuchungen der photochemischen Eigenschaften eines zyklischen Peptides mittels UV/Vis- und 1 -MR-Spektroskopie zeigten die Übertragung des Schaltvorganges auf das Peptidrückgrat. i

Abkürzungsverzeichnis [α] 20 D δ ǫ λ λ iso λ maxe λ maxz ν φ θ τ 1/2 τ abs τ MR AB Abb. Ac Ac Äquiv. Ala AMPB APB Ar abs. Asn ATR Boc br. Bu c C C E C Z CS d D DCM spezifischer Drehwert chemische Verschiebung thermische Energie/ Wärme molekularer Extinktionskoeffizient Wellenlänge Wellenlänge der isosbestischen Punkte Wellenlänge maximaler Absorption des trans-isomers Wellenlänge maximaler Absorption des cis-isomers Wellenzahl Quantenausbeute Winkel thermische albwertszeit per UV/Vis-Spektroskopie ermittelte thermische albwertszeit per 1 -MR-Spektroskopie ermittelte thermische albwertszeit Azobenzol Abbildung Acetyl Essigsäure Äquivalente Alanin 4-(4 -Aminomethylphenylazo)benzoesäure 4-(4 -Aminophenylazo)benzoesäure Aryl absolutiert Asparagin Attenuated Total Reflectance tert.-butyloxycarbonyl breit Butyl Konzentration Celsius Anteil des trans-isomers im photostationären Zustand Anteil des cis-isomers im photostationären Zustand compound stability/ Stabilität der Verbindung Duplett day(s)/ Tag(e) Debye Dichlormethan iii

Abkürzungsverzeichnis DEPT DGF DGP DGT DIEA DIC dm DMA DMAE DMAP DMF DMS EDC DA EE EI ESI et al. Et 2 Et ev FAB Fmoc Fp fs g GDP ges. Gly Grb2 GTP h Cl CTU 2 2 Bt M PLC R-MS distortionless enhancement by polarization transfer/ verzerrungsfreie Verstärkung durch Polarisationstransfer dry gas flow/ Volumenstrom des Trockengases dry gas pressure/ Druck des Trockengases dry gas temperature/ Temperatur des Trockengases,-Diisopropylethylamin 1,3-Diisopropylcarbodiimid Dezimeter,-Dimethylacetamid,-Dimethylaminoethanol,-Dimethylaminopyridin,-Dimethylformamid Dimethylsulfoxid -Ethyl- -(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid ydrochlorid Desoxyribonukleinsäure Essigsäureethylester Elektronenstoßionisation Elektronensprayionisation et alii/ und andere Diethylether Ethanol Elektronenvolt fast atom bombardment/ Beschuß mit schnellen Atomen 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Schmelzpunkt Femtosekunde Gramm Guanosindiphosphat gesättigt Glycin growth factor receptor-bound protein 2/ Wachstumsfaktorrezeptorgebundenes Protein 2 Guanosintriphosphat hour/ Stunden Salzsäure -(1-6-Chlorbenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat Wasserstoffperoxid 1-ydroxybenzotriazol highest occupied molecular orbital/ höchstes besetztes Molekülorbital high performance liquid chromatograhpy/ ochleistungsflüssigchromatographie high-resolution mass spectrometry/ hochauflösende Massenspektrometrie iv

SQC z IR J k kat. kj l LA Lit. LM LUM Lys m M MCPBA Me MgS 4 Mz min ml mmol M MMCl MS MT m/z acl ac 3 a 2 W 4 nm MP MR PDB PDGF pk s Pmp ppm Pro ps heteronuclear single quantum coherence/ heteronukleare Einquantenkohärenzspektroskopie ertz Infrarotspektroskopie Kopplungskonstante Geschwindigkeitskonstante katalytisch Kilojoule Liter Lithiumaluminiumhydrid Literaturwert Lösungsmittel lowest unoccupied molecular orbital/ niedrigstes unbesetztes Molekülorbital Lysin Multiplett medium/ mittel molar m-chlorperbenzoesäure Methanol Magnesiumsulfat Megahertz Minuten Milliliter Millimol Molekülorbital Chlormethylmethylether Massenspektrometrie Methyltrioxorhenium Masse/Ladung normal atriumchlorid atriumhydrogencarbonat atriumwolframat anometer -Methylpyrrolidon nuclear magnetic resonance/ magnetische Kernresonanz Proteindatenbank platelet derived growth factor/ blutplättchenabgeleiteter Wachstumsfaktor Säurekonstante 4-(Phosphonomethyl)phenylalanin parts per million Prolin Pikosekunde v

Abkürzungsverzeichnis psi PSS PTK ptyr q R f R t R RT s Se 2 SG S2 S3 Sos SPPS t t Tab. TBAB TCTU TDL TFA TF Tyr UV Val Vis vs w pounds per square inch/ Pfund pro Quadratzoll photostationary state/ photostationäres Gleichgewicht Phosphotyrosinkinase Phosphotyrosin Quartett Retentionsfaktor Retentionszeit goodness of fit/ Bestimmtheitsmaß Raumtemperatur Singulett strong/ stark Sekunde Selendioxid Schutzgruppe src homology 2 domain/ Src-omologie 2 Domäne src homology 3 domain/ Src-omologie 3 Domäne son of sevenless (Drosophilia-Mutante) solid phase peptide synthesis/ Festphasenpeptidsynthese tertiär Triplett Tabelle Tetrabutylammoniumbromid -(1-6-Chlorbenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorborat trap drive level Trifluoressigsäure Tetrahydrofuran Tyrosin ultraviolett Valin visible/ sichtbar very strong/ sehr stark weak/ schwach vi

Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Kurzzusammenfassung Abkürzungsverzeichnis i iii 1 Einleitung 1 2 Zielsetzung 3 3 Aromatische itrosoverbindungen 5 3.1 Reduktion und in situ xidation....................... 6 3.2 Katalytische xidationen........................... 8 3.3 xidationen mit xon............................. 11 3.3.1 etero-diels-alder-reaktionen.................... 14 4 Azobenzole 17 4.1 Generelle photochrome Eigenschaften.................... 18 4.2 Azobenzole als molekulare Schalter an berflächen............ 21 4.2.1 Synthese der Azobenzole 24-30................... 23 4.2.2 Photochrome Eigenschaften der Azobenzole 24-29........ 23 4.2.3 Kristallstrukturen der Azobenzole 25 und 26............ 25 4.3 Photoschaltbareω-Aminosäuren....................... 27 4.3.1 Synthese und photochrome Eigenschaften der Aminosäuren 33-40 27 4.3.2 Synthese derω-aminosulfonsäure 41................ 31 4.3.3 Der meta-effekt............................. 31 4.3.4 Berechnete Strukturen der Aminosäuren 37, 40 und 44...... 37 4.3.5 Zusammenhang zwischen der Lage des Absorptionsmaximums und der thermischen Stabilität.................... 40 4.4 Ullmann-Reaktionen.............................. 43 4.4.1 ptimierung der Kupplungsbedingungen............. 44 4.4.2 -Arylierung von Aminosäuren................... 46 5 Photoschaltbare peptidische Grb2-S2 Antagonisten 51 5.1 Die Rolle der S2-Domänen in der Signaltransduktion.......... 51 5.2 Die Grb2-S2-Domäne............................. 52 5.3 Phosphotyrosinbausteine und Analoga................... 55 5.3.1 Synthese des Pmp........................... 55 5.4 Synthese peptidischer Grb2-S2 Antagonisten............... 57 5.4.1 Zyklische Peptide............................ 57 5.4.2 Synthese des linearen Peptides 77.................. 60 vii

Inhaltsverzeichnis 5.4.3 Synthese der photochromen zyklischen Peptide.......... 64 6 Zusammenfassung und Ausblick 75 6.1 Aromatische itrosoverbindungen...................... 75 6.2 Azobenzole als molekulare Schalter an berflächen............ 77 6.3 Photochromeω-Aminosäuren......................... 77 6.4 Photochrome Peptide.............................. 80 7 Experimenteller Teil 83 7.1 Methoden und Geräte............................. 83 7.2 Versuche zu Kapitel 3: itrosoverbindungen................ 86 7.3 Versuche zu Kapitel 4: Azobenzole...................... 99 7.3.1 Azobenzole als molekulare Schalter an berflächen........ 99 7.3.2 Photoschaltbareω-Aminosäuren................... 103 7.3.3 Ullmann-Kupplungen......................... 116 7.4 Versuche zu Kapitel 5: Photoschaltbare Peptide............... 128 7.5 Untersuchung der photochromen Eigenschaften.............. 142 7.6 Kristallographische Daten und Strukturverfeinerung für trans-25.... 164 7.7 Kristallographische Daten und Strukturverfeinerung für trans-26.... 166 Spektrenanhang 169 Abbildungsverzeichnis 181 Tabellenverzeichnis 183 Literaturverzeichnis 185 viii

1 Einleitung Peptide und Proteine spielen eine wichtige Rolle in vielen physiologischen Vorgängen von enzymatischen Prozessen bis zum Informationstransfer zwischen Zellen. Die biologische Funktion eines Proteins wird nicht nur durch die Primärstruktur, die Sequenz der Aminosäuren, sondern auch durch seine dreidimensionale Struktur bestimmt. Daher besteht im inblick auf das rationale Design neuer Peptide oder Peptidomimetika besonders vor dem intergrund der Entschlüsselung des menschlichen Genomes ein großes Interesse am Verständnis der Faltungsprozesse, unter denen ein Protein seine dreidimensionale Struktur einnimmt. Ein Versagen dieser Prozesse kann zu schwerwiegenden Erkrankungen führen; eine fehlerhafte Proteinfaltung scheint Auslöser der Alzheimer-Erkrankung und der sog. Prionenerkrankungen wie der Creutzfeldt-Jakob- Krankheit zu sein. 1 Das Phänomen der korrekten Faltung eines Proteins in seine native Konformation illustriert das sogenannte Levinthal-Paradoxon: 2 Für ein Protein einer vergleichsweise geringen Länge von 150 Aminosäuren, von denen jede nur zwei konformationelle Zustände einnehmen könnte, wäre die Gesamtzahl der möglichen Konformationen des gesamten Peptides n=2 150. Unter der Annahme, daß die Konformationsänderung einer Aminosäure eine Zehntelpikosekunde in Anspruch nimmt, würde eine rein zufällige Suche des Proteines nach der günstigsten Konformation ( random search ) im ungünstigsten Fall 2 150 10 13 s, also 4.53 10 24 Jahre einnehmen. Diese Zahl ist Größenordnungen höher als das Alter der Erde (4.55 10 9 Jahre) oder sogar des Universums (13.7 10 9 Jahre). Umso erstaunlicher ist es, wie viele Proteine innerhalb von Sekunden oder sogar Millisekunden in ihre native Konformation falten. ffenbar haben sich im Laufe der Evolution hocheffiziente Mechanismen zur Proteinfaltung entwickelt, die bis heute allerdings noch nicht detailliert verstanden sind. In den letzten Jahren sind verschiedene physikalische Techniken wie z. B. die Infrarotspektroskopie mittels Lasertechnik so weit entwickelt worden, daß sie eine Echtzeit-Beobachtung von biologischen Prozessen im Femtosekunden-Bereich erlauben. Die erausforderung ist nun die gezielte Initialisierung dieser Prozesse im anosekundenbereich. 3 Fundamentale biologische Prozesse wie die Photosynthese oder der Sehprozeß werden durch Licht gesteuert. Ein weiteres Beispiel ist die lichtinduzierte Morphogenese von Pflanzen, die beispielsweise die Samenkeimung, die Synthese von Chlorophyll oder die Blütenbildung umfaßt. In all diesen Prozessen induziert ein Chromophor (Photoschalter) durch Lichtabsorption eine Reihe physikalischer und chemischer Umwandlungen in seiner Umgebung. 4 Unter Photochromismus versteht man die lichtinduzierte reversible Änderung zwischen zwei Zuständen eines Moleküls, die unterschiedliche Absorptionsspektren besitzen. 5 Ein typischer photochromer Prozess ist die cis-trans-isomerisierung von Doppelbindungen, bei der die Änderung des Absorptionsverhaltens mit einer signifikanten Änderung der Molekülgeometrie einhergeht. Das prominenteste Beispiel ist sicherlich die Photoisomerisierung des 11-cis-Retinals zum all-trans-isomer als Primärreaktion des Sehprozesses. 6 1

1 Einleitung hν 11-cis-Retinal all-trans-retinal Abb. 1.1: Lichtinduzierte Isomerisierung des 11-cis-Retinals ach dem Vorbild der atur kann über den Einbau eines artifiziellen Photoschalters in das Rückgrat eines Peptides oder Proteins durch die Isomerisierung des Chromophores die Konformation des Peptides und damit eventuell auch seine Funktion durch Licht moduliert werden. 7 Da durch die moderne Lasertechnologie Licht der gewünschten Wellenlänge und Intensität mittlerweile mit sehr hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung eingesetzt werden kann, eignen sich diese Methoden auch zur Untersuchung der komplexen Vorgänge in lebenden Zellen. ierüber können neue Einblicke in den Prozeß der Proteinfaltung gewonnen werden. 2

2 Zielsetzung Fundamentale Prozesse im Inneren eukaryotischer Zellen wie die Genexpression, der Zellzyklus oder der Zellstoffwechsel werden durch externe Signale gesteuert. Die Signaltransduktion, die Weiterleitung von Signalen aus dem extrazellulären Raum an den Zellkern, spielt eine entscheidende Rolle in der Regulation des Zellzykluses. Das Wachstumsfaktor-Rezeptor-gebundene Protein 2 (growth factor receptor-bound protein 2/ Grb2) ist ein Adapterprotein, dessen S2 Domäne phosphorylierte Tyrosine an den zytoplasmatischen Domänen des Rezeptors erkennt. Es spielt eine wichtige Rolle in der Aktivierung der Ras-Signaltransduktionskaskade, über die Zellwachstum, Zelldifferenzierung und Apoptose gesteuert werden und die an der Entstehung von Tumoren beteiligt ist. 8 Zyklische Peptide mit einemβ-turn um das Bindungsmotiv ptyr-val-asn-val zeigen eine hohe Affinität gegenüber dieser S2-Domäne. 9 Die Integration dieses Bindungsmotivs in ein zyklisches Peptid, dessen Rückgrat durch eine photochrome Aminosäure modifiziert ist, sollte bei geeigneter Ringgröße ein An- und Ausschalten des β-turns und somit der Aktivität des Antagonisten ermöglichen. Um einen möglichst großen biologischen Effekt durch den Schaltvorgang zu erzielen, sollte die lichtinduzierte Isomerisierung des Chromophores mit einer deutlichen Änderung der Molekülgeometrie verbunden sein. Die Isomerisierung von Azobenzolen erfüllt diese Ansprüche (Abbildung 2.1). 10 Moroder et al. konnten unter Verwendung der photochromenω-aminosäure 4-(4 -Aminomethylphenylazo)benzoesäure (AMPB) zyklische Peptide als Modell des Enzymes Thioredoxinreduktase synthetisieren, deren Konformation und Redoxaktivität sich durch die Isomerisierung des Photoschalters modulieren läßt. 11 hν hν', 1.0 nm 0.59 nm C 2 2 C 2 2 2 Abb. 2.1: Lichtinduzierte Isomerisierung und Retrosynthese der photochromen Aminosäure AMPB Da der Schlüssel zu einer erfolgreichen Synthese solcher Aminosäuren in der Darstellung der itrosoverbindung liegt, mußte zuerst eine einfache Methode zur Darstellung unterschiedlich substituierter itrosoarene erarbeitet werden. In einem thematisch abgegrenzten Teil sollten unter Verwendung dieser itrosoverbindungen Azobenzole mit Reportergruppen wie itrilen oder Estern synthetisiert werden, die eine Untersuchung von Elementarprozessen in molekularen Schaltern an 3

2 Zielsetzung berflächen mittels diverser physikalischer Methoden ermöglichen. Die photochromen Eigenschaften dieser Verbindungen sollten UV/Vis- und MR-spektroskopisch untersucht werden, um ein besseres Verständnis der Substituenteneinflüsse zu erlangen. Auf der Grundlage der hierbei gewonnenen Erkenntnisse sollten neue azobenzolbasierte ω-aminosäuren mit verbesserten photochromen Eigenschaften entwickelt werden. Diese sollten mit ilfe eines auf die Chromophore abgestimmten Syntheseprokolls in zyklische Peptide eingebaut werden, die als photoschaltbare Grb2-S2-Antagonisten ein Studium der Faltungsprozesse und eine Modulation der Wechselwirkung mit der Grb2-S2 Domäne erlauben. Y Asn Val Val ptyr Pro X hν hν', Asn Val ptyr Y Val Pro X X, Y: weitere Aminosäuren als Spacer Abb. 2.2: Modell der photoschaltbaren Grb2-S2 Antagonisten 4

3 Aromatische itrosoverbindungen Azobenzole finden seit mehr als 100 Jahren eine breite Anwendung als Farbstoffe und Indikatoren. Die hierfür verwendeten Substanzen werden im allgemeinen durch Azokupplung eines Diazoniumsalzes mit einem Kupplungspartner unter elektrophiler aromatischer Substitution von Wasserstoff hergestellt. Diese Methode liefert ausgezeichnete Ausbeuten mit Diazoniumsalzen, die stark elektronenziehende Substituenten in para-stellung tragen und sehr elektronenreichen Kupplungspartnern (ydroxy- und Aminoaromaten), sie ist jedoch auf dieses Substitutionsmuster beschränkt. 12 Über die Reduktion von itroaromaten oder die xidation von Arylaminen sind Azobenzole z. T. in exzellenten Ausbeuten zugänglich, diese Methode eignet sich jedoch nur zur Synthese symmetrisch substituierter Azobenzole. Im Bezug auf die Wahl der Substituenten stellt die Mills-Kupplung von itrosoarenen mit Arylaminen den breitesten synthetischen Zugang zu Azobenzolen dar (siehe Abbildung 3.1). 13 Der Schlüsselschritt ist hier die Synthese der itrosoverbindung. Sowohl aromatische als auch aliphatische itrosoverbindungen zeichnen sich durch eine hohe Reaktivität aus, deren Ursache in der geringen Energiedifferenz zwischen ihrem höchsten besetzten (M) und dem niedrigsten unbesetzten Molekülorbital (LUM) liegt. Sie gehen daher eine Vielzahl präparativ potentiell nützlicher Reaktionen wie Additionen, Isomerisierungen oder Redoxreaktionen ein. Abbildung 3.1 zeigt beispielhaft einige dieser Reaktionen. eben der in der vorliegenden Arbeit vielfach genutzten Mills-Kondensation mit Arylaminen zu Azobenzolen gehen itrosoverbindungen elektrocyclische Reaktionen wie En-Reaktionen mit Alkenen 14 oder [2+2]- bzw. [4+2]-Cycloadditionen ein. 15,16 Als elektrophile Carbonylanaloga werden sie in Additionsreaktionen eingesetzt: Beispielsweise erhält man durch Umsetzung von itrosoverbindungen mit Diazomethan itrone 17 und mit Grignard-Reagenzien substituierte ydroxylamine 18. Ein aktuelles Forschungsgebiet ist die enantioselektive itroso-aldol-reaktion zur α-aminierung oder α-xygenierung von Carbonylverbindungen. 19 Auch als Radikalfänger werden itrosoverbindungen verwendet. 20 Die hohe Reaktivität bedingt jedoch auch eine Vielzahl von ebenreaktionen, die die Darstellung und Reinigung der redoxaktiven itrosoverbindungen oft komplizieren. bwohl eine Vielzahl präparativer Methoden existiert, sind diese selten auf ein breites Spektrum von itrosoverbindungen anwendbar. 21 Prinzipiell sind itrosoarene durch die xidation von Anilinen oder die Reduktion von itrobenzolen zu ydroxylaminen, die in situ mit Eisen(III)chlorid 22 oder tert.-butylhypochlorid 23 oxidiert werden, zugänglich (siehe Abbildung 3.2). ierbei entstehen durch weitere Reduktion der ydroxylamine Arylamine als ebenprodukte, die durch die vergleichsweise milden xidationsmittel Eisen(III)chlorid oder tert.-butylhypochlorid nicht zu den itrosoverbindungen reoxidiert werden können. Weitere ebenprodukte sind Azoxybenzole durch Kondensation der itrosoverbindungen mit den ydroxylaminen und teilweise auch Azobenzole aus Arylaminen und itrosoverbindungen. Die Produktverteilung 5

3 Aromatische itrosoverbindungen 2 C R R R' R'MgCl R R' C 2 2 2 R' R R R R' R R' R R Abb. 3.1: itrosoverbindungen in der organischen Synthese (nach Adam et al. 14 ) ist abhängig von den Reaktionsbedingungen; Lösungsmittel, p-wert, Reaktionszeit und Temperatur müssen daher sorgfältig gewählt werden. R R 2 x x x 2 Red Red Red R R R R R R Abb. 3.2: Redoxreaktionen aromatischer itrosoverbindungen 3.1 Reduktion und in situ xidation Die Synthese der photoschaltbaren ω-aminosäure 4-[4 -(9-Fluorenylmethoxycarbonylaminomethyl)phenylazo]benzoesäure (Fmoc-AMPB-) wurde von Chmielewski et al. bzw. Moroder et al. durch Mills-Kupplung der aus der itroverbindung dargestellten itrosoverbindung mit (9-Fluorenyl)methyl-4-aminobenzylcarbamat realisiert (Schema 3.3). 22 Ihre Synthesen sind in Abbildung 3.3 dargestellt. 6

3.1 Reduktion und in situ xidation Chmielewski et al. 2 2 1) FmocSu, DIEA, 92% 2) 2, Pd/C, 80% Fmoc 1) Li t Bu, 60% 2) Zn, 4 Cl 3) FeCl 3 t Bu 2 C 2 1) Ac 2) p-ts 67% 1 Fmoc C 2 Cl 2 Moroder et al. 2 2 FmocSu, DIEA C 3 C, 76% Fmoc 1) Zn 2) FeCl 3 2 C 2 Ac 11% 1 Fmoc C 2 2 C 2 1 Die Ausbeute beinhaltet auch die Darstellung der itrosoverbindung, die in der zitierten Arbeit nicht separat angegeben wurde. Abb. 3.3: Literaturbekannte Synthesen der Aminosäure Fmoc-AMPB- nach Chmielewski 22 Moroder 24 und Die Darstellung der itrosoverbindung 2 wurde daher zunächst nach Chmielewski über die Reduktion der itroverbindung und anschließende in situ xidation des ydroxylamins erprobt. Die Umsetzung des 4-itrobenzoesäurechlorides mit Lithiumtert.-butylat in TF nach einer Vorschrift von Standaert ergab den 4-itrobenzoesäureester 1 in einer Ausbeute von 86%. 25 Dieser wurde in Ethylenglykolmonomethylether mit Zink unter Zusatz von Ammoniumchlorid partiell zum ydroxylamin reduziert. ier war eine sorgfältige dünnschichtchromatographische Kontrolle der Reaktion erforderlich, um den optimalen Zeitpunkt zu bestimmen, an dem die in situ xidation durch Zugabe von Eisen(III)chlorid bei 0 C gestartet werden konnte. In einem Maßstab von 22 mmol konnte die itrosoverbindung 2 nach chromatographischer Reinigung, die zur Abtrennung des ebenproduktes 4-Aminobenzoesäure-tert.-butylester erforderlich war, in einer Ausbeute von 70% erhalten werden. Dieses Ergebnis ließ sich jedoch in größeren Ansätzen nicht reproduzieren; hier kam es teilweise zur Bildung erheblicher Anteile des Azoxybenzoles (siehe Abbildung 3.2). Daher wurde im folgenden die xidation von Arylaminen zur Darstellung aromatischer itrosoverbindungen untersucht. Cl 2 Li t 1) Zn, Bu 4 Cl 2 t 2) FeCl Bu 3 TF, RT t Bu 70% 16 h, 86% 1 2 Schema 3.1: Synthese des 4-itrosobenzoesaeure-tert.-butylesters 2 7

3 Aromatische itrosoverbindungen 3.2 Katalytische xidationen och immer stellt die kontrollierte xidation organischer Verbindungen eine erausforderung dar, da partiell oxidierte Produkte oft deutlich oxidationsempfindlicher als ihre Vorläufer sind. Ein Beispiel hierfür sind Alkohole, die wesentlich leichter als die entsprechenden Alkane oxidiert werden. Daher ist eine genaue Auswahl der xidanzien wie auch der Reaktionsbedingungen erforderlich, wenn eine selektive xidation mit hohen Ausbeuten erzielt werden soll. Gerade in der Synthese von substituierten itrosobenzolen als Vorläufer für unsymmetrisch substituierte Azobenzole bieten oxidative Methoden jedoch einen entscheidenden Vorteil: Die hierbei entstehenden ebenprodukte (itro- und Azoxybenzole) sind unter den Reaktionsbedingungen der anschließenden Kondensation zum Azobenzol inert, so daß die oft instabilen und karzinogenen itrosobenzole ohne weitere Reinigung eingesetzt werden können und diese erst nach der Kondensation auf der Stufe des stabilen Azobenzoles erfolgen kann. Die xidation von Anilin zu itrosobenzol mit ilfe der nach ihm benannten Säure (Peroxymonoschwefelsäure) beschrieb Caro bereits 1894. 26 Weitere stöchiometrische Verfahren verwenden bspw. Peressigsäure, meta-chlorperbenzoesäure (MCPBA) oder Kaliumpermanganat. 21 Zur erstellung der Persäuren wird Wasserstoffperoxid als xidationsmittel verbraucht. Der direkte Einsatz von Wasserstoffperoxid in xidationsreaktionen hat daher Vorteile gegenüber der Verwendung von Persäuren: Da Wasser als ebenprodukt bei der xidation gebildet wird, wird die Reinigung der Produkte erheblich erleichert im Vergleich zur Abtrennung der Carbonsäuren, die als ebenprodukte bei der xidation mit organischen Persäuren entstehen. Des weiteren enthält Wasserstoffperoxid bezogen auf das Molekulargewicht einen sehr hohen Gehalt an aktivem Sauerstoff (47%), weshalb wasserstoffperoxidvermittelte Reaktionen vielmals ökonomischer und umweltfreundlicher sind. Wasserstoffperoxid ist jedoch im Vergleich zu organischen Persäuren kinetisch deutlich inerter, daher erfordern fast alle Umsetzungen den Einsatz eines geeigneten Katalysators, der die Aktivierungsenergie des Wasserstoffperoxides herabsetzt ohne im Gegenzug den radikalischen Zerfall zu beschleunigen. 27 Seit gut zehn Jahren werden katalytische Verfahren zur xidation von Anilinen zu itrosobenzolen mit Wasserstoffperoxid untersucht: Mit frühen Übergangsmetallen wie Wolfram oder Molybdän bildet Wasserstoffperoxid Peroxo- oder ydroperoxymetallspezies, in denen der Sauerstoff einen elektrophileren Charakter als im Wasserstoffperoxid besitzt und daher leichter auf den Stickstoff des Amines übertragen wird. 28 30 Auch Methyltrioxorhenium (MT) eignet sich als Katalysator zur selektiven xidation diverser Aniline. 31 Der Schlüssel zu einer erfolgreichen Synthese liegt bei diesen Methoden in der Abtrennung der itrosoverbindung aus der wäßrigen Phase, in der das xidationsmittel und das Amin bzw. das ydroxylamin vorliegen. Wird diese Abtrennung gewährleistet, so kann die Bildung der entsprechenden itro-, Azo- und Azoxyverbindungen als ebenprodukte minimiert werden (vgl. Abbildung 3.2 auf Seite 6). Je nach Löslichkeit der itrosoverbindung können die xidationen im homogenen Medium (Wasser oder Methanol/Wasser) oder aber in einem zweiphasigen System aus Wasser und einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel wie Toluol, Dichlormethan oder Petrolether durchgeführt werden. 8

3.2 Katalytische xidationen Als Modell zur Erprobung dieser Methoden wurde der kommerziell erhältliche 4-Aminobenzoesäuremethylester 3 gewählt, da dieser sich als Vorläufer zur Synthese von photoschaltbaren ω-aminosäuren auf Azobenzolbasis eignet und die Estergruppierung selbst oxidationsstabil ist. Zum Screening der katalytischen xidationsbedingungen wurden jeweils 100 mg (6µmol) des Anilines 3 unter den in Tabelle 3.1 aufgeführten Reaktionsbedingungen mit drei Äquivalenten Wasserstoffperoxid bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Verhältnis der Produkte wurde per 1 -MR-Spektroskopie bestimmt. Katalysator, Me 2 C 2 2 (30%) 2 Me 2 C Me 2 C Lösungsmittel, RT 3 4 5 C 2 Me Eintrag Katalysator Additive Lösungsmittel t Umsatz 4 5 (mol%) [h] [%] [%] [%] 1 MT (20) - Me 19 100 0 1 2 MT (20) - DCM 19 100 0 1 3 a 2 W 4 (2) - DCM 22 56 43 13 4 a 2 W 4 (2) - CCl 3 20 63 20 43 5 a 2 W 4 (2) - Pentan/DCM 1:1.7 20 75 26 49 6 a 2 W 4 (10) - DCM 18 97 51 46 7 a 2 W 4 (10) TBAB DCM 18 16 0 16 8 a 2 W 4 (10) TBAB, 3 P 4 Pentan/DCM 1:1 18 100 84 16 9 Se 2 (5) - Me 19 100 0 100 10 Se 2 (10) - DCM 22 100 80 20 11 Se 2 (10) TBAB, 3 P 4 Pentan/DCM 1:1 22 100 82 18 1 Mischung aus itro- und Azoxyverbindung erhalten Tab. 3.1: xidationen von 4-Aminobenzoesäuremethylester 3 mit Wasserstoffperoxid Methyltrioxorhenium (MT) wurde als homogener Katalysator von Espenson et al. in Methanol bei Raumtemperatur zur xidation donorsubstituierter Aniline wie 4-Anisidin erfolgreich eingesetzt; mit Chlor als elektronenziehendem Substituenten konnten hingegen nur mäßige Ausbeuten erzielt werden. Als ebenprodukte wurden die entsprechenden itro- und Azoxybenzole erhalten. Die Anwendung dieser Reaktionsbedingungen auf die xidation des Anilines 3 ergab nach vollständigem Umsatz (19 h) nur eine Mischung des Azoxybenzoles 5 und der entprechenden itroverbindung, sowohl in Methanol als auch in Dichlormethan. Auch atriumwolframat (a 2 W 4 ) oder aus selbigem erhaltene eteroperoxometallate können als Katalysatoren für die xidation aromatischer Amine eingesetzt werden. Die optimalen Reaktionsbedingungen werden durch das Substrat bestimmt; so konnten Anilin oder elektronenreiche Derivate wie Toluidin oder Anisidin durch Wasserstoffperoxid unter Verwendung von lediglich 0.3 bis 2 mol% atriumwolframat ohne den Zusatz von organischen Lösungsmitteln in sehr guten Ausbeuten zu den entsprechenden itrosoverbindungen oxidiert werden. 32 Da die im Rahmen dieser Arbeit gewählte Modellverbindung 3 bei Raumtemperatur nicht flüssig ist, wurde diese 9

3 Aromatische itrosoverbindungen Reaktion unter Zusatz verschiedener Lösungsmittel durchgeführt. Die Verwendung von 2 mol% atriumwolframat in mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln wie Chloroform, Dichlormethan oder einer Mischung aus Dichlormethan und Pentan ergab nach einer Reaktionszeit von 20 h bei Raumtemperatur eine Mischung aus itroso- und Azoxyverbindung mit einem Gehalt an itrosoverbindung von 20 bis 43%, allerdings konnte kein vollständiger Umsatz erzielt werden. Durch die Verwendung von 10 mol% des Katalysators konnte nach einer Reaktionszeit von 18 h ein nahezu vollständiger Umsatz des Amines mit einem Anteil von 51% itrosoverbindung erreicht werden. Die Anwendung von Tetrabutylammoniumbromid (TBAB) als Phasentransferkatalysator in Dichlormethan verlangsamte die Reaktion und führte ausschließlich zur Bildung der Azoxyverbindung. Durch Zusatz von Phosphorsäure ( 3 P 4 ), wie von Mel nikov et al. für ähnliche Aniline beschrieben, 28 konnte jedoch nach 18 h bei vollständigem Umsatz ein Gehalt von 84% itrosoverbindung erhalten werden. b diese Änderung der Selektivität unter Zusatz von Säure auf einen Wechsel der katalytisch aktiven Spezies zurückzuführen ist oder lediglich darauf, daß im Sauren die Kupplung des intermediär gebildeten ydroxylamines mit dem Edukt zum Azoxybenzol langsamer abläuft bzw. die itrosoverbindung im Sauren eine geringere Löslichkeit besitzt, wurde von den Autoren nicht untersucht. MT wie auch a 2 W 4 werden als Katalysatoren zur xidation sekundärer aliphatischer Amine zu itronen mit Wasserstoffperoxid eingesetzt. 33, 34 Wie bei der xidation primärer aromatischer Amine zu itrosoarenen handelt es sich um eine xidation, bei der insgesamt vier Elektronen übertragen werden und ein ydroxylamin als Zwischenstufe durchlaufen wird. Daher schien es naheliegend, die Verwendung von Selendioxid (Se 2 ) zu erproben, das 1987 von Murahashi als effizienter Katalysator für die itronsynthese etabliert worden war. 35 Die Verwendung von 5 mol% Se 2 in Methanol ergab nach einer Reaktionszeit von 19 h selektiv das Azoxybenzol 5 in quantitativer Ausbeute. Diese Methode könnte somit einen neuen Zugang zur Synthese symmetrisch substituierter Azoxybenzole darstellen, die u. a. als Flüssigkristalle Anwendung finden. Durch Verwendung von 10 mol% des Katalysators in Dichlormethan konnte die Produktselektivität der xidation umgekehrt werden, so daß die itrosoverbindung als auptprodukt mit einem Anteil von 80% erhalten wurde. Der Zusatz von Tetrabutylammoniumbromid und Phosphorsäure führte hier nur zu einer geringen Steigerung des Gehaltes an itrosoverbindung. Murahashi postulierte als katalytisch aktive Spezie die perselenige Säure, die das Amin zunächst unter Bildung der selenigen Säure zum ydroxylamin oxidiert. Durch den Zerfall der selenigen Säure in Selendioxid und Wasser wird Selendioxid regeneriert, das durch Wasserstoffperoxid zur perselenigen Säure reoxidiert wird. Diese oxidiert das ydroxylamin in einem zweiten xidationsschritt schließlich zum itron (Abbildung 3.4). 35 Ein analoger Mechanismus könnte auch für die xidation aromatischer Amine zu itrosoarenen formuliert werden. Die Ergebnisse der katalytischen xidationen stellen zwar einen vielversprechenden Ausgangspunkt dar, sind aber im Bezug auf die Reaktionszeiten und die Produktreinheiten kein optimaler Zugang zu substituierten itrosobenzolen im Labormaßstab. Daher wurde im folgenden die stöchiometrische xidation unter Verwendung von xon untersucht. 10