Transgene Organismen
Themenübersicht 1) Einführung 2) Komplementäre DNA (cdna) 3) Vektoren 4) Einschleusung von Genen in Eukaryontenzellen 5) Ausmaß der Genexpression 6) Genausschaltung (Gen-Knockout) 7) Einschleusung von Genen in Pflanzenzellen
Einführung Eukaryontengene können in Bakterienzellen und in höhere Organismen, also tierische Zellen und solche höherer Pflanzen, eingeschleust werden. Die gentechnisch veränderten Organismen bezeichnet man als transgen.
Welchen Nutzen bringen uns transgene Organismen? Bakterien als Proteinfabriken Erkenntnis über Wirkungsweise der Gene Grundlagen der Gentherapie Schädlingsresistenz Erhöhung des Nährstoffgehalts
Komplementäre DNA Problem: Introns der Eukaryonten-DNA Aufnahme von zur mrna komplementären DNA (cdna) Bsp. Insulinherstellung
Herstellung von cdna Reverse Transkriptase (Retroviren) Bildung eines RNA-DNA-Hybrids Oligo(T)-Primer an Poly(A)-Schwanz der mrna Hydrolyse des RNA-Stranges durch ph- Erhöhung Herstellung von ddna
Herstellung von cdna Terminale Transferase Oligo-Primer synthetische Linker zur Ligation in einen Vektor cdna-bibliothek
Herstellung von cdna (Stryer: Biochemie, 5.Auflage)
Vektoren Einbringen der fremden DNA in die Wirtszelle Plasmide oder Phagen Expressionsvektoren Einfügen der cdna in der Nähe eines starken bakteriellen Promotors
Suche nach den cdna-klonen radioaktiv markierte Antikörper Überführung der Bakterien auf eine Replikaplatte Lyse der Bakterien Identifizierung der gesuchten Kolonien durch Autoradiographie
Geneinbau in Eukaryotenzellen Problem: Bakterien führen keine posttranslationalen Modifikationen aus. Deshalb können viele eukaryontische Gene nur in eukaryontischen Wirtszellen korrekt exprimiert werden.
Geneinbau in Eukaryotenzellen Aufnahme von mit Calciumphosphat gefällten fremden DNA-Molekülen Mikroinjektion mit feiner Glasmikropipette Geneinbau über Viren (Retroviren) Beispiele: Moloney-Mäuse-Leukämie- Virus, Vaccinia-Virus, Baculo- Virus
Experiment: Einbringen des Gens für das Wachstumshormon der Ratte in Mäuseeizellen Somatotropingen auf Plasmid neben Metallothioneinpromotors der Maus Initiation der Genexpression durch Gabe von Cadmium
Experiment: die transgenen Mäuse wachsen weitaus schneller als die Kontrollmäuse unter Cadmium-Gabe Konzentration des Hormons 500-mal so hoch und Körpergewicht doppelt so hoch wie bei normalen Mäusen Veranschaulichung der Integration und effizienten Expression fremder Gene unter Kontrolle eines neuen Promotors in Säugetierzellen
Ausmaß der Genexpression Verwendung von DNA-Chips Durch Hybridisierung der immobilisierten DNA mit fluoreszierender cdna kann man den Expressionslevel des Gens identifizieren Intensität des fluoreszierenden Punktes
Genausschaltung (Gen-Knockout) Prinzip: Homologe Rekombination Durch in eine Zelle eingebrachte Fremd-DNA kann ein Gen, dessen Sequenz zumindest in Teilen homolog ist, durch Austausch von Segmenten unterbrochen werden. Bsp.: Gen für gas regulatorische Protein Myogenin
Homologe Rekombination (Stryer: Biochemie, 5.Auflage)
Einschleusung von Genen in Pflanzenzellen Infektion von Pflanzen durch Agrobacterium tumefaciens (tumorinduzierendes Plasmid) Wurzelhalsgalle (Tumorgewebe) Synthese von Opinen Umstellung des Stoffwechsels der Pflanzenzelle
Ti-Plasmid (Stryer: Biochemie, 5.Auflage)
Ti-Plasmide als Vektoren Einbau eines fremden DNA-Segments in die T-DNA-Region eines kleinen Plasmids Synthetisches Plasmid in Agrobacterium- Kolonie Rekombination Ti-Plasmide mit dem fremden Gen Problem: Transformation gelingt nicht bei wichtigen monokotylen Getreidepflanzen
Weitere Möglichkeiten der Geneinschleusung Elektroporation: Anlegen elektrischer Felder Passierbarkeit der Membran für große Moleküle Genkanonen: mit DNA beschichtete Wolframkügelchen Transformation durch Beschuss