RESOLUTION OIV/OENO 427/2010 KRITERIEN FÜR METHODEN ZUR QUANTIFIZIERUNG VON POTENTIELL ALLERGENEN RÜCKSTÄNDEN EIWEISSHALTIGER SCHÖNUNGSMITTEL IM WEIN Die GENERALVERSAMMLUNG, unter Berücksichtigung des Artikels 2 Absatz 2 iv des Abkommens zur Gründung der Internationalen Organisation für Rebe und Wein, in Anbetracht des Vorschlags der Unterkommission für Analysemethoden und Bewertung von Wein, unter Berücksichtigung, dass die O.I.V. helfen soll, die Gesundheit der Verbraucher zu schützen und einen Beitrag zur Lebensmittelsicherheit leisten soll; betont, dass diese Kriterien unter Berücksichtigung der Entscheidungen anderer internationaler Gremien erneut in Betracht gezogen werden sollten, stellt fest, dass spezifische Verfahren zur Bestimmung von Eiweiß aus Schönungsmitteln im Wein nicht vorgeschrieben sind. Verschiedene ELISA-Verfahren sind bereits verfügbar und können angewendet werden. BESCHLIESST, die unten angeführten Kriterien für Methoden zur Quantifizierung von potentiell allergenen eiweißhaltigen Schönungsmittel im Wein zu verabschieden: KRITERIEN FÜR METHODEN ZUR QUANTIFIZIERUNG VON POTENTIELL ALLERGENEN RÜCKSTÄNDEN EIWEISSHALTIGER SCHÖNUNGSMITTEL IM WEIN 1 Definitionen der Verfahrenskriterien Richtigkeit r = Grad der Übereinstimmung zwischen dem aus einer großen Serie von Testergebnissen erhaltenen Mittelwert und einem anerkannten Referenzwert die Wiederholgrenze ist jener Wert, unter dem zu erwarten ist, dass die absolute Differenz zwischen zwei einzelnen Testergebnissen, die unter Wiederholbedingungen (d.h. mit derselben Probe, von demselben Bearbeiter, mit denselben Geräten, im selben Labor sowie innerhalb einer kurzen Zeitspanne) erhalten worden sind, innerhalb einer spezifischen OIV 2010 1
Wahrscheinlichkeit (im Allgemeinen 95%) liegt, daraus folgend ist r = 2,8 x s r. S r = Standardabweichung, berechnet aus Ergebnissen, die unter Wiederholbedingungen erhalten worden sind. RSD r = Relative Standardabweichung, berechnet aus unter Wiederholbedingungen erhaltenen Ergebnissen [(S r /x ) x 100], wobei x der Mittelwert der Ergebnisse aus allen Labors und von allen Proben ist. R = die Vergleichsgrenze ist der Wert, unter dem der absolute Betrag der Differenz zwischen zwei unter Vergleichsbedingungen (d.h. mit vergleichbarem Material, von denselben Bearbeitern in unterschiedlichen Labors, unter Verwendung von Standardmethoden) gewonnenen Ergebnissen als innerhalb einer gewissen Wahrscheinlichkeit liegend erwartet werden kann (im Allgemeinen 95 %); R = 2.8 x s R. S R = Standardabweichung, berechnet aus Ergebnissen, die unter Vergleichsbedingungen erhalten worden sind. RSD R = Relative Standardabweichung, berechnet aus Ergebnissen, die unter Vergleichsbedingungen [(S R /x x 100] erhalten worden sind Ho R = HORRAT-Wert: entspricht dem Quotient aus dem beobachteten RSD R - Wert geteilt durch den anhand der Horwitz-Gleichung nach der Formel berechneten RSD R -Wert. B 0 = Mittlerer Blindwert LOD = Nachweisgrenze berechnet als LOD = B 0 + 3*S r (B 0 ) LOQ = Bestimmungsgrenze berechnet als LOD = B 0 + 10*S r (B 0 ) 2. Allgemeine Aspekte Voraussetzungen Die Analysemethode muss mit spezifizierten önologischen Praktiken einhergehen. Zusatzstoffe oder allergenhaltige proteinogene Verarbeitungshilfsmittel Jedes Produkt muss chemisch charakterisiert sein und eine strenge Qualitätskontrolle durchlaufen haben. Klassifizierung der Analysemethoden Im Allgemeinen handelt es sich bei Enzym-Immuno-Assays um besonders geeignete und praktische Methoden für die Routineuntersuchung auf Allergene. OIV 2010 2
Zur Bestimmung allergener Rückstände eiweißhaltige Schönungsmittel in Weinen sollten Nachweisverfahren wie die Sandwich- oder kompetitive, direkte oder indirekte ELISA-Technik herangezogen werden. Ist kein enzymmarkierter Antikörper verfügbar, kann zum Nachweis ein Konjugat aus biotyniliertem Antikörper und Avidin-HRP verwendet werden. Antikörper Charakterisierung von Antikörpern (Entwicklung einer Allergenerkennung mit höherer oder geringerer Affinität) Hohe Spezifität für die handelsüblichen Verarbeitungshilfsmittel (wie weiter oben beschrieben) Charakterisierung der Kreuzreaktivität unter Berücksichtigung der in der önologischen Praxis üblicherweise eingesetzten Proteine Nachweisfähigkeit von Allergenderivaten, die auf önologische Behandlungen zurückzuführen sind (Proteolyse oder modifizierte Moleküle) Methode GeeigneteBindungseigenschaften des Antikörpers in Weinproben Auswertbare Ergebnisse bei Anwendung auf Weinproben mit unterschiedlichen chemischen Eigenschaften (ph-wert und Trockenextrakt, Rot- und Weißwein, usw.) Vergleichbarkeit der Ergebnisse von Weinen unterschiedlicher geografischer Herkunft (sogar bei Anwendung unterschiedlicher önologischer Praktiken) Stabilität der Bindungseigenschaften der Antikörper in Bezug auf den Reifegrad des Weins (Dauer, Temperaturen, Farbveränderungen,...) 3. Varianten der Methode Spezifische Verfahren zur Bestimmung von eiweißhaltigen Schönungsmitteln im Wein sind bisher nicht vorgeschrieben. Verschiedene ELISA-Verfahren sind bereits verfügbar und können angewendet werden. Die Laboratorien müssen ein den Anforderungen der OIV genügendes Verfahren verwenden, das die in Tabelle 1 genannten Nachweiskriterien erfüllt. Soweit möglich, sollte das Testmaterial der Gemeinschaftsstudie ein zur Validierung zertifiziertes Referenzmaterial einschließen. Sollte dies nicht zur Verfügung stehen, wird empfohlen, eine alternative Beurteilung der Richtigkeit vorzunehmen. Das allgemeine Protokoll der direkten und indirekten -ELISA-Technik Das direkte Verfahren, in einem Schritt, verwendet nur einen markierten Antikörper. Dieser markierte Antkörper wird mit dem Antigen, das in der Probe/in dem Standard enthalten und an das Mikrotiter-Wellgebunden ist, inkubiert. OIV 2010 3
Das indirekte Verfahren, in zwei Schritten verwendet zum Nachweis einen markierten Sekundärantikörper. Zuerst wird ein Primärantikörper mit dem Antigen, das in der Probe/in dem Standard enthalten und an das das Mikrotiter-Well gebunden ist, inkubiert. Darauf folgt das Inkubieren mit einem markierten Sekundärantikörper, der an den Primärantikörper bindet. Direkt 1. Die Oberfläche einer Mikrotiterplatte vorbereiten, auf der das Antigen aus dem Standard oder der Probe gebunden wird. 3. Zugabe von enzymgebundenem Antikörper, welcher spezifisch an das Antigen bindet. 4. Die Platte zur Entfernung ungebundener Antikörper-Enzym-Konjugate waschen. 5. Eine chemische Substanz zugeben, die vom Enzym in ein farbiges, fluoreszierendes 6. Messung der Extinktion oder der Fluoreszenz oder des elektrochemischen Signals (zum Beispiel Stromstärke) der Mikrotiter-Wells zur Bestimmung vdes Vorhandensein oder der Menge des Antigens. Vor dem Assay muss das Antikörper-Präparat gereinigt werden und der Antikörper muss Indirekt 1. Die Oberfläche einer Mikrotiterplatte vorbereiten, auf der das Antigen aus dem Standard oder der Probe gebunden wird. 3. Primäre Antikörper zugeben, die sich spezifisch an das Antigen binden. 4. Die Platte zur Entfernung ungebundener Antikörper waschen. 5. Sekundäre, enzym-gebundene Antikörper zugeben, die spezifisch für die primären Antikörper sind. 6. Die Platte zur Entfernung ungebundener Antikörper-Enzym-Konjugate waschen. 7. Eine chemische Substanz zugeben, die vom Enzym in ein farbiges, fluoreszierendes 8. Messung der Extinktion oder der Fluoreszenz oder des elektrochemischen Signals (zum Beispiel Stromstärke) der Mikrotiter-Wells zur Bestimmung des Vorhandenseins und der Menge des Antigens. Vor dem Assay müssen beide Antikörper-Präparate gereinigt werden und ein Antikörper muss OIV 2010 4
Abbildung 1: Direkte und indirekte ELISA-Technik Hoch bindende Mikrotiterplatten aus Polystyrol sind für die meisten Anwendungen besonders geeignet; aber um die für das entsprechende Antigen am besten geeigneten Plattentyp zu ermitteln, sollten die Angaben der Herstellers beachtet werden Der Hauptvorteil einer direkten und indirekten ELISA-Technik ist die hohe Sensitivität, die durch einen vergleichbar einfachen Aufbau mit verringerten Möglichkeiten für unspezifische Bindungen erreicht wird. Allerdings ist sie nur auf Proben anwendbar, die einen geringen Gehalt an nicht antigenen Proteinen haben. Das allgemeine Protokoll der kompetitiven ELISA-Technik: Der Begriff Kompetition beschreibt Assays, in denen die Messung einer Substanz aufgrund ihrer Fähigkeit zur Inhibition einer spezifischen Bindung bewertet wird. Der Nachweis kann direkt, in einem Schritt, oder indirekt, in zwei Schritten, erfolgen. Direkt 1. Die Oberfläche einer Mikrotiterplatte vorbereiten, auf der eine bekannte Menge von dem zu bestimmenden Antigen gebunden wird. 3. Die Probe oder den Standard (Antigen) und die enzymgebundenen, spezifisch antigenbindenden Antikörper auf die beschichtete Mikrotiterplatte geben (je mehr Antigene sich in der Probe befinden, desto weniger Antikörper sind in der Lage, sich an das Antigen in dem Mikrotiter-Well zu binden, was zu einer sog."kompetition" führt).. 4. Die Platte zur Entfernung ungebundener Antikörper und ungebundene Antigen- Antikörperkomplexe waschen. 5. Eine chemische Substanz zugeben, die vom Enzym in ein farbiges, fluoreszierendes oder elektrochemisches Signal umgewandelt wird. 6. Messung der Extinktion oder der Fluoreszenz oder des elektrochemischen Signals (zum Beispiel, Stromstärke) der Mikrotiter-Wells zur Bestimmung des Vorhandenseins und der Menge des Antigens. OIV 2010 5
Vor dem Assay muss das Antikörper-Präparat gereinigt werden und der Antikörper muss Indirekt 1. Die Oberfläche einer Mikrotiterolatte vorbereiten, auf der eine bekannte Menge von Antikörpern gebunden ist. 3. Die Probe oder den Standard (Antigen) und die spezifisch antigenbindenden primären Antikörper auf die beschichtete Mikrotiterplatte geben (je mehr Antigene sich in der Probe befinden, desto weniger Antikörper sind in der Lage, sich an das Antigen in dem Mikrotiter-Well zu binden, was zu einer sog."kompetition" führt).. 4. Die Platte zur Entfernung ungebundener Antikörper und ungebundener Antigen- Antikörperkomplexe waschen. 5. Zugabe des enzymmarkierten, für den primären Antikörper spezifischen sekundären Antikörpers. 6. Die Platte zur Entfernung ungebundener Antikörper waschen. 7. Eine chemische Substanz zugeben, die vom Enzym in ein farbiges, fluoreszierendes 8. Messung der Extinktion oder der Fluoreszenz oder des elektrochemischen Signals (zum Beispiel Stromstärke) der Mikrotiter-Wells zur Bestimmung des Vorhandenseins und der Menge des Antigens. Vor dem Assay müssen beide Antikörper-Präparate gereinigt werden und ein Antikörper muss Abbildung 2: Direkte und indirekte kompetitive ELISA-Technik Hoch bindende Mikrotiterplatten aus Polystyrol sind für die meisten Anwendungen besonders geeignet; aber um die für das entsprechende Antigen am besten geeigneten Plattentyp zu ermitteln, sollten die Angaben des Herstellers beachtet werden. OIV 2010 6
Für die kompetitive ELISA-Technik gilt: je größer die Konzentration des ursprünglichen Antigens, desto schwächer ist das zu erwartende Signal. Das allgemeine Protokoll der Sandwich-ELISA-Technik: Die Sandwich ELISA-Technik misst die Menge an Antigen zwischen zwei Schichten von Antikörpern (d.h.antikörper zur Erfassung und zum Nachweis). Das zu messende Antigen muss mindestens zwei Epitope aufweisen, um an die Antikörper gebunden zu werden, da mindestens zwei verschiedene Antikörper in dem Sandwich agieren. Zum Erfassen und Nachweisen in dem Sandwich ELISA-System können entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper verwendet werden. Direkt 1. Die Oberfläche einer Mikrotiterplatte vorbereiten, auf der eine bekannte Menge von Antikörpern zum Erfassen der Antigene gebunden ist. 3. Aufgabe der Antigen enthaltenden Proben oder Standards auf die Platte. 4. Die Platte zur Entfernung ungebundener Antigene waschen. 5. Zugabe von enzymmarkierten Antikörpern (Antikörper zum Nachweis), die spezifisch an das Antigen binden. 6. Die Platte zur Entfernung ungebundener, enzymmarkierter Antikörper waschen. 7. Eine chemische Substanz zugeben, die vom Enzym in ein farbiges, fluoreszierendes 8. Messung der Extinktion oder der Fluoreszenz oder des elektrochemischen Signals (zum Beispiel Stromstärke) der Mikrotiter-Wells zur Bestimmung des Vorhandenseins und der Menge des Antigens. Vor dem Assay sollte das Antikörper-Präparat gereinigt werden und der Antikörper muss Indirekt 1. Die Oberfläche einer Mikrotiterplatte vorbereiten, auf der eine bekannte Menge von Antikörpern zum Erfassen der Antigene gebunden wird. 3. Aufgabe der Antigen enthaltenden Proben oder Standards auf die Platte. 4. Die Platte zur Entfernung ungebundener Antigene waschen. 5. Zugabe von primären Antikörpern zum Nachweis, die spezifisch an das Antigen binden. 6. Die Platte zur Entfernung ungebundener primärer Antikörper waschen. 7. Zugabe von enzymmarkiertem sekundärem Antikörper, der spezifisch an den Antikörper zum Nachweis bindet. 8. Die Platte zur Entfernung ungebundener enzymmarkierter Antikörper waschen. OIV 2010 7
9. Eine chemische Substanz zugeben, die vom Enzym in ein farbiges, fluoreszierendes 10. Messung der Extinktion oder der Fluoreszenz oder des elektrochemischen Signals (zum Beispiel Stromstärke) der Mikrotiter-Wells zur Bestimmung des Vorhandenseins und der Menge des Antigens. Vor dem Assay müssen beide Antikörper-Präparate gereinigt werden und ein Antikörper muss Abbildung 3: Direkte und indirekte Sandwich-ELISA-Technik Es ist für die indirekte Sandwich-ELISA-Technik wichtig, dass die Erfassungsantikörper und die Nachweisantikörper in verschiedenen Spezies gezüchtet werden (z.b. Maus und Kaninchen), damit die enzymgebundenen Sekundärantikörper, die spezifisch für die Nachweisantikörper sind, sich nicht auch an die Erfassungsantikörper binden. Hoch bindende Mikrotiterplatten aus Polystyrol sind für die meisten Anwendungen besonders geeignet; aber um die für das entsprechende Antigen am besten geeigneten Plattentyp zu ermitteln, sollten die Angaben des Herstellers beachtet werden Bei der Sandwich ELISA-Technik ist das Messsignal proportional zu der Menge an Antigen in den Proben. Der Vorteil dieser Technik ist, dass die Proben vor der Analyse nicht aufgereinigt werden müssen und das Assay sehr empfindlich sein kann. OIV 2010 8
Tabelle 1: Nachweiskriterien für Analysemethoden zur Bestimmung von potentiell allergenen Rückständen eiweißhaltiger Schönungsmittel im Wein Bestimmungsgröße Anwendbarkeit Nachweisgrenze Quantifizierungsgrenze Genauigkeit Ausbeute Spezifität Richtigkeit Wert/Kommentar Geeignet zur Bestimmung von Schönungsmitteln im Wein, für verbindliche Aussagen. (ausgedrückt in mg/l) Casein: mindestens 0,5 Ovalbumin: mindestens 0,5 Hausenblase: mindestens 0,5 Lysozym: mindestens 0,5 (ausgedrückt in mg/l) Casein: mindestens 1 Hausenblase: mindestens 1 Lysozym: mindestens 1 Ovalbumin: mindestens 1 HORRAT-Werte kleiner oder gleich 2 in der Ringversuch zur Validierung 80% - 105% (wie in der Ringversuch angegeben) Unabhängig von Matrix Interferenzen x m < 1,96 * s lab sr lab * 1 1 n R ( ) ² ( )² wobei m der zertifizierte Wert des Wein-Referenzmaterials und x der Mittelwert von n Messungen desschönungsmittelgehaltes des betrachteten Weins, (im selben Labor durchgeführt) ist. S r (lab) sind Standardabweichungen, berechnet aus den im selben Labor und unter Wiederholbedingungen erhaltenen Ergebnissen. S R (lab) sind Standardabweichungen, berechnet aus verschiedenen Laboren unter denselben Vergleichsbedingungen erhaltenen Ergebnissen. OIV 2010 9