Spermagewinnung und Spermauntersuchung beim Rüden

Spermagewinnung und Spermauntersuchung beim Rüden Dr. med.vet. Christiane Otzdorff Dipl. ECAR (Reproductive Biotechnology) Absamung: Die Erste Absamung: Die Zweite Absamung: Die Dritte Absamung: Die Vierte

Spermagewinnung beim Rüden fraktionierte Ejakulatgewinnung durch manuelle Stimulation des Penis Elektroejakulation nur in Sonderfällen (z.b. bei Wildkaniden)

Spermagewinnung beim Rüden Hilfsmittel läufige Hündin, Tupfer, Pheromone (Methyl 4-hydroxybenzoat) ungepuderte, (latexfreie) Handschuhe 3 Behälter zum Auffangen des Ejakulates schleimhautverträgliche Antibiotikasalbe ruhige Umgebung, Minimum an anwesenden Personen, keine Zwangsmaßnahmen

Spermagewinnung beim Rüden Stimulation des Bulbus bis zum Aufknoten

Spermagewinnung beim Rüden

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Makroskopische Spermauntersuchung

Makroskopische Spermauntersuchung Volumen: -für jede Ejakulatfraktion und (für das Gesamtejakulat) -Volumen schwankt in Abhängigkeit vom Körpergewicht und der daran gekoppelten Größe der Prostata und der Hoden -Volumen der Einzelfraktionen wird durch Spermagewinnung beeinflußt

Makroskopische Spermauntersuchung Farbe: weißlich gelblich rötlich bräunlich klar, wenig Trübung

Makroskopische Spermauntersuchung Konsistenz: wässrig molkig milchig rahmig ph-wert: Unmittelbar nach der Samengewinnung mittels Indikatorpapier

Mikroskopische Spermauntersuchung

Mikroskopische Spermauntersuchung Beurteilung der Motilität Bestimmung des Anteils toter Spermien Pathomorphologie Bestimmung der Spermienkonzentration

Mikroskopische Spermauntersuchung Motilität am Anfang der Untersuchung, bei 37 C Ermittlung der Einzelbewegungen Anteile der vorwärts-, orts- und pathologisch beweglichen Spermien werden geschätzt und in Prozent angegeben Beurteilung erfolgt in der spermienreichen Fraktion, Fraktion 1 und 3 werden auf Vorhandensein von Spermien kontrolliert

Mikroskopische Spermauntersuchung Motilität ein Tropfen Ejakulat (5-10µl) auf einen vorgewärmten Objektträger aufbringen, Deckglas auflegen Beurteilung bei 200-400facher Gesamtvergrößerung (40er Objektiv) vorwärtsbeweglich = ein Spermium, das mind. zwei Drittel des Gesichtfeldes mehr oder weniger linear durchwandert für Rüden wird eine Vorwärtsbeweglichkeit von mind. 70% gefordert

Mikroskopische Spermauntersuchung Lebend-Tot -Färbung Verwendung von Farbstoffen, für die eine intakte Zellmembran nicht permeabel ist (Bromphenol-Nigrosin, Eosin) Zellmembran toter Spermien ist permeabel für den Farbstoff und die Spermienköpfe färben sich an (Bromphenol-Nigrosin = blau, Eosin = rot) lebende Spermien bleiben nach der Färbung ungefärbt Beurteilung am Ausstrichpräparat bei 1000facher Vergrößerung (100er Objektiv) unter Öl im Hellfeld es werden 300 Spermien ausgewertet

Mikroskopische Spermauntersuchung Herstellung der Lebend-Tot -Färbung (Ausstrichpräparat)

Mikroskopische Spermauntersuchung Nachteile der Lebend-Tot -Färbung: Das Ergebnis der Lebend-Tot -Färbung ist stark abhängig von methodischen Faktoren: Vermischen der beiden Tropfen evtl. Beschädigung der Spermien Einwirkungszeit des Farbstoffes zu langsames Abtrocknen der Farbe kann zu einer Erhöhung des Anteils toter Spermien führen Fehler beim Ausstreichen Lebend-Tot -Färbung hat orientierenden Charakter. Das Ergebnis der Motilitätsbeurteilung ist sicherer.

Mikroskopische Spermauntersuchung Beurteilung der Spermienmorphologie Beurteilung kann ebenfalls am BN-Ausstrich erfolgen erhöhter Anteil pathomorphologisch veränderter Spermien = Teratozoospermie Bewertung einer Teratozoospermie über: Lokalisation der Schädigung primär/sekundär/tertiär Ursache der Schädigung Art der Veränderung Auswirkungen auf die Fertilität Prognose Schädigung reversibel/irreversibel Beim Rüden sollten weniger als 30% der Spermien Anomalien aufweisen!!

Mikroskopische Spermauntersuchung primär entstehen während der Spermatogenese sekundär entstehen nach der Abgabe der Spermien in das Lumen der Tubuli seminiferi contorti (Spermiation) tertiär entstehen während oder nach der Ejakulation oder durch unsachgemäße Behandlung im Verlauf der Samenbehandlung Leidl et al. 1971

Mikroskopische Spermauntersuchung Zytoplasmatropfen wandert während der epididymalen Spermienreifung vom proximalen zum distalen Ende des Mittelstückes und wird i.d.r. von dort an die Umgebung abgegeben Vorgang ist an die Dauer der epididymalen Spermienreifung gebunden proximales, mediales, distales Zytoplasmatröpfchen Zeichen für vorzeitig abgegebene Spermien beim Rüden keine Grenzwerte Leidl et al. 1971

Mikroskopische Spermauntersuchung Bestimmung der Spermienkonzentration (Dichte) Farbe und Konsistenz des Ejakulates Motilitätsbeurteilung Zählkammer Photometer angegeben in Millionen Spermien/ml Hilfsparameter zur Bestimmung der Gesamtspermienzahl

Mikroskopische Spermauntersuchung Zählkammer nach Bürker-Türk Herstellung einer Verdünnung 1:100 (990µl Aqua dest., 10µl Sperma) Vorbereitung der Zählkammer Beschickung der Zählkammer mit 10µl Spermaverdünnung Auszählen bei 400facher Vergrösserung unter Phasenkontrast

Mikroskopische Spermauntersuchung Anzahl gezählter Spermien Anzahl ausgezählter Felder x 25 x 10 x 100 = Anzahl Spermien/mm 3

Weiterführende Untersuchungen Akrosomenfärbungen Akrosomenfärbung mit Bengalrosa und Viktoriablau Fluoreszenzfärbung mit FITC-PNA

Mikroskopische Spermauntersuchung Richtwerte (n = 243 fertile Rüden) und noch tolerierbare Grenzwerte (min., max.) der Ejakulatbeschaffenheit beim Rüden (Günzel-Apel et al. 1994) -10kg 10-20kg 20-40kg 40-60 kg >60kg KG Volumen (ml) (min.) 5-10 (5) 10-15 (5) 10-20 (5) 15-30 (10) 15-30 (10) Volumen Fraktion 2 (ml) 0,5-1,0 0,5-2,0 1,0-2,0 1,0-3,0 1,0-3,0 SGZ (x10 6 ) (min.) 450 (300) 800 (500) 1200 (800) 1500 (1000) 1500 (1000) Vorw.bew. (%) (min.) 60-70 (50) 60-70 (50) 60-70 (50) 60-70 (50) 60-70 (50) Anteil toter S. (%) (max.) 5-10 (15) 5-10 (15) 5-10 (15) 5-10 (15) 5-10 (15) Anomalien (%) (max.) 10-25 (30) 10-25 (30) 10-25 (30) 10-25 (30) 10-25 (30) SGZ = Spermiengesamtzahl