Einführung in die biologische NMR- Spektroskopie H. R. Kalbitzer
Einheit 4
Dynamische Prozesse in Proteinen Bewegungsvorgang Zeitskala [s] Vibrations- und Torsionbewegungen 100 ps 0.1 ps Lateraldiffusion in Membranen 100 ns 0.1 ns Diffusion in Lösung 1 µs - 0.1 ps Rotationsdiffusion in Lösung 10 µs 1 ps Rotation aliphatischer Seitenketten im Protein 0.1 µs 0.1 ns Rotation von aromatischen Seitenketten 10 ms 1 µs Konformationsänderungen in Proteinen 10 µs 100 ks Freisetzung von Substraten bei enzymatischen 1 ms -1 Ms Reaktionen
Messmethoden -12-9 -6-3 0 3 lg τ Relaxation chem. Austausch, R ex Echtzeit Restdipolkopplungen H N -Austausch
1. Messung von zeitabhängigen Prozessen in Echtzeit Minimale Messzeit abhängig von: 1. Aquisitionszeit für einen FID 2. Signal-zu-Rauschverhältnis (notwendiges Averaging) Minimale Meßzeit AQ pro FID wird bei gegebener digitaler Auflösung DA durch Nyquist-Theorem bestimmt.
Nyquist-Samplingtheorem Wenn eine stetige Funktion s(t) bandbreitenbegrenzt ist auf Frequenzwerte f, die kleiner als ein Wert f c sind, dann ist s(t) vollständig durch die diskret abgetastete Sequenz s(k DW) gegeben, falls gilt. 1 2DW f c Daraus folgt: 1 AQ = 2 DA
Signal-zu-Rauschverhältnis S/N kann Aufaddieren erhöht werden. S Anzahl der Scans n N Anzahl der Scans n S/N n Falls Aufaddieren nötig, wächst die notwenige Zeit stark an.
18 O-Austausch im Myosin.Mg 2+.ADP-Komplex (1) (2) E.NTP + H 2 16 O E.NDP.P i E.NDP + P i Schritt 1 wird etwa 40-mal durchlaufen, bevor P i freigesetzt wird H 3 P 18 O 4 H 3 P 18 O 3 16 O
Amidprotonenaustausch in Wasser Säure- und basenkatalysierter Austausch
Amidprotonenaustausch in HPr von S. carnosus Lösung von gefriergetrocknetem HPr in D 2 O, 298 K Nach 24 h 48 min
Pseudo-first-order Kinetik des Austauschs Abhängigkeit der Austauschraten von der Sekundärstruktur HSQC-Intensität als Funktion der Zeit
Korrelationszeiten uns spektrale Dichten Korrelationsfunktion G(f(t)) für zeitlich verändeliche Größe f(t) G( τ ) = f * ( t) f ( t + τ ) Spektrale Dichte J(ω): Fouriertransformierte von G(τ). Für G( τ ) = G(0) e τ / τ c J/s J ( ω) = G(0) e 2τ c = G(0) 2 1+ ω τ 2 c τ / τ c e iωτ dτ 1/τ c
Austausch zwischen zwei Plätzen mit den Resonanzfrequenzen ω o ω/2 und ω o + ω/2 Im mit ω 0 rotierenden Koordinatensystem zwei Grenzfälle: ω τ c >> 1 ω τ c << 1
Simulation eines Two-Site Austauschs (a) K = p A /p B =1 (b) K = p A /p B =2
Langsamer Austausch Zwei Zustände 1 und 2 mit Populationen p 1 und p 2 und Lebensdauern τ 1 und τ 2 Bedingung für langsamen Austausch mit Austauschkorelationszeit τ c = (τ 1 τ 2 )/(τ 1 + τ 2 ): ω = ω 1 ω 2 << 1/τ c Linien an Positionen ω 1 und ω 2 mit relativen Integralen p 1 und p 2. Relaxationszeiten: Platz 1: 1/T 2,1 = 1/T 2,1 +1/τ 1 Platz 2: 1/T 2,2 = 1/T 2,2 +1/τ 2
Schneller Austausch Zwei Zustände 1 und 2 mit relativen Populationen p 1 und p 2 und Lebensdauern τ 1 und τ 2 Bedingung für langsamen Austausch mit Austauschkorelationszeit τ c = (τ 1 τ 2 )/(τ 1 + τ 2 ): ω = ω 1 ω 2 << 1/τ c Linie an Positionen gemittelter Position ω = p 1 ω 1 + p 2 ω 2. Relaxationszeit: 1/T 2 = p 1 /T 2,1 +p 2 /T 2,2 + p 1 p 2 ω 2 /τ c
ph-titration von anorganischem Phosphat H 3 PO 4 PO 4 3- HPO 4 2- H 2 PO 4 1-3.0 6.0 9.0 δ 0 + δ = 1+ i= 1 N N i= 1 δ 10 i i δ 10 iph iph j = 1 i i j= 1 pk pk j j 12.0
Bestimmung individueller pk-werte in Proteinen: pk-werte von His15 in HPr-Proteinen
γ α β 31 P-NMR-Spektren von Mg 2+.ATP bei 202 MHz Intermediärer Austausch Langsamer Austausch
Schneller Austausch bei Titration E + L EL δ free δ observed δ bound
NMR Titration 15 N-HSQC: Cross section of the signal of the residue K346 of a SH2-domain in a titration with EEEpYMPME-NH 2 (lines with ) and simulation (straight lines). k off = k 21 = 700 s 1 k 12 E + L EL k 21 `simple binding Cross section of the signal of the residue I381 of a mutant of the same SH2-domain in a titration with EEEpYMPME-NH 2 (lines with ) and simulation (straight lines). k 21 = 1000 s 1, k 32 = 10 s 1 k 12 E + L EL* EL k 21 k 23 k 32 intermediate complex Günther, Schaffhausen JBNMR
Röntgenstruktur von Ras(wt)
A., & Kalbitzer, H. R. (1996) Biochemistry 35, 10308-10302. Ras.Mg 2+.GppNHp kommt in Lösung in mehr als einem Zustand vor 1. Die zwei Zustände 1 und 2 sind im dynamischen Gleichgewicht mit Austauschraten in der millisekunden Zeitskala. 2. Die freie Aktivierungsenthalpie ist ~80 kj M -1. 3. Effectoren binden nur zu Zustand 2. 4. All kleinen GTPasen (Rap1, Ran, Ef-Tu) zeigen diese Eigenschaft. Geyer, M., Schweins, T., Herrmann, C., Prisner, T., Wittinghofer,
Ringflips in BPTI
Ringflips in HPr von S. carnosus His15 Tyr6
Hochdruck-NMR-Spektroskopie Methylcyclopentan/ Methylcyclohexan 1:1
Hochdruck-NMR-Spektroskopie
Druckabhängigkeit der Fliprate 298 K 275 K
Fit der Druckabhängigkeit der Fliprate
Auswertung der Daten mit Eyring-Gleichung k 1, 1( T, p) = k B h T e ΛH RT ą S + R ą ą V p RT