Ringvorlesung Chemie B - Studiengang Molekulare Biotechnologie Bioorganische Chemie Enzymatische Katalyse 2011 Prof. Dr. A. Jäschke INF 364, Zi. 308, Tel. 54 48 51 jaeschke@uni-hd.de 4. Beispiel: Nucleosidmonophosphat-Kinasen
Enzymfamilie Die Core-Domäne der NMP- Kinasen Gly-X-X-X-X-Gly-Lys
Die P-Schleife interagiert mit der Phosphorylgruppe des ATP Komplexe von NTPs mit Mg 2+ sind die eigentlichen Substrate für alle NTP-abhängigen Enzyme Rolle: 1. Neutralisation, unspez. Wechselwirkungen 2. definierte Konformation 3. Zusätzliche Kontaktstellen - Bindungsenergie
Rolle der gebundenen Wassermoleküle Die Bindung von ATP induziert starke Konformationsänderungen
Mechanismus Deckel klappt zu 2. Substrat (NMP) wird gebunden weitere Konformationsänderung - Triphosphat in direkter Nähe zum Monophosphat Aktive Enzymkonformation entsteht nur, wenn beide Substrate gebunden sind Verhinderung der Konkurrenz durch Wasser Katalyse durch Annäherung Zusammenfassung Zentrales Thema: Stabilisierung des Übergangszustandes 5 grundlegende Strategien: Verwendung der Bindungsenergie Kovalente Katalyse Allg. Säure-Base-Katalyse Metallionenkatalyse Katalyse durch Annäherung
Zusammenfassung Proteasen ermöglichen eine schwer durchführbare Reaktion Carboanhydrasen machen eine schnelle Reaktion noch schneller Restriktionenzyme führen hochspezifische Spaltungsreaktionen aus NMP-Kinasen katalysieren den Austausch von Phosphorylgruppen ohne vorübergehende Hydrolyse
Hammerhead ribozyme (RNase) Synthetic variation (cleaves in trans) You are in charge of what it will cleave
Molecular Scissors
Ribozymes- history 1982 Cech: Tetrahymena rrna intron is self-spliced out Altman and Pace: Ribonuclease P RNP: RNA component alone can process the 5 ends of trnas Mitochondrial group I introns also can self-splice Then group II introns in mitochondria (lariat-formers) Mutations (100 s): Internal guide sequence secondary structure Conserved base analysis (100 s) confirms structure X-ray diffraction: a few 3-D structures
Free guanosine Hammerhead ribozyme (self-cleavage): plant viroids and human delta virus (with Hepatitis C) Self-cleavage via the hammerhead motif
Ribozyme mechanisms Zum Vergleich: RNase A
Katalytische Strategien Architektur des katalytischen Zentrums Aktivierung des Nukleophils Stabilisierung des Übergangszustandes Protonierung der Abgangsgruppe Weitere katalytische Aktivitäten künstliche Ribozyme
Catalysis of C-C bond formation by ribozymes Rationales Exporation of the catalytic bandwidth of RNA Understand structural and mechanistic principles Compare with protein enzymes, deduce general governing principles The Diels-Alder reaction Dienophile Diene Otto Diels Kurt Alder (1876-1952) (1902-1958)
Catalysis of Diels-Alder reactions in Nature Secondary metabolites thought to be biosynthesized via Diels-Alder reaction: Mevinolin (Aspergillus terreus) Alflabene (Alpinia flabellata) Carpanone (Cinnamomum sp.) Solanapyrones A (Alternaria solani) First solved structure of an enzyme which is assumed to catalyze a Diels Alder Reaktion by Ose et al.: Macrophomate Synthase (MPS) Ose et al. Nature 2003 To date, there is no solid proof for the existence of Diels-Alderases in Nature. The spinosyn aglycone biosynthetic pathway. HJ Kim et al. Nature 473, 109-112 (2011) doi:10.1038/nature09981
Artificial biopolymeric Diels-Alder catalysts catalytic antibodies (Abzymes) catalytic RNA (Ribozymes) + Abzyme 1E9 Involved Interactions: hydrophobic interactions 1 hydrogen bond Ribozyme 1. SO2 2. [Ox.] 1E9 + TSA + structure and mechanism? Seelig & Jäschke, J Chem. Biol. 1999 (6) 167-176 176 Catalytic minimal motiv Seelig & Jäschke, J Chem. Biol. 1999 (6) 167-176 176
The hallmarks of enzymatic catalysis saturation behaviour & multiple turnovers Seelig, B., Keiper, S. Stuhlmann, F. & Jäschke, J A. Angew.. Chem. 2000 (112) 4764-4768. 4768. The hallmarks of enzymatic catalysis - Stereoselectivity R,R product S,S product Seelig, B., Keiper, S. Stuhlmann, F. & Jäschke, J A. Angew.. Chem. 2000 (112) 4764-4768. 4768.
The crystal structure of the Diels- Alderase ribozyme RNA product interactions Serganov, A., Keiper, S., Malinina, L., Tereschko,, V., Skripkin,, E., Höbartner,, C., Polonskaia,, A., Phan,, A. T., Wombacher, R., Micura, R., Dauter,, Z., Jäschke, J A., Patel, D. J.: Nature Struct. Mol. Biol. 2005 (12) 218-224. 224.
Comparison with Protein Diels- Alderases Hugot et al. PNAS 2002 (99) 9674-9678. Architecture
Mechanistic considerations Catalysis by approximation in a hydrophobic pocket Stabilisation of the transition state by shape complementarity Destabilisation of diene substrate towards the transition state Electronic effects RNA-product interactions U17 G9 A3 RNA mutations Substrate mutations
Atomare Mutagenese