Methoden 1. 09.11.2004 Sebők Ágnes 1
2 Molekulare Zellbiologie Molekularbiologische Methode I. DNA
3 DNA-Struktur Primärstruktur: Sequenz der Nucleotiden, lineare Polymer, Phosphodiestherbindungen Sekundärstruktur: Doppelhelix, H-BrückenH Tertiärstruktur: Superhelix Quarternärstruktur: DNP, Chromatin
4 Sekundärstruktur Die Faltung der Makromolekül Nichtkovalente Bindungen Doppelhelix DNA stabilisiert durch H-BrückenH
5 Hybridiesierung In vivo: Enzymatisch (DNA-Replikation, Transcription) In n vitro: Wärme (PCR) alkalische Lösungen (Southern-blot) Formamid und Harnstoff (Sequenzierung)
6 Denaturierung: Sekundär- (Tertiär, Quaternär-) struktur nichtkovalente-verbindungen Hydrolyse: Primärstruktur kovalente Verbindungen
7 UV-Absorption der DNA Absorptionsmaximum : 260 nm Konzentrationsbestimmung Bei Denaturierung steigt der UV- Absorption
8 Schmelztemperatur -T m diejenige Temperatur, bei der sich 50% der DNA-Stränge trennen steigt mit zunehmenden G/C- Gehalt der DNA (3 H-Brücken) H
9 Molekularbiologische Methoden Restriktionsendonucleasen Cloning Molecular hybridisation Southern blot Sequencing PCR Genom library
10 Filter-Hybridis Hybridisierungierung Denaturierung Filterbindung Hybridiesierung mit der Probe (radioaktive) Waschen Radiokativität messen Fragen: Anwesenheit der komplementäre Strang Quantität der komplementären DNA/RNA
11 In situ Hybridisierung ierung Mikroskopisches Preparat Denaturierung Hybridiesierung mit der Probe (fluorescent) Waschen Fluorescent Mikroskop (Lichtmikroskop) Fragen: Anwesenheit des komplementären Stranges Wo?
12 Die Restriktionsendonuclease Nuclease schneidet Phosphodiesterbindungen in Nucleinsäure Endo/Exo Nuclease Restriktion Erkennungstellen bzw. Bakterielle Restriktion- Modifikations-System
13 Die Restriktionsendonuclease dsdna-specifische specifische Endonuclease, mit einer specifischen Erkennungssequenz sequenz Palindrom adhäsive e oder glatte Ende
14 Restriktionskarten Verdau mit RE Agarose Gelelectrophorese Wanderung zur positiven Electrode Größere Fragmente wandern langsamer Fluoreszierende Farbstoff die an DNA bindet Relative Lagerung der RE- Erkennungsequenzen kann determiniert werden.
15 In Vitro DNA-Synthese DNA-Polymerase DNA-Matrize Primer 4 dntps, ein radioaktiv markiert Puffer ****** Separierung der freien Nucleotiden von DNA-Strangen
16 Enzymatische DNA-Sequenzierung In vitro DNA-Synthese Primer (oder dntp) ) radioaktiv markiert ddntp (die 3 -OH3 OH-Gruppe fählt) 4 in vitro Reaktionen mit 4 verschiedenen ddntps (1:10) Denaturierende Electrophorese (PAGE mit Harnstoff und Formamide) Autoradiographie
17 Polymerasekettenreaktion (PCR) In vitro DNA-Synthese Hitzestabile DNA-Polymerase Primer-Paar Paar Zyklen: 1. Denaturierung (95 C) 2. Primer-Bindung (60 C) 3. Primer-Verlängerung (60-70 C) Gelelectrophorese
18 PCR Existenz einer Sequenz in der DNA-Mischung Klonierung (Amplifizierung) Länge der DNA-Fragment - Mutationsanalyse
19 Molekulare Zellbiologie Molekularbiologische Methode - Genexpression
20 Polymerasekettenreaktion (PCR) In vitro DNA-Synthese Hitzestabile DNA-Polymerase Primer-Paar Paar Zyklen: 1. Denaturierung (95 C) 2. Primer-Bindung (60 C) 3. Primer-Verlängerung DNA synthese (60-70 C) (Gelelectrophoresis)
21 PCR - Anwendung (Fragen) Existenz einer Sequenz (Infections,, Krebs) Klonierung (Amplifizierung) Mutationsanalyse (Länge der DNA-Fragment) Quantität einer Sequenz Real-time PCR
22 Real-time PCR In vitro DNA-Synthese Hitzestabile DNA-Polymerase Primer-Paar Paar Dritte Primer : mit fluroreszent Farbsott und Auslöscher Polimerase macht fluoreszent Farbstoff frei gleichzeitige (real( real-time) Quantifikation
23 Genexpression Transcription Translation Protein-Function DNA mrna Protein Phenotyp
24 Gentechnik in vivo I. Expression von fremden Genen II. Hinderung der endogenen Gen- Expression
25 Gentechnik in vivo 1. Expression von fremden Genen Gen-Transfer in Zelle Transgene Organisme
26 Hinderung der endogenen Genexpression I. I. DNA KO-mutation
27 Hinderung der endogenen Genexpression II. II. RNA Antisense Antisense RNA Ribosyme RNA-Interferenz
28 Hinderung der endogenen Genexpression III. III. Proteine Microinjection von Antikörper Intrazellulläre Antikörper Expression von dominanten hemmenden Proteinen Peptidomimetiken
mrna 09.11.2004 Sebők Ágnes 29
30 Molekulare Zellbiologie Transcription und Processing der mrna
31 Transcription der mrna RNA Polymerase II. Nucleoplasma Primärtranscript ärtranscript: pre-mrna = hnrna Untereinheiten: Histon-acetyltransferase Helicase Posttranscriptionale Modifizierungen (heterogen nuclearuclear RNA)
32 Promoter: Initiation der mrna-synthese Core P: TATA-box Enhancer Transcriptionsfaktoren sfaktoren allgemeine regulatorische
RNA-Capping 09.11.2004 Sebők Ágnes 33 Enzyme: Nucleotide Phosphohydrolase Guanyltransferase Methyltransferase 5 -Ende 5-5 Verknüpfung, Triphosphat-Brücke Function: Stabilität der mrna (histon mrna-s ohne poly-a) Export aus dem Zellkern Ribosome-Bindung (Proteinsynthese)
34 Polyadenierung 3 -Ende Poly-A Signalsequenz Endonuclease Poly-A-Polymerase Polymerase Poly(A) ) Schwanz: 200-300 Ns. Function: Stabilität der mrna Export aus dem Zellkern
35 Struktur der pre-mrna und mrna Intron Exon 5 und 3 -nichtkodierender Bereich Cap und poly-a-schwanz
36 RNA-Spleißen Introns Entfernen und Exons miteinander verbinden 5 und 3 Spleiße-Signalsequenzen Signalsequenzen snrnp: Rybosym
37 RNA-Sp Spleißmechanismus 5 - U1 ; 3 U2 U4/U6 und U5 Schnitt an der 5 -Spleisstelle Lariatbildung (Schlaufe) Schnitt an der 3 -Spleisstelle Verbindung der Exonsequenzen
38 Spleißung-Krakheiten SLE (systemische Lupus erythematodes) Autoimmunerkrankung Anti-snRNP snrnp-antikörper Thalassemia Anaemia: α und β Globin-Synthese ist ruduziert Mutation der Spleisstelle
Replikation 1. 09.11.2004 Sebők Ágnes 39
40 Molekulare Zellbiologie Replikation der DNA
Das Kornberg-System Matrize-DNA DNA-Polymerase 4 dntp (ein radiaoaktiv markiert) Puffer-Lösung 09.11.2004 Sebők Ágnes 41
Das Kornberg- 09.11.2004 Sebők Ágnes 42 ο Synthese Experiment o TCA-Precipitierun Precipitierung o o o Filter-Bindung Waschen (TCA) Messung der
Das Kornberg- 09.11.2004 Sebők Ágnes 43 Experiment 1. DNA ist in vitro synthetisiert (Die Filter ist radioaktiv) 2. DNA Synthese ist Matrize- abhängig (A+T/G+C - Ratio der Matrize- und neu-synthetisierte- DNA identisch)
44 Das Meselson-Stahl 14 Experiment 14 N-DNA leicht, 15 N-DNA schwer Die Zellen wachsen zuerst im 15 N dann im 14 N-Medium ProbenProben aus der Kultur nach jeder DNA-Replikation
45 Bidirektionale Replikation Replikationsursprung (Origin) Faserautoradiographie 3 H-Markierung (hei( heiß ß danach warm) DNA-Isolation Lichtmikroskopische Autoradiographie
46 Semikonservativ Replikation in eukaryontischen Zellen H3-Thymidin Markierung wahrend der S-Phase und Entfernung des Isotops (Pulse- Chase) Proben nach jeder Replikation Autoradiographie der
5 >3 Richtung der DNA- PCR: Synthese 5-3 3-5 Primers: Amplifizierung,, 2 n 3-5 5-3 Primers: Duplizierung,, 2n 09.11.2004 Sebők Ágnes 47
48 PCR: DNA-Synthese ist Primer- abhangig Keine Synthese ohne Primers Synthese der DNA-Strecke zwischen der Primers
49 DNA-Synthese ist bidirektional Replikationsursprung (Origin) Faserautoradiographie Faserautoradiographie: 3H-Markierung (heiss( danach warm) DNA-Isolation
50 Faserautoradiographie Bidirektionale Synthese: warm heiß zero heiß warm Hypothetische unidirektionale
51 DNA-Replikation ist semidiskontinuirlich Leitestrang, Folgestrang DNA-Ligase Okazaki-Experiment Experiment: 3H-Thymidin-markierung markierung von Bakterien Isolation der DNA
52 Eigenschaften der DNA- Replikation (Zusammenfassung) 1. Matrize-abhangig abhangig Kornberg-E. 2. dntp Kornberg- E. 3. Semikonservativ Meselson-