Kreatinin-Bestimmung TEAS Themen Kreatinin, Clearance, Nierenfunktion, Photometrie, Jaffe-Reaktion Prinzip Kreatinin entsteht als Metabolit des Muskelstoffwechsels in Relation zur Muskelmasse und wird mit dem Harn ausgeschieden. Erhöhte Kreatininwerte finden sich beim akuten Nierenversagen, bei chronischer Niereninsuffizienz sowie bei Minderdurchblutung der Niere. Die Untersuchung der Kreatinin- Konzentration erfolgt photometrisch mit der Jaffe-Methode. Kreatinin eignet sich als Clearance- Substanz, weil Kreatinin zu 99 % über die Niere ausgeschieden wird. Die Kreatinin-Clearance wird aus der Kreatinin-Konzentration im Serum und im Sammelurin unter Berücksichtigung der Sammelmenge und Sammelzeit errechnet. Material Studenten-Basis-Set 1 Mikroliterpipette 10 100 µl 47141-03 1 Mikroliterpipette 100 1000 µl 47141-05 1 Messpipette 10 ml, Teilung 0,1 ml 36600 1 Pipettierball 36592 1 Digitale Stoppuhr 24025 1 Laborbecher, 100 ml, PP 36011-01 1 Laborschreiber, wasserfest 38711 1 Küvettenständer 35661-10 Pipettenspitzen 2-200 μl im Halter, 96 1 Stk. 47148-11 Pipettenspitzen 50-1000 μl im Halter, 1 100 Stk. 47148-12 1 Einweghandschuhe, M, Latex, 100 Stk. 46359 1 Halbmikro-Küvetten 35662-10 Laborausstattungs-Set 1 Photometer 35602-99 Chemikalien 1 Wasser, destilliert, 5 l 31246-81 Zusätzlich werden folgende Reagenzien benötigt Kontrolle TruLab N Kontrolle TruLab P Kreatinin-Reagenz mit Standard Hinweis: Die für diesen Versuch verwendeten Reagenzien und Kontrollproben sind im Anhang aufgelis- Abb. 1: Material www.phywe.com P5911700 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 1
TEAS Kreatinin-Bestimmung tet. Achtung! Beachten Sie stets die Vorbemerkungen, wenn Sie diesen Versuch durchführen. Aufgaben 1. Ermitteln Sie den Kreatinin-Gehalt in einer Serum- Urinprobe sowie in der Kontrolle. 2. Berechnen Sie die zughörige Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes. 3. Berechnen Sie die Kreatinin-Clearance für Ihren Patienten. Durchführung Reagenzvorbereitung - Gebrauchsreagenz ansetzen: 4 Teile R 1 + 1 Teil R 2 - Reagenz auf Raumtemperatur bringen, Beipackzettel beachten. Untersuchungsmaterial - Serum, Siehe Kapitel Präanalytik: Für die Clearance- Bestimmung muss die Serum-Entnahme im Zeitraum der Urin-Sammlung erfolgen. - Standard ist gebrauchsfertig - TruLab P oder N dienen als Kontrollprobe. Sie sind lyophylisiert, entsprechend des Beipackzettels in destilliertem Wasser lösen (siehe Kapitel Vorbemerkung). - Urin: 1 + 49 mit Aqua dest. verdünnen - (falls niedrigere Kreatinin-Werte im Urin zu erwarten sind, können niedrigere Verdünnungen z.b. 1 + 29 angesetzt werden.) - Für die Kreatinin-Clearance wird 24 h Sammelurin benötigt (siehe Kapitel Präanalytik). Abb. 2: Messung Aufgabe 1: Ermitteln Sie den Kreatinin-Gehalt in einer Serum- und einer Urinprobe - Stellen Sie das Photometer auf die Wellenlänge 490 nm (die Schichtdicke beträgt: 1 cm) - Die Temperatur sollte 20 25 C betragen - Die Messung erfolgt gegen den Reagenzleerwert - Die Lösungen jeweils gut durchmischen Insgesamt werden 5 Proben vermessen: - Reagenzleerwert - Standard - Kontrollprobe - Patientenprobe Serum - Patientenprobe Urin Achtung, Urinproben müssen 1 : 49 verdünnt werden, siehe Untersuchungsmaterial 2 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P5911700
Kreatinin-Bestimmung TEAS Reagenzleerwert messen - Gerät einschalten: on/off - Wellenlänge einstellen: 490 nm - 50 µl destilliertes Wasser in eine Küvette pipettieren und die Küvette in die Messstelle stellen - 1000 µl Kreatininreagenz in diese Küvette pipettieren und nach 60 sec.: Taste R drücken - Nach weiteren 120 sec.: Taste T drücken Auch bei der Leerwertmessung kann es zu einer Extinktionsdifferenz kommen. Der entsprechende Wert muss von den folgenden Proben abgezogen werden. Proben messen Siehe auch Tabelle Pippetierschema - 50 µl der Probe in eine Küvette pipettieren und die Küvette in die Messstelle stellen - 1000 µl Kreatininreagenz hinzufügen: Taste R drücken - Nach 60 sec Extinktion E 1 ablesen: Taste T drücken - nach weiteren 120 sec Extinktion E 2 ablesen: Taste T drücken - Gerät abschalten on/off - Grundlagen Pipettierschema Reagenzleerwert Probe(Standa rd/kontrolle, Patient) Aqua dest. 50 µl - Probe(Standard/Ko - 50 µl ntrolle, Patient) Kreatininreagenz 1000 µl 1000 µl Grundlagen Dieser Test dient als Suchtest zur Überprüfung der Nierenfunktion. Er wird auch bei der Verlaufskontrolle von Nierenerkrankungen eingesetzt. Kreatinin entsteht beim Abbau von Kreatin, das für die Muskelkontraktion benötigt wird. Es wird in Relation zur Muskelmasse produziert und mit dem Harn ausgeschieden. Erhöhte Kreatininwerte finden sich beim akuten Nierenversagen, bei chronischer Niereninsuffizienz sowie bei Minderdurchblutung der Niere. Niedrige Kreatininwerte haben keine Krankheitsursache. Die Kreatinin-Konzentration im Serum steigt umso stärker an, je weniger Kreatinin durch die Nieren in den Harn ausgeschieden wird. Sie steigt allerdings überhaupt erst an, wenn die Filtrationsrate der Niere auf 50% der Norm eingeschränkt ist (kreatininblinder Bereich). Mit der Berechnung der Kreatinin- Clearance kann man somit frühzeitig Nierenerkrankungen nachweisen. Die Kreatinin-Clearance in ml/min ist die jenige Menge Blutplasma, die in 1 min allein durch die Nierentätigkeit von Kreatinin befreit wird. Mit ihr wird also die glomeruläre Filtrationsrate GFR erfasst. Die klinische Bedeutung der Kreatinin-Clearance liegt in der frühzeitigen Erfassung einer eingeschränkten Nierenfunktion. Beim Gesunden wird Kreatinin ausschließlich glomulär filtriert, jedoch tubulär weder sezerniert noch rückresorbiert. Deshalb eignet sich Kreatinin als Clearance-Substanz. Zur Bestimmung der Clearance benötigt man also die Kreatinin-Konzentration im 24 h Sammelurin und gleichzeitig im Serum. Hohe Kreatinin-Werte im Serum ergeben einen kleinen Kreatinin-Clearance-Wert. Die Kreatinin-Clearance sinkt also mit der Schwere der Nierenfunktionsstörung. Weiterführende Diagnostik: Mahrfachteststreifen, Urinsedimente, Harnstoff, Proteine im Urin www.phywe.com P5911700 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 3
TEAS Kreatinin-Bestimmung Testprinzip Bei der hier vorgestellten Jaffe-Reaktion bildet Kreatinin mit Pikrat in alkalischer Lösung einen orangeroten Farbkomplex. Der entstandene Farbstoff ist der Kreatininkonzentration der Probe proportional. Neben Kreatinin ergeben eine Vielzahl anderer physiologisch vorkommender Metabolite und auch Medikamente eine vergleichbare Farbreaktion. Diese unspezifischen Reaktionen verlaufen jedoch langsamer, sodass die erzeugten Chromogene, die nicht Kreatinin entsprechen, bei der Messmethode wenig ins Gewicht fallen. Diese Pseudo-Kreatinine (z. B. Pyruvat, 2-Ketoglutarat) reagieren erst nach Ablauf von etwa 10 Minuten. Auswertung Aufgabe 1: Ermitteln Sie den Kreatinin-Gehalt in einer Serum- und einer Urinprobe Der Kreatinin-Gehalt kann direkt aus ΔE (beziehungsweise ΔE-ΔE Leerwert ) der Proben im Vergleich mit dem Standard, dessen Konzentration bekannt ist, ermittelt werden. Bei der Bestimmung des Kreatiningehalts im Urin muss der vorhergehende Verdünnung berücksichtigt werden. Bei einer 1+49 Urinverdünnung wird der Fakotr 50, bei einer 1 + 29 Urinverdünnung der Faktor 30 in die Formel eingesetzt. E Probe Konz. Kreatinin Serum [mg dl] = Konz. Standard E Standard E Probe Konz. Kreatinin Urin [mg dl] = Konz. Standard 50 E Standard Beispielberechnung In unserem Untersuchungsbeispiel erhielten wir folgende Werte: Extinktion E 1 Extinktion E 2 ΔE Konzentration [mg/dl] Standard (Std) 0.01 0.02 0.01 2.0 Kontrolle (TruLab P) 0.18 0.22 0.04 8.0 Patient Serum 0,16 0,18 0,02 4,0 Patient Urin 0,01 0,03 0,02 200 E Kontrolle Konz. Kontrolle[mg dl] = E Standard = 8.0 mg dl E Patient Konz. Patient[mg dl] = E Standard = 8.0 mg dl 0.04 Konz. Standard = 2.0 mg dl 0.01 0.04 Konz. Standard = 2.0 mg dl 0.01 Referenzwerte Kreatinin im Serum Empfehlung Erwachsene: <1 mg/dl 4 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P5911700
Kreatinin-Bestimmung TEAS Kreatinin-Clearance>98 ml/min Die Referenzwerte sind stark von der Methode abhängig. Weitere Informationen zu den Referenzwerten: Siehe Kapitel Vorbemerkung. Aufgabe 2: Berechnen Sie die Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes Mit der Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes überprüft man, ob das Experiment mit Fehler behaftet ist. Siehe Kapitel Vorbemerkung. Der im Experiment ermittelte Wert der Kontrollprobe ist der sogenannte Ist-Wert. Von der Kontrolle kennen wir aber auch den eigentlichen Wert, den Soll-Wert. Er ist auf der Packungsbeilage des Kontrollserums (Trulab P oder N) angegeben. Aus dem ermittelten Ist-Wert und dem bekannten Soll-Wert ergibt sich die Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes nach folgender Formel: KoPEM[%] = Soll Ist Soll 100 Beispielrechnung: Konzentration der Kontrolle Ist: Konzentration der Kontrolle Soll: 8.0 mg/dl 7.6 mg/dl KoPEM[%] = Soll Ist Soll 100 = 7.6 8.0 100 = 5.2% 7.6 Im Anschluss wird die Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes vom Sollwert mit den landesüblich erlaubten Grenzen verglichen. In der Bundesrepublik Deutschland wird diese Grenze für Kreatinin in der Tabelle B 1a RiliBÄK auf +/-11.5 % angegeben. In unserem Beispiel erfüllt der Kontrollprobeneinzelmesswert diese Vorgabe. Folglich kann der Patient beurteilt werden. Achtung: Bitte die gesetzlichen Vorgaben des jeweiligen Landes beachten! Siehe Kapitel Vorbemerkung. Aufgabe 3: Berechnen Sie die Kreatinin-Clearance für Ihren Patienten Da die Kreatinin-Clearance als diejenige Menge Plasma definiert ist, aus welcher das Kreatinin in einer Minute durch die Nierentätigkeit vollständig eliminiert wird, muss das Harnvolumen in einer Minute eingesetzt werden und nicht der Gesamtwert innerhalb von 24 h. Die Berechnung der Clearance C erfolgt nach folgender Formel: C = U V P C = Clearance (Plasmavolumen in ml/min) P = Konzentration des Kreatinins im Serum mg/dl www.phywe.com P5911700 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 5
TEAS Kreatinin-Bestimmung U = Konzentration des Kreatinins im Urin mg/dl V = Harnvolumen in ml, bezogen auf 1 Minute. Berechnungsbeispiel für obigen Patienten (Sammelvolumen: 2000 ml in 24 Stunden = 1440 Minuten) C = 200mg/dl 2000ml 4mg dl 1440min = 69 ml/min Fragen - Wie heißt die Bestimmungsmethode? Jaffe-Methode. - Warum ist es für die Bestimmung so wichtig, die Inkubationszeit zu beachten? Neben Kreatinin ergeben eine Vielzahl anderer physiologisch vorkommender Metabolite und auch Medikamente eine vergleichbare Farbreaktion. Diese unspezifischen Reaktionen verlaufen jedoch langsamer, sodass die erzeugten Chromogene, die nicht Kreatinin entsprechen, bei der Messmethode wenig ins Gewicht fallen. Diese Pseudo-Kreatinine (z. B. Pyruvat, 2-Ketoglutarat) reagieren erst nach Ablauf von etwa 10 Minuten. - Wieso eignet sich Kreatinin für die Clearance-Bestimmung? Weil Kreatinin ein körpereigener Metabolit ist, der zu 99 % ausgeschieden wird. - Welches Untersuchungsmaterial nimmt man für die Clearance-Bestimmung? Serum und 24 h Sammelurin. 6 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P5911700
Kreatinin-Bestimmung TEAS Protokoll Aufgabe 1: Tragen Sie Ihre Daten aus Aufgabe 1 in die folgende Tabelle ein Leerwert Extinktion E 1 Extinktion E 2 ΔE = E 2 -E 1 Standard Kontrolle Tru- Lab P Patient 1 Patient Urin Aufgabe 2: Ergebnis der Abweichung des Kontrollprobeneinzelmesswertes: Aufgabe 3: Die Kreatinin-Clearance des Patienten Fragen - Wie heißt die Bestimmungsmethode? - Warum ist es für die Bestimmung so wichtig, die Inkubationszeit zu beachten? www.phywe.com P5911700 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved 7
TEAS Kreatinin-Bestimmung - Wieso eignet sich Kreatinin für die Clearance-Bestimmung? - Welches Untersuchungsmaterial nimmt man für die Clearance-Bestimmung? 8 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG All rights reserved P5911700