Vorlesung Zellbiologie und Physiologie der Pflanzen Die Pflanzenzelle: Struktur und Kompartimente Membranen der Zelle und Membranproteine Membranen begrenzen die einzelnen Kompartimente Zielstellungen der heutigen Vorlesung : Die meisten Zellkompartimente sind von dichten Membransystemen durchzogen - Welche Membranen gibt es in der Pflanzlichen Zelle J. - Aufbau und Funktion von Membranen - Membranlipide und ihre Bedeutung für Membranen - Arten und Funktionen von Membranproteinen - Lipidmodifikationen und periphere Membranproteine Eigenschaften von Membranen - Membranbegrenzte Kompartimente müssen bei der Zellteilung intakt bleiben - alle wichtigen Membranen entstehen nicht de novo - neue Membranen entstehen immer durch Wachstum und Teilung bereits vorhandener Membranen Die Verbreitung von Membranen -Die Zelle enthält ca. 20 verschiedene Membranen: Plasmamembran Tonoplast Kernmembran Peroxisomenmembran Endoplasmatisches Reticulum Glyoxisomenmembran Golgi Membran Chloroplastenmembranen (2) Trans-Golgi Netzwerk Thylakoidmembran Transport Vesikel Mitochondrienmembranen (2) Endozytotische Vesikelmembranen Endosomenmembran Multivesikuläre Membran 1
Bestandteile und Funktionen von Biomembranen Molekulare Bestandteile: Proteine, Phospholipide, Sterole, andere Lipide. Strukturelemente: Lipiddoppelschicht, verschiedene Klassen an Membranproteinen Funktionen: Grenzfläche zwischen Reaktionsräumen, Träger wichtiger zellulärer Funktionen, insbesondere Signalaufnahme, Signalleitung Transport zwischen Reaktionsräumen, Träger energieumwandelnder Systeme Eigenschaften von biologischen Membranen Biomembranen sind sowohl stabil, aber auch flexibel (fluid) Biomembranen sind immer in sich geschlossen (Vesikel) und umgeben einen umschlossenen Raum Biomembranen werden zusammengehalten von hydrophoben Interaktionen (im Gegensatz zu kovalenten Bindungen oder ionischen Wechselwirkungen) Biomembranen sind semi-permeable für bestimmte Moleküle/Ionen Biomembranen bestehen aus einer Lipiddoppelschicht Molekulare Bestandteile: Bestandteile von Biomembranen Proteine, Phospholipide, Sterole, andere Lipide Art und Zahl der Membranproteine variiert je nach Funktion der Membran (kein einheitliches Proteinmuster) Zusammensetzung (Protein/Lipid Gewichtsverhältnisse) variiert je nach Art der Biomembran: Lipide: Beispiel Neutralfett (Tricylglycerin) Triglycerine sind Fettsäureester des Glycerins. Einfache Triglycerine enthalten jeweils drei identische Fettsäuren. Die meisten natürlich vorkommenden Triglycerine enthalten unterschiedliche, geradzahlige Fettsäuren. Dabei unterscheidet man zwischen gesättigten und ungesättigten Fettsäuren. Funktionen: Energiespeicher (die meisten eukaryotischen Zellen enthalten oil bodies, kann in Samen bis 45% der Zellmasse ausmachen) Strukturlipide in Biomembranen Membranlipide sind amphiphatisch! Strukturlipide enthalten neben unpolaren Fettsäuren andere polare Restgruppen (Phosphate, Zucker) Aminoalkohol Figure 1.3 gruissem 2
Verhalten polarer Lipide in Wasser Polare Lipide formen in Wasser Micellen oder eine Doppelmembran Aggregatszustände der Lipidmembran Zusammensetzung, Konformation und Beweglichkeit der einzelnen Lipide bestimmten den Aggregatszustand der Membran gelartig (parakristallin) Temperatur "flüssig" (flüssig-kristallin) Thermischer Phasenübergang der Lipidmembran In einer reinen Lipidmembran erfolgt der Übergang zwischen einem gelförmigem und flüssigem Zustand abrupt Phasenübergang bei kritischer Temperatur Der Phasenübergang steigt mit zunehmender Sättigung der Fettsäuren zu höheren Übergangstemperaturen. Komplexe Biomembranen enthalten Lipide mit unterschiedlichen Phasenübergängen, dadurch kommt es zu einem langsamen Übergang der Phasenzustände Weitere Bestandteile der Membran Fluidität der Membran Phospholipide Bei gleicher Temperatur: Ungesättigte Fettsäuren erhöhen die Fluidität; Sterole Sterole wirken ausgleichend: sie vermindern die Fluidität bei hohen Temperaturen und die Versteifung bei niedrigen Temperaturen. 3
Fluidität der Membran Beweglichkeit der Phospholipide innerhalb der Membran Hohe Anpassungsfähigkeit und Flexibilität der Membran die Membranlipide können sich durch unterschiedliche Mechanismen innerhalb der Membran bewegen: - schnelle Bewegungen innerhalb einer Schicht - langsame Bewegung zwischen den Schichten Flippasen vermitteln die Translokation zwischen den Schichten der Membran ("flip-flop"-mechanismus) Flippasen vermitteln die Translokation zwischen den Schichten der Membran ("flip-flop"-mechanismus) Lipidzusammensetzung der Membran in verschiedenen Pflanzen fad2 Mutante enthält nur einfach ungesättigte Fettsäuren fad2 wt Lipidtyp Gerste Arabidopsis Spinat 22 C Phospholipide 44 47 64 Sterolyglycoside -- 5 -- Acetylierte Glycoside -- 3 13 Glucocerebroside 16 7 14 freie Sterole 35 38 7 fad2 fad2 Mutante: Membran Versteifung durch weniger mehrfach ungesättigter ( mobiler ) Fettsäuren: A wt Reduziertes Wachstum bei 22 C, ausgelöst durch wenig Zellstreckung, daher kompaktes Mesophyll ohne Interzellularen (wenig Gasaustausch!); C Wildtyp mit normal entwickeltem Mesophyll Membran Verflüssigung durch thermische Mobilisierung: 36 C D-E Wachstum bei höheren Temperaturen (36 C ) stellt Zellstreckung und Blattmorphologie nahezu wieder her. 4
Pflanzen sind direkt abhängig von der Umgebungstemperatur Verschiedene Pflanzenspezies haben eine sehr unterschiedliche Frosttoleranz; wenig Kälte-tolerant sind z. B. Baumwolle, Mais, Reis. Trotzdem benötigen Kälte-resistente Pflanzen eine milde Kältevorbehandlung um die volle Frosttoleranz zu entwickeln Zusammenhang von Kältesensitivität und Membranaufbau Pflanzen passen sich an unterschiedliche Wachstumstemperaturen mit verändertem Sättigungsgrad der Lipide an. Anpassung an Kälte geht mit Erhöhung ungesättigten ( mobileren ) Fettsäuren einher. Dadurch wird in der Kälte Membranversteifung und schädliche Phasenseparierung verhindert. Anzucht: 23 C 4 Tage: -5 C 10 Tage: 23 C Anzucht: 4 C 4 Tage: -5 C 10 Tage: 23 C Kältedadaptierte Pflanzen vertragen jedoch weniger Wärme (übermäßige Mobilität der Membran!) Laterale Phasentrennung der Membran Membran-Proteine - Komplexe Membranen enthalten sowohl "flüssige" als auch "gelartige" Bereiche - Membranproteine finden sich aber nur in den "flüssigen" Bereichen Funktion von Membranproteinen Membranproteine Transport Enzymaktivität Signaltransduktion (Rezeptoren) Verknüpfung benachbarter Membranen Zell Zell Erkennung (Beteiligung von Zuckergruppen!) Verknüpfung mit Zytosklett 5
Integrale Membranproteine Integrale Proteine weisen einen oder mehrere transmembrane hydrophobe Bereiche auf, der von hydrophilen, aus der Membran ragenden Bereichen begrenzt werden. Zur Verankerung in der Membran weisen integrale Proteine eine oder mehrere a-helices oder ß-Fassstrukturen auf Aus der Aminosäurezusammensetzung lässt sich die Zahl transmembraner Helices ableiten. Detergenzien - Membranproteine Transportmechanismen an der Membran Mit starken Detergenzien können intergrale Proteine aus der Membran gelöst werden: Natrium-Dodecyl-Sulphat als amphiphiles Molekül wirkt als solches Detergenz 1. Durch passive Diffusionkönnen nur wenige Stoffe wie Gase oder lipophile Moleküle die Lipiddoppelschicht durchqueren. 2. Wasser, Ionen und biologisch relevante Moleküle können aber durchporen oderkanäle selektiv in Richtung des Konzentrationsgradienten hindurchdiffundieren. 3. Größere und/oder polare Moleküle wie Zucker und Aminosäuren, können mit Hilfe spezieller Proteine (Carrier und Transporter) durch die Membran transportiert werden. Transport-Proteine: Poren, Kanäle und Transporter Passiver Transport: Diffusion an der Membran Isotonisch: Hypertonisch: Hypotonisch: gleicher osmotischer Druck wie ein Vergleichsmedium höherer osmotischer Druck als ein Vergleichsmedium geringerer osmotischen Druck als ein Vergleichsmedium Über eine Membran wird durch Diffusion von Wasser ein Gleichgewicht hergestellt 6
Passiver Transport: Plasmolyse & Turgeszenz Passive Transport-Proteine: Ionenporen Hecht sche Fäden: Zell-Zell Verbindungen der Plasmamembran durch die Plasmodesmata Freie Diffusion entlang des Gradienten Spezifität für Ionen Kein aktiver Transport z.b. Aquaporine Passive Transport-Proteine: Ionenkanäle Passive Transport-Proteine: Ionenkanäle Freie Diffusion Spezifität für Ionen reagieren auf Signale Regulation: - Spannung - Ionen - Liganden Uni-portale Ionenkanäle: geregelter Transport entlang des Konzentrationsgradienten Passive Transport-Proteine: Sym und Antiporter Aktive Transport-Proteine: Ionentransporter Sym-/ Antiporter: Konzentrationsgradient eines Partners als Energielieferant notwendig Aktiver Transport ATP-Verbrauch Transport entgegen des Gradienten 7
Transport-Proteine: Ionentransporter ABC-Transporter ATP Binding Cassette transporter ca. 130 ABC-Transporter bekannt in Arabiopsis thaliana Beteiligt an: Vakuolenbeladung Pathogen Abwehr Xylem-Beladung Schadstoff-Detoxifikation Stomaregulation Transport-Proteine: Kapazität Transport-Prozesse in der Zelle Kanäle und Antiporter sorgen für den Stofftransport einfacher Moleküle: Ionen (Na, K, Ca, Mg, ) Zucker Transporter vermitteln den energieabhängigen Transport von komplexen Stoffen: Anthocyane Chlorophyllabbauprodukte Gallsäuren Glucoside Sulfon-Verbindungen P-Typ ATPase (Protonenpumpe) als Energielieferant P-Typ ATPase (Protonenpumpe) als Energielieferant ATP-getriebene Protonenpumpen liefern durch den Aufbau eines H + Gradienten die nötige Energie für verschiedene andere Transportprozesse 8
Protonengradient als Energielieferant für Transportprozesse Transport-Prozesse an der Vakuole ATPase gestütztes Ansäuern des extra-zellulären Raums ermöglicht die Stoffaufnahme entgegen des Konzentrationsgradienten in der Wurzel An der Plasmamembran erfolgt der Transport in der Regel über Symporter V-ATPasen liefern die Energie zur Beladung der Vakuole in Form eines Protonen Gradienten Das Beladen erfolgt in der Regel durch Anti-portalen Transport Transport-Proteine: H + -ATPase ATP-vermittler Transport von Protonen entgegen eines bestehenden Gradienten Vakuläre V-ATPasen V-ATPase bestehen aus zwei strukturellen Untereinheiten: V0: Membrananker V1: rotierende Kopfregion Transport-Proteine: ATPasen I F-Typ ATP-Synthasen in Mitochondrien in Chloroplasten Protonengradient als Energiequelle für andere Transportmechanismen 9
Transport-Proteine: ATPasen II Transport-Proteine: ATPasen II Verankerung peripherer Membranproteine Periphere Membranproteine: 1. Kovalente Bindung an Lipide (z.b. über Zuckergruppen) Periphere Membranproteine 2. Ionische Bindung mit integralen Proteinen (oft vermittelt durch Ca- oder Mg-Ionen) 3. Lipid-Lipid-Wechselwirkungen von Membranlipiden und lipidmodifizierten Proteinen Proteinmodifikation zur Membranverankerung Periphere Membranproteine Beispiel CBL1 N-Myristoylation: co-translationale Amid-Bindung an Glycine M P WT G2A C3S CBL1 G 1 2 3 4 Palmitoylation: post-translationale Thioesterbindung an Cysteine CBL1.GFP ATG TAA Gen GFP Myristoylierung und Palmitoylierung vermitteln die Plasmamembranlokolisation von CBL1 10
Periphere Membranproteine Beispiel CBL1 Untersuchung von Lipidmodifikationen durch GFP-Fusionsproteine P CBL1 A 1 2 3 4 WT G2A C3S 3H-myristic acid CBL1.GFP CBL1G2A.GFP CBL1C3S.GFP CBL1G2A.GFP M P P M CBL1 CBL1 CBL1 Funktion der Lipidmodifikation für die Lokalisation des CBL1- Proteins Komplexität pflanzlicher Membranen - Komplexe Membranen enthalten sowohl "flüssige" als auch "gelartige" Bereiche - Membranproteine finden sich aber nur in den "flüssigen" Bereichen "Lipid rafts" als Bestandteile der Membran "Lipid rafts" - dichtere Packung von Cholesterol und gesättigten Sphingolipiden (äußere Membranschicht), bzw. Cholesterol und Phospholipiden (innere Membranschicht) - höhere Schmelztemperatur - unlöslich gegenüber Detergenzien - Trennung der Mikrodomäne gegenüber der Umgebung - Assemblierung kann dynamisch erfolgen - mehrere Rafts können zusammenfusionieren - 70 (ein raft) bis 300 nm (als Cluster) Größe 11
"Lipid rafts" - unterschiedliche Typen (Lipid- und Proteinzusammensetzung) - bestimmte Proteine haben eine höhere Affinität zu Rafts als zur umgebenden Lipidstruktur (GPI-anchored, acylated proteins, cholesterol-linked, aber auch Transmembranproteine) - Proteine die nicht miteinander Interagieren, kommen dadurch in räumliche Nähe innerhalb der Mikrodomäne, die eine schnelle Signalverarbeitung erlaubt - In der Mikroskopie können Nano- und Mikrodomainen nachgewiesen werden, aber viele bisher beschriebene Lipid rafts sind wahrscheinlich Isolationsartefakte 12