BIOCHEMIE DER ERYTHROZYTEN

108 PLATZ 2: BIOCHEMIE DER ERYTHROZYTEN Verschiedene Liganden des Häm-Eisens beeinflussen das Absorptionsspektrum der Hämgruppe im ichtbaren. Allgemein bekannt ist der von Auge erkennbare Farbunterschied zwischen Oxyhämoglobin im hellroten arteriellen Blut und Desoxyhämoglobin im "blauen" venösen Blut (Exp. 2.3, 2.4). Die Unterschiede der pektren von Oxy- und Desoxyhämoglobin werden in der Medizin ausgenützt, um dadurch die auerstoffsättigung im Blut zu bestimmen, z.b. mit einer nicht invasiven Methode am Finger (= ohne Blutentnahme, photometrisch im Nagelbett eines Fingers; Monitorgerät in Form eines Fingerlings). In Exp. 2.2 wird die Pufferfunktion von Hämoglobin als dem gewichtigsten Blutprotein nachgewiesen. Die Ladungsverhältnisse von Aminosäureresten in Proteinen soll damit veranschaulicht und diskutiert werden (Vergleiche auch Exp. 4.2 Titration von Aminosäuren, 1. Jahreskurs). Theoretische Grundlagen: Photometrie (. 31) Kenntnisse über Mechanismus des auerstofftransports und Quartärstruktur von Hämoglobin Kenntnisse über Wirkungsweise elektronenübertragender Häm-Enzyme Bezug zu anderen Plätzen: Absorptionsspektren von NAD + und NADH, Exp. 1.6; Bestimmung von Eisenkonzentration und Eisenbindungskapazität im erum, Exp 4.3. Giftige sauerstoffhaltige Nebenprodukte aus dem toffwechsel: Eine Folge des aeroben toffwechsels ist die Bildung giftiger sauerstoffhaltiger Nebenprodukte, die durch verschiedene Mechanismen entgiftet werden müssen. Hauptsächlich sind Oxidasen, die auerstoff als Oxidationsmittel benützen, und elektronentransportierende Enzyme verantwortlich für die kontinuierliche Bildung von auerstoffradikalen und Peroxiden. Besonders viele Radikale werden nach auerstoff-unterversorgung von Geweben bei Reperfusion nach Infarktgeschehnissen (Gehirn, Herz) gebildet. o produzieren uperoxiddismutase, Aminosäureoxidase, NADH-Oxidase aus Leukozyten und andere Enzyme Wasserstoffperoxid, ein Oxidationsmittel. Hauptsächlich betroffen durch diese Oxidationsgifte sind ungesättigte Fettsäuren in Membranlipiden, die durch Lipidperoxidation (eine Radikalkettenreaktion) zerstört und zum Teil quervernetzt werden. Als Folge der Lipidperoxidation werden weitere äusserst reaktive sauerstoffhaltige Verbindungen gebildet, welche ihrerseits zu chäden an Proteinen und an DNA führen können. Vitamin E (in Lipid-Membranen eingelagert) ist eine der wichtigsten ubstanzen, welche solche Radikale unschädlich macht. Andere wichtige Antioxidantien sind Glutathion, Vitamin C, beta-carotin sowie körpereigene heterozyklische aromatische ubstanzen. Für die schnelle Beseitigung von H 2 O 2 ist die überall vorkommende Katalase und die Glutathionperoxidase verantwortlich. Glutathionperoxidase kann nicht nur Wasserstoffperoxid sondern auch andere Peroxide abbauen. In Exp. 2.1 wird gezeigt, dass Katalase die Oxidation des Hämeisens durch Wasserstoffperoxid verhindert. In wenigen Fällen können Enzyme den oxidativen chaden beheben. Die "Reparaturfunktion" der Methämoglobinreduktase verhindert im Erythrozyten die Anhäufung von Methämoglobin. Angeborener Mangel oder Defekt von Enzymen, welche der Abwehr gegen oxidative chäden dienen, sind beim Mensch bekannt und können zu erheblichen törungen führen (Exp 2.5)

109 EXPERIMENT 2.1: Katalase im Blut Wasserstoffperoxid oxidiert Fe 2+ im Hämoglobin (rot) zu Fe 3+ im Methämoglobin (braun). Katalase katalysiert die Zerlegung von H 2 O 2 zu Wasser und auerstoff. Katalase hat eine sehr hohe molekulare Aktivität von 5'000'000 min -1. Natriumazid hemmt die Katalase. Lösungen: Wasserstoffperoxid (3%); Phosphatpuffer (0.1 M), ph 7.0; Natriumazid (0.1 M), giftig! In 3 RG (A, B, C) je 3 ml Wasser und 3 Tropfen Citrat-Blut geben (die anfängliche Trübung verschwindet innert ca. 30 ekunden). Zu B und C 3 Tropfen Natriumazid-Lösung geben. Nun zu den drei Proben je 1 ml Phosphatpuffer, zu A und B je 1 ml Wasserstoffperoxid und zu C 1 ml Wasser geben. Die Farbveränderung während etwa 5 min beobachten. Das Azidanion N 3 - bindet an Fe 3+ der Hämgruppe von Katalase und Cytochromoxidase. Weshalb werden dadurch die beiden Enzyme gehemmt? EXPERIMENT 2.2: Titration von Hämoglobin Hämoglobin ist nach dem Bicarbonat-Puffersystem der wichtigste Puffer im Blut. Die Titrationskurve der Hämoglobinlösung wird im Bereich von ph 9 - ph 5 aus dem Verbrauch von HCl ermittelt, da der äureverbrauch des "Lösungsmittels" (H 2 O) in diesem ph-bereich gering ist. Aus dem Verlauf der Titrationskurve wird ersichtlich in welchem ph-bereich Hämoglobin am besten puffert. Die Pufferkapazität gibt die Leistungsfähigkeit eines Puffersystems an. ie wird angegeben als Menge H + (bzw. OH - ) die bei einem Liter Pufferlösung eine phänderung von 1.0 bewirken. Bei bekannter Konzentration der Hämoglobinlösung kann die Pufferkapazität eines Liters einer 1 mm Hämoglobinlösung (bzw. von 1 mmol Hämoglobin) bei ph 7.5 ermittelt werden. Volumen der Hämoglobinlösung im Messzylinder falls nötig mit 0.15 M NaCl auf 25 ml einstellen, mischen und davon 0.1 ml zu einem RG, das 4 ml NaPhosphatpuffer enthält, geben. Inhalt des RG gut mischen und in Messküvette giessen. Am Photometer die Extinktion bei 540 nm gegen Puffer- Blindwert ablesen. Der millimolare Extinktionskoeffizient bei 540 nm beträgt 59 mm -1 cm -1. Daraus die Konzentration der unverdünnten Hämoglobinlösung berechnen. Vor Versuchsbeginn Bedienungsanleitung des ph-meters lesen und ph-meter mit der aufgestellten Eichlösung eichen.

a) Magnetrührstäbchen in 50 ml Becherglas legen und 25 ml der Hämoglobinlösung zugeben. Magnetrührer abschalten. Mit Wasser abgespülte Elektrode vorsichtig eintauchen (darf Rührstäbchen nicht berühren) und ph-wert ablesen. Magnetrührer wieder einschalten. Titration durch portionenweise Zugabe von 0.5 ml HCl (0.02 M) durchführen (ocorex Pipette benützen). Nach jeder Zugabe ph-wert notieren. Von ph 6 - ph 5 Portionen von 1 ml HCl zugeben um Zeit zu sparen. Im bipweb steht eine Auswertetabelle zur graphischen Darstellung zur Verfügung. Die ph-werte werden im bipweb als Funktion des äureverbrauchs aufgezeichnet. 110 b) Titration wiederholen mit 25 ml des "Lösungsmittels" (= Wasser, 0.15 M NaCl, mit verdünnter NaOH/HCl auf ph 9 einstellen). Portionenweise 0.2 ml HCl (0.02 M) zugeben bis gesamthaft 2 ml. Messwerte im bipweb in die gleiche Tabelle eintragen und anschliessend die Graphik ausdrucken. Die Titrationskurve der Hämoglobinlösung wird aus der Differenz des äureverbrauchs von Titration (a) und (b) erhalten. Da der äureverbrauch des "Lösungsmittels" gering ist, entspricht der äureverbrauch der Titration (a) praktisch der Titrationskurve. Bei ph 7.5 und ph 6.5 die horizontalen Abstände der erhaltenen Kurven (a) und (b) mit einem Massstab bestimmen und in ml HCl umrechnen. Aus der Differenz der beiden Werte die Anzahl µmol HCl berechnen, die beim verwendeten Volumen (25 ml) und der gegebenen Konzentration (siehe bei Einführung zu Exp. 2.2) zu einer ph-änderung von einer Einheit führten. Daraus die Pufferkapazität eines Liters einer 1 mm Hämoglobinlösung und des Hämoglobins im einem Liter Blut bestimmen (Hämoglobin: M r 64'000; 140-160 g /Liter Blut). Zur Auswertung bipweb verwenden (unter Durchführung). In welchem Bereich puffert Hämoglobin gut? Welche eitenketten sind für die Pufferung im physiologischen ph-bereich verantwortlich? Der pk a eines bestimmten Typs von eitenkette in einem Protein ist keine konstante Grösse. Erklären ie dies im Zusammenhang mit dem Resultat von Exp. 2.2. EXPERIMENT 2.3: Absorptionsspektrum von Oxyhämoglobin Das Absorptionsspektrum von Oxyhämoglobin wird ausgemessen und mit den abgebildeten pektren von CO-Hämoglobin (HbCO), Methämoglobin (MetHb, Fe 3+ im Häm) quantitativ verglichen. Lösungen: Hämoglobin in Wasser; Natriumphosphatpuffer (0.01 M), ph 6.5. Hämoglobinlösung (0.50 ml) zu 40 ml 0.01 M Natriumphosphatpuffer geben und mischen. Die

verdünnte Oxyhämoglobinlösung in Küvette (chichtdicke 1 cm) einfüllen. Phosphatpuffer als Vergleichslösung in andere Küvette geben. Das Absorptionsspektrum der Oxyhämoglobinlösung kann mit dem zur Verfügung stehenden pektrophotometer automatisch aufgenommen werden. Das Photometer ist so eingestellt, dass es die Extinktion der Oxyhämoglobinlösung alle 5 nm gegen die Vergleichslösung zwischen 450 nm und 630 nm misst und speichert. Zu diesem Zweck wird zuerst die Basislinie der Vergleichslösung gemessen, wodurch das Gerät jeweils den Blindwert bei den verschiedenen Wellenlängen bestimmt und speichert (Anleitung beim Photometer befolgen). Anschliessend die Küvette mit der Oxyhämoglobinlösung in den Lichtweg stellen und das pektrum aufnehmen (Anleitung beim Photometer befolgen). Das Gerät zieht automatisch bei allen Extinktionswerten den zugehörigen Blindwert ab. Die Liste mit den Extinktionswerten ausdrucken. Zur Auswertung mit graphischer Darstellung steht im bipweb eine vorbereitete Excel-Tabelle zur Verfügung, in welche die Extinktionswerte eingetragen werden. Bei 540 nm die molare Konzentration der untersuchten Oxyhämoglobinlösung berechnen unter Verwendung des millimolaren Extinktionskoeffizienten bei 540 nm von 59 mm -1 cm -1. Damit für sämtliche Wellenlängen die fehlenden ε-werte in der Excel-Tabelle berechnen; mit den ε-werten wird das pektrum von Oxyhämoglobin graphisch dargestellt. Es soll mit den gegebenen pektren (siehe weiter hinten) verglichen werden. Hier können ie die ausgedruckte Liste der Extinktionen einkleben. 111 Wie gross ist die Extinktion eines mit O 2 beladenen Erythrozyten bei 540 nm (angenommene mittlere Dicke: 2 µm; angenommene Hämoglobin-Konzentration: 300 mg/ml)? Vergleichen ie die Bindung von CO mit der Bindung von CO 2 an Hämoglobin.

EXPERIMENT 2.4: Absorptionsspektrum von Desoxyhämoglobin Oxyhämoglobin kann durch Entfernung des auerstoffs aus der Lösung in Desoxyhämoglobin übergeführt werden. Experimentell wird dies durch Reduktion des in der Lösung vorhandenen auerstoffs mit Natriumdithionit (Na 2 2 O 4 ) erreicht. Lösungen: Wie im Exp. 2.3, zusätzlich Natriumdithionit (Na 2 2 O 4 ). Gleiche verdünnte Hämoglobinlösung wie im Exp. 2.3 verwenden. Küvette aus dem Photometer nehmen (Korrosionsgefahr!), eine patelspitze Dithionit zur Lösung in der Küvette geben und mit dem Rührstäbchen mischen. Die Basislinie zum Aufnehmen des pektrums ist bereits von Exp. 2.3 im Gerät gespeichert (sonst neu bestimmen, siehe Exp. 2.3!), sodass nur noch das pektrum zwischen 450nm und 500 nm aufgenommen wird. Auswertung im bipweb: Wie Exp. 2.3. Zur Berechnung der Extinktionskoeffizienten aus den gemessenen Extinktionen soll ε = 57 mm -1 cm -1 bei 550 nm benutzt werden. Damit für sämtliche Wellenlängen die fehlenden ε- Werte in der Excel-Tabelle berechnen; mit den ε-werten wird das pektrum von Desoxyhämoglobin graphisch dargestellt. Es soll mit dem pektrum von Oxyhämoglobin und mit den gegebenen pektren (siehe weiter hinten) verglichen werden. Hier die ausgedruckte Liste der Extinktionen einkleben. Weshalb gibt Oxyhämoglobin den auerstoff in der Peripherie ans Gewebe ab? Welche Prozesse übernehmen im Gewebe die "Rolle des Dithionits"?

70 60 50 CO-Hämoglobin Methämoglobin CN-Methämoglobin ε * 10-3 [M -1 cm -1 ] 40 30 20 10 0 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 Wellenlänge [nm]

114 EXPERIMENT 2.5: Bestimmung von Methämoglobin im Blut Im Körper kann Methämoglobin durch Einwirkung von Oxidationsmitteln wie Wasserstoffperoxid (siehe vorne) oder aromatischen Nitro- und Aminverbindungen entstehen (verschiedene gebräuchliche Medikamente kommen dafür in Frage). In geringer Menge entsteht im Erythrozyten Methämoglobin durch den am Häm-Eisen gebundenen auerstoff. Die in den Erythrozyten vorhandene NADHabhängige Methämoglobinreduktase bewirkt, dass die Methämoglobinkonzentration im allgemeinen 2% nicht überschreitet. Ein Mangel bei der familiären Methämoglobinämie führt zu einem erhöhten Methämoglobingehalt im Blut und bei gleichzeitiger Belastung mit oxidativ wirkenden Medikamenten im Blut (siehe oben) kann dies zu einer erheblichen Beeinträchtigung der auerstofftransportkapazität führen. Methämoglobin (MetHb) hat ein charakteristisches Extinktionsmaximum bei 630 nm (siehe pektrum vorne), welches bei der Bildung von Cyanmethämoglobin (CNMet-Hb) verschwindet (das Cyanid- Anion bindet an Fe 3+ im MetHb). Die Extinktionsänderung bei 630 nm ist proportional zur MetHb- Konzentration. In hämolysiertem und bereits verdünntem Patientenblut wird die Extinktion bei 630 nm vor (A 1 ) und nach (A 2 ) Zugabe von Kaliumcyanid (KCN) gemessen. In einem zweiten Ansatz wird zuerst sämtliches Hämoglobin durch Zugabe von Kaliumhexacyanoferrat(III) zu MetHb oxidiert und anschliessend die Extinktion wieder vor (B 1 ) und nach (B 2 ) Zugabe von KCN gemessen. Reagenzien: A 1 - A 2 % MetHb = x 100 B 1 - B 2 - verdünntes Hämolysat - Kaliumhexacyanoferrat(III) (K 3 Fe(CN) 6 ) - Kaliumcyanid (KCN, wird von Assistierenden abgegeben, sehr giftig!) Am Photometer Blindwert (Wasser) auf E = 0.0 bei 630 nm einstellen. Zwei Küvetten A, B mit Hb- Lösung vorbereiten. Zu B einige Kristalle Kaliumhexacyanoferrat(III) zugeben (= alles Hb zu MetHb oxidiert). Küvette mit Parafilm verschliessen, mehrmals kippen. Die Extinktionen bei 630 nm ablesen. E 630 nm A1:... B1:... In beide Küvetten einiger Körnchen KCN zugeben und mischen (KCN von Assistierenden verlangen. tark giftig!). E 630 nm A2:... B2:... Probe:... % MetHb

115 Aus den Messwerten den Gehalt an MetHb berechnen. Welche Ursache kann einer ausgeprägten angeborenen Methämoglobinämie zugrunde liegen? EXPERIMENT 2.6: Undurchlässigkeit der Erythrozytenmembran für polare ubstanzen Ionen und polare ubstanzen können nicht oder sehr schlecht durch Lipidmembranen diffundieren. Transmembranale Proteine ermöglichen als "Transporter", Ionenkanäle (passiver Transport) oder als Ionenpumpen (Na + /K + -ATPase, aktiver Transport) den Transport bestimmter Ionen und polarer Moleküle durch die Erythrozytenmembran (siehe Exp. 9.2 ommersemester). Im folgenden Versuch wird die Undurchlässigkeit der Erythrozytenmembran für Kaliumhexacyanoferrat(III) (K 3 Fe(CN) 6 ) demonstriert. Hämoglobin wird durch Kaliumhexacyanoferrat(III) zu Methämoglobin (braun) oxidiert. Die Erythrozytenmembran ist für Kaliumhexacyanoferrat(III) undurchlässig und Methämoglobin wird erst nach Zerstörung der Erythrozytenmembran durch Hämolyse gebildet. Es werden bereits gewaschene und gepackte Erythrozyten verwendet. Drei Plastikröhrchen vorbereiten und mit folgenden Volumina beschicken (ml): A B C Gepackte EC 0.2 0.2 - NaCl, 150 mm 1.8 1.8 2.0 Kaliumhexacyanoferrat(III) + + + Zu Röhrchen A, B und C eine kleine patelspitze Kaliumhexacyanoferrat(III) geben. Röhrchen mit Parafilm verschliessen und mehrmals kippen (nicht schütteln!). Röhrchen A und B für 1 Minute zentrifugieren und die Farbe des edimentes und des Überstandes beobachten. A B C......... Überstand von A und B bis auf kleinen Rest abgiessen, danach Zugabe zum ediment: NaCl, 150 mm 2.0 - H 2 O - 2.0

Röhrchen A und B mit Parafilm verschliessen und nach mehrmaligem Kippen zentrifugieren. Farbe von Überstand und ediment, wenn vorhanden, mit C vergleichen und notieren. 116 A B ediment (Ja/Nein):...... Überstand (Farbe):......... Wie kommt die Farbänderung zustande? Welche anderen Transportsysteme, die für Erythrozyten eine wichtige Rolle spielen, kennen ie? Wie gelangen O 2 und CO 2 durch die Erythrozytenmembran?