5.2 Genexpression Sequenz in eine RNA-Sequenz. Die Enzyme, die diese Reaktion katalysieren, sind die DNA-abhängigen RNA-Polymerasen. Sie bestehen aus mehreren Untereinheiten, die von den Pro- bis zu den Eukaryonten mit ihren drei RNA-Polymerasen konserviert sind. Letztere haben noch weitere zusätzliche Untereinheiten. Das zu transkribierende Gen wird in die Promotorregion, die kodierende Sequenz und den Terminator unterteilt. Die RNA-Polymerase bindet an den Promotor über Hilfsproteine. In Prokaryonten sind das verschiedene σ-faktoren, die unterschiedliche Promotoren erkennen, in Eukaryonten für die drei RNA-Polymerasen spezifische generelle (bzw. Allgemeine) Transkriptionsfaktoren. Die RNA-Polymerasen bewegen sich bei der Transkription vom Promotor in 5 3 -Richtung an der DNA entlang und benutzen dabei den 3 5 -Strang als Matrize (Template) der Synthese. Gen 5 Promotor kodierende Sequenz Terminator 3 3 Ablauf der Transkription: Die Transkription ist das Kopieren eines Bereiches der DNA- Transkriptionsinitiation Transkriptionsende 5 Template Strang Man unterscheidet drei Phasen der Transkription - Initiation - Elongation - Termination Initiation der Transkription: Die RNA-Polymerase bindet über die Hilfsproteine (hier gezeichnet für den σ 70, den Haupt-σ-Faktor von Bakterien, der eine 35 und eine 10 Region - 1 -
erkennt) an den Promotor. Die DNA ist dabei noch doppelsträngig, sodass dieser Komplex geschlossener Komplex genannt wird. Die DNA wird dann lokal aufgeschmolzen, es entsteht der offene Komplex, das erste Nukleotid der RNA wird eingebaut: Die RNA-Polymerase benutzt den 3 5 -Strang als Template für die Synthese. Nach 8-9 eingebauten Nukleotiden löst sie sich vom Promotor und den dort gebundenen Proteinen (zum Beispiel dem σ-faktor). Elongation der Transkritpion: Nachdem die Polymerase den Promotor verlassen hat, beginnt die Elongationsphase. Dieser Vorgang ist wenig reguliert. Durch Transkription wird die DNA vor der RNA-Polymerase positiv und hinter ihr negativ verdrillt (Supercoil). Dieses topologische Problem wird durch die Topoisomerasen behoben. Die Topoisomerasen sind essentielle Enzyme bei der Transkription und auch der Replikation. Substanzen, die die bakteriellen Topoisomerasen hemmen, sind sehr potente Antibiotika, weil sie Transkription und Replikation der Bakterien verhindern. - 2 -
Termination der Transkription: Wenn die Polymerase die Terminator-Sequenz erreicht hat, stoppt die Transkription. Die RNA-Polymerase dissoziiert von der DNA ab und die RNA wird freigesetzt. Terminatoren sind in Prokaryonten relativ gut definiert. Dies gilt auch für die eukaryontischen RNA-Polymerasen I und III. Bei der RNA-Polymerase II ist die Termination dagegen eng mit der Bildung der Poly-A-Sequenz am Ende der späteren mrna verknüpft, die von einer eigenen Poly-A-Polymerase gebildet wird. Regulation der Transkription in Prokaryonten Negative Initiationsregulation im Lac-Cistron (Jacob-Monod-Modell): Die Gene lacz, lacy und laca kodieren Proteine, die für den Abbau von Lactose erforderlich sind. 5 vor diesen Genen liegen eine Operator- und eine Promotorsequenz sowie das laci Gen, das den lac- Repressor kodiert. In Abwesenheit von Lactose bindet der Repressor als Tetramer an den Operator und verstellt damit der RNA-Polymerase den Weg bei der Transkription der Gene, die zum Lactoseabbau benötigt werden. Wenn Lactose vorhanden ist, wird in der Zelle Allolactose gebildet, die als Induktor wirkt: Sie bindet an den Repressor, der dann eine Konformationsumwandlung durchläuft und sich vom Operator löst. Die RNA-Polymerase kann nun die Gene lacz, lacy und laca transkribieren, die für den Abbau von Lactose notwendigen Enzyme ß-Galactosidase, Permease und Transacetylase können produziert werden. - 3 -
Dieser negative Regulationsmechanismus sorgt dafür, dass die Enzyme für die Verwertung von Lactose als Kohlenhydratquelle erst dann in signifikantem Ausmaß gebildet werden, wenn diese in größerer Menge im Medium vorhanden ist. Da die Bindungen sowohl des Repressors an den Operator wie auch der RNA-Polymerase an den damit überlappenden Promotor Gleichgewichtsreaktionen sind, ist die Repression nicht vollständig. Es kann auch in Abwesenheit von Lactose einmal vorkommen, dass der Repressor gerade abdissoziiert ist, wenn die RNA-Polymerase zum Promotor kommt. So wird sehr wenig mrna gebildet, von der einige Enzymmoleküle translatiert werden. Dies ist für den Regulationsmechanismus wichtig, da Permease benötigt wird, um Lactose aus dem Medium aufzunehmen, und da die Bildung der Allolactose eine Nebenreaktion der ß-Galactosidase ist. Nur dadurch, dass immer einige Enzymmoleküle vorhanden sind, kann die Zelle also auf das Vorhandensein von Lactose im Medium reagieren. Positive Regulation am lac-operon: Solange E.coli Glucose aufnehmen und verstoffwechseln kann, werden andere Zucker, auch wenn sie im Medium vorhanden sind, kaum verwertet. Stoppt die Aufnahme von Glucose in die Bakterienzelle wird camp (5-3 -cyclo-amp) gebildet. Dieses bindet an das CAP-Protein (catabolite activator protein) welches dadurch zum Transkriptionsfaktor wird, der vor dem lac-promotor an die DNA binden kann. Da die RNA-Polymerase an den camp/cap-komplex bindet, steigert dieser deren Affinität zum Promotorbereich und damit die Transkription. Diese positive Kontrolle ist also notwendig, um die maximale Transkriptionsrate im lac-operon erreichen zu können. Regulation eukaryontischer Gene: Die Transkription eukaryontischer Gene ist sehr viel komplexer als die prokaryontischer Gene. Das menschliche Genom umfasst etwa 3 x 10 9 Basenpaare, nur etwa 10% des Genoms enthält Sequenzen, die Proteine kodieren. Der größte Teil des Genoms besteht aus repetitiven und regulatorischen Sequenzen, die die Transkription steuern. Negative Regulation: Die Ausbildung von Heterochromatin dient der allgemeinen Stilllegung der verpackten Gene. Im Gegensatz zu der Situation bei den Prokaryonten führt dies zur vollständigen Unterbindung der Transkription. Durch die entsprechende Modifikation der Histone und Freilegung der Promotorsequenzen für die Interaktion mit regulatorischen - 4 -
Proteinen und der RNA-Polymerase kann diese Inhibition wieder aufgehoben werden (vgl. Vortrag Chromatin). Positive Regulation: Die Organisation eines eukaryontischen Genes ist in der obigen Abbildung wiedergegeben. Das Gen enthält kodierende (Exon) und nicht kodierende Sequenzen (Intron). Es ist flankiert von Matrix-assoziierten-Regionen (MARs), mit denen die Chromatinschleife, die das Gen enthält, an Gerüstproteinen des Chromosoms befestigt ist (vgl. Vortrag Chromatin). Zwischen dem kodierenden Bereich und den MARs liegen mehrere regulatorische Sequenzen. In 5 -Richtung vor dem kodierenden Bereich ist der Core-Promotor lokalisiert. Er enthält die TATA-Box. An den Core-Promotor binden das TATA- Bindungsprotein TBP und die Faktoren TFIIA-H. Dies sind generelle Transkriptionsfaktoren, die die RNA-Polymerase am Transkriptionsstart positionieren. Dieser Vorgang wird unterstützt durch weitere Transkriptionsfaktoren, die am regulatorischen Promotor binden, der stromaufwärts vom Core Promotor liegt. - 5 -
Im Gegensatz zu den Promotoren, die direkt 5 vom Gen liegen, gibt es noch weitere regulatorische Elemente, die als Enhancer (Verstärker) bezeichnet werden. Enhancer können viele tausend Basenpaare 5 oder 3 vom Gen entfernt positioniert sein. Auch an diese Elemente binden Transkriptionsfaktoren. Sie wechselwirken mit dem Transkriptionsapparat durch Protein-Proteininteraktion, indem eine Schlaufe der DNA-ausgebildet wird: An der Ausbildung des eukaryontischen Transkriptionskomplexes sind über hundert verschiedene Proteine beteiligt: - RNA-Polymerase (10-12 Proteine) - Generelle Transkriptionsfaktoren (TBP, TFIIA, TFIIB, TFIIC, TFIID, usw) - Spezifische Transkriptionsfaktoren (binden an Promotor und/oder Enhancer) - Brückenproteine, die mehrere Proteine verklammern - Mediatoren (Komplexe aus bis zu 20 Proteinen, die regulatorisch wirken) - Histon-Acetylasen und Deactylasen, die das Chromatin zugänglich machen ( vgl. Vortrag Chromatin) Processing des Primärtranskriptes: Bereits während der Transkription wird die entstehende RNA prozessiert. Am 5 -Ende der RNA wird die sogenannte CAP-Struktur angebracht. Sie besteht aus einem methylierten Guanin, das über eine 5 5 Bindung verknüpft ist. Am 3 - Ende der RNA wird ein poly-a-schwanz angebracht, der etwa 200 Adenosinresten umfasst. Die CAP-Struktur und der poly-a- Schwanz werden bei der Translation benötigt, um festzustellen ob die mrna intakt ist; nur wenn beide Strukturen vorhanden sind, wird die mrna zur Proteinsynthese eingesetzt. Die verbleibenden Introns werden durch den Proteinkomplex Spleißosom entfernt. Hierbei spielen Komplexe aus kurzen RNAs und Proteinen (snrnps) eine wichtige Rolle (vergl. Vortrag 5.3 RNA). Die Prozessierung des Primärtranskripts findet während der Transkription statt und ist im Falle der Polyadenylierung an der Ter- - 6 -
mination der Transkription beteiligt. Die prozessierte RNA wird dann aus dem Kern der Zelle ausgeschleust und steht für die Translation zur Verfügung. Grundlegende Literatur: Löffler, Basiswissen Biochemie, 7. Auflage S. 246-262 Löffler Petrides Heinrich, Biochemie & Pathobiochemie, 8. Auflage S. 256-267, 271-278 Rassow Hauser Netzker Deutzmann, Biochemie, 3. Auflage S. 437-449 Themen, die im Vortrag angesprochen werden sollten: Ablauf der Transkription am Beispiel der Prokaryonten Aufbau der RNA-Polymerase Struktur eines Gens Initiation der Transkription Elongation der Transkription Termination der Transkription Regulation eines prokaryontischen Gens Das Lac Cistron als Beispiel Lac-Repressor Lac-Operator CAP-Protein Regulation eukaryontischer Gene Regulationssequenzen eines eukaryontischen Gens o Promotor o Enhancer o MAR Processing des eukaryontischen Primärtranskriptes (Spleißen nur allgemein) - 7 -