Erfahrungen zur Bekämpfung der Bovinen Virus Diarrhoe (BVD/MD) mit spezieller Berücksichtigung der Verbreitung von BVDV-Genotypen im Bundesland Tirol

, 254-258 Aus dem Institut für Veterinärmedizinische Untersuchungen, Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit 1, und dem Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt, Fachbereich Veterinärmedizin 2 Erfahrungen zur Bekämpfung der Bovinen Virus Diarrhoe (BVD/MD) mit spezieller Berücksichtigung der Verbreitung von BVDV-Genotypen im Bundesland Tirol K. SCHÖPF 1, W. GAEDE 2 und M. MATT 1 eingelangt am 12.4.2005 angenommen am 21.10.2005 Schlüsselwörter: BVD-Virus, Genotypen, Prävalenz, realtime RT-PCR, Bekämpfungsprogramm. Zusammenfassung Ein bundesweites und verpflichtendes BVD-Bekämpfungsprogramm existiert in Österreich seit dem 1. August 2004. In Tirol wurde die BVD-Virus-Infektion allerdings schon seit 1999 freiwillig in enger Zusammenarbeit mit der Veterinärabteilung der Tiroler Landesregierung bekämpft. Primäres Ziel war die Eradikation des Virus ohne Impfung, wobei das Erkennen und anschließende Ausmerzen von persistent infizierten Tieren im Vordergrund standen. Durch ein jährliches Screening konnte deren Anteil in Tiroler Rinderbeständen von ursprünglich 1,22 % auf 0,37 % gesenkt werden. Der Nachweis von BVDV-Antigen erfolgte mittels kommerzieller ELISA-Testkits. In der vorliegenden Studie wurden im Frühjahr 2003 von 45.871 untersuchten Rindern im Alter von 14 Tagen bis 18 Monaten 169 Tiere im ELISA als Antigen-positiv erkannt (Prävalenzrate 0,37.%). Bei einer Wiederholungsuntersuchung nach 8 Wochen wurden von 101 Tieren Blutproben gewonnen. Alle Proben waren wieder im Antigen-ELISA positiv. Insgesamt wurden 193 von diesen im Antigen-ELISA positiven Serumproben am Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt in Stendal mittels Genotypisierung auf das Vorkommen von BVDV-2 untersucht. Anhand dieser Untersuchungen wurde gezeigt, dass in der Tiroler Rinderpopulation bisher kein BVDV-2 nachgewiesen werden konnte. Abkürzungen: Ag = Antigen; AGES = Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit; AMA = Agrar Markt Austria; BVD = Bovine Virus Diarrhö; BVDV = Bovine Virus Diarrhö Virus; ELISA = Enzyme-linked Immunosorbant Assay; MD = Mucosal Disease; OD = optical density; PI = persistent infiziert; RT-PCR = Reverse Transkriptase Polymerase Chain Reaction Keywords: BVDV, genetic types, prevalence, real-time RT- PCR, eradication. Summary Experience in BVDV eradication in Tyrol s cattle with special consideration of the occurrence of BVDV genotypes Introduction On August 1, 2004, the Austrian government enacted BVD-regulation and introduced a compulsory national BVD-control program. In Tyrol, BVDV eradication had already started on a voluntary basis in 1999. The main aim of this voluntary control scheme on a farm level was the identification and elimination of all persistently infected animals without vaccination. The annual screening revealed a decrease of the proportion of these PI-animals from 1.22 to 0.37 %. Methods During surveillance activities in the year 2003, out of 45,871 blood samples from cattle at the age of 2 weeks to 18 months, 169 samples were BVDV antigen capture ELISA positive (prevalence rate 0.37 %). In the course of a second blood test 8 weeks later, 101 animals were retested. In the laboratory, commercially available antigen capture ELISA technique is routinely used to detect BVDV antigen in serum. For the detection of virus genomes a real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) was applied. Results Totally 193 of these antigen ELISA positive blood samples were tested by RT-PCR at the Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen Anhalt in Stendal for the occurrence of BVDV-2. All samples were classified as BVDV-1 and no BVDV-2 could be detected in bovine field samples from the Tyrol region. Conclusions The removal of persistently infected animals is the long term basis of the BVDV eradicaton program in Tyrol. In all BVDV positive field samples BVDV-1 genome could be detected by RT-PCR. 254

Einleitung Die Bovine Virus Diarrhö (BVD) zählt weltweit zu den wirtschaftlich bedeutendsten Infektionskrankheiten des Rindes. Der enorme Stellenwert dieser Erkrankung lässt sich anhand der ehemals freiwilligen Bekämpfungsinitiativen einzelner Bundesländer sowie aufgrund der gesetzlichen Regelung (BVD-Verordnung, 2004) ableiten. Die Infektion mit dem Virus der BVD hat in Abhängigkeit vom Immunstatus und dem Trächtigkeitsstadium des betroffenen Tieres, der Immunitätslage der Herde, dem Genooder Biotyp des Erregers und seiner Virulenz verschiedenartige Auswirkungen (PETERHANS et al., 2004). Für die Epidemiologie ist die Infektion seronegativer Mütter zwischen dem 42. und 114. Trächtigkeitstag von zentraler Bedeutung (McCLURKIN et al., 1984). Das Virus, das in jedem Stadium die Plazentaschranke überwindet und den Fetus infiziert, trifft in diesem Zeitraum auf ein noch nicht funktionsfähiges Immunsystem. Die Folge ist eine Immuntoleranz, die die Eliminierung des Virus verhindert. Das Resultat ist letztlich die Geburt eines persistent infizierten (PI) Kalbes, das lebenslang das BVDV in extrem hohen Dosen ausscheidet und so zum entscheidenden Vehikel für die Aufrechterhaltung von Infektionskreisläufen und für die Weiterverbreitung der Infektion wird (FLEBBE u. MEHRKENS, 1992). Im Jahr 1994 wurde nach dem Auftreten neuer, hochvirulenter Stämme in Nordamerika das BVD-Virus in zwei Genotypen - BVDV-1 und BVDV-2 - unterteilt (PELLERIN et al., 1994; RIDPATH et al., 1994). Mittlerweile werden diese beiden Genotypen als selbständige Spezies betrachtet. Untersuchungen im benachbarten Bayern zeigen, dass 11 aus 96 Isolaten (11,5 %) im Zeitraum 1992-1996 als BVDV-2 typisiert werden konnten (WOLFMEYER et al., 1997). Eine andere Untersuchung in Deutschland von 505 BVDV-positiven Feldseren weist eine etwas geringere Prävalenz von BVDV-2 nach (6,5 %; BEER u. WOLF, 1999), während BVDV-2 in Kanada und USA weitaus häufiger zu sein scheint (BOLIN u. RIDPATH, 1999). Tirol weist einen Rinderbestand von 179.138 Tieren und 10.747 Rinderhalter auf (AMA Datenbank vom 1.1.2005). Die Betriebsstruktur ist vorwiegend kleinbäuerlich, und die durchschnittliche Betriebsgröße liegt bei etwa 17 Tieren pro Betrieb. Diese schwankt je nach Region zwischen 7 Tieren pro Betrieb im Bezirk Landeck und 24 Tieren im Bezirk Kufstein. Bedeutend ist, dass es aufgrund der Alpung zu einem starken Wechsel in der Betriebsstruktur kommt. Die systematische Bekämpfung von Tierseuchen gehört zu den Kernaufgaben des Instituts für Veterinärmedizin der Österreichischen Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit (AGES). Am 1. August 2004 trat die BVD-Verordnung bundesweit in Kraft und löste die freiwilligen BVD-Eradikationsprogramme der einzelnen Bundesländer ab. Auch in Tirol war seit 1999 in Zusammenarbeit mit der Veterinärabteilung der Tiroler Landesregierung ein freiwilliges BVD-Eradikationsprogramm organisiert worden. Ziel war ein jährlich durchgeführtes, flächendeckendes Screening auf PI-Tiere und Ausmerzung von Virusträgern ohne Anwendung einer Impfung. Im Zeitraum 1999/2000 wurde erstmals bei Rindern in der Altersgruppe von 3 Monaten bis 3 Jahren der BVDV- Antigen Status mittels ELISAs flächendeckend erhoben. Ein Jahr später erfolgte die Untersuchung von Tieren im Alter zwischen 2 Monaten und 2 Jahren. Ab dem Jahre 2002 wurden die nachgeborenen Kälber im Alter von 14 Tagen bis ca. 18 Monaten gezielt auf BVDV-Antigen untersucht. Identifizierte Virusträger wurden - sofern nicht schon geschlachtet - in einem zweiten Untersuchungsgang ca. 8 Wochen später nachuntersucht und die bestätigten PI-Tiere ausgemerzt. Während des freiwilligen Bekämpfungsprogramms im Jahr 2003 wurden Seren, welche in 2 Untersuchungsgängen im BVDV-Antigen-ELISA positiv reagiert hatten, im Rahmen einer Laborkooperation mit dem Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen Anhalt, Fachbereich Veterinärmedizin in Stendal, mittels weiterer molekularbiologischer Untersuchungen analysiert. Vergleichende Untersuchungen von Serumproben in 2 verschiedenen BVDV-Antigen-ELISAs und in der PCR wurden durchgeführt. Ziele dieser Arbeit sind es, einen Überblick über die Umsetzung der BVD-Bekämpfungsstrategie zu geben, vergleichende antigenetische Untersuchungen darzustellen und über die Ergebnisse der Untersuchungen hinsichtlich der beiden BVDV-Genotypen im Bundesland Tirol zu berichten. Material und Methode Entnahme der Blutproben Die Blutprobenentnahmen erfolgten im Zeitraum März- April 2003 bei 45.871 Rindern im Alter von 14 Tagen bis 18 Monaten aus 9.456 Tiroler Rinderbeständen durch die ortsansässigen praktischen Tierärzte. Von den im ersten Untersuchungsdurchgang positiven 169 Serumproben wurden 146 zufällig ausgewählt und einer weiteren molekularbiologischen Untersuchung am Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen Anhalt unterzogen. Da 68 dieser in der Erstuntersuchung positiven Tiere aus den Beständen entfernt worden waren, gelangten nur noch 101 Proben zur Wiederholungsuntersuchung nach 8 Wochen ins Labor. Von diesen wurden nur jene Proben nach Stendal zur Genotypisierung gesandt, deren Ergebnisse im Chekit- BVD-Virus III zweimal positiv waren. Antigen-ELISA Alle Serumproben wurden laut Prüfvorschrift mittels Chekit-BVD-Virus III (Fa. Bommeli, Bern, Schweiz) in Innsbruck auf Glykoprotein E RNS (EO, gp 48) untersucht. Laut Herstellerangaben liegt die Sensitivität dieses Tests bei 89,3-95,9 %. Die Auswertung erfolgte mit dem HT2 Fotometer (Fa. Anthos, Salzburg, Österreich), die Daten wurden mit dem Software Programm Win Read 3.0. beurteilt. Am Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen Anhalt wurden die Serumproben mittels HerdCheck-BVDV-Antigen-ELISA (Fa. Idexx, Westbrook, Maine, USA) und realtime RT-PCR getestet. In einer Validierungsstudie der Fa. Idexx werden für diesen ELISA eine Spezifität von 97,6-100 % und eine Sensitivität von 98,1-100 % angegeben. Zur Messung der OD-Werte wurde ein Reader der Fa. Tecan (Männedorf, Schweiz) verwendet. Virus-RNA Extraktion Die virale RNA wurde als Gesamtnukleinsäure automatisch auf dem Laborroboter Microlab Star (Fa. Hamilton, Bonaduz, Schweiz) unter Verwendung magnetischer 255

Tab. 1: PCR-Untersuchungsergebnisse bei erstuntersuchten Seren Test real-time RT-PCR (n=146) Ergebnis positiv 1 negativ 2 Spezifität 3 Sensitivität 3 Von den 45.871 im Zeitraum von März bis April 2003 untersuchten Tieren wurden 169 (0,37 %) mittels Chekit- BVD-Virus III-ELISAs als Antigen-positiv erkannt. Die von den 169 positiven Seren zufällig ausgewählten 146 wurden weiter untersucht. 93 Seren konnten in der real-time RT-PCR als BVDV positiv bestätigt werden (Tab. 1). Mit 52 in der PCR negativen Proben und 10 in der PCR positiven Seren wurde ein HerdCheck-Antigen-ELISA durchgeführt. Von den 10 Proben, welche sowohl im Chekit- BVD-Virus III-ELISA als auch in der real-time RT-PCR positiv reagierten, wurden 8 auch im HerdCheck-Antigen- ELISA als positiv erkannt. Dies entspricht einer Sensitivität dieses ELISAs von 80 %. Die negativen PCR-Ergebnisse konnten bei 51 von 52 Proben bestätigt werden (Spezifität 98,1 %). Eine einzige Probe war in beiden ELISA-Testsystemen im Gegensatz zur PCR positiv. Nach 8-10 Wochen wurden wie oben erwähnt 101 Blutproben zur Bestätigung der Viruspersistenz an das Institut für veterinärmedizinische Untersuchungen in Innsbruck eingesandt. Alle Proben zeigten im Chekit-BVD-Virus III-ELISA eine positive Reaktion. Davon wurden 47 Proben, die im Chekit-BVD-Virus III-ELISA zweimal ein positives Ergebnis gezeigt hatten, einer weiteren molekularbiologischen Unter- Chekit-BVD- Virus-III- positiv 93 53 - - ELISA (n=146) HerdCheck- Antigen- positiv 8 1 ELISA 98,1 % 80 % (n=62) negativ 2 51 1 Eine Stichprobe von 10 Seren (aus 93 in der RT-PCR bestätigten) wurde nochmals mittels HerdCheck Antigen-ELISA überprüft. 2 Von den 53 in der RT-PCR negativen Proben konnten nur 52 im HerdCheck-BVDV-Antigen-ELISA wiederholt werden, da von einer Probe zu wenig Material vorhanden war. 3 Spezifität (Sensitivität) des HerdCheck Antigen ELISAs bei Annahme der RT-PCR als Goldstandard Tab. 2: Untersuchungsergebnisse bei der Nachuntersuchung Test real-time RT-PCR (n=47) Ergebnis positiv negativ gesamt Chekit (n=47) 1 positiv 44 3 47 Idexx (n=3) positiv - - - negativ - 3 3 1 Diese Proben waren im Chekit ELISA wiederholt positiv. Beads (AGOWA mag Midi DNA Isolation Kit, Fa. Agowa, Berlin, Deutschland) isoliert. Die Bestätigung für die Isolierung inhibitorfreier Nukleinsäure erfolgte für jede Probe durch eine real-time PCR zum Nachweis des Myostatingens, das als genomische DNA je Zelle in einfacher Kopie vorliegt (LAUBE et al., 2001). Real-time RT-PCR Die real-time RT-PCR wurde zunächst als pan-pestiviraler Nachweis geführt (GAEDE et al., 2005b). Die Detektion der PCR-Produkte erfolgte durch eine fluoreszenzmarkierte Pestivirus-Sonde im TaqMan-Format. In einer zweiten real-time RT-PCR schloss sich der spezifische Nachweis von BVDV-2 an. Dabei wurde die Diskriminierung von BVDV-2 durch Verwendung einer für diese Virusspezies spezifischen Sonde erreicht (McGOLDRICK et al., 1999). Die verwendeten Primer und Sonden waren von der Biotez GmbH bzw. von TIB Molbiol GmbH (Berlin, Deutschland) hergestellt worden. Die real-time RT-PCR wurde auf dem icycler (Fa. Biorad, Hercules, USA) durchgeführt. Der detaillierte Reaktionsansatz der one-step-protokolle wurde, wie bei GAEDE et al. (2005b) beschrieben, durchgeführt. Das einheitliche Temperatur-Zeit-Programm der one-step RT-PCR richtete sich nach den Herstellerangaben des verwendeten Quantitect Probe RT-PCR Kit (Fa. Qiagen, Hilden, Deutschland). Ergebnisse 256

suchung am Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen Anhalt unterzogen. 44 Proben ließen sich in der PCR bestätigen. Die 3 in der real-time RT-PCR negativen Proben waren ebenfalls im HerdCheck-Antigen-ELISA negativ (Tab. 2). Untersuchung auf BVDV-Genotypen Die Untersuchung von 137 Proben auf BVDV-2 mit der spezifischen Sonde in der real-time RT-PCR erbrachte ausnahmslos negative Ergebnisse. Diskussion Im alpinen Bereich sind die Voraussetzungen für die BVD-Bekämpfung besonders schwierig. Jahreszeitlich bedingt, speziell durch die Alpung, kommt es zu einem bedeutsamen Wechsel in der Betriebsstruktur. Während im Winter die Betriebe im Schnitt mit 17 Stück Vieh ausgesprochen klein sind, können während der Sommerperiode auf der Alm mehrere hundert Tiere in einer Herde vereint sein. Seit August 2004 ist die Verordnung über ein Untersuchungsprogramm zur Bekämpfung der Bovinen Virusdiarrhöe und der Mucosal Disease bei Rindern in Kraft getreten. Dadurch sind auch neue Bestimmungen für das In-Verkehr-Bringen von Rindern rechtsverbindlich wirksam. Gerade dem Tierverkehr in Tirol wird seit 2004 eine große Bedeutung in der Infektionsepidemiologie von BVDV beigemessen (WEGSCHEIDER et al., 2005). Für die Diagnostik einer persistenten Infektion wurde neben den kommerziellen ELISAs ein mittlerweile in BVD- Bekämpfungsprogrammen verbreitetes real-time RT-PCR- Verfahren eingesetzt (GAEDE et al., 2003). Diese real-time RT-PCR ist auf hoch konservierte Bereiche im Pestivirusgenom gerichtet und weist daher sowohl BVDV-1 als auch BVDV-2 nach. Die Spezifität wird bei der RT-PCR mit bis zu 100 % angegeben (DREW et al., 1999; ROSSMANITH et al., 2001). Damit ist die Grundlage für effektive PI-Screeningprogramme insbesondere auf der Basis gepoolter Blut- oder Milchproben bzw. von Tankmilch gegeben (DÜNSER et al., 2004, GAEDE et al., 2005b). Für erforderliche Einzeltieruntersuchungen sind gegenwärtig E RNS - Antigen-ELISAs die Methode der Wahl. Sensitivität und Spezifität dieser Tests werden durch die Wahl der testinternen monoklonalen Antikörper bestimmt. Diese Antikörper können durch unspezifische Bindung an Serumbestandteile falsch-positive Reaktionen bedingen. Dem wird die Vorgabe bestimmter stringenter Reaktionsbedingungen entgegengestellt. Bei den hier dargestellten Untersuchungen ergaben 51 der erstuntersuchten Proben im Chekit-BVD-Virus III-ELI- SA ein positives Ergebnis, welches aber in 2 voneinander unabhängigen Testmethoden (zweiter ELISA und real-time RT-PCR) nicht bestätigt werden konnte, so dass ersteres Ergebnis als falsch-positiv betrachtet werden muss. Im Rahmen der Wiederholungsuntersuchungen waren es 3 aus 47 Proben, die falsch-positiv reagierten. Diese 47 Seren waren im Gegensatz zu den ersten Einsendungen vorselektiert, da sie zweimal ein positives Ergebnis im Chekit-BVD-Virus III-ELISA aufgewiesen hatten. Es muss in diesen Fällen von unspezifischen ELISA-Reaktionen ausgegangen werden, was die Notwendigkeit umfassender Feldprüfungen durch die diagnostischen Hersteller vor In-Verkehr-Bringen von Tests unterstreicht. Alternativ ist in Betracht zu ziehen, dass bei der Erstuntersuchung neben PI auch transient infizierte Rinder als positiv beurteilt wurden. Allerdings bleibt in diesem Falle jedoch die Frage zu beantworten, warum diese transient infizierten Tiere in der üblicherweise sensitiveren RT-PCR negativ reagiert hätten. Im Hinblick auf die Sicherheit der BVD-Bekämpfung ist die sensitive Identifizierung von PI-Tieren entscheidend. Die hier festgestellten falsch-positiven Ergebnisse haben daher weniger gravierende Folgen als falsch-negative. Da das primäre Ziel dieser Studie die Prävalenzschätzung von BVDV-2 in Tirol war, umfasste das Untersuchungsmaterial für die Methodenvergleiche ausschließlich ELISA-positive Proben. Eine allgemeine Aussage über falsch-negative Ergebnisse kann daher nicht getroffen werden. Abgesehen davon zeigten 2 Proben ein positives Ergebnis sowohl in der PCR als auch im Chekit-BVD-Virus III-ELISA, jedoch ein negatives Ergebnis im HerdCheck- Antigen-ELISA. Dies spricht für das Vorliegen eines falschnegativen Ergebnisses in diesem ELISA. Der wahre Status der einzigen Probe mit negativem PCR-Ergebnis aber übereinstimmend positiven Ergebnissen der beiden ELI- SAs konnte nicht ermittelt werden, da für eine weitere Abklärung über die kulturelle Virusisolierung zu wenig Serum zur Verfügung stand. Möglicherweise liegt hier eine unspezifische Reaktion der beiden ELISAs vor. Andererseits ist auch ein falsch-negatives PCR-Ergebnis nicht auszuschließen. Dies kann durch den enzymatischen Abbau viraler RNA durch deren Freisetzung infolge der wiederholten Gefrier-Tauzyklen bedingt sein. Außerdem ist auch eine Inhibition der RT-PCR durch die Probenmatrix (Serum oder Plasma) vorstellbar. Die als Inhibitionskontrolle durchgeführte Myostatin-PCR belegt zwar, dass das Serum ohne Inhibition für die PCR aufbereitet worden war. Damit ist jedoch nicht die fehlerfreie reverse Transkription (RT) der viralen RNA dokumentiert. Hierzu müsste idealerweise mit einer internen RNA-Kontrolle gearbeitet werden. Für einen in Erprobung befindlichen kommerziellen realtime RT-PCR Kit zum BVDV-Nachweis liegen hierzu bereits überwiegend positive Daten vor (GAEDE et al., 2005a). Seit Mitte der 1990er Jahre kam es ausgehend vom nordamerikanischen Kontinent zu einer raschen Verbreitung neuer und zum Teil hochvirulenter BVDV-Stämme, die inzwischen als selbständige Pestivirus-Spezies BVDV-2 taxonomisch eingeordnet werden (RIDPATH et al., 1994). Da die Differenzierung zwischen BVDV-1 und BVDV-2 anfangs aufwendige Sequenzierungen voraussetzte, waren flächendeckende epidemiologische Erhebungen kaum möglich. Dagegen lässt die beschriebene Verfahrensweise der real-time-pcr eine relativ einfache spezifische Detektion von BVDV-2 zu. Damit konnten erstmalig Daten über die Verbreitung von BVDV-1 und BVDV-2 in Tirol erhoben werden. Die in dieser Studie erhobenen Ergebnisse deuten auf das dominante Vorkommen von BVDV-1 in der Tiroler Rinderpopulation hin. Dies deckt sich mit den Ergebnissen der Untersuchungen von KOLES- AROVA et al. (2004), bei denen der Subgenotyp BVDV-1f als der in Österreich dominierende identifiziert wurde. Ähnliche Berichte, die auf hauptsächliches Vorkommen von BVDV-1 hinweisen, liegen aus Norditalien und England vor (VILCEK et al., 1999; FALCONE et al., 2001). Dagegen weisen Untersuchungen aus dem benachbarten deutschen Bundesland Bayern mit 11,5 % (11 aus 96 Isolaten im Zeitraum 1992-1996) auf eine relativ hohe Prävalenz 257

von BVDV-2 hin (WOLFMEYER et al., 1997). Offensichtlich ist es bisher aber gelungen, einen Eintrag von BVDV-2 über den Tierverkehr in die Tiroler Rinderpopulation zu verhindern. Literatur AMA-Datenbank (2005): Datenbank der Agrar Markt Austria, Dresdnerstrasse 70, 1210 Wien. BEER, M., WOLF, G. (1999): Selektion von BVDV-Genotyp II-Isolaten mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers und FACS- Analyse. Berl. Münch. Tierärztl. Wschr. 112, 345-350. BOLIN, S. R., RIDPATH, J. F. (1999): Prevalence of bovine viral diarrhea virus genotypes and antibody against those viral genotypes in fetal bovine serum. Vet. Diagn. Invest. 10, 135-139. DREW, T. W., YAPP, F., PATON, D. J. (1999): The detection of bovine viral diarrhoea virus in bulk milk samples by the use of a single-tube RT-PCR. Vet. Microbiol. 64, 145-154. DÜNSER, M., SCHWEIGHARDT, H., SCHÖPF, K. (2004): Eradikation der Bovinen Virus Diarrhoe mittels Real Time PCR. Klauentierpraxis 12, 83-86. FALCONE, E., CORDIOLI, P., SALA, G., TARANTINO, M., TOL- LIS, M. (2001): Genotyping of bovine viral diarrhoea viruses isolated from cattle in northern Italy. Vet. Res. Commun. 25, 161-167. FLEBBE, U., MEHRKENS, L. (1992): BVD/MD und ihre Bekämpfung in Niedersachsen. Deutsch. Tierärztl. Wschr. 99, 217-220. GAEDE, W., GEHRMANN, B., KÖRBER, R. (2003): BVD-Virämikereliminierung: effektives Herdenscreening durch Kombination von RT-PCR und Antigen-ELISA in Blut- und Milchproben. Berl. Münch. Tierärztl. Wschr. 116, 234-239. GAEDE, W., RAHN, U., WEIMANN, Y., TIRPITZ, J. (2005a): Erste Erfahrungen mit Chekit-BVD-Real Real Time RT-PCR Kit zum Nachweis von RNA des Virus der Bovinen Virusdiarrhoe. 5. Internationales Symposium zur BHV 1-, BVD- und Paratuberkulosebekämpfung vom 09.-11.03.2005 in Stendal (Deutschland), Poster Nr. 7. GAEDE, W., REITING, R., SCHIRRMEIER, H., DEPNER, K. R., BEER, M. (2005b): Nachweis und Spezies-spezifische Differenzierung von Pestiviren mit der real-time RT-PCR. Berl. Münch. Tierärztl. Wschr. 118, 113-120. KOLESAROVA, M., FRANZ, S., JACKOVA, A., VILCEK, S., MÖSTL, K., BENETKA, V., SCHÖPF, K., SCHODER, G., HOFER, J., BAUMGARTNER, W. (2004): Genetic typing of Bovine Viral Diarrhoea Virus from Austrian field samples. Vet. Med. Austria/Wien. Tierärztl. Mschr. 91, 265-268. LAUBE, I., BUTSCHKE, A., ZAGON, J., SCHAUZU, M., KROH, L., BROLL, H. (2001): Nachweisverfahren für Rindfleisch in Lebensmitteln unter Anwendung der TaqMan-Technologie. Bundesgesundheitsblatt 44, 326-330. McCLURKIN, A. W., LITTLEDIKE, E. T., CUTLIP, R. C., FRANK, G. H., CORIA, M. G., BOLIN, S. R. (1984): Production of cattle immunotolerant to bovine viral diarrhea virus. Can. J. Comp. Med. 48, 156-161. McGOLDRICK, A., BENSAUDE, E., IBATA, G., SHARP, G., PATON, D.J. (1999): Closed one tube reverse transcription nested polymerase chain reaction for the detection of pestiviral RNA with fluorescent probes. J. Virol. Methods 79, 125-135. PELLERIN, C., HURK, J. van den, LECOMTE, J., TUSSEN, P. (1994): Identification of a new group of bovine viral diarrhea virus strains associated with severe outbreaks and high mortalities. Virology 203, 260-268. PETERHANS, E., BACHOFEN, C., JUNGI, T. W., SCHWEIZER, M. (2004): BVD-Virus: wie man das Immunsystem weniger Tiere überlistet und damit in der Wirtspopulation weltweit erfolgreich ist. Vet. Med. Austria/Wien. Tierärztl. Mschr. 12, 327-335. RIDPATH, J. F., BOLIN, S. T., DUBOVI, E. J. (1994): Segregation of bovine viral diarrhea virus into genotypes. Virology 205, 66-74. ROSSMANITH, W., VILCEK, S., WENZL, H., ROSSMANITH, E., LOITSCH, A., DURKOVIC, B., STROJNY, L., PATON, D. J. (2001): Improved antigen and nucleic acid detection in a bovine virus diarrhoea eradication program. Vet. Microbiol. 81, 207-218. VILCEK, S., DREW, T. W., MC GOLDRICK, A., PATON, D. J. (1999): Genetic typing of bovine pestiviruses from England and Wales. Vet. Microbiol. 69, 227-237. WEGSCHEIDER, M., DÜNSER, M., SCHWEIGHARDT, H., SCHÖPF, K. (2005): Infektionsdynamik in Tiroler Rinderbeständen mit BVD-Geschehen. 5. Internationales Symposium zur BHV 1-, BVD- und Paratuberkulose-Bekämpfung, Stendal (Deutschland), Poster Nr. 5. WOLFMEYER, A., WOLF, G., BEER, M., STRUBE, W., HEHNEN, H. R., SCHMEER, N., KAADEN, O. R. (1997): Genomic (5 UTR) and serological differences among German BVDV field isolates. Arch. Virol. 142, 2049-2057. Rechtsnorm: 2004 Verordnung der Bundesministerin für Gesundheit und Frauen über ein Untersuchungsprogramm zur Bekämpfung der Bovinen Virusdiarrhöe und der Mucosal Disease bei Rindern (BVD- Verordnung) vom 22. Juli 2004, BGBl. 2004/303, idgf. Anschrift der Verfasser: Dr. Karl Schöpf, Dr. Monika Matt, Langer Weg 27, A-6020 Innsbruck; Dr. Wolfgang Gaede, Haferbreiter Weg 132-135, D-39576 Stendal. e-mail: karl.schoepf@ages.at 258