Experimentelle Studie 1 Non-invasive, ortsaufgelöste Bestimmung von Gewebeeigenschaften der Augenlinse hinsichtlich Rheologie, Brechungsindex, Dichte und Proteinkonzentration unter Anwendung der Brillouin-Spektroskopie Non-Invasive, Spatially Resolved Determination of Tissue Properties of the Crystalline Lens with regard to Rheology, Refractive Index, Density and Protein Concentration by using Brillouin Spectroscopy Autoren S. Reiß 1, O. Stachs 2, R. Guthoff 2, H. Stolz 1 Institute 1 Institut für Physik, Universität Rostock 2 Augenklinik, Universität Rostock Schlüsselwörter " Katarakt " Presbyopie Augenlinse " Key words " Cataract " presbyopia eye lens " eingereicht 13.7.2011 akzeptiert 11.11.2011 Bibliografie DOI http://dx.doi.org/ 10.1055/s-0031-1281952 Klin Monatsbl Augenheilkd 2011; 228: 1 7 Georg Thieme Verlag KG Stuttgart New York ISSN 0023-2165 Korrespondenzadresse Stephan Reiß Institut für Physik, Universität Rostock Universitätsplatz 3 18055 Rostock Tel.: ++ 49/3 81/4 98 67 84 Fax: ++ 49/3 81/4 98 67 82 stephan.reiss@uni-rostock.de Zusammenfassung Die konfokale Brillouin-Spektroskopie stellt ein Messverfahren dar, mit dessen Hilfe es möglich ist, die rheologischen Eigenschaften von Materialien non-invasiv zu bestimmen. Ihre Anwendung in der Augenheilkunde kann die Möglichkeit bieten, in vivo die Verformungseigenschaften transparenter biologischer Gewebeabschnitte wie Hornhaut oder Augenlinse ortsaufgelöst zu ermitteln. Dies scheint hinsichtlich der aktuellen Presbyopieforschung ein vielversprechender Ansatz. Durch die ortsaufgelöste Erfassung der viskoelastischen Eigenschaften der Augenlinse ist ein besseres Verständnis des natürlichen Alterungsprozesses der Linse sowie der Einflüsse unterschiedlicher Linsentrübungen auf deren Steifigkeit zu erwarten. Aus den gewonnenen spektralen Daten kann zusätzlich auf die relativen Proteinkonzentrationen, den relativen Brechungsindexverlauf sowie den relativen Dichteverlauf innerhalb des Linsengewebes geschlossen werden. Das Prinzip der konfokalen Brillouin-Mikroskopie aufgrundlage der spektralen Auswertung spontaner Brillouin-Streusignale unter Verwendung hochauflösender dispersiver Bauelemente wird vorgestellt. Eigene In-vitro-Messergebnisse an tierischen und menschlichen Linsen werden präsentiert und hinsichtlich ihrer rheologischen Aussagekraft bewertet. Diese Daten werden bekannten Forschungsergebnissen gegenübergestellt. Abstract The confocal Brillouin spectroscopy is an innovative measurement method that allows the noninvasive determination of the rheological properties of materials. Its application in ophthalmology can offer the possibility to determine in-vivo the deformation properties of sections of transparent biological tissue such as the cornea or eye lens with spatial resolution. This seems to be a promising approach concerning current presbyopia research. Due to the spatially resolved detection of the viscoelastic lens properties, a better understanding of the natural aging process of the lens and the influences of different lens opacities on the stiffness is expected. From the obtained spectral data the relative protein levels, the relative refractive index profile and the relative density profile within the lens tissue can be derived in addition. A measurement set-up for confocal Brillouin microscopy based on spectral analysis of spontaneous Brillouin scattering signals by using a high-resolution dispersive device is presented. First in-vitro test results on animal and human lenses are presented and evaluated concerning their rheological significance. These data are compared with known research results. Brillouin-Spektroskopie Streuung optischer Strahlung, welche in vielen natürlichen Objekten unvermeidlich auftritt, kann dazu ausgenutzt werden, Auskunft über dessen Materialeigenschaften zu erhalten. Brillouin beschrieb 1922 erstmals den Effekt, dass kohärent eingestrahltes Licht, welches an thermisch erregten Schallwellen gestreut wird, eine Frequenzverschiebung erfährt, die gleich der Frequenz der streuenden Schallwelle ist [1]. In jedem Medium ist ständig ein Untergrund thermisch induzierter, statistisch verteilter akustischer Wellen über einen weiten Frequenzbereich präsent. Das an ihnen gestreute Licht wird als spontanes Brillouin-Streulicht bezeichnet ( " Abb. 1). Seine Messung kann mithilfe der Brillouin-Spektroskopie erfolgen und liefert einen direkten Zusammen- Korrekturexemplar: Veröffentlichung (auch online), Vervielfältigung oder Weitergabe nicht erlaubt A
2 Experimentelle Studie Abb. 1 Streuprozesse an periodischen Dichteschwankungen. hang zu den rheologischen Eigenschaften des Materials. Dabei wird die spektrale Änderung des gestreuten Lichtes zum einfallenden monochromatischen Laserlicht bestimmt. Da die Streuung des einfallenden Lichtes aufgrund der akustischen Gitterbzw. Molekülschwingungen um ihre Gleichgewichtslage auftritt, wird nach Doppler das Brillouin-Streulicht um den gleichen Betrag zur höheren und zur niederen Frequenz in Bezug zur Frequenz des einfallenden Lichtes verschoben. Man spricht hier von der Stokes- und Anti-Stokes-Brillouin-Frequenzverschiebung (Formel 1). 2nν L ν B = ± c Vcos ( Θ 2 ) Δν B Brillouin-Frequenzversatz ν L Laserfrequenz n Brechungsindex des Materials c Lichtgeschwindigkeit im Vakuum V Schallgeschwindigkeit im Material θ Streuwinkel Aus dem Frequenzversatz (Δν B ) der inelastisch gestreuten Brillouin-Frequenz (ν B ) zur elastisch gestreuten Rayleigh-Frequenz (ν R ) lässt sich auf die rheologischen Eigenschaften des Messorts in der Probe schließen. Aufgrund der Messung in Rückstreuung an longitudinalen akustischen Schallwellen [2, 3] in viskoelastischen Materialien kann der Dehn- bzw. Elastizitätsmodul, der ein Maß für die Steifigkeit des Materials ist, nicht ermittelt werden [4]. Es ist jedoch mithilfe des vorgestellten Verfahrens möglich, eine direkte Aussage über die Volumenelastizität (auch Kompressionsmodul [K] genannt) zu treffen und somit eine Bewertung hinsichtlich der Rückformung des zu untersuchenden Materials zu liefern. Der Kompressionsmodul kann aus folgendem mathematischem Zusammenhang berechnet werden (Formel 2]): c ν ν B K = ( L ) 2 ρ 2 n cos ( Θ 2 ) Hier ist ρ die Dichte der zu untersuchenden Probe. Der Kompressionsmodul gibt das Verhältnis von allseitiger Druckänderung zur Volumenänderung an und bietet somit die Möglichkeit, die Augenlinse in Bezug auf ihre rheologischen Eigenschaften zu bewerten. Gerade hinsichtlich der Klärung der Ursachen der Alterssichtigkeit ist dies von großem Interesse, da im Laufe des Lebens ein Verlust der Elastizität der Augenlinse mit der Abnahme des Akkommodationserfolgs einhergeht [5]. (1) (2) Der gemessene Brillouin-Versatz eröffnet die Möglichkeit, weitere wichtige Eigenschaften des Linsengewebes abzuleiten. Da die Schallgeschwindigkeit innerhalb des Linsengewebes direkt mit dem Brechungsindex und der Dichte zusammenhängt, lassen sich diese als relativer Verlauf innerhalb der Augenlinse aus dem gemessenen Brillouin-Frequenzversatz bestimmen [6]. Außerdem ist der Brechungsindex linear mit der Proteinkonzentration [7, 8] verbunden, wodurch sich die relative Proteinkonzentrationsverteilung aus den Messdaten der Brillouin-Spektroskopie berechnen lässt. Der Zusammenhang zwischen Schallgeschwindigkeit und Proteinkonzentration in biologischem Gewebe wurde in früheren Veröffentlichungen von de Korte et al. [9], Vaughan et al. [10] und Goss et al. [11] bereits diskutiert und nachgewiesen. Nach dem empirischen Modell von Goss et al. [12], welches auf der Grundlage einer statistischen Analyse von 15 Gewebearten entstand, wurde ein Ansatz entwickelt, mit dem man in der Lage ist, über die Schallgeschwindigkeit im Gewebe auf die Proteinkonzentration zu schließen (Formel 3]). M(V V 0 ) P = 100 % (3) V 0 V ist die Schallgeschwindigkeit im Gewebe, P entspricht der prozentualen Proteinkonzentration und M stellt einen Korrekturfaktor dar, deren Größe abhängig ist von der Schallgeschwindigkeit innerhalb des Gewebes. V 0 ist die Schallgeschwindigkeit, die vorhanden ist, wenn keine Protein- und Collagenkonzentrationen vorhanden sind. Messung von Brillouin-Streusignalen unter Verwendung hochauflösender dispersiver Elemente Die Herausforderung in der Brillouin-Spektroskopie besteht darin, das inelastisch gestreute Licht vom elastisch gestreuten Rayleigh-Licht, welches zusätzlich gestreut wird, zu trennen. Zum einen ist das elastisch gestreute Licht um Größenordnungen intensiver als das inelastisch gestreute Brillouin-Licht und zum anderen ist der Frequenzversatz zwischen diesen Streuanteilen mit einigen GHz nur sehr gering. In der Umsetzung der Brillouin-Spektroskopie für die In-vivo-Anwendung am menschlichen Auge ergibt sich eine zusätzliche Schwierigkeit: Um das Linsengewebe möglichst gering zu belasten, ist es notwendig, Laserlicht mit niedriger Frequenz bzw. großer Wellenlänge zu verwenden. Erhöht man jedoch die Wellenlänge der Anregungslichtquelle, so verringert sich der Frequenzversatz des inelastisch gestreuten Lichtes zum dominierenden elastischen Streuanteil. Dadurch steigt die Anforderung an die spektrale Auflösung des Spektrometers. Durch den Einsatz eines Virtually Imaged Phased Array (VIPA) [13] kann man dieser Anforderung jedoch gerecht werden. Hierbei handelt es sich um ein hochauflösendes dispersives Element, welches gegenüber einem optischen Gitter eine bis zu 20-mal höhere Winkeldispersion [14] und einen Intensitätsverlust der einfallenden Strahlung von weniger als 20 % aufweist. Das VIPA funktioniert nach dem Prinzip eines Vielstrahl-Interferometers. Es besteht aus einer dünnen Glasplatte, die unterschiedlich stark reflektierende Schichten besitzt ( " Abb. 2). Das aus dem zu untersuchenden Linsengewebe gestreute Licht wird über eine zylindrische Sammellinse in das VIPA als Linie fokussiert. Dort kommt es zu einer Vielzahl von Reflexionen, die ein Feld von Austrittsstrahlen produzieren, welche miteinander interferieren. Diese Interferenz hat zur Folge, dass Korrekturexemplar: Veröffentlichung (auch online), Vervielfältigung oder Weitergabe nicht erlaubt Reiß S et al. Non-invasive, ortsaufgelöste Bestimmung Klin Monatsbl Augenheilkd 2011; 228: 1 7
Experimentelle Studie 3 virtuelle Abbildung R 100 R = 95% Abb. 2 Schematischer Aufbau und Funktion eines VIPA-basierten Spektrometers. δ R 0 Glas cyl. Linse Linse EM CCD Abb. 3 Schematische Darstellung des Tandem- VIPA-Messaufbaus; AL zu untersuchende Augenlinse (Probe), L1 Objektivlinse, L2 /L3 /L4 /L5 Sammellinsen, CL1 /CL2 /CL3 Cylinderlinsen, S Spiegel, LB Lochblende. Intensität/w. E. Abb. 4 Typisches Brillouin-Spektrum (oben) mit CCD-Ausgabe (unten) von Methanol. Experimentelle Umsetzung Ein eigens für die Messung entwickelter Halbleiterlaser (unter Verwendung einer Laserdiode LD-0780 0100-AR der Firma TOPTICA Photonics) liefert mit einer Wellenlänge von 780 nm die kohärente Strahlquelle. Diese Wellenlänge stellt einen akzeptablen Kompromiss zwischen der Strahlenbelastung des zu untersuchenden biologischen Gewebes und der realisierbaren spektralen Trennung des inelastischen vom elastischen Streuanteil dar. In " Abb. 3 ist der schematische Aufbau eines Tandem-VIPA dargestellt. Über eine Objektivlinse (L1), die eine numerische Apertur von 0,3 besitzt, wird der Laserstrahl in die zu untersuchende Probe bzw. Augenlinse fokussiert. Der zurückgestreute Lichtanteil wird durch die gleiche Linse wieder eingesammelt und über eine Kollektorlinse (L2) auf eine Lochblende (LB) abgebildet. Dadurch werden die Vorteile der konfokalen Mikroskopie [15] ausgenutzt. Die Anforderungen an die Aberration von Objektiv- und Kollektorlinse sind gering, und sogenannte optische Schnitte können vorgenommen werden. Auf diese Weise wird in dem realisierten Messaufbau nur Streulicht eines Volumens von ca. x y z = 0,008 mm 0,008 mm 0,20 mm = 1,3 10 4 mm³ aus der Probe erfasst und weiter über die positive Zylinderlinse (CL1) in das VIPA1 (Auftragsfertigung durch die Firma SLS Optics Ltd.) linienfokussiert. Über eine Sammellinse (L4) und zwei weitere Zylinderlinsen (CL2 /CL3) wird das bereits in seine Frequenzen zerlegte Licht in ein zweites identisches VIPA fokussiert und anschließend über die Linse (L5) auf den Detektor (CCD) abgebildet [16]. Licht entsprechend seiner Wellenlänge das VIPA in verschiedenen Winkeln verlässt. Eine abbildende Linse formt die Winkeldispersion in eine räumliche Abbildung auf einen Detektor (EM CCD) um. Beispielmessungen an verschiedenen Probensystemen Testaufnahmen wurden mit einem Single-VIPA-Aufbau (unter Verwendung nur eines dispersiven Elements) an Flüssigkeiten vorgenommen. " Abb. 4 zeigt ein typisches Brillouin-Spektrum mit dazugehörigem CCD-Bild von Methanol. Es wurde ein Brillouin-Frequenzversatz von 3,74 GHz ermittelt, was bei einer Dichte von ρ = 790 kg/m³ und einer Brechzahl von n = 1,329 nach Formel 2 einen Kompressionsmodul von K = 0,99 GPa ergibt. Es zeigte sich jedoch, dass mit dem Single-VIPA-Aufbau Messungen an biologischem Gewebe nicht möglich sind. Hier ist der Rayleigh-Streuanteil deutlich intensiver als bei klaren Flüssigkeiten und verdeckt so das schwache Brillouin-Signal. Daher wurde in Analogie zu den Überlegungen von Scarcelli und Yun [3, 17] der in " Abb. 3 gezeigte Tandem-VIPA-Aufbau realisiert, der das Brillouin-Signal deutlich vom Rayleigh-Signal trennt und so detektierbar macht. Korrekturexemplar: Veröffentlichung (auch online), Vervielfältigung oder Weitergabe nicht erlaubt
4 Experimentelle Studie Ein weiterer Schritt, das Messverfahren für In-vivo-Anwendung nutzbar zu machen, besteht in der Minimierung der Strahlenbelastung für das Auge. Hier soll eine hochempfindliche EMCCD- Kamera (DU888 DC-BV der Firma ANDOR) Verwendung finden, die bei einer Leistung des einstrahlenden Lasers von 12 mw pro Messpunkt eine minimale Belichtungszeit von 0,3 s erlaubt. Mit dem Tandem-VIPA-Aufbau wurden erste ortsaufgelöste Invitro-Messungen durchgeführt. Aus dem gemessenen Brillouin- Versatz wurden der Kompressionsmodul, der relative Brechungsindex- und Dichteverlauf, die Schallgeschwindigkeit sowie die relative Proteinkonzentrationsverteilung innerhalb der Augenlinse abgeleitet. Zur Fehlerabschätzung der Messergebnisse wurden für jede Messposition 5 Einzelmesswerte aufgenommen und aus ihnen der relative Fehler berechnet. Die In-vitro-Messung wurden an einer Schweinelinse (24 Stunden nach Tötung, Alter 2,5 Jahre), Kaninchenlinse (3 Stunden nach Tötung, Alter 0,5 Jahre) und an einer 48 Jahre alten humanen Linse (72 Stunden nach Tod) durchgeführt. Nach der Extraktion wurden die Linsen bei 4 C in BSSplus-Lösung [16] gelagert. Während der Messungen befanden sich die Linsen in einer Küvette mit 0,9 %iger physiologischer Kochsalzlösung, um eine Dehydrierung zu vermeiden. Die Brillouin-Messungen wurden in Form eines axialen Tiefenscans entlang der optischen Achse beginnend mit der anterioren Linsenfläche bis zur posterioren Linsenfläche durchgeführt. Dabei wurde die Linse in 500 µm Schritten mittels eines Linearmotors, dessen Positioniergenauigkeit 0,1 µm beträgt, verschoben. Eigene Ergebnisse Dargestellt werden die Messergebnisse des Brillouin-Frequenzversatzes sowie berechnete Ergebnisse von Kompressionsmodul, Brechungsindex, Dichte, und Proteinkonzentration. Zur Berechnung des Kompressionsmoduls nach Formel 2] müssen für Brechungsindex und Dichte Annahmen erfolgen. Häufig wird sich hierzu auf globale Werte für Brechungsindex und Dichte bezogen [2], welche jedoch nicht der Gradientenstruktur der Linse [7, 8] entsprechen. Durch ein Iterationsverfahren, das auf dem Zusammenhang von Proteinkonzentration und Brechungsindex beruht [18], erfolgt eine Anpassung dieser Einflussgrößen. Zu Beginn der Iteration werden ein minimaler und ein maximaler Brechungsindex angenommen. Nach Formel 1] werden mithilfe dieser Startwerte und der gemessenen Brillouin-Frequenzversätze innerhalb der Linse die jeweiligen Schallgeschwindigkeiten berechnet. Aus diesen werden nach Formel 3] die Proteinkonzentrationen bestimmt. Aufgrund des Zusammenhangs von Proteinkonzentration und Brechungsindex ist man in der Lage, auf einen neuen Brechungsindexverlauf innerhalb der Linse zu schließen. Mithilfe der so neu gefundenen Brechungsindizes können erneut die Schallgeschwindigkeiten und Proteinkonzentrationen ermittelt werden. Diese Iterationsschleife wird so oft durchlaufen, bis sich der Wert für den Brechungsindex nur noch minimal ändert. Als Ergebnis erhält man den relativen Proteinkonzentrations- und Brechungsindexverlauf durch die Linse. Die Startwerte für den Brechungsindex müssen dabei so gewählt werden, dass nach erfolgter Iteration der Brechungsindex für den Linsenkern, dem aus der Literatur bekannten Wert entspricht. Die Iterationsschleife zur Ermittlung des Dichteverlaufes verläuft analog. Infolge der so ermittelten Brechungsindizes und Dichtewerte für die einzelnen Messpositionen, kann nach Formel 2] der jeweilige Kompressionsmodul errechnet werden. Schweinelinse Die Messergebnisse des Brillouin-Frequenzversatzes und der nach Formel 2] berechnete Kompressionsmodul sind in " Abb. 5 dargestellt. Die für die Berechnung zugrunde gelegten Brechungsindizes und Gewebedichten sind als Iterationsergebnis in " Tab. 1 aufgeführt. Dabei wurden dem maximalen Brillouin- Versatz (in Messposition 3,77 mm) die aus der Literatur [19, 20] bekannten Werte für maximalen Brechungsindex und maximale Dichte zugeordnet. " Abb. 6 zeigt die aus Formel 1 berechnete Schallgeschwindigkeit für die einzelnen Messorte und die Trendlinie der Proteinkonzentration durch die Linse. Für die Konstante M wurde der Wert 4,5 angenommen und für die Schallgeschwindigkeit der Wert für Abb. 5 Brillouin-Versatz (Δν B ) und berechneter Kompressionsmodul (K) einer Schweinelinse in-vitro als axialer Scan. V/(m/s) Abb. 6 Schallgeschwindigkeit (V) und Proteinkonzentration (P) einer Schweinelinse aufgrund diskreter axialer Messwerte des Brillouin- Frequenzversatzes. K/GPa P/% Tab. 1 Relativer Brechungsindex- und Dichteverlauf innerhalb einer Schweinelinse in-vitro axialer Scan. Messort/mm 0,72 1,43 2,27 3,03 3,77 4,47 5,15 5,80 6,43 7,04 7,62 Brechungsindex 1,39 1,46 1,48 1,50 1,51 1,50 1,50 1,48 1,46 1,46 1,39 Dichte/(kg/m³) 1030 1071 1079 1094 1098 1094 1090 1083 1071 1071 1030 Korrekturexemplar: Veröffentlichung (auch online), Vervielfältigung oder Weitergabe nicht erlaubt Reiß S et al. Non-invasive, ortsaufgelöste Bestimmung Klin Monatsbl Augenheilkd 2011; 228: 1 7
Experimentelle Studie 5 K/GPa Abb. 7 Brillouin-Versatz (Δν B ) und berechneter Kompressionsmodul (K) einer Kaninchenlinse in-vitro als axialer Scan. K/GPa V/(m/s) P/% V/(m/s) P/% Abb. 8 Schallgeschwindigkeit (V) und Proteinkonzentration (P) einer Kaninchenlinse aufgrund diskreter axialer Messwerte des Brillouin- Frequenzversatzes. Abb. 9 Brillouin-Versatz (Δν B ) und berechneter Kompressionsmodul (K) einer menschlichen Linse in-vitro als axialer Scan. Abb. 10 Schallgeschwindigkeit (V) und Proteinkonzentration (P) einer menschlichen Linse aufgrund diskreter axialer Messwerte des Brillouin- Frequenzversatzes. Tab. 2 Relativer Brechungsindex- und Dichteverlauf innerhalb einer Kaninchenlinse in-vitro axialer Scan. Messort/mm 0,84 1,60 2,34 3,04 3,72 4,37 5,00 5,61 6,19 6,75 Brechungsindex 1,45 1,51 1,58 1,60 1,60 1,57 1,58 1,54 1,52 1,44 Dichte/(kg/m³) 1057 1073 1092 1097 1098 1099 1091 1082 1075 1054 Tab. 3 Relativer Brechungsindex- und Dichteverlauf innerhalb einer menschlichen Linse in-vitro axialer Scan. Messort/mm 0,71 1,06 1,41 1,75 2,09 2,47 2,79 3,10 3,40 3,71 4,01 Brechungsindex 1,36 1,37 1,40 1,41 1,40 1,42 1,39 1,42 1,41 1,38 1,37 Dichte/(kg/m³) 1051 1057 1073 1079 1074 1085 1068 1083 1081 1063 1056 Wasser. Die Ergebnisse sind auf die reale Messposition innerhalb der Linse bezogen. Kaninchenlinse Die Auswertung der Messdaten erfolgte hinsichtlich Brillouin- Versatz und Kompressionsmodul ( " Abb. 7). Die iterativ gefundenen Daten für Brechungsindex und Dichte sind in " Tab. 2 zu sehen. Hier wurden dem maximalen Brillouin-Versatz (Messposition 3,72 mm) der Brechungsindex mit 1,6 und die Dichte mit 1098 kg/m³ zugeordnet [21]. " Abb. 8 zeigt Schallgeschwindigkeits- und Proteinkonzentrationsverlauf axial durch die Linse. Zur Berechnung der Trendlinie der Proteinkonzentration wurde ein Korrekturfaktor M = 3,0 angenommen. Menschliche Linse Die Messergebnisse sind in den " Abb. 9, 10 sowie in " Tab. 3 entsprechend den Auswertungen von Schweine- und Kaninchenlinse dargestellt. Zur Berechnung des Kompressionsmoduls wurde der zentrale Brechungsindex von 1,42 und die Dichte von 1085 kg/m³ [2, 22] dem maximalen Brillouin-Versatz am Messpunkt 2,47 mm zugeordnet. Die Schallgeschwindigkeit und die Proteinkonzentrationsverteilung (Trendlinie) für die diskreten Messpositionen sind in " Abb. 10 dargestellt. Der Korrekturfaktor M wurde mit 4,5 angenommen. Korrekturexemplar: Veröffentlichung (auch online), Vervielfältigung oder Weitergabe nicht erlaubt
6 Experimentelle Studie Bewertung des Potenzials der Brillouin-Mikroskopie Das vorgestellte Prinzip ermöglicht es, die Brillouin-Streuung am biologischen Gewebe, speziell in der Augenlinse, zu messen. Die Methode liefert eine ortsabhängige Änderung des Brillouin-Frequenzversatzes und damit des Kompressionsmoduls in axialer Richtung. Eigene Messungen an Linsen weisen auf ein höheres Kompressionsmodul und damit ein höheres Volumenelastizitätsmodul im Linsenkern als in der Linsenrinde hin. Diese Ergebnisse stimmen mit den Ergebnissen von Vaughan et al. [10], Bailey et al. [2] und Scarcelli et al. [3] überein. Im Vergleich der 3 gemessenen Linsen zeigt sich, dass die Kaninchenlinse das größte Kompressionsmodul im Linsenkern besitzt, und auch die Schweinelinse eine signifikant größere Volumenelastizität als die menschliche Linse aufweist. Dies bestätigen die Angaben von Vilupuru et al. [20]. Die Messdaten der menschlichen Augenlinse stellen eine Besonderheit dar. Der Brillouin-Versatz und damit das ermittelte Kompressionsmodul weisen signifikante Fluktuationen auf. Untersuchungen anderer Forschergruppen [3, 7, 9, 23] an tierischen und menschlichen Linsen konnten ortsabhängige Änderungen hinsichtlich Schallgeschwindigkeits- und Brechungsindexverteilung nicht feststellen. Jedoch zeigen die Messungen von Kasthurirangan et al. [24] eine ähnliche Homogenitätsänderung hinsichtlich der Verteilung des Brechungsindexes, wie sie in " Abb. 9, 10 dargestellt sind. Zur Untersuchung dieser Auffälligkeit bedarf es hier jedoch weiterer systematischer Untersuchungen. Es muss geprüft werden, ob ein Zusammenhang zwischen der Stärke der Fluktuation und dem Alter der Linse besteht. Sollte sich diese noch durchaus spekulative Vermutung bestätigen, würde sie eine neue Beurteilung der altersabhängigen Veränderung der Augenlinse ermöglichen. Jedoch ist nicht auszuschließen, dass postmortale Veränderungen im Linsengewebe die Ursache für diese Fluktuationen darstellen. Ein Zusammenhang zwischen Linsenalter und Höhe des Kompressionsmoduls, wie von Scarcelli et al. [23] an tierischen Linsen gefunden wurde, konnte von Bailey et al. [2] aufgrund von Messungen an 29 menschlichen Linsen nicht bestätigt werden. Invivo-Untersuchungen könnten neue Erkenntnisse liefern, da eventuelle Gewebeveränderungen, wie sie bei In-vitro-Messungen auftreten können, auszuschließen sind. Die Gründe für die Unterschiede im Kompressionsmodul zwischen Linsenrinde und Linsenkern sind in der Zusammensetzung der Linsenmatrix zu suchen. Bereits Vaughan et al. [10] stellten einen Zusammenhang zwischen der Höhe des Brillouin-Frequenzversatzes und der Höhe der Proteinkonzentration bzw. des Wassergehalts fest. Die Augenlinse besteht zu durchschnittlich 66 % aus Wasser [25]. Die Wasserkonzentration nimmt von der Linsenrinde zum Linsenkern hin und mit zunehmendem Alter ab [26]. Da die Augenlinse das eiweißreichste Organ darstellt [18, 27], muss außerdem die Verteilung der Proteine in Bezug auf die Linsenkonsistenz innerhalb der Linse näher betrachtet werden. So fand Ulrich [18] bereits 1990 eine Korrelation zwischen dem Proteingehalt der Linse und der Linsenkonsistenz sowie zwischen Proteingehalt und Brechungsindex. Gum [27] erkannte eine Veränderung der Proteinverteilung innerhalb der Linse in Abhängigkeit vom Alter. Dabei nimmt mit zunehmendem Alter die Proteinkonzentration innerhalb des Linsenkerns ab und innerhalb der Linsenrinde zu. Untersuchungen an Tierlinsen zeigten, dass z. B. Fischlinsen mit der höchsten Proteinkonzentration eine große Linsenhärte und einen hohen Brechungsindex besitzen. Vögel dagegen haben einen geringen Proteingehalt und somit eine weiche Linse mit niedrigem Brechungsindex [28]. Tab. 4 Maximale Proteinkonzentration an in-vitro gemessenen Linsen im Vergleich zu früheren Veröffentlichungen. Schweinelinse Kaninchenlinse menschl. Linse de Korte et al. [9] Latina et al. [30] Urs [6] 64 % 66 % 70 % 73 % 50 % 50 % Diese Erkenntnisse finden ihre Bestätigung in den aufgeführten Messergebnissen. Aufgrund des Zusammenhangs der Schallgeschwindigkeit im Linsengewebe und der Proteinkonzentration [6] kann aus dem Brillouin-Frequenzversatz (nach iterativer Angleichung des Brechungsindexes) die relative Proteinkonzentration innerhalb der Augenlinse bestimmt werden. Die Ergebnisse stimmen mit früheren Veröffentlichungen [6, 9, 12, 22, 24, 29] überein. Görig et al. [29] geben in einer Gegenüberstellung der globalen Schallgeschwindigkeiten von Kaninchenlinsen, Schweinelinsen und menschlichen Linsen für das Kaninchen einen Wert von (1748 ± 26) m/s an. Diese Angabe korreliert gut mit dem ermittelten Durchschnittswert von 1744 m/s für die Kaninchenlinse aus " Abb. 8. Des Weiteren zeigten Görig et al. [29], dass die Schallgeschwindigkeit innerhalb der Kaninchenlinse höher ist als innerhalb der Schweinelinse. Die Schallgeschwindigkeit im Linsengewebe des Schweines ist hingegen größer als innerhalb der menschlichen Linse. Auch diese Angaben stimmen gut mit den eigenen Ergebnissen überein. Demzufolge ist auch die Proteinkonzentration in der Kaninchenlinse am höchsten und die Proteinkonzentration der menschlichen Linse geringer als in der Schweinelinse. Die Proteinkonzentration wurde aus der Schallgeschwindigkeit im Linsengewebe aufgrundlage des empirischen Modells von Goss et al. [12] (Formel 3]) abgeleitet. Hierbei musste der Korrekturfaktor M entsprechend angepasst werden. Dies stellte bereits Urs [6] fest, welcher ebenfalls eine erhöhte Proteinkonzentration von 50 % für die menschliche Linse berechnete ( " Tab. 4). Ansonsten wird die globale Proteinkonzentration mit 33 % in der Literatur angegeben. Erst nach einer Neubewertung des Korrekturfaktors für das zu untersuchende Gewebe kann dieses empirische Modell zu vergleichenden Betrachtungen herangezogen werden. Dann aber ist es durchaus möglich, mittels der Brillouin-Spektroskopie eine vergleichbare Aussage zur Proteinkonzentrationsverteilung innerhalb der Augenlinse treffen zu können. Zusammenfassung Fazit für die Praxis eigene Messungen Schallgeschwindigkeit, Brechungsindex, Proteinkonzentration, Dichte und Kompressionsmodul sind korrespondierende physikalische Eigenschaften. Mithilfe der Brillouin-Spektroskopie ist es möglich, ortsaufgelöste Aussagen hinsichtlich dieser Eigenschaften des Linsengewebes zu treffen. Unter der Annahme bestimmter Randbedingungen können der relative Verlauf von Brechungsindex, Dichte und Proteinkonzentration innerhalb der Augenlinse bestimmt werden. Aufgrund des optimierten Tandem-VIPA-Aufbaus und der Verwendung eines sensitiven Detektors, welcher kurze Messzeiten von unter 0,3 s zulässt, kann bei einer Laserleistung von 12 mw die Laserschutzklasse 2 eingehalten werden. Dadurch ist die Anwendung dieses Verfahrens auch in vivo möglich. Korrekturexemplar: Veröffentlichung (auch online), Vervielfältigung oder Weitergabe nicht erlaubt Reiß S et al. Non-invasive, ortsaufgelöste Bestimmung Klin Monatsbl Augenheilkd 2011; 228: 1 7
Experimentelle Studie 7 Interessenkonflikt: Nein Danksagung Die Autoren danken dem Department Science and Technology of Life Light and Matter der Universität Rostock, der DFG (Transregio37, Micro- and Nanosystems in Medicine Reconstruction of Biological Functions) and REMIDIS für Ihre Unterstützung. Literatur 01 Brillouin L. Diffusion de la lumiere et des rayonnes X par un corps transparent homogene influence delàgitation thermique. Ann Phys 1922; 17: 88 122 02 Bailey ST, Twa MD, Gump JC et al. Light scattering study of the normal human eye lens: elastic properties and age dependence. IEEE Transaction on biomedical engineering 2010; 57: 2910 2917 03 Scarcelli G, Yun SH. Confocal Brillouin microscopy for three-dimensional mechanical imaging. Nature Photonics 2007; 2: 39 43 04 Mezger T. Das Rheologie-Handbuch. Hannover: Vincentz2000 05 Young T. On the mechanism of the eye. Philosophical Transactions of the Royal Society of London 1801; 91: 23 88 06 Urs R. Investigation of accommodation and presbyopia using ultrasound imaging during ex vivo simulated accommodation [Dissertation]. Coral Gables, Florida: University of Miami 2010, http://scholarlyrepository.miami.edu/oa_dissertatinons/360 07 Barer R, Joseph S. Refractometry of living cells. Quarterly Journal Microscopy in Science 1954; 95: 399 423 08 Pierscionek B, Smith G, Augusteyn RC. The refractive increments of alpha, beta and gamma crystallins. Vision Research 1987; 27: 1539 1541 09 De Korte CL, Van der Steen AFW, Thijssen JM et al. Relation between local acoustic parameters and protein distribution in human and porcine eye lenses. Experimental Eye Research 1994; 59: 617 627 10 Vaughan JM, Randall JT. Brillouin scattering, density and elastic properties of the lens and cornea of the eye. Nature 1980; 284: 489 491 11 Goss SA, Dunn F. Concentration Dependence of Ultrasonic Absorption in Aqueous Solutions of Bovine Serum Albumin. Ultrasonics Symposium 1974, 65 68 12 Goss SA, Frizzell LA, Dunn F et al. Dependence of the ultrasonic properties of biological tissue on constituent proteins. Journal of the Acoustical Society of America 1980; 67: 1041 1044 13 Shirasaki M. Virtually Imaged Phased Array. FUJITSU Sci Tech J 1999; 35: 113 125 14 Shirasaki M. Large angular dispersion by a virtually imaged phased array and ist application to a wavelength demultiplexer. Optics Letters 1996; 21: 366 368 15 Minsky M. Memoir on inventing the confocal scanning microscope. Scanning 1988; 10: 128 138 16 Reiß S, Burau G, Stachs O et al. Spatially resolved Brillouin spectroscopy to determine the rheological properties of the eye lens. Biomedical Optics Express 2011; 2: 2144 2159 17 Scarcelli G, Yun SH. Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy. Optics Express 2011; 19: 10913 10922 18 Ulrich K. Linsenproteine (Kristalline). Hrsg. Vergleichende Biochemie der Tiere. Jena: Fischer 1990, 322 332 19 Dillingham AK, Deuring H, Hilborn GJ et al. DE Patent No DE 000060113085 T2. 2006 20 Vilupuru AS, Glasser A. Optical and biometric relationship of the isolated pig crystalline lens. Ophthalmic & physiological optics: the journal of the British College of Ophthalmic Opticians (Optometrists) 2001; 21: 296 311 21 Hughes A. A schematic eye for the rabbit. Vision Res 1972; 12: 123 138 22 Jones CE, Atchison DA, Meder R et al. Refractive index distribution and optical properties of the isolated human lens measured using magnetic resonance imaging (MRI). Vision Res 2005; 45: 2352 2366 23 Scarcelli G, Yun SH. Brillouin microscopy for ocular biomechanics. Lasers and Electro-Optics (CLEO) and Quantum Electronics and Laser Science Conference (QELS) 2010 24 Kasthurirangan S, Markwell EL, Atchison DA et al. In vivo study of changes in refractive index distribution in the human crystalline lens with age and accommodation. Invest Ophthalmol Vis Sci 2008; 49: 2531 2540 25 Fisher RF, Pettet BJ. Presbyopia and the water content of the human crystalline lens. J Physiol 1973; 234: 443 447 26 Samuelson DA. Embryology and anatomy. In: Gelatt KN (Hrsg) Veterinary Ophthalmology. 2. Aufl. Philadelphia: Lea und Febinger 1991, 75 84 27 Gum GG. Physiology of the eye. In: Gelatt KN (Hrsg) Veterinary Opthalmology. 2. Aufl. Philadelphia: Lea und Febiger 1991, 138 143 28 Wileke K. Morphologische und physiologische Untersuchungen an transparenten und katarktösen Linsen von Farm- und Wildlachsen (Dissertation). Berlin: Freie Universität Berlin 2008 29 Görig C, Varghese T, Stiles T et al. Evaluation of acoustic wave propagation velocities in the cular lens and vitreous tissues of pig, dog and rabbits. American Journal of Veterinary Research 2003; 67: 288 295 30 Latina M, Chylack LT, Fagerhom P et al. Dynamic light scattering in the intact rabbit lens. Its relation to protein concentration. Investigative ophthalmology & visual science 1987; 28: 175 183 Korrekturexemplar: Veröffentlichung (auch online), Vervielfältigung oder Weitergabe nicht erlaubt