Mikrobielle Ökologie VL 4 Gradienten und Aktivitäten Bert Engelen engelen@icbm.de www.icbm.de/pmbio Aerobe Atmung <CH 2 O> + O 2 CO 2 + H 2 O Glucose 2 Pyruvat CO 2, Reduktionsäquivalente NAD + 2 e - e - schrittweise über steigendes Redoxpotential zu O 2 transportiert H + O 2 Protonen-Gradient CO 2 GTP H 2 O Atmungskette FADH 2 freie Energie wird zur Bildung benutzt 1
Veratmung von alternativen Elektronenakzeptoren: Glucose NAD + H + 2 e - Protonen-Gradient X Pyruvat X red. CO 2 Nitrit TCC CO 2 Nitrat Thiosulfat GTP Eisen III NADPH FADH 2 Mangan IV Uran VI Spezialfall der Denitrifikation: Nitrat-Nitrit-Atmung NAD + Glucose 2 e - Protonen-Gradient Pyruvat CO 2 H + NO 3 - H 2 O NO - 2 Anhäufung von Nitrit im Medium (oder Blut) TCC CO 2 GTP Bei nitratreicher Nahrung: Cyanose bei Säuglingen (Methämoglobin) NADPH FADH 2 2
Denitrifikation Nitrat-Ammonifikation 2 NO 3 -+ 2 H + + 10 [H] N 2 + 6 H 2 O NO 3 -+ 2 H + + 8 [H] NH 4 + 3 H 2 O - liefert 90% der Energie der Reduktion von O 2 - geringere freie Energie als bei Umsetzung zu N 2 Abb.: Cypionka (2003) Abb.: Cypionka (2003) Gewinn an freier Energie (ΔG 0 ) je nach: Anzahl der übertragenen Elektronen Differenz der Redoxpotenziale (E o ) Stichwort: Nernstsche Gleichung ΔG ' = z F Δ 0' 0 E E o [mv] Aerobe Atmung O 2 /H 2 O +820 ΔG 0 = -2870 kj/mol Glucose Denitrifikation NO 3- /N 2 +751 ΔG 0 = -2715 kj/mol Glucose Nitrat-Ammonifikation NO 3- /NH 4 +363 ΔG 0 = -1800 kj/mol Glucose /NAD + - 320 FADH/FAD + - 220 Energiegewinn 3
Welche Prozesse finden wir in Sedimenten? Vertikale Abfolge von Elektronenakzeptoren im Sediment O 2 NO 3 - MnO 2 Fe(III) SO 4 2- E o [mv] O 2 /H 2 O +820 Aerobe Atmung NO - 3 /N 2 +751 Denitrifikation NO - 3 /NH + 4 +363 Nitratammonifikation MnO 2 /Mn 2+ +390 Manganreduktion FeOOH +150 Eisenreduktion SO 2-4 /HS - -218 Sulfatreduktion S o /HS - -240 Schwefelreduktion CO 2 /CH 4-244 Methanogenese CH 4 Idealisiertes Schema Frage? Was tun, wenn kein Elektronenakzeptor für die Atmungskette vorhanden ist? Antwort! Gärung! 4
Das generelle Prinzip einer Gärung Energiekonservierung nicht durch: - chemiosmotische Mechanismen (Protonen-Gradient) sondern durch: - Substrat-Phosphorylierung -Ausbeute und Wachstumsertrag gering! Bsp.: Alkoholische Gärung: wenig Biomasse, viel Alkohol Bezeichnung der Gärungen nach ihren charakteristischen Endprodukten Alkohol (Ethanol) Milchsäure Buttersäure Propionsäure Gemisch verschiedener Säuren Das generelle Prinzip einer Gärung Glucose Organisches Substrat Reduktionsäquivalente 2 Pyruvat CO 2, Atmungskette Protonengradient [H] Abbau Intermediate oxidierte Produkte reduzierte Produkte CO 2 GTP Energiekonservierung nicht : - chemiosmotisch (Protonen-Gradient) FADH 2 sondern: - Substrat-Phosphorylierung 5
Die homofermentative Milchsäuregärung Glucose 6 COOH C O CH 3 2 Pyruvat 2 NAD + 2 2 Lactat COOH HC OH Lactat-Dehydrogenase CH 3 Das anaerobe Nahrungsnetz Polymere Monomere Primäre Gärer Sekundäre Gärer, Syntrophe Sulfatreduzierer Methanogene Fettsäuren, Succinat, Alkohole, Lactat Formiat, H 2, CO 2, Methanol Acetat CH 4, CO 2 CO 2 6
Mikrobielle Aktivitäten Welche Aktivitäten zeigen Mikroorganismen? Phytoplankton: Produktion im Mittel 68.7 g C org m 2 a -1 (etwa 1 Tafel Schokolade) Zooplankton: Freßraten von Flagellaten: 5-300 Bakterien h -1 Bakterien: Ekto-, Exoenzyme, zersetzen Detrituspartikel und Polymere ingestierte Partikel werden stets osmotroph aufgenommen das ganze Gewässer dient als Nahrungsvakuole der Bakterien Effektive Aufnahme von N, P, Fe 7
Wie weist man mikrobielle Aktivitäten nach? Substratverwertung Tracer Analyse von Zellbestandteilen Wachstum Wärmefreisetzung Hemmung Produktbildung Wie mißt man die Aktivitäten, Probleme??? System ist im Fließgleichgewicht (Es tut sich fast nichts) Erhebliche Veränderung der Situation durch: Div. Kontrollen Substratzusatz Ausschluß von Größenklassen oder Licht etc. => Tracer in Spurenkonzentrationen am besten geeignet Tracer sollen - natürliche Konzentration möglichst wenig erhöhen - nur kurz umgesetzt werden, damit sie nicht in einen Kreislauf geraten 8
Wie mißt man die Aktivitäten? Messung von Primäproduktion: 14 CO 2 -Fixierung im Licht (minus Dunkelkontrolle) O 2 -Freisetzung (minus Dunkelkontrolle) Messung von Bakterienwachstum: 3 H-Thymidin-Aufnahme (1/4 der DNA) Einbau von markierten Aminosäuren (Leucin) 35 S-SO 2-4 Assimilation -Zunahme Wie mißt man die Aktivitäten? Messung von mikrobiellen Abbauvorgängen: CO 2 -Freisetzung O 2 -Aufnahme Umsatz von Modellsubstraten 9
Substratumsatz Probleme: - Fließgleichgewicht (steady state, Bildungsrate Verbrauchsrate) - Natürliche Konzentrationen meist nur 10-100 nm - Div. Kontrollen, Substratzusatz, Ausschluss von Größenklassen oder Licht etc. verändern die Situation schnell grundlegend Messung des Nettoumsatzes nur an sehr aktiven Standorten z.b. CO 2 -Freisetzung, O 2 -Aufnahme Bestimmung des "Heterotrophen Potenzials", Zusatz von Substratüberschuss, (Einbau von zugesetzten markierten Substraten,? Glucose,? Konzentration im Vergleich zur natürlichen Konzentration) Abschätzung von v max Einsatz von Tracern z.b. 14 C, 35 S, fluoreszierende Modellsubstrate wie MUF (Methylumbelliferyl-Rest fluoresziert nach Abspaltung durch (Exo)-Enzym) Welche Wachstumsraten zeigen Mikroorganismen? Phytoplankton abhängig von Jahreszeit, N, P Fe, Licht etc. (Temp.?) Bakterien Verdopplungszeit von 1-20 d Wodurch sind die Aktivitäen und Wachstum limitiert? Nicht grundsätzlich durch Licht, Temperatur, CO 2 Meist durch Nährstoffe: Fe > N > P > (Mn) (Si) 10
Beispiel photosynthetische Primärproduktion CO 2 + H 2* O <CH 2 O> + * O 2 Messung der 14 CO 2 -Fixierung im Licht (z.b. Flasche im See) Erhöhung der CO 2 -Konzentration meist kein Problem Dunkelkontrolle zum Abzug der CO 2 -Fixierung im Dunkeln? Netto- oder Brutto-Fixierung: Anfangs nur Aufnahme O 2 -Freisetzung (minus Dunkelkontrolle) nur bei sehr hohen Raten sinnvoll Hemmung 11
Wirkung von Hemmstoffen Möglichst spezifische Blockade von essentiellen Prozessen Anhäufung von Intermediaten oder alternativen Endprodukten Langfristig Veränderung des Systems... (kurzfristig einsetzen!) Wirkung von Hemmstoffen Plötzliche Dunkelheit hemmt die Photosynthese (s.o.) Filtrieren entfernt Grazer Acetylen (HC HC) hemmt die Denitrifikation (Umsetzung von N 2 O zu N 2 ). Es entsteht N 2 O als Endprodukt und ist leicht im Gaschromatographen nachweisbar Bromethansulfonat (BES) hemmt die Methanogenese. BES ist ein Analoges des Coenzym M Molybdat hemmt die Sulfatreduktion. Molybdat ist ein Analoges des Sulfat Nitrapyrin hemmt die Nitrifikation (Umsetzung von Ammonium zu NItrat). Käuflich als 'N-Serve' etc. 12
(Bakterien)wachstum 3 H-Thymidin-Aufnahme (1/4 der DNA) Tracer Einbau von markierten Aminosäuren (Leucin) Tracer 35 SO 42 -Assimilation ( 1 % der Trockenmasse) Tracer Zunahme von DNA (konst. pro Zelle) Zellbestandteile Zunahme der Zellzahl (Grazer abfiltriert < 2µm) Hemmung FDC (frequency of dividing cells) Ohne Inkubation oder Zusatz von Stoffen! Identifizierung und Zählung aktiver Zellen Umsatz von künstlichen Elektronenakzeptoren, Tetrazoliumsalze INT oder TTC Prinzip: 'Verpackter' Akzeptor wird aufgenommen und reduziert, wobei ein unlösliches, gefärbtes oder fluoreszierendes Produkt entsteht 13
Identifizierung und Zählung aktiver Zellen Mikroautoradiographie: Einbau von radioaktiven Substraten z.b. 14 C-Glutamat in Proteine oder 3 H-Thymidin in die DNA Tracer Zählung teilungsfähiger Zellen mit Nalidixinsäure: Hemmt DNA-Replikation, es entstehen fädige Zellen, die sich nicht teilen Wachstum Bestimmung der Ribosomenzahl mit fluoreszierenden Sonden: Je aktiver eine Zelle, desto mehr Ribosomen hat sie Analyse von Zellbestandteilen Analyse von Zellbestandteilen aktiver Zellen DNA (Epifluoreszenz-Nachweis mit DAPI oder Acridinorange) als indikator intakter Zellen (s.o.) Phospholipide als nur kurzfristig überdauernde Bestandteile Ribosomen: 1000-20 000 pro Bakterium je nach Aktivität, Anfärbung mit RNA-Sonden Messenger-RNA (mrna) als Indikatoren für gerade gebildete Proteine molekularbiologische Methoden... 14
... und nochmal zurück zur quantitativen PCR Prinzip der Polymerase Chain Reaction DNA-Doppelstrang 94 C Denaturierung - Schmelzen der DNA 50-65 C Annealing - Primeranlagerung 72 C Elongation - Kettenverlängerung n C 100 Denaturierung 90 80 Elongation 70 60 Annealing 50 40 0 1 2 3 4 5 6 Minuten Typisches PCR-Programm Schritt 1: Denaturierung 94 C 5 min 1 Schritt 2: Denaturierung 94 C 1 min Annealing ~ 55 C 1 min ~ 30 Elongation 72 C 1 min Schritt 3: Elongation 72 C 5 min 1 15
Realtime PCR: Funktionelle Gene Methanosarcinales Methylamin, DMS Methanomicrobiales Wasserstoff + CO 2 Methanosarcinales Methylierte Aromaten (Huminsäuren, Torf?) Wilms et al. (2006) FEMS Microbiol Ecol (submitted 16