Vergleich von diagnostischen Methoden zum Nachweis der Koi-Herpesvirus Herpesvirus-Infektion (KHV-I) Fischgesundheitsdienst Dr. Kerstin Böttcher, Dr. Grit Bräuer Vergleich von diagnostischen Methoden zum Nachweis der KHV-I Einleitung direkter indirekter Erregernachweis Material und Methoden Methoden zum indirekten Erregernachweis Ergebnisse Vergleich Methoden zum indirekten Erregernachweis Vergleich direkter indirekter Erregernachweis Befunde Negativ- + Positivkontrollen, Angelgewässer Zusammenfassung + Diskussion Schlußfolgerung
Einleitung Projekt der TSK, gefördert aus Mitteln der Fischereiabgabe: Vergleich von diagnostischen Methoden zum Nachweis der KHV-Infektionam Beispiel von sächsischen Angelgewässern -2x indirekter Erregernachweis: ELISA, SNT - 1x direkter Erregernachweis: PCR Einleitung Direkter Erregernachweis
Einleitung Direkter Erregernachweis, z.b. PCR (Polymerase- Kettenreaktion, gentechnischer Nachweis von Erbgut- Teilen des KHV) Einleitung Indirekter Erregernachweis (Nachweis einer Reaktion auf den Erreger)
Einleitung Erreger dringt in Fisch ein Einleitung Bildung von n (AK), die mehr oder weniger spezifisch für den Erreger sind (Schlüssel-Schloß-Prinzip)
Einleitung Bindung der an Erreger Einleitung Zurückdrängung/ Vernichtung des Erregers durch verschiedene Mechanismen bleiben noch vorhanden
Einleitung zirkulieren im Blut Blutentnahme Einleitung Labordiagnostischer Nachweis von spezifischen n, z.b. mittels -ELISA oder SNT
Material und Methoden: Indirekter Erregernachweis : -ELISA(Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) - mit Teilen des Erregers (Antigen) beschichtete Platten Material und Methoden: Zugabe der Proben
Material und Methoden: Inkubation der Probenansätze Material und Methoden: Bindung spezifischer AK (falls vorhanden) an Antigen
Material und Methoden: Spülen Material und Methoden: Zugabe von AK gegen Karpfenantikörper
Material und Methoden: Inkubation Material und Methoden: Gegen Karpfenantikörper gerichtete AK binden an Karpfen-AK (falls vorhanden)
Material und Methoden: Spülen Material und Methoden: Zugabe von n gegen die letzten AK, die mit einem bestimmten Enzym gekoppelt sind (Konjugat)
Material und Methoden: Inkubation Material und Methoden: Konjugatbindet an die zuletzt zugegebenen AK (falls vorhanden)
Material und Methoden: Spülen Material und Methoden: Zugabe eines chemischen Stoffes, der durch Einwirken des Enzyms farbig wird
Material und Methoden: Indirekter Erregernachweis : -ELISA - Inkubation Kein Farbumschlag = NEGATIV Farbumschlag = POSITIV -> quantitative Bestimmung photometrisch -> Relation zur Positivkontrolle Material und Methoden: SNT Indirekter Erregernachweis : SNT (Serum-Neutralisationstest) - Mischen der Proben mit lebendem Labor-Virus
Material und Methoden: SNT Inkubation: neutralisierende (falls vorhanden) binden + neutralisieren damit das Virus Material und Methoden: SNT Zugabe der Probe zu einer Zellkultur
Material und Methoden: SNT Inkubation: nicht neutralisiertes Virus infiziert Zellen und zerstört sie, neutralisiertes Virus greift Zellen nicht an Material und Methoden: SNT Zerstörte Zellen = Zellrasen erhalten = NEGATIV POSITIV
Material und Methoden Blutentnahme aus kaudaler Hohlvene von Karpfen Beprobung Mai September 2010 Wassertemperaturen 15 24 C Untersuchte Größenklassen: K2, K3, KL (Negativkontrollen) K3 (Positivkontrollen) K3, KL (Angelgewässer) Serumgewinnung Material und Methoden Aufteilung in 3 Proben (Cefas*, FLI**, Rückstellprobe) - Cefas: kommerzieller -ELISA(KHV) -FLI: laboreigener SNT (KHV) Bis zur Versendung tiefgekühlte Lagerung -18 C Zeitgleich Gewinnung von Gewebeproben zur KHV- Untersuchung mittels PCR (LUA Dresden) * Centre for Environment, Fisheries& Aquaculture Science (Weymouth, GB) ** Friedrich-Loeffler-Institut, Nationales Referenzlabor für Fischseuchen, Riems
1. Methodenvergleich ELISA SNT Material und Methoden Material und Methoden insg. 73 Serumproben KHV-AK-ELISA + KHV-SNT - 32 aus Angelgewässern - 10 Positivkontrollen aus infizierten Beständen - 31 Negativkontrollen aus unverdächtigen Betrieben weitere 7 Proben wurden nur mit einer serologischen Methode untersucht 72 Gewebeproben KHV-PCR
Ergebnisse: Vergleich der direkten und indirekten Methoden Erwartungshaltung ELISA: empfindlich, Nachweis jeglicher KHV-spezifischer, die an das Antigen binden SNT: sehr spezifisch, Nachweis nur von neutralisierenden n => Mehr positive Ergebnisse beim ELISA zu erwarten Ergebnis Übereinstimmung: 39/73 (~ 53 %) Unstimmigkeit: 34/73 (~47%) Ergebnisse: Vergleich der direkten und indirekten Methoden Unstimmigkeiten: ELISA SNT negativ verdächtig 9x negativ positiv 7x positiv negativ 7x verdächtig negativ 4x verdächtig positiv 4x positiv verdächtig 3x => völlig gegensätzliche Ergebnisse 14x (ca. 19%)!!! Bei Mehrfachuntersuchungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten z.t. abweichende oder sich widersprechende Ergebnisse
Ergebnisse: Vergleich der direkten und indirekten Methoden Indirekter Erregernachweis ELISA (75): 33 x neg. 12 x verd. 30 x pos. SNT (78): 27 x neg. 16 x verd. 35 x pos. Direkter Erregernachweis KHV-PCR (72): 68 x neg. 4x pos. Ergebnisse: Vergleich der direkten und indirekten Methoden Serumproben der 4 PCR-positiven Fische: Nachweis spez. AK mit beiden Methoden (ELISA: 3x positiv, 1x verdächtig, SNT: 4x positiv) Serumproben der 68 PCR-negativen Fische: bei 30 Fischen mit einer oder beiden Methoden Nachweis spezifischer AK => Kein Widerspruch: vorhandene AK unterdrücken das Virus, KHV zieht sich zurück, ist dann schwer nachweisbar
Ergebnisse: Befunde Negativkontrollen Betrieb Vorbericht n ELISA SNT PCR 1 regelm. Brutzukauf aus BY, seit 2007 immer negativ mit PCR untersucht, bisher niemals KHV- Klinik(KAT. III) 9 K2 9x neg 6x neg 1x verd 1x pos 9x neg 2 eigene Laichfischbestände, 12 6x neg 11x neg 12x neg seit 2003 regelmäßige Untersuchung m. negativen Ergebnissen auf KHV (KAT. II) KL 2x verd 4x pos 1x verd 3 eigene Laichfische, kein Zukauf von Satzfischen, seit 2003 regelmäßig mit negativen Ergebnissen auf KHV untersucht (KAT. II) 10 K3 6x neg 4x verd 2x neg 4x verd 4x pos 10x neg Ergebnisse: Befunde Positivkontrollen Betrieb Vorbericht n ELISA SNT PCR 4 Teich 1, massiver KHV-Ausbruch 2009 (KAT. V) 8 K3 1x neg 1x verd 1x neg n.a. 6x pos 7x pos 4 Teich 2, massiver KHV-Ausbruch 2010 (KAT. V) 2 K3 1x verd 1x pos 2x pos 2x pos
Ergebnisse: Befunde Angelgewässer Befunde ELISA SNT Haselbacher See (5) 2x neg. 1x neg. 2x verd. 2x verd. 1x pos. 2x pos. - Verluste + KHV-Nachweis im Gewässer 2008 - Gewebeproben KHV-PCR: 5x neg Ergebnisse: Befunde Angelgewässer Befunde ELISA SNT Talsperre Bautzen (15) 7x neg. 6x neg. 1x verd. 7x verd. 7x pos. 2x pos. - Gewässer bisher KHV-unverdächtig - Gewebeproben KHV-PCR: 15x neg
Ergebnisse: Befunde Angelgewässer Befunde ELISA SNT Talsperre Quitzdorf(12) 1x neg. 1x verd. 10x pos. 12x pos. - Gewässer bisher KHV-unverdächtig - Gewebeproben KHV-PCR: 10x neg., 2x pos. Zusammenfassung + Diskussion Ergebnisse KHV-AK-ELISA und KHV-SNT stimmten zu ca. 53% überein Ergebnisse von SNT und ELISA sind nicht vergleichbar es werden unterschiedliche AK gemessen Mehrfachuntersuchungen ein und derselben Probe zu verschiedenen Zeitpunkten führten sowohl beim ELISA als auch beim SNT teilweise zu unterschiedlichen Ergebnissen
Zusammenfassung + Diskussion Einzeltier Nachweis von KHV-spezifischen AK in 100% der KHV-PCRpositivenKarpfen mit einer oder beiden Methoden Nachweis von KHV-spezifischen AK in ca. 44% der KHV-PCRnegativen Karpfen mit einer oder beiden Methoden Bestand KHV-AK nachweisbar mit ELISA oder SNT bei fast allen Proben aus Beständen mit KHV-Historie= Positivkontrollen: bis zu 100% positive Proben KHV-AK auch nachweisbar mit ELISA oder SNT in Beständen unabhängig vom Seuchenstatus = Negativkontrollen: 0 bis 40% positive Proben! Zusammenfassung + Diskussion 3 untersuchte Angelgewässer: ca. 20 50 % positive Proben in ELISA oder SNT in 2 Gewässern ohne aktuellen KHV-Nachweis(PCR) bis zu 100 % positive Proben in 1 Gewässer mit zeitgleichem KHV-Nachweis(PCR)
Zusammenfassung + Diskussion viele AK-Nachweise, insbesondere bei Negativkontrollen (meist nur einzelne Individuen positiv) => Nachweis anderer AK (Kreuzreaktionen, z.b. Karpfenpocken)? => oder Nachweis natürlicher (unspezifischer) AK, die mit Alter des Fisches zunehmen? einziger komplett negativ (ELISA) untersuchter Bestand war K2 => oder Nachweis von AK gegen eine apathogene Variante des KHV, das mit üblichem PCR nicht erfasst wird? Schlußfolgerung Mit ELISA-oder SNT-Ergebnissenalleine keine sichere Aussage über Seuchenstatus einer Population möglich Kombination verschiedener Methoden zum direkten + indirekten Nachweis erhöht u.u. die Aussagekraft bei Nachweis von AK müsste sich im StreßtestKHV mittels PCR nachweisen lassen ( einmal Herpes immer Herpes ) Weitere Forschung unbedingt erforderlich
Vielen Dank an die Betriebe und die Angler, die uns die Karpfen für dieses Projekt zur Verfügung gestellt haben! Danke für Ihre Aufmerksamkeit