Vergleich von diagnostischen Methoden zum Nachweis der Koi-Herpesvirus- Infektion (KHV-I) am Beispiel von Proben aus sächsischen Angelgewässern

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1 Projektbericht Vergleich von diagnostischen Methoden zum Nachweis der Koi-Herpesvirus- Infektion (KHV-I) am Beispiel von Proben aus sächsischen Angelgewässern - gefördert aus Mitteln der Fischereiabgabe des Freistaates Sachsen - Dr. Kerstin Böttcher, Dr. Grit Bräuer, Sächsische Tierseuchenkasse Einleitung Im Jahr 2003 wurde die Koi-Herpesvirus-Infektion (KHV-I) erstmalig bei Nutzkarpfen in Sachsen nachgewiesen. Betroffen waren drei Fischhaltungsbetriebe. Die fünf infizierten Karpfenbestände zeigten hochgradige Verlustgeschehen. Bis heute hat die Zahl der nachgewiesenen Infektionen und der betroffenen Betriebe dramatisch zugenommen. So wurde im Jahr 2008 die KHV-I in 109 Karpfenbeständen aus 26 Betrieben festgestellt, so dass von einer weiten Verbreitung des Virus in den Fischhaltungsbetrieben ausgegangen werden muss. Demgegenüber wurde das Virus in Angelgewässern im Zusammenhang mit Fischsterben bisher nur selten nachgewiesen. Nach wie vor ist jedoch die epidemiologische Bedeutung verschiedener Angelgewässer im Zusammenhang mit KHV-I-Ausbrüchen in darunterliegenden Teichwirtschaften ungeklärt. Erstmalig im Jahr 2008 erfolgten KHV-Nachweise auch in zwei Wildgewässern, die von den sächsischen Anglerverbänden als Angelgewässer benutzt werden. Klare epidemiologische Hintergründe waren jedoch nicht ermittelbar. Es bestand lediglich der Verdacht auf die Einschleppung mit zugekauften Karpfen. Als Haupteinschleppungsursache in bislang unbelastete Gewässer gilt der Besatz mit unerkannten Virusträgern. In der Vergangenheit musste dies trotz vorhergehender negativer Untersuchungen von klinisch gesunden Satzfischen auf KHV mittels Erreger- bzw. Erregererbgutnachweis durch die in Sachsen angewandte PCR Technik mehrfach festgestellt werden. In unerkannten Virusträgern ist die Zahl der vorhandenen Viren derart gering und zudem unregelmäßig verteilt, dass ein Nachweis schwierig sein kann. KHV gehört zu den Viren, die sich im Wirtsorganismus latent aufhalten. Das heißt, im Verlaufe der Infektion wird ein Zustand erreicht, in dem kein infektiöses Virus mehr nachweisbar ist, es sich aber in Wirtszellen zurückgezogen hat und durch den Einfluss von Stressfaktoren wieder reaktiviert werden kann. Deshalb sind zusätzliche Methoden erforderlich, um die Nachweissicherheit zu erhöhen. In der Diskussion stehen immer wieder serologische Methoden, die dazu dienen, bestimmte Abwehrstoffe (spezifische Antikörper) des Fisches zu ermitteln. Diese Stoffe werden als Reaktion des Fischkörpers auf den Kontakt mit einem Krankheitserreger in diesem Fall KHV gebildet. Antiörper sind noch nachweisbar, wenn der Erreger nicht mehr im Körper zirkuliert bzw. sich inbestimmte Organe zurückgezogen hat. Ob sie diagnostisch verwertbar sind und wie lange sie meßbar sind, ist noch umstritten. Deshalb sollten im Rahmen des Projektes zwei Methoden zum KHV-Antikörpernachweis geprüft und mit der vorhandenen, validierten Methode zum Erregernachweis verglichen werden. Durch den Vergleich der Laborbefunde, die mit den verschiedenen Methoden erhoben wurden, sollten Hinweise zur Verwertbarkeit dieser Methoden in der Praxis

2 ermittelt werden. Die Ergebnisse der Antikörpernachweise sollten an den Erregernachweisen bzw. den klinischen Ergebnissen auf Plausibilität geprüft werden. Zusätzlich sollte der KHV-I-Status von vier geografisch nicht im Zusammenhang stehenden sächsischen Angelgewässern durch diese Untersuchungen ermittelt werden. In einem Gewässer gelang es jedoch nicht, Karpfen zur Beprobung zu fangen. Um das Probenkontingent auszuschöpfen, wurden Proben aus infizierten Fischbeständen (Positivkontrollen) sowie aus unverdächtigen Fischhaltungsbetrieben ( Negativkontrollen ) gewonnen. Material und Methoden Zum Vergleich der drei diagnostischen Methoden wurden Paralellproben von einzelnen Fischen untersucht. Je Fisch wurden zum einen Gewebeproben mittels molekularbiologischer Methode auf KHV-Erbgut, zum anderen Blutserumproben durch zwei verschiedene Methoden auf das Vorhandensein von KHV-spezifischen Antikörpern untersucht. Herkunft der Proben Die Proben wurden im Zeitraum bis von zweisömmrigen (K2), dreisömmrigen (K3) oder älteren (KL) Karpfen entnommen. Die beprobten Karpfen stammten aus folgenden Gewässern und Betrieben: Am Beispiel von Proben aus dem Haselbacher See sollte untersucht werden, wie sich die KHV-Infektion nach den klinischen Ausbrüchen des Jahres 2008 weiterentwickelt. Weiterhin wurden Proben aus den Talsperren Bautzen und Quitzdorf gewonnen. Diese waren zwar bisher klinisch unauffällig und anhand geringer Probenzahlen negativ auf KHV untersucht worden, jedoch lagen bis dahin keine statistisch aussagekräftigen Laborbefunde für diese Gewässer vor. Die geplanten Proben aus der Lunzenau im Einzugsgebiet der Zwickauer Mulde mussten entfallen, da hier keine Karpfen zur Probenahme gefangen werden konnten. Die Karpfen aus den Angelgewässern wurden durch Angler gefangen und für die Beprobung zur Verfügung gestellt. Um in den Methodenvergleich vorberichtlich abgesicherte Proben einzubeziehen, wurden zusätzlich unverdächtige und infizierte Fischbestände als Negativ- und Positivkontrollen beprobt. Die Teichwirtschaften Müglenz (Kategorie II) und Cunnersdorf (Kategorie III) sowie die Fischzucht Wolf (Kategorie II) werden seit Jahren gemäß KHV-Programm regelmäßig mit negativen Ergebnissen auf KHV untersucht. Hier wurden jeweils Proben gezogen und als Negativkontrollen verwendet. Als Positivkontrollen wurden zwei Fischbestände der Teichwirtschaft Weißig beprobt, die 2009 bzw einen akuten KHV-I-Ausbruch erlitten hatten (Kategorie V) sowie ein Fischbestand der Kreba Fisch GmbH, der 2009 zu einem KHV-positiven Restbestand (akuter KHV-Ausbruch 2008) hinzugesetzt wurde, jedoch keine KHVtypische Klinik ausbildete.

3 Probengewinnung Die Blutentnahme erfolgte aus der kaudalen Hohlvene mittels Serum-Kabevette (R) mit aufgesetzter, steriler Kanüle (0,90 x 40 mm). Durch Zentrifugation wurde das Serum von den festen Blutbestandteilen getrennt, abpipettiert und in je drei Teilproben in Eppendorf-Röhrchen aufgeteilt. Für die molekularbiologische Untersuchung auf Erregererbgut wurden mit sterilen Instrumenten Gewebeproben der Karpfen entnommen. Da in den Angelgewässern zumeist ältere wertvolle Fische gefangen wurden, wurde einer Sektion der Karpfen durch die Angler nicht zugestimmt, so dass sich die Probenahme hier auf Kiemenbioptate beschränkte. An den anderen Probenahmestellen erfolgte die Sektion der Fische mit Entnahme von Rumpfnierengewebe. Das Gewebe wurde entweder für den sofortigen Versand in Transportmedium für virologische Proben überführt oder im Fall einer erforderlichen Konservierung in Kunststoffröhrchen ohne Medium verbracht. Das Untersuchungsmaterial (Gewebe und drei Serumproben je Fisch) wurde so beschriftet, dass es eindeutig einer bestimmten Herkunft sowie jeweils einem Karpfen zugeordnet werden konnte. Notiert wurde zu jedem Fisch Entnahmedatum, Wassertemperatur, Altersklasse, Herkunft und Vorbericht. Probenkonservierung und versendung Die Serumproben wurden unmittelbar nach Zentrifugation und Abfüllung bei -20 C eingefroren. Nach Ende des Beprobungszeitraumes wurden alle vorgesehenen Proben gemeinsam zur jeweiligen Untersuchungseinrichtung geschickt. Dazu wurden isolierende Styroporkisten verwendet und mit Kühlakkus bestückt. Es wurden Dienstleister beauftragt, die eine Auslieferung der Proben beim untersuchenden Labor innerhalb von 24 Stunden zusichern konnten. Die Gewebeproben wurden in Transportmedium für virologische Proben der Landesuntersuchungsanstalt für das Gesundheits- undf Veterinärwesen Sachsen (LUA) gekühlt und nach Möglichkeit unmittelbar nach der Gewinnung per Kurier zur Untersuchungsstelle geliefert, so dass sie Stunden nach Entnahme dort eintrafen. In einigen Fällen war bis zur Versendung mittels Kurier eine Konservierung ohne Transportmedium bei -20 C erforderlich. Untersuchungsverfahren Alle Proben wurden einzeln untersucht mit folgenden Methoden: 1.) Die Untersuchung auf Vorhandensein von Erbgut des Erregers wurde mittels eines molekularbiologischen Verfahrens, der Polymerase Chain Reaction (PCR, Polymerase-Kettenreaktion) an der LUA, Standort Dresden durchgeführt. Hierbei werden bekannte Teile des Erreger-Erbgutes im Labor vervielfältigt. Die so entstandenen PCR-Produkte werden mittels fluoreszierender Farbstoffe in Agarosegel dargestellt oder die Fluoreszenz wird während der PCR direkt gemessen. Folgende Arbeitsanleitungen kamen zur Anwendung: PCR nach Gilad 2002 in Verbindung mit nested PCR nach Bergmann et al und Realtime PCR nach Gilad et al Untersuchungsmaterial: Kiemengewebe oder Kiemen- und Rumpfnierengewebe

4 2.) Serumneutralisationstest (SNT) am Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Insel Riems: Dazu wird das zu untersuchende Serum in verschiedenen Verdünnungsstufen mit dem KHV gemischt, für mindestens eine Stunde inkubiert und anschließend auf eine Zellkultur gegeben. Diese wird für mindestens sieben Tage bei 26 C inkubiert. Sind neutralisierende Antikörper im Serum vorhanden, wird das Wachstum des KHV je nach Verdünnungsstufe des Serums gehemmt. Keine Wachstumshemmung des KHV tritt auf, wenn keine Antikörper gegen das Virus im Serum vorhanden sind, die Zellen der Zellkultur werden zerstört. Untersuchungsmaterial: Serum 3.) Antibody Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay (Antikörper-ELISA) am Centre for Environment, Fisheries & Aquaculture Science (Cefas) Weymouth Laboratory, UK: Hierbei wird gereinigtes KHV in die 96 Vertiefungen einer Mikrotestplatte (ELISA- Platte) gegeben und mit Magermilchpulver geblockt. Das zu testende Serum sowie negative und positive Kontrollseren werden in Doppelansätzen für eine Stunde auf den Platten inkubiert. Die an das KHV-Antigen gebundenen spezifischen Karpfenantikörper aus dem Proben-Serum werden mit monoklonalen Anti-Karpfen-IgM-Antikörpern von der Maus in einer 45-minütigen Inkubation detektiert. Die so gebundenen monoklonalen Antikörper werden nach einer 45-minütigen Inkubation mit polyklonalen Anti-Maus- IgM-Antikörpern von der Ziege, die mit Peroxidase konjugiert sind, nachgewiesen. Mittels der gebundenen Peroxidase wird enzymatisch Tetramethylbenzidin (TMB) in einer Farbreaktion umgesetzt. Nach Stoppen der Farbreaktion mit Schwefelsäure wird die Extinktion mit einem Spektrophotometer bei 450 nm gemessen. Untersuchungsmaterial: Serum Auswertung Die Zusammenfassung der Ergebnisse sowie die Auswertung erfolgte durch den Fischgesundheitsdienst der Sächsischen Tierseuchenkasse in enger Zusammenarbeit mit dem Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems (FLI). Die Ergebnisse werden in geeigneter Form veröffentlicht. Ergebnisse Insgesamt wurden 85 Karpfen beprobt. Es wurden 77 Gewebeproben mittels PCR auf KHV-Genom untersucht. Acht Gewebeproben waren nicht verwertbar. 80 Serumproben wurden im Cefas per ELISA und 83 Serumproben am FLI per SNT auf KHV-spezifische Antikörper untersucht. Die übrigen Serumproben waren nicht verwertbar oder es konnte Probenmaterial nicht in ausreichender Menge gewonnen werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

5 Tabelle 1: Ergebnisse verschiedener Untersuchungsmethoden auf KHV Methode n negativ verdächtig positiv PCR (Genomnachweis) ELISA Cefas (AK-Nachweis) SNT FLI (AK-Nachweis) Serumproben wurden sowohl mittels ELISA (Cefas) als auch SNT (FLI) untersucht. In 41 Fällen (ca. 53 %) stimmten die Ergebnisse überein, in 37 Fällen (ca. 47 %) erbrachten die verschiedenen Methoden unterschiedliche Ergebnisse. Dabei kamen alle denkbaren Ergebniskombinationen vor. Besonders herauszustellen sind die vollkommen gegensätzlichen Ergebnisse bei neun Proben ELISA negativ/ SNT positiv und bei sieben Proben ELISA positiv/ SNT negativ. Dies entspricht über 20 %. Die Einzelheiten sind in Tabelle 2 sowie Abbildung 1 und 2 aufgeführt SP-ratio (ELISA) Titerhöhe 1:... (SNT) Probennummer SP-ratio ELISA well1 SP-ratio ELISA well2 SNT 1 : Abbildung 1: Vergleich der Meßwerte im ELISA (SP-ratio) und SNT (Titer) ELISA: < 6,05 = negativ, 6,05 bis < 14,0 = verdächtig, 14,0 = positiv (rote Linie) SNT: < 1:4 = negativ, 1:4 bis 1:6 = verdächtig, 1:8 = positiv (rote Linie) Proben-Nr = Negativkontrollen Proben-Nr = Positivkontrollen Proben-Nr = Angelgewässer

6 Tabelle 2: Ergebniskombinationen bei verschiedenen Untersuchungsmethoden auf KHV-spezifische Antikörper Anzahl der Proben mit ELISA (Cefas) SNT (FLI) Ergebniskombination negativ negativ 4 verdächtig verdächtig 21 positiv positiv 9 negativ verdächtig 9 negativ positiv 7 positiv negativ 5 verdächtig negativ 4 verdächtig positiv 3 positiv verdächtig 4% positivverdächtig 5% verdächtigpositiv 6% verdächtignegativ 12% negativverdächtig 9% positiv-negativ 21% negativnegativ 5% verdächtigverdächtig j übereinstimmende Ergebnisse gegensätzliche Ergebnisse abweichende Ergebnisse 12% negativ-positiv 26% positiv-positiv Abbildung 2: Darstellung der prozentualen Verteilung der Ergebniskombinationen bei zwei Untersuchungsmethoden (ELISA, SNT) auf KHV-spezifische Antikörper Sieben Proben wurden mehrfach im SNT untersucht. Die Untersuchung derselben Proben zu verschiedenen Zeitpunkten brachte teilweise unterschiedliche, zum gleichen Zeitpunkt annähernd identische Ergebnisse (Tabelle 3).

7 Tabelle 3: Untersuchung von sieben Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten im SNT Probennr. 1. Teilprobe 1. Teilprobe 2. Teilprobe 2. Teilprobe Teilprobe negativ positiv verdächtig verdächtig negativ positiv negativ negativ verdächtig positiv negativ negativ negativ positiv negativ verdächtig negativ positiv positiv positiv 6 negativ --- positiv positiv positiv 7 negativ --- positiv positiv positiv Im Serum der vier Karpfen, in deren Gewebe KHV-Genom mittels PCR nachgewiesen wurde, konnte ein Antikörpertiter im SNT bei allen und im ELISA bei drei Tieren ermittelt werden. Beim vierten untersuchten Serum brachte der ELISA ein verdächtiges Ergebnis. Die übrigen 73 Karpfen mit negativem PCR-Befund zum Zeitpunkt der Probenentnahme wiesen unterschiedlichste Befunde bei den Untersuchungen auf KHV-spezifische Antikörper auf. Die Verteilung entspricht nahezu der Gesamtverteilung der Ergebnisse (Tabelle 2, Abbildung 2). Als Negativkontrollen wurden 31 Karpfen aus drei KHV-unverdächtigen west- und mittelsächsischen Betrieben beprobt: 1.) In der Teichwirtschaft Cunnersdorf wurden 2005 und 2006 einzelne KHV- Nachweise bei Kv bzw. K1 erhoben. Danach wurde der Betrieb regelmäßig und immer mit negativem Ergebnis auf KHV-Genom untersucht (Kategorie III). Zu keinem Zeitpunkt war eine KHV-typische Klinik festgestellt worden. Der Betrieb kauft jährlich Karpfenbrut aus Bayern zu. Es wurden neun Karpfen (K2) untersucht. 2.) Die Fischzucht Wolf verfügt über eigene Laichfischbestände und wird seit 2003 regelmäßig mit negativen Ergebnissen auf KHV-Genom untersucht (Kategorie II). Zur Beprobung kamen zwölf Karpfen (K3). 3.) Die Teichwirtschaft Müglenz besitzt ebenfalls eigene Laichkarpfen und kauft keine Satzfische zu. Der Betrieb liegt isoliert und wird seit 2003 regelmäßig mit negativen Ergebnissen auf KHV-Genom untersucht (Kategorie II). Hier wurden zehn Karpfen(K3) untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst.

8 Tabelle 4: Untersuchungsergebnisse bei den Negativkontrollen Betrieb Vorbericht n ELISA SNT PCR 1 regelm. Brutzukauf aus BY, 9 9x neg 6x neg einzelne KHV- 1x verd Nachweise, danach immer 1x pos negativ, bisher niemals KHV- Klinik (KAT. III) 2 eigene Laichfischbestände, seit 2003 regelmäßige Untersuchung m. negativen Ergebnissen auf KHV (KAT. II) 3 eigene Laichfische, kein Zukauf von Satzfischen, seit 2003 regelmäßig mit negativen Ergebnissen auf KHV untersucht (KAT. II) 12 6x neg 2x verd 4x pos 10 6x neg 4x verd 11x neg 1x verd 2x neg 4x verd 4x pos neg neg neg Zwecks Positivkontrolle wurden zwölf Karpfen aus bekanntermaßen KHV-positiven Beständen untersucht. 4.) Im Schwarzen See (a) der Teichwirtschaft Weißig wurde 2009 ein massiver KHV- Ausbruch festgestellt, im Bunteteich (b) war 2010 ein klinischer KHV-Ausbruch zu verzeichnen. Beprobt wurden in beiden Teichen K3. 5.) Der Neuteich Diehsa der Kreba Fisch GmbH war im Jahr 2008 von einer klinischen KHV-I betroffen. Dieser Teich konnte aufgrund seiner geografischen Bedingungen nicht komplett abgefischt, trockengelegt und gekalkt werden. Nach Abfischung eines Großteils der Karpfen wurde er wieder bespannt und mit KHVnegativen Karpfen neu besetzt. Tabelle 5 zeigt die zusammengefassten Untersuchungsergebnisse. Tabelle 5: Untersuchungsergebnisse bei den Positivkontrollen Betrieb Vorbericht n ELISA SNT PCR 4a Teich 1, massiver KHV-8 1x neg Ausbruch 2009 (KAT. V) 1x verd 6x pos 4b Teich 2, massiver KHV-2 1x verd Ausbruch 2010 (KAT. V) 1x pos akuter KHV-I-Ausbruch, 2 1x neg keine komplette Abfischung, 1x pos Trockenlegung + Kalkung durchgeführt, Neubesatz mit KHV-negativen Fischen (KAT. V) n.a. = nicht auswertbar 1x neg 7x pos 2x pos 2x pos n.a. 2x pos 2x neg

9 Aus den Angelgewässern Haselbacher See, Talsperre Bautzen und Talsperre Quitzdorf konnten insgesamt 35 Karpfen beprobt werden. Bei Karpfen aus dem Haselbacher See wurde im Jahr 2008 mittels PCR KHV- Genom in Verbindung mit einem Verlustgeschehen nachgewiesen. Danach sind keine Symptome oder Todesfälle bei Karpfen mehr bekannt geworden. Bei den Talsperren Bautzen und Quitzdorf handelt es sich um bislang KHVunverdächtige Gewässer, in denen bis heute kein Karpfensterben nachgewiesen wurde. Es gelangte bisher jedoch nur eine geringe Probenanzahl aus diesen Gewässern zur PCR-Untersuchung, die mit negativen Ergebnissen auf KHV abgeschlossen wurde. Die im Rahmen dieses Projektes erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. Tab. 6: Untersuchungsergebnisse der Proben aus den Angelgewässern Gewässer n ELISA SNT PCR Haselbacher See 5 2x neg 2x verd 1x pos 1x neg 2x verd 2x pos 5x neg Talsperre Bautzen 17 7x neg 2x verd 8x pos Talsperre Quitzdorf 13 2x neg 1x verd 10x pos 7x neg 7x verd 3x pos 13x pos 17x neg 11x neg 2x pos Diskussion Die Untersuchungsergebnisse der beiden verwendeten serologischen Methoden ELISA (Cefas) und SNT (FLI) zum Nachweis KHV-spezifischer Antikörper im Serum von Karpfen wiesen eine relativ geringe Übereinstimmungsrate auf (ca. 53%). Bei den nicht übereinstimmenden Ergebnissen kamen alle denkbaren Kombinationen vor. In über 20% der Fälle wurden sogar völlig entgegengesetzte Befunde (positiv negativ oder negativ positiv) erhoben. Aus diesen Ergebnissen kann gefolgert werden, dass keine der beiden Methoden als Methode der Wahl angesehen werden kann. Die unterschiedlichen Befunde könnten dadurch erklärt werden, dass unterschiedliche Arten von spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden: Beim ELISA werden alle Antikörper, die sich an einen präparierten Antigenausschnitt binden, dargestellt, beim SNT nur die Antikörper, die in der Lage sind, das Virus zu neutralisieren. Bezogen auf das Einzeltier wurde festgestellt, dass bei 100 % der KHV-PCRpositiven Karpfen und bei etwa 44 % der KHV-PCR-negativen Karpfen mit einer oder beiden serologischen Methoden KHV-spezifische Antikörper nachweisbar waren. Die Ergebnisse auf den Bestand bezogen waren ähnlich: In Beständen, die bekanntermaßen eine KHV-Klinik durchgemacht hatten (Positivkontrollen), wurden bis zu 100 % der Proben mit den eingesetzten serologischen Methoden positiv auf KHV-spezifische Antikörper getestet. Antikörper waren jedoch auch in Beständen unabhängig vom Seuchenstatus ( Negativkontrollen ) in 0 bis 40 % der Proben nachweisbar.

10 In den untersuchten Angelgewässern verhielt es sich entsprechend. In % der Proben aus den beiden Gewässern ohne aktuellem KHV-Genom-Nachweis (PCR) wurden mittels serologischer Methoden KHV-spezifische Antikörper festgestellt. In dem Gewässer mit zeitgleichem KHV-Genom-Nachweis (PCR) wurden bis zu 100 % der untersuchten Seren positiv auf KHV-Antikörper getestet. Ein Nachweis von Antikörpern bei gleichzeitigem negativen Ergebnis im direkten Erregernachweis ist dabei nicht als Widerspruch zu sehen. Sind viele spezifische Antikörper vorhanden, so können sie das KHV derart unterdrücken, dass es sich in bestimmte Zellen zurückzieht, nur in geringer Virusmenge vorliegt und somit kaum nachweisbar ist (mündl. Mitteilung FLI). Im Rahmen dieser Untersuchung erfolgten mehr KHV-Antikörpernachweise als erwartet, insbesondere bei den Negativkontrollen. Dabei trat vermutlich ein bestimmter Anteil falsch positiver Ergebnisse in Erscheinung. Eine denkbare Möglichkeit für falsch positive Ergebnisse wäre der Nachweis von kreuzreagierenden Antikörpern, die beispielsweise gegen andere Herpesviren wie Karpfenpocken gebildet wurden. Möglicherweise kursiert auch eine andere, apathogene KHV-Variante, die eine entsprechende Antikörperbildung induziert, jedoch keine Krankheitserscheinungen verursacht und auch mit der herkömmlichen PCR nicht nachweisbar ist. Eine weitere mögliche Ursache könnten unspezifische, natürliche Antikörper sein, die mit steigendem Alter der Fische in zunehmendem Maße gebildet werden, in den Tests reagieren und zu falsch positiven Ergebnissen führen könnten (mündl. Mitteilung Prof. Steinhagen). Der einzige, im ELISA komplett negativ getestete Bestand war gleichzeitig der jüngste untersuchte Bestand (K2), was diese Theorie untermauert. Insgesamt deuten die Befunde, die im Rahmen dieses Projektes erhoben wurden, darauf hin, dass sowohl die Ergebnisse des ELISA als auch die des SNT mit Einschränkungen zu interpretieren sind. Dies wird auch noch einmal deutlich bei der Mehrfachuntersuchung von Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten, die teilweise verschiedene oder widersprüchliche Ergebnisse lieferte. Die Untersuchung von Teilproben im SNT zu ein und demselben Zeitpunkt dagegen erbrachte nahezu identische Ergebnisse, was darauf hindeutet, dass Ergebnisse maßgeblich von den verwendeten Labormaterialien bzw. deren Chargen oder von der Art und Weise der Test-Durchführung abhängig sind. Ähnliche Feststellungen können für Mehrfachuntersuchungen im ELISA (anderes Projekt, noch nicht veröffentlicht) getroffen werden. Keine der beiden hier angewendeten serologischen Methoden (ELISA, SNT) alleine lässt eine sichere Aussage über den Seuchenstatus einer Population zu. Empfehlenswert sind die serologischen Methoden allenfalls als Ergänzung zum direkten Erregernachweis (PCR), wodurch die Aussagekraft möglicherweise erhöht werden kann. Aufgrund der Biologie des KHV ist davon auszugehen, dass jeder Karpfen mit Antikörpernachweis auch Virusträger ist. Es müsste sich also bei einem serologisch positiven Individuum bzw. Bestand nach den neuesten Vorgaben des FLI (24 h bis 5 Tage nach Streßeinwirkung) auch Virusgenom mittels PCR nachweisen lassen. Weitere Forschung auf diesem Gebiet ist unbedingt erforderlich, um die diagnostischen Möglichkeiten zum Nachweis der KHV-I zu verbessern.