Medizinische Klinik und Poliklinik der Universität Ulm Abteilung Innere Medizin II Kardiologie, Angiologie, Pneumologie und Nephrologie

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1 Medizinische Klinik und Poliklinik der Universität Ulm Abteilung Innere Medizin II Kardiologie, Angiologie, Pneumologie und Nephrologie Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. V. Hombach Transiente genetische Markierung CD34-positiver hämatopoetischer Stammzellen für die in vivo Applikation Implikationen für eine therapeutische Myokardregeneration Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm Vorgelegt von Thomas Prill aus Göppingen Ulm 2005

2 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Klaus-Michael Debatin 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Jan Torzewski 2. Berichterstatter: PD Dr. Michael Schmitt Tag der Promotion:

3 Meinen Eltern

4 Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS...I VERZEICHNIS DER VERWENDETEN ABKÜRZUNGEN: EINLEITUNG KARDIOMYOPATHIEN STAMMZELLEN KARDIOVASKULÄRE ZELLERSATZTHERAPIE DAS CD34-ANTIGEN UND CD34-EXPRIMIERENDE ZELLEN TRANSFEKTION UND TRANSFEKTIONSMETHODEN DER LOW AFFINITY NERVE GROWTH FACTOR-RECEPTOR (LNGFR) FRAGESTELLUNG DER ARBEIT MATERIAL UND METHODEN MATERIAL UND GERÄTE METHODEN ERGEBNISSE EXPRESSION VON LNGFR AUF TRANSFIZIERTEN STAMMZELLEN KINETIK DER LNGFR-EXPRESSION AUF TRANSFIZIERTEN PBSC UND BMSC IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE LNGFR-TRANSFIZIERTER PBSC UND BMSC VITALITÄT LNGFR-TRANSFIZIERTER BMSC UND PBSC EXPRESSION VON LNGFR IN HUMANEM MYOKARDGEWEBE DISKUSSION CD34-POSITIVE HÄMATOPOETISCHE STAMMZELLEN MARKIERUNG CD34-POSITIVER STAMMZELLEN DER LNGF-REZEPTOR ALS GENETISCHER MARKER ALTERNATIVTHERAPIEN ZUR ZELLERSATZTHERAPIE BEI DILATATIVER KARDIOMYOPATHIE UND TERMINALER HERZINSUFFIZIENZ AUSBLICK ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS DANKSAGUNGEN...65 I

5 Inhaltsverzeichnis 8 ANHÄNGE POSTER LEBENSLAUF...69 II

6 Abkürzungsverzeichnis Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen: AS ASC AK bfgf BMSC bp BSA CD cdna DCM DMSO DNA EB EDTA EGF ESC FACS FCS FSC GAPDH GFP G-CSF GM-CSF HSC IGF IgG IL kb kd LIF Aminosäure adult stem cells (Adulte Stammzellen) Antikörper basic fibroblast growth factor bone marrow stem cells base pair bovine serum albumin cluster of differentiation copydna dilated cardiomyopathy (Dilatative Kardiomyopathie) dimethyl sulfoxide desoxyribonucleic acid embryonic bodies ethylene diamine tetraacetic acid epidermal growth factor embryonic stem cell (Embryonale Stammzellen) fluorescent activated cell sorting fetal calf serum forward scatter glyceraldehyd-3-phosphate dehydrogenase green fluorescent protein granulocyte colony stimulating factor granulocyte/macrophage colony stimulating factor hematopoietic stem cell (Hämatopoetische Stammzellen) insulin-like growth factor immunoglobulin G interleukine kilo base kilo dalton leukemia inhibitor factor 1

7 Abkürzungsverzeichnis LNGFR delta low affinity nerve growth factor receptor LNGFR low affinity nerve growth factor receptor M. Morbus MAPC multipotent adult progenitor cells MHC major histocompatibility complex MSC mesenchymal stem cells (Mesenchymale Stammzellen) NGF nerve growth factor NYHA New York Heart Association PBS phosphate buffered saline PBSC peripheral blood stem cells PCR polymerase chain reaction PDGF platelet derived growth factor PE phycoerythrine PSG penicilline, streptomycin, glutamine RNA ribonucleic acid rpm rounds per minute RPMI Roswell Park Memorial Institute RT room temperature (Raumtemperatur) RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction SCF stem cell factor SCID severe combined immuno-deficiency SSC side scatter TAE tris acetate EDTA Taq thermophilus aquaticus-dna-polymerase Thy-1 thymidylate synthase-complementing protein UV ultra violet WB wash/perm buffer WHO World Health Organization 2

8 Einleitung 1 Einleitung Die Nutzung von Stammzellen zur Regeneration geschädigten Gewebes ist einer der Brennpunkte der gegenwärtigen Forschung und des öffentlichen Interesses. Ein möglicher Einsatzbereich von Stammzellen wäre das große Feld kardiovaskulärer Erkrankungen. Laut Statistischem Bundesamt verstarben im Jahr 2002 in Deutschland fast Menschen an Erkrankungen des Herz-Kreislauf- Systems (Statistisches Bundesamt Deutschland). Dies bedeutet, dass fast jeder zweite Todesfall auf eine Erkrankung dieses Organsystems zurückzuführen ist. Weltweit sind ca. 22 Millionen Menschen an einer chronischen Herzinsuffizienz erkrankt; jährlich kommen 2 Millionen neu diagnostizierte Fälle dazu (O Connell JB, American Heart Association: 2002 Heart and Stroke Statistical Update). Die Ursachen für diese chronische Erkrankung können vielfältig sein. Zu den Erkrankungen des Herz-Kreislaufsystems zählt auch die Dilatative Kardiomyopathie (DCM), die in ihrem klinischen Erscheinungsbild als Herzinsuffizienz imponiert. Die Diagnose einer DCM wird meist erst in einem fortgeschrittenen Stadium gestellt. Die Patienten sind zu diesem Zeitpunkt meist zwischen 20 und 50 Jahre alt. Trotz Behandlung beträgt die 5-Jahres- Überlebensrate dann nur noch ca. 50%. Patienten mit DCM im fortgeschrittenen Stadium haben also eine ebenso schlechte Prognose wie Patienten mit Malignomen. Der Einsatz adulter Stammzellen zum Gewebeersatz stellt möglicherweise einen neuen Ansatz zur kurativen Therapie der DCM dar, die sich bis heute im fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung auf die Herztransplantation beschränkt. Da Spenderherzen bei weitem nicht in ausreichender Zahl vorhanden sind, wäre eine kurative Alternativtherapie von großem Nutzen. Erste klinische Versuche bei Patienten mit ischämischen Herzmuskelschädigungen zeigten nach Applikation von Stammzellen aus dem Knochenmark eine Verbesserung der Pumpfunktion bei diesen Patienten (Strauer et al. 2002). Der Mechanismus, der zu dieser klinisch messbaren Funktionsverbesserung führt, ist jedoch noch weitgehend unbekannt. Evidenzen sprechen für eine Transdifferenzierung der eingebrachten Stammzellen. Die Transdifferenzierungshypothese wird aktuell in der Fachpresse sehr kontrovers diskutiert und ist beim Menschen nach autologer Applikation noch 3

9 Einleitung nicht auf zellulärer Ebene nachgewiesen worden. Der Nachweis des Transdifferenzierungsvermögens hämatopoetischer Stammzellen (HSC) wäre demnach ein wichtiger Schritt auf dem Weg zur Klärung dieser Frage und auch auf dem Weg zu einer Zellersatztherapie. 1.1 Kardiomyopathien Kardiomyopathien sind schon in den 60er Jahren des 19. Jahrhunderts erstmals beschrieben worden, obwohl das Krankheitsbild selbst damals noch nicht klar definiert war (Hallopeau 1869, Liouville 1869). Nach intensiver Beforschung etablierten sich in der Klinik und der klinischen Terminologie dann drei Typen von Kardiomyopathien: die Dilatative Kardiomyopathie (DCM), die Hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) und die Restriktive Kardiomyopathie (RCM). Im Jahre 1996 erfolgte die auch aktuell noch gültige Neudefinition und Neuklassifikation der Kardiomyopathien durch die WHO und die International Society and Federation of Cardiology (Richardson et al. 1996). Die drei bis dahin fest klinisch etablierten Krankheitsbilder DCM, HCM und RCM wurden weitgehend beibehalten und in die neue Klassifikation integriert. Der Begriff der Kardiomyopathie umschließt nun nach neuer WHO-Definition Herzmuskelerkrankungen, die mit einer kardialen Dysfunktion einhergehen. Kardiomyopathien werden anhand der ihnen zugrunde liegenden Pathophysiologie und Ätiologie in zwei Kerngruppen eingeteilt. Die erste Kerngruppe umfasst vier Untertypen, bei denen eine primär myokardiale Genese vorliegt. Sie beinhaltet die Dilatative Kardiomyopathie, die Hypertrophe Kardiomyopathie, die Restriktive Kardiomyopathie und die Arrhythmogene Rechtsventrikuläre Kardiomyopathie. Zur zweiten Kerngruppe gehören Kardiomyopathien, die nicht als primär myokardiale Erkrankungen verstanden werden, sondern Ursachen haben, die außerhalb des Myokards liegen und die deshalb als Spezifische Kardiomyopathie bezeichnet werden. Ursachen können in Erkrankungen der Klappen liegen, ischämisch, hypertensiv oder metabolisch bedingt sein. 4

10 Einleitung Dilatative Kardiomyopathie Die Dilatative Kardiomyopathie (DCM) im speziellen lässt sich durch eine Dilatation und eine eingeschränkte systolische Funktion des linken oder beider Ventrikel charakterisieren (Richardson et al. 1996). Die Ursachen der DCM sind sehr heterogen und zum Teil noch unbekannt. Geht die Erkrankung vom Myokard selbst aus, so können die Ursachen genetisch, viral (Bowles et al. 1986, Why et al. 1994), immunologisch (Caforio et al. 1994, Kühl et al. 1996) oder toxisch bzw. alkoholtoxisch sein. Ist die DCM mit einer bekannten kardiovaskulären Krankheit vergesellschaftet, die jedoch das Ausmaß der kardialen Dysfunktion nicht erklärt, wird sie als spezifische DCM definiert. Häufigste Ursache ist aber eine nicht ausgeheilte virale Myokarditis. Klinisches Kardinalsymptom ist die Linksherzinsuffizienz, begleitet von Arrhythmien und Thrombembolien, bis hin zum plötzlichen Herztod, der in jedem Krankheitsstadium auftreten kann. Die Inzidenz der DCM liegt in der westlichen Welt bei etwa 6 8 pro Einwohnern pro Jahr, die Prävalenz bei etwa 36 pro Einwohnern (Codd et al. 1989, Mestroni et al. 1999, Rakar et al. 1997). Für die Bundesrepublik Deutschland liegen keine genauen Daten vor, es ist aber anzunehmen, dass die Häufigkeit ähnlich hoch ist. Da die DCM klinisch als Herzinsuffizienz imponiert, wird sie weitestgehend auch so behandelt. Der therapeutische Spielraum in der Behandlung der DCM ist quasi auf die konservative Herzinsuffizienztherapie beschränkt. Diese besteht aus einer Kombination von Angiotensinkonversionsenzymhemmern (ACE-Hemmer), - Adrenozeptorantagonisten (-Blocker), Diuretika, Spironolakton, Nitraten und Digitalisglykosiden. Die Basis der medikamentösen Therapie bilden die ACE- Hemmer, die bei Fortbestehen der Beschwerden durch -Blocker und Spironolakton ergänzt werden. Diuretika, Nitrate und Digitalisglykoside können Symptome lindern, haben allerdings keinen positiven Effekt auf das Überleben der Patienten (Remme et al. 2001). Untersuchungen bei Herzinfarktpatienten zeigten zwar eine Regeneration von geschädigtem Myokardgewebe aus teilungsfähigen Vorläuferzellen, doch ist dieses Potential sehr begrenzt (Beltrami et al. 2001). Es reicht bei weitem nicht aus, um geschädigtes Gewebe nach Infarkten oder bei der DCM zu regenerieren. Im fortgeschrittenen Stadium kommt nur noch die Herztransplantation als einzig etablierte kurative Therapie in Frage. Adulte Stammzellen könnten beim Zellersatz eine wichtige Therapieoption eröffnen. 5

11 Einleitung 1.2 Stammzellen Stammzellen sind teilungsfähige Zellen des Embryos, des Fötus oder des Erwachsenen, die noch nicht vollständig differenziert sind und sich von anderen Körperzellen durch ihre unter bestimmten Umständen gegebene Fähigkeit zur ständigen Proliferation und Selbsterneuerung unterscheiden. Sie sind klonal und haben ein unterschiedlich stark ausgeprägtes Differenzierungspotential. Es soll aus der heterogenen Gruppe der Stammzellen nur auf embryonale und hämatopoetische Stammzellen detaillierter eingegangen werden Embryonale Stammzellen Aus einer befruchteten Eizelle entwickelt sich nach drei Zellteilungen die sogenannte Morula (Gilbert 2000). Die dabei entstehenden Tochterzellen sind totipotent, was bedeutet, dass jede dieser Zellen (eingenistet in den Uterus) eigenständig einen vollständigen Organismus bilden kann. Diese Fähigkeit zur Totipotenz geht mit dem Übergang in die folgenden Entwicklungsstadien verloren. Nach weiteren Teilungen entwickelt sich die Blastocyste, eine flüssigkeitsgefüllte Zellkugel, welche aus dem umhüllenden Trophoblasten und der Inneren Zellmasse besteht. Aus dieser Inneren Zellmasse können die embryonalen Stammzellen (ESC) gewonnen werden, die sich in vitro unbegrenzt teilen können und somit noch pluripotente Eigenschaften aufweisen. Embryonale Stammzellen werden demnach über die Art ihrer Gewinnung definiert und stellen keine eigenständige Zellart dar. Es sind bisher nur bei Mäusen, Affen und beim Menschen embryonale Stammzelllinien etabliert worden. Die Isolierung muriner ESC gelang erstmalig im Jahre 1981 (Evans et al. 1981). Erst 14 Jahre später konnten beim Rhesusaffen embryonale Stammzellen isoliert werden (Thomson et al. 1995). Die ersten 5 humanen embryonalen Stammzelllinien konnten von Thomson (Thomson et al. 1998) im Jahre 1998 aus 14 Blastocysten gewonnen und kultiviert werden. Sie werden als pluripotent betrachtet, können sich also in alle Zellen des menschlichen Körpers entwickeln (Itskovitz-Eldor et al. 2000, Schuldiner et al. 2000), jedoch bei Einnistung in den Uterus keinen ganzen Organismus bilden. Neuere Ergebnisse von Schöler (Hubner et al. 2003) zeigen im murinen Modell jedoch erste Anzeichen für eine mögliche Totipotenz von embryonalen 6

12 Einleitung Stammzellen. Es bleibt abzuwarten, ob sich menschliche embryonale Stammzellen ähnlich verhalten IN VITRO DIFFERENZIERUNGSPOTENTIAL VON ESC; EINE KURZE DARSTELLUNG Das große Differenzierungspotential humaner ESC konnte in zahlreichen Arbeiten gezeigt werden: Differenzierung zu neuronalen Vorläuferzellen (Reubinoff et al. 2001, Zhang et al. 2001) und Zellen aller drei Keimblätter (Reubinoff et al. 2001) Differenzierung zu Kardiomyozyten (Kehat et al. 2001) Differenzierung zu Endothelzellen (Levenberg et al. 2002) Differenzierung zu B-Zellen des Pankreas (Assady et al. 2001) Differenzierung zu Zellen der Haut, Nebenniere, Muskeln, Knochen, Niere, Urogenitaltrakt (Schuldiner et al. 2000) ESC der Maus konnten bisher zu folgenden Zelltypen differenziert werden: Dopamin und Serotonin produzierenden Zellen (Lee et al. 2000) Kardiomyozyten (Klug 1996, Weissmann 2000, Wobus et al. 1995) Insulin-produzierenden Zellen, die einen medikamentös induzierten Diabetes korrigieren konnten (Lumelsky et al. 2001,Soria et al. 2000) Adipozyten (Dani et al. 1997) Astrozyten, Gliavorläuferzellen und Oligodendrozyten (Brustle et al. 1999) THERAPEUTISCHER EINSATZ EMBRYONALER STAMMZELLEN BEI DER ZELLERSATZTHERAPIE Die Hoffnungen, die auf ESC gesetzt werden, sind groß. Die Applikation unbehandelter undifferenzierter ESC ist jedoch wegen der Entstehung von Teratomen und Teratokarzinomen (Reubinoff et al. 2000, Wakitani et al. 2003) keine Option in der Zellersatztherapie. Ziel der derzeitigen Bemühungen ist es, aus embryonalen Stammzellen gezielt spezielle Vorläufergewebe zu differenzieren, um diese direkt am Ort der Schädigung applizieren zu können. Da es, wie erwähnt, in vitro schon gelungen ist, humane embryonale Stammzellen zu verschiedenen Vorläuferzellen zu differenzieren (s.1.2.1) und die Pluripotenz der 7

13 Einleitung ESC bekannt ist, scheinen alle Voraussetzungen für einen Einsatz bei bisher nicht heilbaren Erkrankungen wie z.b. Morbus Parkinson (Gerlach et al. 2002), amyotrophische Lateralsklerose (Mazzini et al. 2003) und Diabetes etc. gegeben. Allerdings müssen vorher noch eine Reihe von Problemen gelöst werden, bevor ESC zum klinischen Einsatz gebracht werden können LIMITATIONEN DES EINSATZES VON ESC ZUM ZELLERSATZ BEIM MENSCHEN Sowohl die Beforschung als auch der Einsatz embryonaler Stammzellen sind ethisch umstritten, da bei der Gewinnung embryonaler Stammzellen Embryonen verbraucht werden. Die Erzeugung embryonaler Stammzellen ist in Deutschland verboten (Embryonenschutzgesetz). Beim Einsatz undifferenzierter embryonaler Stammzellen besteht die Gefahr einer Tumorentwicklung, z.b. Teratome oder Teratokarzinome (Reubinoff et al. 2000, Wakitani et al. 2003). Da noch sehr wenig über die zur Differenzierung notwendigen Umgebungsfaktoren bekannt ist, verbietet sich die Applikation embryonaler Stammzellen beim Menschen bis auf weiteres. In Versuchen mit Kardiomyozyten, die aus murinen ESC gezüchtet wurden, zeigte sich ein deutlich arrhythmogenes Potential dieser Zellen (Zhang et al. 2002). Die Gefahr der Induktion potentiell lebensbedrohlicher Arrhythmien ist beim Einsatz embryonaler Stammzellen zur Myokardregeneration deshalb immer zu beachten. Genau wie bei Organtransplantationen tritt auch beim Einsatz embryonaler Stammzellen und aus ihnen abgeleiteter Zellen eine Abstoßung des eingebrachten Fremdmaterials auf. Da die ESC über Klasse I Oberflächenantigene des major histocompatibility complex (MHC) als fremd erkannt werden, müsste begleitend zur Stammzelltherapie eine immunsuppressive Therapie stattfinden. Lediglich durch therapeutisches Klonen könnten Stammzellen hergestellt werden, die mit den Zellen des Empfängerorganismus immunologisch identisch sind. Dies ist jedoch in allen europäischen Ländern mit Ausnahme von Großbritannien verboten. Eine zweite Möglichkeit wäre der Einsatz von Zellen, die sich sowohl in Blutzellen als auch in das gewünschte Gewebe entwickeln. Die eingebrachten Blutzellen könnten die Abstoßung verringern (chimäres Immunsystem). 8

14 Einleitung Es ist gegenwärtig noch sehr schwierig, Stammzellen gezielt zu einer Gewebeart zu differenzieren und spezifisch differenzierte Zellen zu selektionieren. Verfahren, die dies erlauben, müssen noch für den klinischen Einsatz etabliert werden. Die Frage, ob sich die aus ESC entstandenen Zellen in das Gewebe des Zielorgans integrieren und eine funktionelle Einheit bilden, ist noch nicht geklärt. Bilden sie beispielsweise im Falle der Kardiomyozyten Zell-Zell- Kontakte aus, die für eine funktionelle Integration wichtig sind? Und kommt es durch die eingebrachten Zellen zu einer funktionellen Verbesserung? Embryonale Keimbahnzellen Erstmals konnten embryonale Keimbahnzellen im Jahr 1998, also im gleichen Jahr wie ESC, isoliert werden. Dies gelang durch Wissenschaftler um Gearhart (Shamblott et al. 1998) von der Johns Hopkins Universität in Baltimore, Maryland. Die Zellen können aus der Gonadenanlage von 5-10 Wochen alten Feten gewonnen werden, welche sich im weiteren Verlauf in die Eizellen und Spermien entwickeln (Turnpenny et al. 2003). Sie können in Kultur gehalten werden und zeigen den embryonalen Stammzellen ähnliche Eigenschaften (Resnick et al. 1992) Embryonale Karzinomzellen Im Jahre 1975 konnten aus Tumoren bei Mäuseembryonen erstmals diese undifferenzierten Zellen isoliert werden (Martin et al. 1975). Sie können permanent in Kultur gehalten werden und differenzieren nach Injektion in eine Blastozyste zu Zellen aller drei Keimblätter aus. In adultes Gewebe injiziert entwickeln sie Teratokarzinome Adulte Stammzellen Adulte oder somatische Stammzellen (ASC) sind undifferenzierte Zellen, die in differenzierten Geweben vorkommen und sich hier einerseits lebenslang teilen (Selbsterneuerung) und fortlaufend proliferieren können, und sich andererseits an der Gewebeneubildung beteiligen. Frühe Beschreibungen adulter Stammzellen stammen aus dem Jahr 1966 von Luriia und Fridenshtein (Luriia et al. 1966). ASC stellen eine recht uneinheitliche Gruppe dar; auch ist noch unklar, ob 9

15 Einleitung verschiedene adulte Stammzellen auseinander hervorgehen oder ob sie gar übrig gebliebene embryonale Stammzellen sind, die einen Teil ihres Differenzierungspotentials verloren haben. Die Unterscheidung erfolgt anhand einer Reihe von Oberflächenmarkern und ihres Differenzierungsverhaltens in vitro. Es ist jedoch oft schwierig, sie zu isolieren und aufzureinigen, was auch daran liegt, dass adulte Stammzellen nur in geringer Zahl im Körper vorkommen. So schätzt man die Frequenz HSC im Knochenmark auf 1:10000 bis 1:15000 (Weissman 2000). Eine weitere Schwierigkeit ist die Kultivierung in vitro. Adulte Stammzellen neigen im Gegensatz zu embryonalen Stammzellen dazu, in Kultur recht schnell auszudifferenzieren und ihr Stammzellpotential zu verlieren POPULATIONEN ADULTER STAMMZELLEN Hämatopoetische Stammzellen (HSC): Hämatopoetische Stammzellen sind schon seit mehr als 40 Jahren im klinischen Gebrauch und sind dementsprechend gut erforscht (Becker et al. 1963). Sie haben die Fähigkeit, über verschiedene Differenzierungsstufen Blutzellen aller drei Blutzellarten wie z.b. Erythrozyten, Thrombozyten, Granulozyten, Monozyten, natürliche Killerzellen, T- und B-Lymphozyten und Plasmazellen zu bilden und teilen sich in vivo kontinuierlich. HSC können auf drei verschiedenen Wegen gewonnen werden: Sie können aus dem Knochenmark über eine Knochenmarkpunktion aus dem Beckenkamm gewonnen werden. Dies ist der klassische Weg der Gewinnung von HSC. Sie können leukapheretisch aus dem peripheren Blut aufgereinigt werden. Meist werden sie dazu vorher mit Zytokinen wie dem granulocyte-colonystimulating-factor (G-CSF) oder auch selten dem granulocyte-macrophagecolony-stimulating-factor (GM-CSF) aus dem Knochenmark ins Blut mobilisiert, wo sie dann in einer höheren Konzentration vorliegen. Die dritte Quelle ist Nabelschnurblut. Da die Hämatopoese beim Fetus noch zu einem großen Teil in der Leber stattfindet, zirkulieren beim Neugeborenen und somit auch im Nabelschnurblut noch in großer Zahl hämatopoetische Stammzellen. Diese Stammzellen scheinen sogar eine größere 10

16 Einleitung Proliferationsfähigkeit zu besitzen als Knochenmarkstammzellen (Kim et al. 1999). HSC tragen verschiedene Oberflächenmarker, die sich zur Isolation aus Knochenmark und Blut bewährt haben. Undifferenzierte HSC exprimieren CD34, CD133 und Thy-1 (Miraglia et al. 1997, Peault et al. 1993). In der Praxis hat sich die Isolierung anhand des CD34-Markers (siehe 1.4) bewährt. Die Transplantation von HSC wird bei einer Vielzahl von Malignomen und hämatologischer Erkrankungen eingesetzt (Benesch et al. 2003, Holmberg et al. 2003) und ist oft die einzige Therapieoption mit kurativem Potential. Mesenchymale Stammzellen (MSC): Mesenchymale Stammzellen, auch bone marrow stromal cells genannt, stellen eine weitere Population adulter Stammzellen dar, die aus dem Knochenmark isoliert werden können. Ihre Isolierung gelang kurze Zeit nach der Isolierung von hämatopoetischen Stammzellen (Friedenstein et al. 1966, Friedenstein et al. 1970) und ist relativ einfach, da sie beim Ausplattieren von Knochenmark an der Bodenfläche anhaften. Sie können sich über viele Passagen hinweg teilen und sich in Knochen, Knorpel, Fett und Bindegewebe differenzieren (Bianco et al. 2001, Pittenger et al. 1999). Die Wachstumsfaktoren PDGF, EGF, bfgf und IGF wirken dabei stark mitogen (Bianco 1999). MSC sind negativ für CD34. Progenitorzellen: Als wichtiger Vertreter aus der Gruppe der Progenitorzellen sind die Hämangioblasten (Endotheliale Progenitorzellen) zu nennen. Sie treten im Knochenmark auf und haben die Fähigkeit, Blutgefäße und Endothel zu bilden und an der Vaskularisation von Gewebe mitzuwirken (Asahara et al. 1997). Sie tragen dazu bei, nach Myokardinfarkt den Gewebeumbau (remodeling) zu verringern und die Herzfunktion zu verbessern (Kocher et al. 2001). MAPC (multipotent adult progenitor cells) sind erst vor kurzem isoliert worden und stellen eventuell die bisher einzig bekannte Population ASC dar, die das Kriterium der Pluripotenz erfüllt. So bildeten sich im Experiment bei Mäusen aus einer einzigen markierten MAPC alle drei Keimblätter (Jiang et al. 2002). In vitro gelang außerdem die Differenzierung in funktionstüchtige hepatozytenähnliche Zellen (Schwartz et al. 2002). MAPC können ohne 11

17 Einleitung auszudifferenzieren über mehr als 70 Passagen in Kultur gehalten werden. Darüber hinaus können sie sich unter ischämischen Bedingungen zu Gefäßendothelzellen differenzieren und dadurch an einer Angiogenese teilnehmen (Reyes et al. 2002). Stammzellen, die in anderen Geweben gefunden werden können: In Epithelien (Haut und Darmepithel): In diesen Geweben mit hoher Proliferationsrate regenerieren die Stammzellen untergegangene Zellen (Bianco et al. 2000, Slack 2000). Im Gehirn: Neuronale ASC konnten erstmals 1965 im Bulbus olfactorius und im Hippocampus postnataler Rattengehirne (Altman u. Das 1965, Altman 1969) nachgewiesen werden. Adulte Stammzellen kommen auch im Gehirn von anderen Säugern vor (Johansson et al. 1999) und können sich in alle drei Zelltypen, also Astrozyten, Oligodendrozyten und Neurone, entwickeln (Gage et al. 1995, McKay 1997, Momma et al. 2000, Shihabuddin et al. 1999, Temple et al. 1999). Im Fettgewebe: Es konnte gezeigt werden, dass im Fettgewebe Zellen existieren, die zu Vorläufern von Chondrozyten, Myozyten, Adipozyten und Osteozyten differenzieren, und lange in vitro kultiviert werden können (Zuk et al. 2001). Die Gewinnung dieser Stammzellen ist für den Patienten vergleichsweise ungefährlich. Im Pankreas: Genfer Wissenschaftler fanden im Pankreas selbst Zellen, die den neuralen Stammzellmarker Nestin exprimieren (Zulewski et al. 2001), über lange Zeit in Kultur gehalten werden können und sich in Insulin-produzeriende Zellen differenzieren können (Lumelsky et al. 2001). Für Aufsehen sorgte auch kürzlich die Veröffentlichung einer Lübecker Arbeitsgruppe, die anhand eines speziellen Isolationsverfahrens Zellen aus dem exokrinen Pankreasgewebe von Menschen isolieren konnten, die sich in Kultur zu Zellen aller drei Keimblätter entwickeln, sich dort stabil teilen und in Differenzierungskulturen kleine Gewebeverbände, sog. organoide Gewebekörper, bilden können (Kruse et al. 2004). 12

18 Einleitung In der Leber: Nach Implantation fetaler humaner Leberzellen in SCID-Mäuse konnte in den Mäusen danach eine humane Hämatopoeseaktivität nachgewiesen werden (Namikawa et al. 1990). Satellitenzellen und Myoblasten des Skelettmuskels: Satellitenzellen sind erstmals bei Fröschen entdeckt worden und liegen vereinzelt in der Basallamina von Muskelfasern vor. Sie können nach Verletzungsreizen, Ischämien oder anderen Stimuli zur Proliferation angeregt werden. Skelettmyoblasten stellen muskelständige Stammzellen dar, die sich zu Skelettmuskulatur differenzieren können. Sie können relativ einfach gewonnen und kultiviert werden. Zellen der side population : Diese Zellen sind aus Knochenmark und aus Skelettmuskulatur isolierbar, können sich die Muskulatur integrieren und Dystrophin bilden (Gussoni et al. 1999). Sie können dadurch isoliert werden, dass sie einen speziellen Farbstoff über transmembranöse Pumpen aus den Zellen schleusen und somit geringer fluoreszieren als andere Zellen. Sie sind CD34-negativ. ASC gelten als multipotent, d.h. sie können Deszendenten hervorbringen, die nicht demselben Keimblatt angehören wie die Ausgangszelle. Beispiele hierfür sind Knochenmarkstammzellen, die sich im Gehirn von Mäusen zu Zellen entwickeln, die neuronale Marker exprimieren (Brazelton et al. 2000) HÄMATOPOETISCHE STAMMZELLEN UND IHR KLINISCHER EINSATZ Schon seit Jahren ist bekannt, dass nach myeloablativer Chemotherapie die Rekonstitution einer normalen Hämatopoese durch Transplantation mit HSC möglich ist. Diese Therapie ist mittlerweile klinisch fest etabliert. Die Arbeit von Donald Orlic aus dem Jahre 2001 (Orlic et al. 2001a) zeigte, dass murine hämatopoetische Stammzellen sich möglicherweise zu Kardiomyozyten entwickeln können. Diese Evidenzen hatten einen großen wissenschaftlichen Widerhall und stellten den Startschuss für eine intensive Beforschung der klinischen Anwendung von HSC zur stammzellbasierten Zellersatztherapie und hier insbesondere der kardiovaskulären Zellersatztherapie dar. In letzter Zeit wurden verstärkt kritische Stimmen laut, die den Einsatz von HSC zur Behandlung 13

19 Einleitung beispielsweise von ischämischen Myokarderkrankungen als verfrüht und unverantwortlich bezeichnen. 1.3 Kardiovaskuläre Zellersatztherapie Therapie mit HSC und Knochenmarkstammzellen: Nach Veröffentlichung der Ergebnisse von Orlic (Orlic et al. 2001a), die zeigten, dass eine Unterpopulation von HSC in der Lage ist, zu Kardiomyozyten zu differenzieren und untergegangenes Herzgewebe bei der Maus zu regenerieren, ist der Einsatz autologer HSC zum Zellersatz ein Stück näher gerückt. Orlic zeigte am murinen Infarktmodell, dass Knochenmarkstammzellen nach intrakardialer Injektion funktionstüchtiges Myokardgewebe samt Endothelzellen und Zell-Zell- Kontakten wie z.b. Desmosomen bilden können. Auch funktionell ließ sich eine Verbesserung verifizieren. So nahm der enddiastolische Druck im linken Ventrikel ab und die Kontraktilität zu. Diese Ergebnisse am Mausmodell konnte Strauer (Strauer et al. 2002) auch beim Menschen nachvollziehen. Im Gegensatz zu den Versuchen von Orlic wurden hier jedoch relativ unselektierte humane Knochenmarkstammzellen eingesetzt. Zehn Patienten mit Myokardinfarkt wurden intrakoronar Knochenmarkstammzellen appliziert. Nach drei Monaten hatte sich die Infarktregion im Vergleich zu einer Kontrollgruppe signifikant verkleinert. Auch weitere kardiologische Untersuchungen (Radionuklidventrikulographie, Stressechokardiographie, Koronarangiographie) zeigten eine Verbesserung der Herzfunktion. Kurze Zeit später veröffentlichte Assmus ähnlich positive Ergebnisse beim Menschen (Assmus et al. 2002). Es wurden insgesamt 20 Patienten nach akutem Myokardinfarkt hämatopoetische Stammzellen aus dem Blut oder aus dem Knochenmark intrakoronar appliziert. Es zeigten sich nach vier Monaten signifikante Verbesserungen der linksvetrikulären Ejektionsfraktion, ein Rückgang der Wandbewegunsstörungen im Infarktareal und ein signifikant vermindertes endsystolisches linksventikuläres Ventrikelvolumen. Therapie mit Myoblasten: Erste klinische Studien mit transplantierten Myoblasten führte Menasche aus Paris bei einem Patienten mit chronisch ischämischer Herzerkrankung durch (Menasche et al. 2001). Die Ventrikelfunktion hatte sich nach kombinierter Bypass-Operation 14

20 Einleitung und Myoblastentransplantation verbessert. Allerdings konnte keine funktionelle Integration der Myoblasten in das Myokard nachgewiesen werden. Bei Versuchen mit Kaninchen konnte eine andere Forschergruppe eine funktionelle Verbesserung bei infarzierten Herzen feststellen und licht- und elektronenmikroskopisch Herzund Skelettmuskulatur nachweisen (Taylor et al. 1998). Inwieweit Myoblasten wirklich transdifferenzieren können, bleibt aber umstritten (Reinecke et al. 2002). Therapie mit fötalen Kardiomyozyten: Im Gegensatz zu adulten Kardiomyozyten können sich fötale Kardiomyozyten noch in begrenztem Maße teilen und differenzieren (Soonpaa et al. 1994). Gewonnen werden sie aus Embryonen, was sie aus ethischer Sicht für den Einsatz beim Menschen disqualifiziert Limitationen ASC bei der kardiovaskulären Stammzelltherapie Adulte Stammzellen kommen gewöhnlich nur in sehr geringer Frequenz im Körpergewebe vor. Eine in vitro Vermehrung ist zum einen wegen des eingeschränkteren Proliferationspotentials und zum anderen aufgrund der stattfindenden Differenzierung schwierig. Populationen adulter Stammzellen müssen noch genauer differenziert werden, um gezielt die Population mit dem größten therapeutischen Potential einsetzen zu können. Ähnlich wie bei embryonalen Stammzellen ist nicht auszuschließen, dass die eingebrachten Zellen ein arrhythmogenes Potential entwickeln können. Eine Differenzierung bzw. Transdifferenzierung adulter autologer Stammzellen beim Menschen ist bislang auf zellulärer Ebene noch nicht bewiesen. 1.4 Das CD34-Antigen und CD34-exprimierende Zellen Das CD34-Antigen ist ein membranständiges Protein mit einem Molekulargewicht von 116 kd. Es wurde erstmals von Civin (Civin et al. 1984) im Jahre 1984 beschrieben und wird von unreifen lymphohämatopoetischen Stammzellen gebildet. Die genaue Funktion des CD34-Antigens ist bis heute nicht endgültig geklärt. Es wird genutzt, um hämatopoetische Stammzellen aus dem peripheren Blut für eine 15

21 Einleitung Stammzelltransplantation anzureichern. Es konnte gezeigt werden, dass die Transplantation CD34-positiver Zellen des Knochenmarks und peripheren Blutes auf myeloablativ chemotherapierte Empfänger zu einer kompletten hämatopoetischen Rekonstitution führt (Berenson et al. 1988, Civin et al. 1996). Darüber hinaus zeigte sich, dass eine starke Korrelation zwischen der Anzahl retransfundierter CD34-positiver peripherer Blutstammzellen und der anschließenden hämatologischen Rekonstitutionskinetik besteht. Eine CD34- Messung ist binnen weniger Stunden durchführbar, und stellt eine weit verbreitete und akzeptierte Methode zur Quantifizierung hämatopoetischer Stammzellen dar. Auch die Selektion von HSC anhand des CD34-Antigens ist ein etabliertes Verfahren in der Hämatologie und wäre deshalb auch zum Einsatz bei kardiologischen Patienten problemlos möglich. Daneben wird das CD34-Antigen auch auf Kapillarendothelien und in embryonalen Fibroblasten gebildet. Mit zunehmender Reifung verschwindet die Expression von CD34. Interessant ist an dieser Stelle, dass nach Myokardinfarkt ein Anstieg der Konzentration CD34-positiver Stammzellen im Blut zu beobachten ist (Shintani et al. 2001). Der genaue Effekt bzw. eine physiologische Funktion dieses Anstieges ist jedoch noch unbekannt. 1.5 Transfektion und Transfektionsmethoden Da in der vorliegenden Arbeit mit der Nukleofektion gearbeitet wurde, soll hier ein kurzer Überblick über andere gängige Transfektionsverfahren gegeben werden. Unter Transfektion versteht man das Einschleusen fremder Nukleinsäuren in eine Zelle durch physikalische und/oder chemische Methoden. Davon abgegrenzt wird die Transduktion, die das Einschleusen von DNA mittels viraler Infektion beschreibt. Es geht bei allen Methoden darum, Zell- und Kernmembran zu überwinden und Fremd-DNA zur Expression zu bringen. Methoden: Elektroporation: Durch kurzes Anlegen einer Spannung wird die Zellmembran permeabilisiert und so durchlässig für die DNA gemacht. Die Elektroporation ist eine schnelle und gut reproduzierbare Transfektionsmethode, die bei einer 16

22 Einleitung Vielzahl von Zielzellen anwendbar ist. Sie kann für stabile und transiente Transfektionen verwendet werden (s ). Nukleofektion: Die Nukleofektion ist der Elektroporation sehr ähnlich und eine neue Methode der physikalischen Transfektion. Dabei wird die DNA durch eine Kombination von spezifischen Puffern und einem elektrischen Impuls bis in den Kern eingeschleust. Der genaue Mechanismus, sowie die Zusammensetzung der Nukleofektionslösung etc. sind aus patentrechtlichen Gründen nicht veröffentlicht worden. Ballistische Transfektion: Mit DNA beschichtete Wolfram- oder Goldkugeln werden auf die Zellen geschossen. Lipofektion mit kationischen Lipiden / Liposomen: Durch einen DNA- Liposomen-Komplex, welcher mit der ähnlich aufgebauten Zellmembran fusioniert, wird die DNA ins Zellinnere und schließlich in den Zellkern gebracht. Calciumphosphatpräzipitation: Calciumphosphat mit DNA wird auf die Zellen gegeben, die es dann per Endozytose aufnehmen. Mikroinjektion: Die DNA wird mit Hilfe einer Mikrokapillare direkt in den Zellkern injiziert. Diese Methode ist sehr zeitaufwendig, da jede Zelle einzeln behandelt werden muss. Virale Transduktionsmethoden: Bei dieser Methode benutzt man ein speziell verändertes Virus als Vektor, welches ein Gen in die Zelle einschleust. Diese Methode ist sehr effizient; es muss jedoch darauf geachtet werden, dass die viralen Vektoren keinen schädlichen Einfluss auf die Zielzelle haben und das zu analysierende bzw. therapeutisch wirksame Gen korrekt zur Expression gebracht wird. Problematisch ist, dass nicht gesteuert werden kann, an welcher Stelle die Fremd-DNA ins Zielgenom inseriert Stabile und transiente Transfektion Grundsätzlich werden zwei Muster der Expression der Fremd-DNA unterschieden. Bei der transienten Transfektion wird die Fremd-DNA nicht ins Genom der Zielzelle eingebaut, weshalb sie im Verlauf der weiteren Zellteilungen verloren geht. Die Expression der eingebrachten Gene kann deshalb nur im Bereich von Tagen analysiert werden. Bei der stabilen Transfektion wird die DNA entweder ins 17

23 Einleitung Zellgenom eingebaut oder wird in der Zelle autonom repliziert (durch Einführen von Replikationsorigins in die transfizierte DNA), was zu einer dauerhaften Expression des eingebrachten Gens führt. 1.6 Der low affinity nerve growth factor-receptor (LNGFR) Der LNGF-Rezeptor ist ein Zelloberflächenmarker, der ausschließlich auf Nervenzellen, wie z.b. in der Broca-Region (Hefti et al. 1986) und reifen B- Lymphozyten exprimiert wird. Er wird nicht auf Kardiomyozyten exprimiert und eignet sich daher für Markerstudien am Herzen. Für die Transfektion wurde die inaktive, in ihrer zytoplasmatischen Domäne trunkierte Form des LNGF-Rezeptors (deltalngfr, LNGFR) verwendet. Der Rezeptor ist also in der Lage, Liganden zu binden; die Signaltransduktion kann jedoch nicht stattfinden. Dieser Marker wurde schon für die klinische Applikation in Studien mit Knochenmarktransplantationen verwendet, wo er sich bewährt hat (Bonini et al. 1997, Bonini et al. 1998, Mavilio et al. 1994, Ruggieri et al. 1997, Verzeletti et al. 1998). 18

24 Einleitung 1.7 Fragestellung der Arbeit Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Voraussetzungen einer stammzellbasierten myokardialen Regeneration bei Patienten mit Dilatativer Kardiomyopathie (DCM). Ausgehend von den Arbeiten von Orlic, der eine Transdifferenzierung muriner HSC zeigte, und der Arbeit von Strauer, der eine klinisch messbare funktionelle Verbesserung bei Herzinfarktpatienten nach Applikation von mononukleären Knochenmarkstammzellen beschrieb, soll die vorliegende Arbeit dazu beitragen die Frage zu klären, ob humane CD34-positive HSC das Potential besitzen, zu Kardiomyozyten auszudifferenzieren. Könnten HSC auf nicht toxische Weise markiert werden, wäre ein Wiederauffinden dieser markierten Zellen nach erfolgter Applikation möglich. Zu diesem Zweck wurden humane HSC auf dem etablierten Weg über eine CD34- Selektion aus dem Knochenmark und aus dem peripheren Blut isoliert. Anschließend wurden diese Zellen mit der trunkierten Form des LNGFR Gens transfiziert, um folgende Fragen zu klären: Ist eine Transfektion CD34-positiver HSC mit dem LNGFR-Vektor mittels Nukleofektion möglich? Führt die Transfektion zu einer effizienten Markierung der Zellen und lassen sich die Zellen einfach detektieren? Beeinflusst die Transfektion die Vitalität der Zellen? Wie lange bleiben die Zellen markiert? Wie ist die Kinetik der Transfektion? 19

25 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Material und Geräte Zellen und Gewebsschnitte CD34-positive periphere Blutstammzellen Abteilung für Transfusionsmedizin der Universität Ulm CD34-positive Knochenmarkstammzellen Endomyokardbiopsien Abteilung für Transfusionsmedizin der Universität Ulm Abteilung Innere Medizin II (Kardiologie), Universitätsklinikum Ulm Zellkultur (Grundmedium und Zusätze) RPMI 1640 Fetales Kälber Serum (FCS) L-Glutamine (200MM) humanes rekombinantes SCF (stem cell factor) humanes rekombinantes IL-3 (Interleucine 3) humanes rekombinantes IL-6 (Interleucine 6) Invitrogen, Carlsbad, USA PAA Laboratories GmbH, Linz, A Invitrogen, Carlsbad, USA R&D Systems, Wiesbaden, D R&D Systems, Wiesbaden, D R&D Systems, Wiesbaden, D Antibiotika und Transfektionsmedien Penicillin/Streptomycin Invitrogen, Carlsbad, USA Human CD34 cell Nucleofector Solution Amaxa, Biosystems, Köln, D 20

26 Material und Methoden Oligonukleotide Alle Primer wurden bei MWG Biotech, München, D synthetisiert und lagen als Arbeitslösungen mit einer Konzentration von 10 pmol/µl in ddh 2 O gelöst vor FÜR DIE CHARAKTERISIERUNG TRANSFIZIERTER CD34-POSITIVER PBSC UND BMSC Oligo Sequenz Verwendung LNGFR-F 5 -CAG GAC AAG CAG AAC AAC GTG-3 LNGFR-Nachweis LNGFR-R 5 -CGT GCT GGC TAT GAG GTC TTG-3 LNGFR-Nachweis GAPDH-F 5 -AAG AGA GGC ATC CTC ACC CT-3 GAPDH-Nachweis GAPDH-R 5 -TAC ATG GTC GGG GTG TTG AA-3 GAPDH-Nachweis Nukleinsäuren und Längenstandards 1 kb-plus DNA-Ladder Invitrogen, Carlsbad, USA pcr3.1 Invitrogen, Carlsbad, USA Antikörper Anti-human NGF-Receptor (CL10012) Cedarlane Laboratories Limited, Hornbay, Ca Horse anti-mouse, biotinylated IgG 1 anti-mouse, PE-conjugated Dianova, Hamburg, D Becton Dickinson, Heidelberg, D Chemikalien Agar Agarose Bromphenolblau BSA Fluka Chemika, Buchs, CH Roche Mol. Biochem., Mannheim, D Sigma-Aldrich, Deisenhofen, D Serva Feinbiochemica, Heidelberg, D 21

27 Material und Methoden Dako Fluorescent Mounting Medium DMSO EDTA Ethidiumbromid Dako Corp., Carpintena, Ca, USA Sigma-Aldrich, Deisenhofen, D Merk, Darmstadt, D Sigma-Aldrich, Deisenhofen, D Verbrauchsmaterialien Kultur-Schalen (12 Well-Platten) Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA Sterilfilter Nalgene Nunc Int., Rochester, USA Falcon-Zentrifugenröhrchen (50 ml,15 ml) Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA FACS-Röhrchen Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA Verwendete Kits Cytofix/Cytoperm Eukaryotic TA Expression kit Expand Long Template PCR System High Speed Plasmid Maxi Kit High Speed Plasmid Midi Kit HotStarTaq Master Mix MikroSpin S-300 HR Columns Omniscript RT Kit Perm/Wash Buffer Becton Dickinson, Heidelberg, D Invitrogen, Carlsbad, USA Roche Mol. Biochem., Mannheim, D Qiagen GmbH, Hilden, D Qiagen GmbH, Hilden, D Qiagen GmbH, Hilden, D Amersham Pharmacia Biotech, USA Qiagen GmbH, Hilden, D Becton Dickinson, Heidelberg, D 22

28 Material und Methoden pgem-t-easy Vector System QIAprep Spin Mini prep Kit QIAquick Gel Extraction Kit RNeasy Mini Kit Shredder Säulen Staining Buffer (BSA) Promega Corp., Madison, USA Qiagen GmbH, Hilden, D Qiagen GmbH, Hilden, D Qiagen GmbH, Hilden, D Qiagen GmbH, Hilden, D Becton Dickinson, Heidelberg, D Geräte AgaGel Maxi Biofuge primo R FACS-Calibur flow cytometer Hera Safe (Bench) Image Master VDS (Gel-Auswertung) Immunfluoreszenz Mikroscop Inkubator Hera Cell Nucleofector transfector system Schüttelinkubator Certomat H Spektrophotometer DU-640 T3 Thermocycler UV-Leuchte Zell Counter Biometra, Göttingen, D Heraeus, Hanau, D Becton Dickinson, Heidelberg, D Heraeus, Hanau, D Amersham Pharmacia, Freiburg, D Zeiss, Jena, D Heraeus, Hanau, D Amaxa, Biosystems, Köln, D B.Braun, D Beckmann, D Biometra, Göttingen, D Biometra, Göttingen, D Schärfe System, Reutlingen, D 23

29 Material und Methoden HSC-Medium RPMI1640 FCS PSG SCF IL-3 IL-6 90 ml 10 ml 2 ml 50 ng/ml 20 ng/ml 10 ng/ml PSG L-Glutamine Penicillin Streptomycin 5 ml (50% v/v) 5 ml (50% v/v) TAE-Elektrophoresepuffer Tris Base Eisessig EDTA (0,5 M) 242 g 57,1 ml 100 ml ddh 2 O ad 1 l ph 8, EDTA-Lösung (0,5 M) Na 2 EDTA x 2H 2 O H 2 O 18,6 g 70 ml 10 M NaOH ad ph 8,0 H 2 O ad 100 ml 24

30 Material und Methoden Ladepuffer Bromphenolblau Xylencyanol EDTA Glycerol 0,001% w/v 0,001% w/v 50 mm 30% v/v Ethidiumbromid-Färbelösung 1x TAE-Puffer Ethidiumbromid 200 ml 100 µl (0,005% (v/v)) Immunfluoreszenz (blocking-buffer) BSA PBS 0,2% (w/v) 50 ml 2.2 Methoden Zellkultivierung (PBSC und BMSC) Die CD34-positiven hämatopoetischen Stammzellen (HSC) wurden von der Abteilung für Transfusionsmedizin der Universität Ulm zur Verfügung gestellt. Alle verwendeten Zellpräparate stammten von Patienten, die mittels einer Einverständniserklärung der Verwendung der Zellen für Forschungszwecke zugestimmt hatten. Die Zellen wurden entweder durch den Granulozyten-Makrophagen Koloniestimulierenden Faktor (GM-CSF) in das periphere Blut mobilisiert und leukapheretisch isoliert (peripheral blood stem cells; PBSC) oder mittels Knochenmarkpunktion aus dem Beckenkamm (bone marrow stem cells; BMSC) gewonnen und in der Abteilung für Transfusionsmedizin der Universität Ulm magnetisch selektioniert. Durchflusszytometrische (FACS) Reinheitsuntersuchungen mit einem Phycoerythrin (PE)-konjugierten anti-cd34- Antikörper zeigten eine Reinheit von mehr als 99% CD34-positiver Zellen für die 25

31 Material und Methoden PBSC und mehr als 95% für BMSC. Die Zellen wurden dann in flüssigem Stickstoff bei -180 C kryokonserviert. Alle Arbeiten mit Zellkulturen wurden zur Vermeidung einer Kontamination mit Bakterien, Hefen oder Pilzen in einer Laminar-Flow Werkbank mit sterilflitrierten Lösungen und unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die Zelllinien wurden im HSC-Medium bei 37 C, 5% CO 2 und in gesättigter Wasserdampfatmosphäre über den zu beobachtenden Zeitraum kultiviert. Das Medium wurde jeden zweiten Tag gewechselt und frische Wachstumsfaktoren hinzugegeben. Die Zellen waren in autologem Plasma mit 10% DMSO kryokonserviert, welches den Zellen während des Einfrierens Wasser entzieht und somit die Bildung zellschädigender Eiskristalle verhindert. Die kryokonservierten Zellen wurden mit 10 ml vorgewärmtem RPMI 1640 Medium, dem 10% FCS und 2% PSG zugesetzt worden war, zügig aufgetaut. Die Zellsuspension wurde bei Raumtemperatur und mit 1200 rpm 5 Minuten lang abzentrifugiert, um flüssiges und für die Zellen in diesem Zustand toxisches Einfriermedium rasch zu entfernen. Das Pellet wurde dann in 10 ml vorgewärmtes HSC-Medium aufgenommen. Zu Beginn der Messreihe wurde von der Suspension ein 20 µl Aliqout entnommen, mit NaCl auf eine Verdünnung von 1:200 verdünnt und mit dem Zellcounter die Vitalität und Zellzahl bestimmt. Nach einer Inkubation von 1 h bei 37 C und 5% CO 2 wurden die Zellen transfiziert Transfektion Als Transfektionsmethode wurde die Nukleofektion eingesetzt. Die Nukleofektion ist eine auf der Elektroporation basierende relativ neue physikalische Gentransfermethode, bei der die Zielzellen durch Applikation spezifischer elektrischer Pulse in einem speziellen Puffersystem zur Aufnahme von Fremd- DNA veranlasst werden. Die DNA wird hierbei nicht nur in die Zelle, sondern in den Zellkern gebracht. In der vorliegenden Arbeit wurden die Zellen mit dem pcr3.1 Vektor, der die trunkierte Form des LNGFR-Gens trug, transfiziert. Der Vektor wurde von Frau Dr.biol.hum.Juliane Wiehe, Abteilung Innere Medizin II, Universität Ulm, hergestellt, und mir freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Als Negativ-Kontrolle dienten Zellen, die mit dem pcr3.1 Leervektor transfiziert wurden. Die mit 26

32 Material und Methoden deltalngfr transfizierten Zellen exprimieren also die transmembrane und die extrazelluläre Domäne des Rezeptors und waren so über Antikörper nachweisbar. Da die intrazelluläre Domäne jedoch fehlt, kann keine Signaltransduktion stattfinden. Die Transfektion folgte dem vom Hersteller angegebenen Protokoll. Nachdem die Zellen 1 h inkubiert waren, wurden sie in ein 50 ml Zentrifugations-Falcon gebracht und 5 min bei RT mit 1200 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt. Das Pellet wurde nun in 100 µl Human CD 34 cell Nucleofector Solution resuspendiert. Die Zellkonzentration lag zwischen 5x10 5 bis 1x10 6 Zellen pro 100 µl. Eine Transfektionsprobe setzte sich aus 100 µl Zellsuspension und 2 µg des LNGFR Vektor-Konstrukts bzw. 2 µg des pcr3.1 Leervektors zusammen. Die Zellsuspension wurde in die vom Hersteller mitgelieferten Transfektionsküvetten gebracht und mit einem speziell für CD34-positive Zellen optimierten Transfektionsprogramm im Nucleofector transfiziert. Nach der Transfektion wurden 500 µl HSC-Medium zugefügt und die Zellen auf zwei Löcher einer 12-Loch Kulturplatte verteilt, in die 2 ml HSC-Medium vorgelegt waren Durchflusszytometrische Auswertung der LNGFR-Expression auf HSC (FACS-Analyse) Die Durchflusszytometrie (FACS) ist eine häufig verwendete Methode zur Charakterisierung individueller Zellen innerhalb eines Zellgemisches. Dabei werden Zellen in einem Flüssigkeitshüllstrom (sheath fluid) einzeln nacheinander an einem Laserstrahl vorbeigeleitet und die entstehende Lichtstreuung nach vorne (FSC, forward scatter) und zur Seite (SSC, side scatter) von Detektoren aufgenommen. Auf der x-achse ist in den gezeigten Diagrammen der Forward Scatter aufgetragen, welcher die Ablenkung des Laserstrahls in seiner Einfallsrichtung angibt. Die jeweilige Streuung gibt Aufschluss über Größe und Oberflächenbeschaffenheit der untersuchten Zellen. Werden Zellen eingesetzt, die mit fluorochrom-gekoppelten Antikörpern markiert sind, so lassen sich diese Zellen anhand der emittierten Fluoreszenz, die von Detektoren aufgenommen und anschließend verrechnet wird, auch über die Expression von 27

33 Material und Methoden Oberflächenproteinen charakterisieren. Auf der y-achse ist auf einer logarithmischen Skala die Fluoreszenzstärke aufgetragen, die sich so ergibt. In dieser Arbeit wurde die posttransfektionelle Expression des LNGF-Rezeptors auf HSC mittels Fluoreszenz eines PE-konjugierten Zweitantikörpers durchflusszytometrisch bestimmt. Nach den entsprechenden Zeitspannen (4, 36, 84, 120, 200 Stunden) wurden die Zellen geerntet und von jeder Probe 20 µl für die Vitalitätsbestimmung entnommen. Die Zellen wurden bei RT für 5 min mit 1200 rpm zentrifugiert und dann in 1:10 verdünntem Wash/Perm Buffer (WB) gewaschen. Danach wurden sie pelletiert, in 500 µl Cytofix/Cytoperm aufgenommen und bei 4 C für 20 min fixiert. Die abzentrifugierten Zellen wurden dann mit dem nichtkonjugierten anti-human NGF-Receptor Antikörper mit einer Verdünnung von 1:100 für 40 min auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden dann zweimal mit WB gewaschen und im Dunkeln 40 min mit dem PE-konjugierten IgG 1 -anti-mouse Antikörper inkubiert. Daraufhin wurden sie erneut mit WB gewaschen und in 500 µl Staining Buffer (BSA) resuspendiert. Die FACS-Auswertung erfolgte mit dem FACS-Calibur Flow Cytometer (Becton & Dickinson), das über einen Argon-Ionen-Laser mit einer Wellenlänge von 488 nm verfügt. Die Auswertung der Rohdaten erfolgte mit der Cellquest Software in der Version Reverse-Transkriptase Polymerase Kettenreaktion Vom Prinzip her folgt die RT-PCR (Reverse-Transkriptase Polymerase Kettenreaktion) der PCR, mit dem Unterschied, dass hier ein reverser Transkriptionsschritt, der RNA in komplementäre copy-dna (cdna) überführt, vorgeschaltet ist. Die Polymerase-Ketten-Reaktion wird zur Amplifikation von definierten DNA-Sequenzen, in unserem Fall des LNGFR-Gens und des GAPDH-Gens, benutzt. Das Grundprinzip der PCR ist die enzymatische Duplikation eines DNA-Abschnittes. Hierzu werden zwei Oligonukleotide (Primer) benötigt, die jeweils komplementär zu dem (+)-Strang des einen Endes und zu dem (-)-Strang des anderen Endes der zu amplifizierenden DNA-Region sind. Die Spezifität der verwendeten Primer ist von entscheidender Bedeutung für die PCR. Mit zunehmender Länge der Primer sinkt die Wahrscheinlichkeit des 28