Interpretationshilfe 3M Petrifilm Schnellnachweis Coliforme (RCC)

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1 3M Petrifilm Interpretationshilfe 3M Petrifilm Schnellnachweis Coliforme (RCC) Dieser Leitfaden soll sie mit der Auswertung von Ergebnissen auf 3M TM Petrifilm TM Schnellnachweis Coliforme (RCC), wie von drei der weltweit meistakzeptierten Nachweismethoden für Coliforme definiert, vertraut machen. Für zusätzliche Informationen wenden sie sich bitte an den, für ihre Region zuständigen, Ansprechpartner für 3M Mikrobiologie Produkte. AOAC International und das U.S. FDA Bacteriological Analytical Manual (BAM) definieren Coliforme als gramnegative Stäbchen, die durch metabolische Laktosefermentation Säure und Gas produzieren. Coliforme Kolonien, die auf den Petrifilm RCC - Platten wachsen, produzieren Säure durch die sich, aufgrund des ph - Indikators, die Gelfarbe von rot - orange nach gelb verfärbt und eine Zählung der vermutlich coliformen Keime liefert. Rund um die Coliformen Kolonien eingeschlossenes Gas zeigt bestätigte Coliforme Keime an. ISO definiert Coliforme durch ihrer Fähigkeit in einem methodenspezifischen, selektiven Medium zu wachsen. ISO - Methode 4832, Zählung von Coliformen durch Koloniezählung, definiert Coliforme durch ihre Größe und die Säureproduktion auf VRB mit Lactose (VRBL) Agar. Auf Petrifilm RCC - Platten werden diese säureproduzierenden Coliformen durch gelbe Säurezonen oder durch rote Kolonien, mit oder ohne Gas angezeigt. ISO - Methode 4831, Zählung von Coliformen mit einer Methode der höchswahrscheinlichen Anzahl (MPN), definiert Coliforme durch ihre Fähigkeit der Gasproduktion aus Lactose in einer selektiven Nährlösung. Auf Petrifilm RCC - Platten werden diese Coliformen durch rote Kolonien, mit Gas angezeigt. AFNOR hat Petrifilm RCC - Platten sowohl im Vergleich zu ISO - Methode 4831 als auch ISO - Methode 4832 validiert Nach 6 Stunden Inkubation. Coliformen Nachweis durch Säurezonen (6-14 h) Gelbe Säurezonen können schon nach 6 Stunden erscheinen. Sind Coliforme vorhanden, erscheinen gelbe Zonen die sich während der Inkubation weiter ausbreiten. Interpretation im Vergleich zur AOAC / BAM Methode Gelbe Säurezonen, mit und ohne roten Mittelpunkt, als vermutet Coliforme auszählen. Interpretation im Vergleich zu ISO 4832 (VRBL) Gelbe Säurezonen, mit und ohne roten Mittelpunkt, als Coliforme auszählen. Endresultate nach 14 h. (AFNOR Validierung) Nach 14 Stunden Inkubation. Coliformen Nachweis durch Koloniezählung Rote Kolonien mit oder ohne Gas können schon nach 8 Stunden erscheinen und bei längerer Inkubation weiterwachsen. Interpretation im Vergleich zur AOAC / BAM Methode Rote, mit Gas in Verbindung stehende, Kolonien immer als bestätigt Coliforme auszählen Interpretation im Vergleich zu ISO 4831 (MPN) Zählen Sie rote Kolonien mit Gas als Coliforme. Finale Ergebnisse nach 24 +/- 2h (AFNOR Validierung). Ausnahme: verarbeitetes Schweinefleisch. Interpretation im Vergleich zu ISO 4832 (VRBL) Rote, mit Gas in Verbindung stehende, Kolonien als Coliforme auszählen. Endresultate, mit Ausnahme von verarbeitetem Schweinefleisch, nach 24 h +/- 2 h. (AFNOR Validierung)

2 Das frühe Auswerten des 3M Petrifilm RCC für den Schnellnachweis von Coliformen durch Säure- und Gasbildung hängt von der Bakterienart und ihrer Konzentration ab. Auswerten von Säurezonen (6-14 h) Gelveränderung in den Abbildungen 3 bis 10 beachten. Während die Coliformen Säure produzieren, verändert sich die Gelfarbe von rot - orange nach orange - gelb. Hohe Konzentrationen Coliformer (> 1000 Kolonien / Platte) können die gesamte Wachstumsfläche schon nach 4 Stunden gelbfärben. Siehe Abbildung 4. In diesem Fall sollte die Probe zur genaueren Auswertung weiter verdünnt werden. Einige Coliforme produzieren große Mengen Säure. Bei diesen Organismen kann ein Zusammenfließen der Säurezonen schon bei weniger als 20 Kolonien / Platte auftreten. Hochrechnungen können auf Platten mit getrennten Säurezonen auch bei mehr als 50 Kolonien / Platte durchgeführt werden. Der kreisförmige Wachstumsbereich der Petrifilm RCC - Platten entspricht ca. 20 cm 2. Geschätzte Werte werden durch Auszählen eines oder mehrerer repräsentativer Quadrate ermittelt. Der Durchschnittswert der ausgezählten Quadrate wird dann mit 20 multipliziert. In dem Quadrat in Abbildung 5 sind sechs Säurezonen markiert. Sobald die Coliformen weiterwachsen, erscheinen innerhalb der Säurezonen rote Kolonien Coliformen Auswertung = 0 5. Geschätzte Coliformen Auswertung = Nicht auswertbar (tatsächliche Anzahl > 10 5 ) 6. Geschätzte Coliformen Auswertung = 120 Geschätzte Coliformen Auswertung = 280

3 Auswertung von Kolonien und Gasblasen (8-24 h) Abbildung 7 und 8 zeigen Resultate derselben, bei gleicher Zeit inkubierten, Konzentration unterschiedlicher Organismen. Klar abgezeichnete Kolonien mit Säurezonen erscheinen auf beiden Platten. Die Organismen in Abbildung 8 scheinen allerdings schneller in der Lage zu sein durch Lactosefermentation Gas zu produzieren, als diejenigen in Abbildung 7. Abhängig von der bisher eingesetzten Methode werden die Kolonien mit oder die Kolonien ohne Gas ausgezählt. Eine Kolonie steht dann mit Gasblasen in Verbindung, wenn der Abstand zwischen Kolonie und Gasblase nicht größer als der Koloniedurchmesser ist, oder die Gasblasen ringförmig um die Kolonie angeordnet sind. Kreis 1 und 2 speziell in Abbildung 7. *Abbildung 9 ist ein weiteres Beispiel für das Auswerten von Kolonien mit oder ohne Gas. Die Auszählung ist abhängig von der angewandten Methode. Im Vergleich zu AOAC / BAM Methoden, bestätigte Coliforme mit Gas = 72. Im Vergleich zu ISO 4831, Coliforme als Kolonien mit Gas = 72. Im Vergleich zu ISO 4832, Coliforme als Kolonien mit oder ohne Gas = 128. Wenn die Anzahl der Coliformen 150 Kolonien / Platte übersteigt, die Zählung schätzen. Auf dem Schaumdamm gewachsene Kolonien nicht auszählen. Sie sind nicht unter dem selektiven Einfluß des Mediums gewachsen. Siehe Abbildung 7 bis Coliformen Auswertung = 64 Coliformen Auswertung = (Text für Coliformen Auswertung beachten*) Geschätzte Coliformen Auswertung = 240

4 Nicht auswertbare Ergebnisse ( > 1000 Kolonien / Platte ) ColiformenAuswertung - Nicht auswertbar ( > 10 4 ) Nicht auswertbare Petrifilm RCC - Platten haben eines oder mehrere der folgenden Merkmale: Gelfarbe wechselt von rot - orange nach orange - gelb, viele kleine Kolonien, viele Gasblasen. ColiformenAuswertung - Nicht auswertbar (> 10 3 ) Die in Abbildung 12 dargestellte Petrifilm RCC - Platte hat zwei typische Merkmale nicht auswertbarer Kolonien: Wechsel der Gelfarbe und viele kleine Kolonien Coliformen Auswertung - Nicht auswertbar (> 10 4 ) Die Kolonieanzahl in Abbildung 13 ist so hoch, daß einzelne Kolonien nicht mehr definiert werden können. Der Wechsel der Gelfarbe und die vielen Gasblasen weisen auf eine nicht auswertbare Platte hin. Coliformen Auswertung = 0 Abbildung 14 zeigt eine Petrifilm RCC - Platte mit einer hohen Anzahl gramnegativer nicht - coliformer Kolonien. Sind Organismen die keine Lactose fermentieren in großer Zahl vorhanden, kann das Gel dunkler erscheinen.

5 ph - Wert: Die meisten Bakterien benötigen für ein optimales Wachstum einen ph -Wert nahe 7,0. Proben oder Probenreihen mit niederigem ph - Wert müssen auf einen ph - Wert zwischen 6,5 und 7,5 angeglichen werden bevor sie auf Petrifilm Platten pipettiert werden. Abbildung 15 und 16 zeigen Beispiele für einen, nach der ph - Angleichung, plattierten Naturjoghurt. Hemmstoffe in der Platte verhindern ein Wachstum der gram - positiven Starterkolonien. Die von den Starterkolonien produzierte Säure kann allerdings trotzdem zu einem Wechsel der Gelfarbe von rot - orange nach orange - gelb führen und somit ein nicht - auswertbares Ergebnis vortäuschen. Platten mit frischem Joghurt deshalb während der Inkubation immer wieder kontrollieren und auf weitere Anzeichen einer nicht - auswertbaren Platte achten Coliformen Auswertung = 0 Ein Vergleich der oben abgebildeten Kontrollplatte mit den nicht - auswertbaren Platten auf der vorhergehenden Seite zeigt, daß in Abbildung 15 weder Kolonien noch Gasblasen auf eine nicht - auswertbare Platte hinweisen. Coliformen Auswertung = 4 Trotz des Farbwechsels im Gel ist die von Coliformen produzierte Säure einfach zu erkennen. Produktpartikel: Lebensmittelpartikel sind meist unregelmäßig geformt und stehen nicht mit Gasblasen in Verbindung Coliformen Auswertung = 11 Abbildung 17 zeigt eine frühe Auswertung einer Paprikaprobe. Kreis 1 zeigt eine Säurezone um einen roten, unregelmäßig geformten Probenpartikel. Einige Lebensmittelproben können saure Bestandteile enthalten die eventuell mit dem ph - Indikator reagieren. Kreis 2 zeigt eine Gasblase neben einem roten, unregelmäßig geformten Probenpartikel, aber keine Säurezone. Keine von beiden sollte als Kolonie ausgewertet werden. Coliformen Auswertung = 10 Abbildung 18 zeigt eine Schokoladenverdünnung. Während der Inkubation breiten sich, mit Kolonien in Verbindung stehende, Säurezonen weiter aus. Mit Kolonien in Verbindung stehende Gasblasen sind eine weitere Hilfe zur Identifikation von Coliformen. Gasblasen könne Kolonien auch umranden. Die Auswertung von Kolonien mit oder ohne Gasblasen ist abhängig von der verwendeten Methode.

6 3M Petrifilm Schnellnachweis Coliforme (RCC) Für detaillierte Warnhinweise, Vorsichtsmaßnahmen, Garantiebeschränkungen, Haftungsbeschränkungen, Lagerung, Entsorgung und weitere Gebrauchshinweise siehe Packungsbeilage. Lagerung Gebrauchsanweisung 1 Ungeöffnete Packungen bei 8 C lagern. Vor Ablauf des Verfallsdatums verbrauchen. 2 Geöffnetes Ende einer nicht verbrauchten Packung umfalten und mit Klebeband verschließen. 3 Wiederverschlossene Packungen bei 25 C und 50 % relativer Luftfeuchtigkeit lagern. Geöffnete Packungen nicht gekühlt lagern und innerhalb eines Monats verbrauchen. Vorbereitung Geeignete Menge einer geeigneten Verdünnungsflüssigkeit z. B. 0,1 % Roh - und Magermilch können direkt aufpipettiert werden. Für andere Lebensmittel undmilchprodukte mindestens eine 1:10 Verdünnung der Probe vorbereiten. Probe in geeignetes, steriles Gefäß (z.b. Stomacher Beutel, Verdünnungsflasche, Whirl - Pak Beutel oder andere geeignete Gefäße) einwiegen oder pipettieren. Peptonwasser, Peptonsalzlösung (ISO - Methode 6887), 0,85-0,90 % -ige Kochsalzlösung, destilliertes Wasser oder Butterfield Phosphat Puffer (IDF Phosphat Puffer - KH2PO4 bei g/L - eingestellt auf einen ph - Wert von 7.2 ) hinzufügen. Vermischen oder homogenisieren der Probe nach anerkannten Methoden. Beimpfung Keine Citrat-, Bisulfit- oder Thiosulfathaltige Puffer verwenden. ph - Wert der verdünnten Probe auf 6,6 bis 7,2 angleichen: für saure Produkte mit 1N NaOH, für alkalische Produkte mit 1N HCl. Petrifilm auf ebene Oberfläche legen. Mit senkrecht gehaltener Pipette, 1 ml Deckfilm anheben. der Probe in die Mitte der unteren Folie pipettieren. Deckfilm vorsichtig abrollen um Lufteinschlüsse zu vermeiden. Deckfilm nicht einfach fallenlassen.

7 Beimpfung 10 Probenverteiler mit glatter Seite nach unten auf die Probe unter dem Deckfilm legen Durch leichten Druck auf den Probenverteiler die Probe auf dem kreisförmigen Wachstumsbereich verteilen. Probenverteiler abheben. Platte zur Gelverfestigung mindestens 1 Minute liegenlassen. Inkubation Interpretation <70 F 13 Maximal 20 Platten, bei 35 C ± 1 C* für bis zu 24 h. ± 2 h, mit der klaren Seite nach oben, übereinander inkubieren. Abhängig von der gewünschten Information die Platten in definierten Zeitabständen kontrollieren. * Bezüglich der Ausnahme laut AFNOR (Inkubationstemperatur von verarbeitetem Schweinefleisch) die Packungsbeilage beachten Um eine frühe Auswertung der Petrifilm Platten zu erleichtern, bitte bei indirekter Beleuchtung auszählen. Petrifilm Platten können auf handelsüblichen Koloniezählgeräten oder anderen Vergrößerungsquellen ausgezählt werden. Zum Auswerten der Ergebnisse Interpretationshilfe beachten. Kolonien können zur weiteren Identifikation isoliert werden. Deckfilm anheben und die Kolonie vom Gel nehmen. Zusätzliche Hinweise Inkubationsdauer und temperatur sind abhängig von der gewählten Methode. Siehe Packungsbeilage.

8 Gesamtkeimzahl - Art.Nr / 100 Stück - Art.Nr / 1000 Stück Hefen & Schimmelpilze - Art.Nr / 100 Stück - Art.Nr / 1000 Stück Enterobacteriaceen - Art.Nr / 50 Stück - Art.Nr / 1000 Stück Coliforme - Art.Nr / 50 Stück - Art.Nr / 1000 Stück Schnellnachweis Coliforme - Art.Nr / 50 Stück - Art.Nr / 500 Stück geringe Mengen Coliforme - Art.Nr / 50 Stück - Art.Nr / 500 Stück E. coli und Coliforme - Art.Nr / 50 Stück - Art.Nr / 500 Stück 3M Medica Zweigniederlassung der 3M Deutschland GmbH Hammfelddamm Neuss Tel: (02131) Fax: (02131) M Österreich GmbH Brunner Feldstrasse Perchtoldsdorf Tel.: +43-(0) Fax: +43-(0) medizin-at@mmm.com 3M (Schweiz) AG Eggstrasse Rüschlikon Switzerland Tel.: Fax: Please recycle. Printed in Germany. 3M All rights reserved D 3M and Petrifilm are trademarks of the 3M company.