Kultivierung und Charakterisierung von potentiellen kardialen Progenitorzellen

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1 Aus der Medizinischen Klinik II mit Poliklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. med. W. G. Daniel Kultivierung und Charakterisierung von potentiellen kardialen Progenitorzellen Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Helmut Kronfeldner aus Elisabethszell

2 Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Universität Erlangen-Nürnberg Dekan: Referent: Korreferent: Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler Prof. Dr. C. Garlichs Prof. Dr. W. G. Daniel Tag der mündlichen Prüfung:

3 Gewidmet meinen Eltern

4 INHALTSVERZEICHNIS I ZUSAMMENFASSUNG... 1 SUMMARY EINLEITUNG Die Regenerationsfähigkeit des Herzmuskels Klinischer Hintergrund Eigenschaften von Progenitorzellen und Stammzellen Versuche zur regenerativen Zelltherapie am Herzen Embryonale Stammzellen Myoblasten aus der Skelettmuskulatur Hämatopoetische Stammzellen Autologe kardiale Progenitorzellen Isolation von c-kit-zellen Isolation von sca-1-zellen Isolation von SP-Zellen Isolation von isl-1-zellen Isolation von Zellen mit der Kardiosphären-Methode Zielsetzung MATERIALIEN UND METHODEN Materialien Methoden Die Zellkultur Die Zellkultur aus Herzmuskelgewebe Anlage der Zellkulturen mit Explantaten Anlage der Zellkulturen mit Kardiosphären Anlage der Zellkulturen mit Cardiosphere Derived Cells (CDC) HUVEC-Zellkulturen THP-1-Zellkulturen Lichtmikroskopie Immunzytochemie Übertragung der Kardiosphären auf Objektträger Übertragung der CDC auf Objektträger Immunzytochemische Färbung Kontrollfärbungen an THP Kontrollfärbungen an HUVEC Kontrollfärbungen am Explant Die Eigenschaften der untersuchten Markerproteine c-kit MDR (bzw. P-Glykoprotein) Marker für Zellen aus dem Knochenmark Marker für Kardiomyozyten... 22

5 II Immunhistochemie Western Blot Analyse Proteinextraktion Proteinquantifizierung SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese Immunoblot Elektronenmikroskopie Durchflusszytometrie der Überstände Herstellen der Reagenzien Vorbereiten der Filter-Platte Durchflusszytometrische Messung Die Eigenschaften der untersuchten Zytokine Statistik ERGEBNISSE Morphologie und Entwicklung der Zellen Explantat-Kulturen Kardiosphären Cardiosphere Derived Cells (CDC) Die Zellkulturen im Zeitverlauf Immunzytochemie an Kardiosphären und CDC Immunzytochemie an Kardiosphären (CS) Connexin c-kit Kardiales Troponin T MEF2D GATA nkx FOXH Vimentin CD CD MDR Kernfärbung mit DRAQ Immunzytochemie mit Cardiosphere Derived Cells (CDC) Connexin c-kit Kardiales Troponin T MEF2D GATA nkx FOXH Vimentin CD CD MDR Zusammenfassung Elektronenmikroskopie der Kardiosphären Ergebnisse der Antikörper-Positivkontrollen Western Blot mit Anti-MEF2, Anti-nkx2.5 und Anti-GATA Immunhistochemie mit Anti-Vimentin, Anti-MDR, Anti-Troponin und Anti-c-kit Immunzytochemie an THP-1 mit Anti-CD34 und Anti-CD Immunzytochemie an HUVEC mit Anti-c-kit Immunzytochemie am Explantat mit Anti-cTnT... 66

6 III 3.5 Zytokine in den Überständen der Kulturen t-pa IL IL MCP Nicht nachgewiesen: svcam-1, sp-selektin, scd40-l DISKUSSION Die Isolation und Expansion von kardialen Progenitorzellen ist reproduzierbar durchführbar CS und CDC sind positiv für c-kit und negativ für MDR Die Zellen der Kardiosphären und die CDC exprimieren herzmuskelzellspezifische Marker Die Zellen der CS sind negativ für CD34 und CD45, CDC sind negativ für CD45 und schwach positiv für CD Die spezielle Morphologie der Kardiosphären Die Hülle der Kardiosphären Der Kern der Kardiosphären Abgrenzung der CS und CDC von Fibroblasten Die CS und CDC sezernieren die Zytokine MCP-1, IL-6, IL-8 und t-pa Vorteile der Kardiosphärenmethode Nachteile der Kardiosphärenmethode Die Einordnung als adulte kardiale Progenitorzellen Ausblick ANHANG Materialien Zellkultur Immunzytochemie Immunhistochemie Western-Blot Durchflusszytometrie Geräte Herstellung von Kulturmedien, Beschichtungen, Pufferlösungen und Reagenzien für die IHC und WB Herstellung von Kulturmedien Herstellung von Beschichtungen Pufferlösungen Reagenzien für die Immunhistochemie (IHC):

7 IV Reagenzien für Western Blot (WB): Weitere Ergebnisse der Antikörper-Positivkontrollen Immunhistochemie MDR am Kolonkarzinompräparat Vimentin am Herzmuskelpräparat Immunzytochemie CD34 auf THP-1-Zellen CD45 auf THP-1-Zellen c-kit auf HUVEC LITERATURVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS DANKSAGUNG LEBENSLAUF.. 133

8 1 ZUSAMMENFASSUNG Zusammenfassung Hintergrund: Vor wenigen Jahren konnten erstmals adulte, multipotente, kardiale Progenitorzellen im Herzmuskel nachgewiesen werden. Seitdem wird ein Weg gesucht, der einen erfolgreichen Einsatz dieser Zellen bei der Therapie der chronischen Herzinsuffizienz ermöglichen soll. Ein möglicher Ansatz dafür ist die Selektion und Vervielfältigung dieser kardialen Stammzellen durch eine spezielle Zellkulturmethode, bei der sich Kardiosphären (CS) und davon abgeleitete Zellen (CDC) entwickeln. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung dieses Verfahrens in Erlangen, die Überprüfung dieser neuartigen Methode und eine genauere Charakterisierung von CS und CDC. Methoden: Aus humanem Herzmuskelgewebe wurden über verschiedene Kulturschritte CS gezüchtet. Es handelt sich dabei um spezielle kugelige Zellansammlungen. Die darin enthaltenen Zellen wurden in eine Monolayer-Kultur überführt und als CDC bezeichnet. CS und CDC wurden lichtmikroskopisch und mit Methoden der Immunzytochemie untersucht. Die Kardiosphären wurden zusätzlich elektronenmikroskopisch begutachtet. Die durch die Kultur konditionierten Nährmedien wurden durchflusszytometrisch auf die Anwesenheit und Veränderung der Zusammensetzung von Zytokinen untersucht. Ergebnisse: Das Verfahren zur Gewinnung der Zellen konnte erfolgreich etabliert werden. CS und CDC zeigten sowohl für Stammzellen als auch für Kardiomyozyten typische Markermoleküle. Sie erwiesen sich als positiv für c-kit, Connexin43, kardiales Troponin T, MEF2D, GATA4, nkx2.5 und negativ für CD34, CD45, MDR. Morphologisch zeigte sich bei den CS ein zelldichter Randbereich umgeben von einer flachen Einzellschicht und ausgefüllt von nekrotischem Material. Die konditionierten Nährmedien enthielten in allen Kulturphasen die Zytokine MCP-1, IL-6, IL-8 und t-pa. Schlussfolgerungen: Die Zellkulturmethode ist nur mit großem Aufwand durchführbar und deshalb noch verbesserungswürdig. Für die weitere Erforschung der kardialen Progenitorzellen kann diese Methode weiterhin wertvolle Dienste als Quelle für Zellen leisten und möglicherweise Grundlage für einen zukünftigen therapeutischen Einsatz bilden. Die analysierten Zytokine müssen in weiteren Untersuchungen auf ihre Funktion bei der interzellulären Kommunikation und ihre Rolle bei der Steuerung des Wachstums von Herzmuskelzellen überprüft werden.

9 2 SUMMARY Summary Backround: A few years ago adult multipotent cardiac progenitor cells could be detected in the myocardium for the first time. Thenceforth the search started for a path to use these cells successfully for the treatment of chronic heart failure. One possible approach is the selection and expansion of these cardiac stem cells by a special cell culture method in which Cardiospheres (CS) and Cardiosphere Derived Cells (CDC) develop. The aim of this study was to establish this procedure in Erlangen, to test this new method and to characterize CS and CDC more precisely. Methods: Human myocardium was processed through different culture steps to obtain Cardiospheres, which are specific spherical accumulations of cells. The cells contained in these CS were then transformed into a monolayer culture to yield CDC. CS and CDC were analyzed with light microscopy and immuncytochemistry. Cardiospheres were also examined with an electron microscope. The culture media, which were conditioned by the growing cells, were analyzed by flow cytometric methods. This procedure was performed to assess the content and change in the composition of cytokines in these culture media. Results: The technique to obtain these cells could be established successfully. CS and CDC showed typical molecular markers for stem cells and cardiomyocytes. They were tested positive for c-kit, connexin43, cardiac Troponin T, MEF2D, GATA4, nkx2.5 and were negative for CD34, CD45 and MDR. The CS showed an area full of cells in the outer section of the sphere, surrounded by a flat cellular monolayer. It was filled up with necrotic material. The conditioned cell mediums contained the cytokines MCP-1, IL-6, IL-8 and t-pa in every phase of the culture, whereas svcam-1, scd40-l and sp-selectin could not be detected. Conclusion: The cell culture method is feasible only with greater effort and therefore it needs to be improved. This technique can still provide a valuable source for cells, and may form the base for future therapeutic use. The analyzed cytokines have to be examined further to assess their function in intercellular communication and their role in controlling the growth of heart muscle cells.

10 3 EINLEITUNG 1 EINLEITUNG 1.1 Die Regenerationsfähigkeit des Herzmuskels Das Myokard des erwachsenen Menschen galt lange Zeit als vollständig ausdifferenziertes, postmitotisches Organ, dessen Kardiomyozyten nicht zu Zellneubildung und Regeneration fähig seien. Diese These wurde allgemein akzeptiert. Kontraktiles Herzmuskelgewebe sei also nach Beschädigung oder Zerstörung, wie es beispielsweise im Rahmen eines Myokardinfarktes geschehen kann, in seiner eigentlichen Funktion für immer verloren und könne nur durch Narbengewebe ersetzt werden. In den letzten Jahren wurde dieses Dogma durch neuere 16, 189 Erkenntnisse in Frage gestellt. Im Jahr 2001 konnten Beltrami et al. erstmals nachweisen, dass nach einem Herzinfarkt in der Nähe von infarzierten Arealen eine erhöhte mitotische Aktivität in Kardiomyozyten auftritt. 16 Die Vermutung, dass einige Zellen im Herzmuskel zur Regeneration von Kardiomyozyten fähig sein könnten, wurde durch die Beobachtungen von Anversa et al. erhärtet. Dabei wurden nach der Transplantation von weiblichen Spenderherzen in männliche Empfänger einige Zellen mit Y-Chromosomen im Herzmuskel und in den dort liegenden Arteriolen gefunden. Dies legte die Vermutung nahe, dass sich spezielle, im Blut zirkulierende Zellen aus dem Knochenmark in den Herzmuskel integrieren. 158 Mit dem Begriff der Regeneration wird in diesem Zusammenhang der Ersatz von defekten oder abgestorbenen Zellen durch Mitose von Nachbarzellen oder Stammzellen bezeichnet. Weitere Untersuchungen bestätigten die Annahme, dass ein gewisser Zellumsatz im Myokard stattfindet und sich im Herzen multipotente Stammzellen befinden, die sich zu Kardiomyozyten, 15, 17, 86, 87, 118, 124, 145 Gefäßmuskelzellen und Endothelzellen differenzieren können. Durch eine spezielle Methode der kulturtechnischen Selektion konnten vor wenigen Jahren erstmals Kardiosphären (CS) und davon abgeleitete Zellen (CDC) isoliert und vermehrt werden. Sie wurden damals als kardiale Progenitorzellen bezeichnet. Es soll sich dabei um spezielle adulte und im Herzen ansässige Vorläuferzellen von Kardiomyozyten handeln. Es wurden 42, 124, 169 sowohl Eigenschaften von Stammzellen als auch von Herzmuskelzellen nachgewiesen. Die Etablierung dieses Kulturverfahrens und die Charakterisierung der daraus hervorgehenden, noch relativ wenig erforschten Zellpopulation ist das Ziel dieser Arbeit. 1.2 Klinischer Hintergrund Laut statistischem Bundesamt ist die Herzinsuffizienz in Deutschland der häufigste Grund für einen stationären Krankenhausaufenthalt. 173 Die chronische ischämische Herzkrankheit ist die häufigste Todesursache in Deutschland. 174, 175 Die Prognose hängt dabei vor allem auch vom Ausmaß des irreversiblen Zelluntergangs von Kardiomyozyten ab, welche nicht mehr durch

11 4 EINLEITUNG funktionierende Muskelzellen, sondern durch Narbengewebe ersetzt werden. Dieser Zelltod findet typischerweise als Folge eines Myokardinfarkts statt und führt zu einer Beeinträchtigung der Funktion des Myokards. 70 Für die entstehende Herzinsuffizienz fehlen bislang gezielte kausale und kurative Therapiemöglichkeiten zur Regeneration oder zum Ersatz von Herzmuskelzellen. 9 Bisher stehen zur Bekämpfung der kardiovaskulären Erkrankungen präventive Strategien, medikamentöse Therapien und operative oder interventionelle Reperfusionsmethoden zur Verfügung. Die Angriffspunkte dieser Behandlungen sind vor allem die Sicherstellung der koronaren Versorgung, die Verhinderung von gefährlichen Herzrhythmusstörungen und die Verbesserung der Effizienz der verbleibenden kardialen Pumpfunktion. Daneben kann bei der terminalen Herzinsuffizienz in einigen Fällen die Herztransplantation zu einer bedingten Heilung führen. Diese letzte Behandlungsoption kann aber aufgrund des Mangels an Spenderorganen, den entstehenden Kosten und Risiken bei diesem umfangreichen Eingriff und der nachfolgenden problematischen immunsuppressiven Therapie nur bei einem begrenzten Patientenkollektiv durchgeführt werden. Seit etwa zwei Jahrzehnten wurden Versuche unternommen, durch Zelltransplantation einen erfolgreichen Ansatz zum gezielten Ersatz des defekten Myokards zu entwickeln. Die Entdeckung von Stammzellen bzw. Progenitorzellen, die sich zu Kardiomyozyten differenzieren 116, 158 können, machte diese Therapieoption erst denkbar. Die bedingte Regenerationsfähigkeit des Herzmuskels ist heute weitgehend anerkannt, konnte aber bisher den Krankheitsverlauf bei Herzinsuffizienz nicht spürbar positiv beeinflussen. In Zukunft könnten die Vorläuferzellen des Herzmuskels möglicherweise auch in situ mit bestimmten Medikamenten zur Regeneration des Myokards angeregt werden. 17, 24, 28, 53, 87 Es konnte bereits nachgewiesen werden, dass Resveratrol die Regenerationsleistung der kardialen Stammzellen erhöhen kann Eigenschaften von Progenitorzellen und Stammzellen Im Folgenden wird kurz auf die grundlegenden Begriffe adulte Stammzellen und Progenitorzellen eingegangen. Der Begriff adulte Stammzellen beschreibt nicht ausdifferenzierte Zellen des menschlichen Körpers, die dazu fähig sind, sich in unbegrenztem Maße unter Bewahrung des nicht ausdifferenzierten Zustands zu teilen und sich zu spezialisierten Zellen zu differenzieren. 63 Verfaillie et al. definierten die Stammzellen in ähnlicher Weise: - Sie zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, sich selbst durch vielfache Zellteilung zu erneuern; - Aus ihnen gehen Tochterzellen hervor, die sich üblicherweise in mehrere unterschiedliche Zelltypen differenzieren können;

12 5 EINLEITUNG - Sie können sich nach Transplantation in einen Empfängerorganismus im entsprechenden Herkunftsgewebe wieder ansiedeln; - Dort differenzieren sich ihre Tochterzellen vollständig zum Zelltypus des besiedelten Gewebes aus, auch wenn dieses nicht beschädigt ist. Für die Definition der Stammzellen reichen hier die ersten beiden Kriterien. Bei hämatopoetischen, neuralen und embryonalen Stammzellen konnten auch die beiden zusätzlichen Merkmale nachgewiesen werden, welche vor allem für die Zelltherapie eine wichtige Bedeutung zu haben scheinen. 193 Im Rahmen dieser Arbeit wurde auch nach verschiedenen Stammzellmarkern gesucht. Deren Anwesenheit kann auf eine zumindest multipotente Differenzierungsfähigkeit und potentiell gesteigerte Proliferationsfähigkeit hinweisen. Tochterzellen multipotenter Vorläuferzellen können sich nur noch zu bestimmten Zellarten des Herzens differenzieren. 193 Die untersuchten kardialen Progenitorzellen werden so bezeichnet, weil sie aus dem Herzmuskel isoliert wurden. Durch die Benennung wird auch deutlich, dass neben Kardiomyozyten auch andere Zellarten des Herzens daraus hervorgehen können. So entwickeln sich anscheinend auch 15, 42, 124, 169 Gefäßendothelzellen und glatte Gefäßmuskelzellen aus diesen Vorläuferzellen. Nicht nur durch die Fähigkeit unterschiedliche Zellarten hervorzubringen, sondern auch durch die Proliferationsrate unterscheiden sich die Stammzellen der verschiedenen Organe und Gewebearten. 69, 193 Die Vorläuferzellen verschiedenster Gewebe sind deshalb nicht fähig zur selbstständigen und vollständigen Regeneration, sobald die Zellschädigung ein gewisses Ausmaß überschreitet. Beispielsweise reicht die regenerative Kapazität im Myokard offensichtlich nicht aus, um die Herzfunktion nach einem Infarkt vollständig wiederherzustellen. Überzeugende Erklärungen dafür wurden bisher noch nicht gefunden. Als mögliche Ursachen können eine mögliche schlechte vaskuläre Versorgung, apoptosefördernde Mechanismen oder fehlende parakrine Anregung und Steuerung in Betracht gezogen 61, 67, 139, 192 werden. 1.4 Versuche zur regenerativen Zelltherapie am Herzen Seitdem nachgewiesen werden konnte, dass einige Zelltypen die Fähigkeit besitzen, sich in das 16, 158 beschädigte Myokard zu integrieren, wird versucht, diese Zellen zu isolieren, zu charakterisieren und einen Weg für den therapeutischen Einsatz zu finden. 76, 94 Im Folgenden wird geschildert, wie Zellen aus dem Skelettmuskel, dem Knochenmark, und dem Herzmuskel gewonnen, untersucht und transplantiert wurden, um die Regeneration des Myokards zu fördern. Auch embryonale Stammzellen werden für die Erforschung der genaueren Mechanismen verwandt und als Quelle von regenerativen Therapien in Erwägung gezogen.

13 6 EINLEITUNG Es wurde nach Zellen gesucht, die wie Stammzellen proliferieren, und sich im Verlauf zu Kardiomyozyten differenzieren. Sie sollten darüber hinaus ins Myokard einwandern und dort die Funktion des Herzmuskels verbessern. Außerdem sollten sie möglichst problemlos gewonnen, isoliert und vervielfältigt werden können. Insgesamt sollte die Behandlungsmethode bei geringem Risiko den größtmöglichen Nutzen für den Patienten erreichen Embryonale Stammzellen Im Jahr 2001 gelang erstmals die gezielte Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen zu Zellen, die in Struktur und Funktion den Kardiomyozyten glichen. Sie zeigten Spontanaktivität und exprimierten sowohl frühe kardiale Transkriptionsfaktoren wie GATA4, nkx2.5 und MEF, als auch spezielle Strukturproteine des Herzmuskels. 92 Neben den Herzmuskelzellen entstanden auch glatte Gefäßmuskelzellen und Endothelzellen. Im Rattenherz koppelten sich diese embryonalen Stammzellen elektromechanisch an die adulten Kardiomyozyten. Die Pluripotenz, die scheinbar volle Funktionalität und hohe Proliferationsrate sprechen für die weitere Erforschung embryonaler Stammzellen. 123, 172 Andererseits besteht auch bei diesen Zellen die Frage nach der Quelle des embryonalen Gewebes. Der Einsatz und die Erforschung von embryonalen Stammzellen sind ethisch problematisch. Schon wegen der ethischen und rechtlichen Lage erscheint die Verwirklichung dieser Therapieoption unwahrscheinlich. Zudem bestehen die Gefahren einer möglichen Teratomentwicklung, Arrhythmogenität und die Problematik der immunologischen Abstoßung dieser körperfremden Zellen. Außerdem entwickeln sich bisher nur 1% der embryonalen Stammzellen zu Kardiomyozyten. 70, 91 Insgesamt stellt also die allogene Transplantation von embryonalen oder neonatalen Kardiomyozyten beim Menschen bislang keine Option dar. 46, 63 Eine noch weniger erforschte Quelle für die Regeneration von Herzmuskelzellen ist die gezielte Kultur von Spermatogonien. Durch spezielle Methoden ließen sich daraus multipotente kardiale Progenitorzellen gewinnen. Deren Eigenschaften, aber auch Probleme sind mit denen der embryonalen Stammzellen vergleichbar. Ethische oder gesetzliche Einschränkungen liegen dabei aber in weitaus geringerem Maße vor. 70 Ein weiterer Ansatz ist die Verwendung induzierter pluripotenter Stammzellen (ips), welche durch Reprogrammierung von adulten somatischen Zellen erhalten werden können. Dabei werden beispielsweise Fibroblasten durch das Einschleusen bestimmter Gene in einen pluripotenten Zustand zurückversetzt. Die ips scheinen die Vorteile der autologen Anwendung mit positiven Eigenschaften von embryonalen Stammzellen zu vereinen. Andererseits bilden diese Zellen Teratome und ihre Fähigkeiten zur Differenzierung sind noch weitgehend unbekannt. Zudem ist unklar welche

14 7 EINLEITUNG ungünstigen langfristigen Effekte der Einsatz von genetisch veränderten Zellen beim Menschen 63, 136 bewirken kann Myoblasten aus der Skelettmuskulatur Schon im Jahr 1992 wurden beim Hund erstmals myogene Zellen ins Myokard implantiert. 116 Für den Einsatz im infarzierten Herzmuskel konnte relativ problemlos Skelettmuskelgewebe vom Patienten entnommen werden. Im Muskel befinden sich Präkursorzellen des Muskels, welche im ruhenden Zustand als Satellitenzellen bezeichnet werden. Bei Verletzung des Muskels proliferieren sie und differenzieren sich gleichzeitig zu Skelettmuskelzellen. Ab diesem Zeitpunkt werden sie als Myoblasten bezeichnet. Die von Marelli et al. gewonnenen Zellen proliferierten in der Zellkultur schnell und zeigten keine tumoröse Entartung. Außerdem schienen sie ziemlich belastbar bezüglich auftretender Ischämien zu sein. Im Tierversuch und ersten klinischen Studien schien die Injektion dieser Zellen ins Myokard eine erfolgreiche Methode zu sein, erfüllte aber langfristig nicht die Erwartungen einer ausreichend andauernden Verbesserung der Herzfunktion. Außerdem traten häufiger Arrhythmien nach der Zelltransplantation auf. 116, 137, 170, 171 Ursächlich dafür waren vermutlich die fehlende Ausprägung von elektrischen Verknüpfungen und die unterschiedlichen kontraktilen Eigenschaften zwischen ansässigen Kardiomyozyten und Skelettmuskelzellen. Die beobachtete Verbesserung der Herzfunktion wurde teilweise dem Wirken von parakrinen Faktoren zugeschrieben Hämatopoetische Stammzellen Adulte Stammzellen aus dem Knochenmark konnten sich bisher in die unterschiedlichsten Zellen differenzieren. Sie entwickelten sich zu Skelettmuskelzellen, Hepatozyten, Neuronen, Kardiomyozyten und einigen anderen, obwohl sie nicht aus Geweben dieser Zelltypen abstammen. 70, 158 C-kit-positive Knochenmarksstammzellen, die keine Marker der hämatopoetischen Entwicklung zeigten, übernahmen nach Transplantation in die Nähe eines infarzierten Areals in Mäuseherzen Struktur und Funktion von Kardiomyozyten, Endothelzellen und glatten Gefäßmuskelzellen. 147 Sogenannte mesenchymale Stammzellen (MSC, mesenchymal stem cells ) wurden häufig als die Subpopulation der hämatopoetischen Stammzellen ausgemacht, welche zur multipotenten, eigentlich knochenmarksfremden Differenzierung fähig ist. Unter anderem können sich MSC nach einer Behandlung mit 5-70, 172 Azacytidin auch zu Kardiomyozyten entwickeln. Viele 73, 139, 159, 165 Stammzellen werden vermutlich parakrin vermittelt. Effekte der mesenchymalen

15 8 EINLEITUNG Daneben gibt es noch einige weniger bekannte Ansätze zur Gewinnung kardiogener Stammzellen: Endotheliale Progenitorzellen aus Knochenmark, Blut oder Nabelschnurblut trugen zur Angiogenese in infarzierten Mäuseherzen bei und wandelten sich teilweise in Kardiomyozyten um. Side-Population-Zellen (SP-Zellen) aus dem Knochenmark werden nach demselben Prinzip wie die weiter unten beschriebenen kardialen SP-Zellen isoliert, welche über 70, 156 ähnliche Struktur und Funktion verfügen. Es wurden bereits klinische Versuche am Menschen durchgeführt, die eine kurzfristige und nur geringe Verbesserung der kardialen Funktion erreichten, aber langfristig keinen Vorteil erbrachten. Auch im Tiermodell konnten keine dauerhaften Besserungen der Herzfunktion beobachtet werden. Der nachgewiesene kurze Effekt der MSC bei der kardialen Regeneration soll möglicherweise durch einen parakrinen Einfluss auf die Zellen des Herzens erklärbar 73, 139 sein. Insgesamt ist nach den bisherigen Ergebnissen aktuell noch kein ausreichend 119, 137, 170 wirksamer therapeutischen Einsatz am Menschen möglich Autologe kardiale Progenitorzellen Mit der Entdeckung der kardialen, d.h. im Herzen ansässigen Progenitorzellen eröffnete sich eine neue Perspektive für die Zelltherapie am Herzen. 16, 145, 158 Ob diese Zellen tatsächlich im Herzen entstehen, oder aus anderen Organen stammen, konnte bislang noch nicht festgestellt werden. 24 Die bisher gefundenen, isolierten oder gezüchteten Zellen zeigten eine gewisse Multipotenz, wobei in diesem Zusammenhang die Fähigkeit der Progenitorzellen gemeint ist, sich in die verschiedenen im Herzen vorkommenden Zelltypen zu differenzieren. Dazu gehören Kardiomyozyten, Endothelzellen und glatte Gefäßmuskelzellen. 15 Da sich die im Folgenden beschriebenen Zellen im Herzen befanden, wurden sie je nach Autor als kardiale Stammzellen, kardiale Progenitorzellen oder kardiale Präkursorzellen bezeichnet. Der besondere Vorteil der autologen Transplantation liegt in der optimalen Immunkompatibilität Isolation von c-kit-zellen Mit Hilfe eines Antikörpers gegen c-kit konnten Beltrami et al. die ersten sogenannten kardialen Stammzellen aus dem Rattenmyokard isolieren. 15 Bei c-kit handelt es sich um einen membrangebundenen Stammzellfaktorrezeptor. Die isolierten Zellen waren im Gegensatz zu den Kardiomyozyten kleiner, zeigten eine geringere Differenzierung und waren nur in geringfügiger Anzahl im Myokard vorhanden. Sie besaßen keine Marker ausdifferenzierter Herzmuskelzellen, glatter Gefäßmuskelzellen oder Endothelzellen. Darüber hinaus war eine direkte Herkunft aus einer hämatopoetischen Zelllinie durch das Fehlen der entsprechenden Oberflächenantigene (CD34, CD45, CD20, CD45RO, CD8, lin-neg.) ausgeschlossen. Stattdessen wiesen diese speziellen Zellen für Stammzellen charakteristische Marker wie c-kit,

16 9 EINLEITUNG Mdr-1, sca-1 und Transkriptionsfaktoren, welche in der frühen Entwicklung der kardialen 12, 15 Muskelzellen exprimiert werden (nkx2.5, GATA4, MEF2), auf. Die Isolierung aus Herzmuskelgewebe erfolgte dabei über die Markierung der Stammzellen mit Anti-c-kit-Antikörpern, wodurch diese Zellen schließlich mittels MACS oder FACS selektioniert werden konnten. Die gewonnenen c-kit-positiven Zellen wurden daraufhin kultiviert und analysiert. 15, 39 Die intravaskuläre Injektion dieser Progenitorzellen verbesserte die 44, 108 Herzfunktion von infarzierten Rattenherzen. Etwa 60% dieser kardialen Stammzellen verfügte gleichzeitig über die drei Marker c-kit, sca-1 und MDR-1. Die Anzahl dieser Vorläuferzellen war im menschlichen Herzmuskel nach einem akuten Myokardinfarkt erhöht. Vor allem die Grenzzonen in der Nähe des infarzierten Gewebes enthielten deutlich mehr dieser Stammzellen. 190 Die anhaltend stark erhöhte Belastung des menschlichen Herzmuskels führte nicht nur zur Hypertrophie, sondern auch zur Zellteilung bzw. Proliferation von Progenitorzellen. 189 Die Zellfusion von Stammzellen mit ausdifferenzierten Zellen wird als 15, 44, 189, 190 Ursache für die nachgewiesenen Phänomene weitgehend ausgeschlossen Isolation von sca-1-zellen Das membrangebundene Protein sca-1 wurde als weiterer Marker zur Identifikation und Selektion einer anderen Population von kardialen Progenitorzellen im adulten Herzmuskel verwendet. Die aus Mäuseherzen isolierten Zellen exprimierten keine kardialen Marker, kein nkx2.5, CD34 oder CD45. Sie unterschieden sich von hämatopoetischen Zellen, von Endothelzellen und von Muskelzellen. Nur die frühen kardialen Transkriptionsfaktoren GATA4 12, 121, 145 und MEF2 konnten nachgewiesen werden. Teilweise zeigten sie Eigenschaften von Side-Population-Zellen. 146 Erst nach der Stimulation mit 5-Azacytidin 145 oder Oxytocin 121 waren die meisten isolierten sca-1-positiven Zellen zur kardiomyogenen Differenzierung fähig. Nach Injektion in infarzierte Mäuseherzen migrierten einige in die Ischämiezone und exprimierten unter anderem kardiales Troponin I und 121, 145 Connexin43. Sca-1-positive und CD31-negative Zellen führten dort zu Angiogenese, Regeneration von Kardiomyozyten und Verbesserung der Herzfunktion. 196 Unter anderem soll das gelöste Zelladhäsionsmolekül svcam-1 diese Effekte bei kardialen Progenitorzellen (CPC) vermitteln. 120 In vivo konnte im adulten menschlichen Myokard 190 und in Rattenherzen 15 eine kleine Zellpopulation gefunden werden, welche c-kit, sca-1 und MDR-1 exprimierte. Diese oben beschriebenen, sogenannten kardialen Stammzellen waren in etwa 60% der Fälle gleichzeitig für c-kit, MDR, und sca-1 positiv Isolation von SP-Zellen Als Side Population (SP) wurden die Zellgruppen bezeichnet, die sich durch die exklusive Fähigkeit auszeichneten, den Farbstoff Hoechst33342 mit Efflux-Pumpen wie ABCG2 aus dem

17 10 EINLEITUNG Zytosol herauszutransportieren. 118, 166 Sie wurden in verschiedensten Organen (Knochenmark, Skelettmuskel, Leber u.a.) gefunden und gelten als Kandidaten für adulte Stammzellen. 203 Die aus dem Myokard isolierten Zellen wiesen verschiedene Eigenschaften von Stammzellen auf und waren in einer Kokultur mit Herzmuskelzellen zur kardiomyogenen und endothelialen Differenzierung fähig. 75 Sie exprimierten frühe kardiale Transkriptionsfaktoren und Endothelzellmarker stärker als die SP-Zellen des Knochenmarks. 200 Auch durch die Stimulation mit Oxytocin oder Trichostatin konnten die SP-Zellen zur Differenzierung in selbstständig kontrahierende Kardiomyozyten gebracht werden. Diese exprimierten dann auch nkx2.5, GATA4, MEF2, kardiales Troponin T und einige Myosinleichtketten. 148 Das größte Potential zur kardiomyogenen Differenzierung in der Gruppe der SP-Zellen besitzen die sca-1-positiven und CD31-negativen Zellen Die hierfür zugrunde liegenden Experimente wurden an Mäusen und Ratten durchgeführt, die gewonnenen Zellen waren multipotent und zeigten kardiomyogene Differenzierung durch Cokultur oder Stimulation. Die Herkunft der SP-Zellen bleibt aber weiterhin unklar. 70 MDR ist 55, 166 vermutlich nicht am Hoechst-Efflux der SP-Zellen beteiligt Isolation von isl-1-zellen Isl-1 ist ein Homöodomänen-Transkriptionsfaktor aus der LIM-Gruppe. Es handelt sich um einen embryonalen Marker, der besonders undifferenzierte Zellen kennzeichnet. Die isl1- positiven Zellen im neonatalen Herzen unterscheiden sich grundlegend von den bisher beschriebenen Zellpopulationen. Sie exprimieren kein c-kit oder sca-1 und gehören auch nicht zu den SP-Zellen. Stattdessen zeigen sie sich positiv für nkx2.5 und GATA4. Isl1 ist ein Marker für kardiale Progenitorzellen aus dem sekundären Herzfeld, aus dem der rechte Vorhof und der Ausflusstrakt des Herzens hervorgehen. Aus diesen Zellen können sich Kardiomyozyten, aber auch glatte Muskelzellen, Endothelzellen, Schrittmacherzellen und andere nichtmuskuläre Zellen des Herzens entwickeln. Bisher wurden isl1-positive Zellen nur im fötalen oder neonatalen Myokard nachgewiesen. Ob sie zur Reparatur eines beschädigten Herzmuskels fähig sind, oder sie die Herzfunktion in irgendeiner Art verbessern können, konnte 23, 65, 104, 133 bislang nicht festgestellt werden Isolation von Zellen mit der Kardiosphären-Methode Im Gegensatz zu den oben genannten maschinellen Isolationsmethoden, welche auf der Selektion von Zellen mit bestimmten Oberflächenmarkern beruhten, konnten nach der von Messina et al. entwickelten Methode erstmals humane kardiale Vorläuferzellen durch eine spezielle Kulturtechnik isoliert und vermehrt werden. 124 Dieses Verfahren wurde auch im Rahmen dieser Arbeit angewandt und wird später genauer beschrieben. Die bei dieser Kulturmethode entstandenen Zellhaufen wurden als Kardiosphären bezeichnet. Sie zeigten

18 11 EINLEITUNG durch ihr Wachstum und ihre Oberflächenmarker Ähnlichkeit mit Stammzellen und bewiesen bei Versuchen im Infarktmodell bei Mäusen ihr regeneratives Potential. Die Kardiosphären waren positiv für Stammzellmarker (c-kit, sca-1, CD34), für endotheliale Marker (KDR/flk-1, CD31, vwf) und für Marker kardialer Myozyten (ctni, MHC). Menschliche Kardiosphären konnten hierbei nur durch die Cokultur mit neonatalen Rattenkardiomyozyten zur spontanen Kontraktion gebracht werden. 124 Von Smith et al. wurden aus den CS in einem weiteren Schritt zu Cardiosphere Derived Cells (CDC), d.h. von Kardiosphären abgeleiteten Zellen gewonnen. 169 Außerdem beschrieb diese Arbeitsgruppe die heterogene Zellpopulation der CS und CDC detaillierter. Die Zellen stellten sich positiv für CD105, teilweise für c-kit, CD90, Cx43 und nur wenig für CD34 und CD31 dar. Sie waren negativ sowohl für CD45, MDR1, CD133 als auch für weitere Marker von Knochenmarksstammzellen und deren Abkömmlingen. Somit handelte es sich vermutlich um Vorläuferzellen (CD105, CD90) bzw. Stammzellen (c-kit) mit dem typisch kardialen Connexin43, aber ohne den Endothelzellmarker CD Durch die neu entwickelten Zellkulturmethoden konnte aus einer sehr kleinen Myokardprobe eine große Anzahl von heterogenen, proliferierenden und sich selbstständig differenzierenden Zellen gewonnen werden. 169 Durch die Injektion von humanen CS und CDC in infarzierte Herzen von immundefizienten 124, 169 Mäusen konnte eine Verbesserung der Herzfunktion erreicht werden. Nach derselben Methode wurden CDC aus endomyokardialen Biopsien des Schweines gewonnen und in infarzierte Schweineherzen iniziiert. 62, 84 Durch die Zelltransplantation in die Grenzzone des Infarkts verbesserte sich die Auswurfleistung des Herzens jeweils in signifikant stärkerem Maß als ohne diese Behandlung. 105 In Kokultur mit neonatalen Rattenkardiomyozyten bildeten die humanen CDC herzmuskeltypische Kalium- und Kalziumkanäle aus. 169 Humane CS zeigten spontane Kontraktionen nur bei Kokultur mit Kardiomyozyten von Ratten. 124 Verbesserung der Auswurfleistung konnte auch durch Synchronisation der Herzaktion nach einer CDC-Implantation an Ratten nachgewiesen werden. 20 Weiterführende Untersuchungen zu den CDC zur gezielten Steuerung der Differenzierung mittels oszillierender elektromagnetischer Felder konnten nachweisen, dass dadurch bevorzugt 60, 114 die kardiomyozytäre Entwicklung stattfand. Beim experimentellen Einsatz am infarzierten Myokard konnte festgestellt werden, dass die Injektion von Cardiosphere Derived Cells in das infarzierte Myokard mit verschiedenen Problemen behaftet ist. So wird beispielsweise ein Teil der Zellen durch den Blutstrom aus dem Herz herausgespült. 21 Um die Retention von CDC in der Ischämiezone zu erhöhen, wurden diese Zellen mit magnetischen Mikropartikeln beschichtet und durch Magnetfelder am Herzen festgehalten. Dadurch konnte das regenerative Potential der CDC noch besser ausgenutzt werden. 32 Eine

19 12 EINLEITUNG 1.5 Zielsetzung Ziel dieser Arbeit war die Überprüfung der von Messina et al. und Smith et al. vorgestellten Kulturmethode und deren Ergebnisse. Dafür sollten das Wachstum und die Morphologie der Zellen und Zellkonglomerate bereits während der Kulturphasen regelmäßig lichtmikroskopisch begutachtet werden. Für die Untersuchung der aus der Zellkultur hervorgebrachten Kardiosphären und der davon abgeleiteten CDC standen immunzytochemische, durchflusszytometrische und elektronenmikroskopische Methoden zur Verfügung. Die Immunzytochemie war als häufig erprobte Methode ein geeignetes Instrument bei der Suche nach gewebs- und zelltypischen Proteinen. Hierbei war vor allem von Interesse, ob sich typische Stammzellmarker bei CS und CDC nachweisen lassen, ob sie Anzeichen einer Differenzierung zu Kardiomyozyten aufweisen und ob sie anhand der Expression ihrer Oberflächenmarker von Fibroblasten, Zellen des Knochenmarks und Endothelzellen abgegrenzt werden können. Damit sollte einerseits überprüft werden, ob die bisher publizierten Ergebnisse reproduziert werden können. Durch die Suche nach weiteren Antigenen wurde andererseits angestrebt, ein detaillierteres Bild dieser neuartigen Zellen zu erhalten. Mit durchflusszytometrischen Untersuchungen sollte die Sekretion gewisser Chemokine im Verlauf der Zellkultur überprüft werden. Durch die Verwendung des Elektronenmikroskops wurde die Ultrastruktur der Kardiosphären untersucht. Insgesamt sollten also diese spezielle Kulturmethode evaluiert werden und die dabei entstehenden Zellpopulationen exakter auf ihre Eigenschaften charakterisiert werden.

20 13 MATERIALIEN UND METHODEN 2 MATERIALIEN UND METHODEN 2.1 Materialien siehe Anhang, Kapitel Methoden Die Zellkultur Für die beschriebenen Experimente wurden Zellkulturen aus Herzmuskelgewebe (Explantatkulturen, Kardiosphärenkulturen und Kulturen von Cardiosphere Derived Cells), aus Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) und aus der Zelllinie THP-1 verwendet. Die Arbeiten an den Zellkulturen wurden unter keimfreien Bedingungen an einer sterilen Arbeitsbank durchgeführt. Alle Medien und Enzymlösungen wurden vor ihrer Verwendung an den Zellen auf 37 C im Wasserbad erwärmt. Alle Zellmedien wurden einige Tage vor der Verwendung gemischt und auf 50mL aliquotiert. Von jedem erstellten Medium und den Aliquots wurden Sterilkontrollen angefertigt und vor Verwendung des Mediums begutachtet. Wie im Folgenden beschrieben, wurden die Zellkulturen mit Explantaten, CS und CDC nach leicht abgewandelten Protokollen von Messina et al. 124 und Smith et al. 169 angefertigt Die Zellkultur aus Herzmuskelgewebe Ausgehend von Herzmuskelgewebeproben, welche hier als Explantate bezeichnet werden, bildeten fibroblastenartige Zellen auf dem Boden der Zellkulturschalen einen Zellrasen. Auf diesem zeigten sich daraufhin kleinere rundliche Zellen, welche möglichst selektiv abgetragen und in eigene Kulturgefäße verbracht wurden. Dort entwickelten sich kugelförmige schwimmende Zellhaufen, welche als Kardiosphären bezeichnet wurden. Diese konnten durch Aufnahme des Überstandes wiederum abgetrennt und in einer weiteren Kulturflasche ausgesät werden. Die Kardiosphären hafteten hier am Boden an, wuchsen aus und bildeten wiederum einen Zellrasen. Diese Zellen wurden als Cardiosphere Derived Cells (CDC) bezeichnet. Die Zellkultur der aus Herzmuskelgewebe gezüchteten Zellen erfolgte im Inkubator bei einer Temperatur von 37 C, 5,0% CO2 und 100% Luftfeuchtigkeit.

21 14 MATERIALIEN UND METHODEN Abb. 2-1: Schematische Darstellung der Verarbeitung von Explantaten und der Entwicklung von Kardiosphären und von Kardiosphären abgeleiteten Zellen (CDC) (modifiziert nach Smith et al. 169 ) Anlage der Zellkulturen mit Explantaten Die Explantate zur Anlage der Primärkulturen wurden aus Gewebeproben genommen, die bei Herz-Operationen entnommen wurden. Sie stammten aus dem rechten Vorhofsohr. Smith et al. hatten es aus dem Septum des Herzens entnommen, Messina et al. aus Vorhof und Kammer des Herzens. 124, 169 Es wurde in isotonischer Lösung bei 4ºC gelagert und zeitnah verarbeitet. Die Gewebsstücke/Explantate wurden unter sterilen Bedingungen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült. Auf einer 100mm-Zellkulturschale wurden Perikardanteile, Fettgewebe und möglichst das gesamte Endokard mechanisch entfernt. Das freipräparierte Muskelgewebe wurde von den anderen Anteilen getrennt und auf eine weitere 100mm- Zellkulturschale in 2mL PBS verbracht. Dort wurde das Muskelgewebe nach dem Abpipettieren des PBS mit 1mL 0,05% Trypsin für 5 Minuten behandelt. Während der Enzymeinwirkung wurden die Gewebestücke mit einer Schere auf weniger als 0,5mm Durchmesser zerkleinert. Danach wurden 2mL Complete Explant Medium (CEM) (siehe Anhang, Kapitel ) zugegeben. Damit wurde die proteolytische Wirkung des Trypsins durch die im FCS des Nährmediums enthaltenen Antiproteasen gestoppt. Die erhaltenen kleinen Stückchen wurden mit sterilen Kanülen auf mit Fibronektin beschichteten 60mm-Zellkulturschalen (siehe Anhang, Kapitel ) übertragen. Zur Beschichtung wurden pro Schale 125µL der Fibronektinlösung in 2,5 ml PBS aufgelöst. Nach mindestens 20 min Inkubation bei 37 C wurde der Überstand verworfen und die Schale mit 1-2mL PBS gespült, womit sie bereit für die Kulturanlage war. Die nur leicht am Schalenboden angedrückten Explantate wurden nach einer kurzen Anhaftzeit von circa zehn Minuten mit jeweils 2mL CEM pro Kulturschale versorgt. Bei Fütterung und Transport musste sehr vorsichtig vorgegangen werden, um ein Abschwimmen der nur schwach haftenden Gewebsstückchen zu vermeiden. Im Inkubator herrschten für alle Kulturen dieselben Verhältnisse: 37 Grad Celsius, 100% Luftfeuchte, 5% CO2. Es wurden bei jeder Kulturanlage zwischen 4 und 12 Kulturschalen mit jeweils 12 bis 18 Gewebsstückchen angefertigt. Bei den angelegten Kulturen wurde alle 3-4 Tage das Medium gewechselt, wobei 2mL abpipettiert und 2mL CEM wieder vorsichtig zugegeben wurden. Ein kleiner Rest Medium konnte in der Schale

22 15 MATERIALIEN UND METHODEN verbleiben. Das Wachstum der Zellkulturen wurde unter dem Mikroskop (Olympus CK40) kontrolliert Anlage der Zellkulturen mit Kardiosphären Etwa zwei bis drei Wochen nach der Anlage der Explantat-Kulturen war ein Rasen aus bindegewebsartigen Zellen um die Gewebsstückchen herum ausgewachsen, auf dem sich kleine runde Zellen befanden. Der Zellrasen diente dabei als Nährboden und Zellmatrix für die einzelnen, kleineren Zellen. Diese im Phasenkontrastmikroskop helleren Zellen wurden von Messina et al. als kardiosphärenbildende Zellen bezeichnet. Beim nächsten Kulturschritt, die Anlage von Zellkulturen mit Kardiosphären, sollten sie möglichst selektiv vom Zellrasen abgelöst werden. 124 Zur CS-Kulturanlage wurde von den Explantat-Kulturen zuerst das Medium abpipettiert und davon pro Kulturschale 1mL gesammelt. Daraufhin wurden diese Kulturen mit jeweils 2mL PBS gespült und das Aspirat ebenfalls in diese Sammlung gegeben. 1mL erwärmtes Versene wurde zugegeben, nach einer Minute Einwirkzeit abpipettiert und wiederum gesammelt. Dann wurde 1mL erwärmtes 0,05% Trypsin auf die Kulturen gegeben, nach 70 bis 90 Sekunden wieder entfernt und diese Zellsuspension mit der Sammlung vereinigt. Das dort gesammelte Medium inaktivierte die Wirkung des Trypsins. Bei der Aspiration der vom Trypsin abgelösten Zellen musste darauf geachtet werden, nicht den gesamten Zellrasen mitzuentfernen. Den Explantat-Kulturen wurde sofort wieder 2mL CEM zugegeben. Die gesammelte Zellsuspension wurde bei 180g für 10 Minuten zentrifugiert, der Überstand verworfen und das entstandene Pellet mit 3mL Cardiosphere Growing Medium (CGM) (siehe Anhang, Kapitel ) resuspendiert. Die Zellkonzentration wurde in einer Neubauerzählkammer nach Zugabe von 50µL Trypanblau zu 50µL Zellsuspension bestimmt. Die angestrebte Zellzahl betrug bis Zellen pro ml. Bei einer zu hohen Zellzahl wurde weiter mit Medium verdünnt. Meist wurden 3mL dieser Zellsuspension in eine mit Poly- D-Lysin (PDL) beschichtete 25cm²-Flasche gegeben (siehe Anhang, Kapitel ). PDL sollte durch seine anionischen Eigenschaften die Adhäsion der Kardiosphären verhindern. 13 Die Zellen der Kardiosphären konnten im Gegensatz zu Fibroblasten auch ohne Anhaftung am Zellkulturboden überleben und wachsen. Dadurch konnte ein weiteres Unterscheidungsmerkmal zur Selektion verwendet werden. Zu diesen Kulturen wurden alle 3-4 Tage 3mL CGM zugegeben. Das alte Medium verblieb dabei in der Flasche, da es in dieser Phase der Züchtung von Bedeutung war, die im Medium schwimmenden Kardiosphären zu erhalten. Auch die von den CS ins Nährmedium sezernierten Zytokine wurden somit in der Kultur belassen. Falls keine Verwertung des Überstandes möglich war, wurde nach ca. 2 Wochen ein Füllstand von 12mL Medium in der Flasche erreicht. Um das überflüssige Medium von den Zellen abzutrennen, wurde bei 180g für 10min zentrifugiert, das Zellpellet in 3mL CGM resuspendiert und wieder in die Flasche zurückgeführt.

23 16 MATERIALIEN UND METHODEN Anlage der Zellkulturen mit Cardiosphere Derived Cells (CDC) Abhängig von großen interindividuellen Unterschieden im Wachstumsverhalten der Kardiosphären war die Ernte der CS zu den unterschiedlichsten Zeitpunkten möglich. Dabei war es wichtig, diese Zellhaufen von Zellschrott zu unterscheiden und den richtigen Zeitpunkt der Ernte der Kardiosphären abzupassen. Zu einem frühen Zeitpunkt war es schwieriger diese Kardiosphären zu identifizieren und die Zellzahl zu gering, um ausreichendes Wachstum in der nächsten Kultur sicherzustellen. Zu späteren Zeitpunkten begannen diese Zellhaufen, sich auf den mitabgelösten und jetzt am Boden auswachsenden fibroblastenartigen Zellen anzuheften. Dadurch entzogen sie sich ebenfalls einer weiteren Verarbeitung. Die Entwicklung und Anhaftung der Kardiosphären am Zellkulturboden geschah in einigen Fällen innerhalb nur eines Tages. Bei ausreichender Größe, typischer Form und genügend hoher Anzahl der Kardiosphären wurden diese weiterverarbeitet zu den von Kardiosphären abgeleiteten Zellen (Cardiosphere Derived Cells, CDC). 169 Dafür wurde das Nährmedium mit den in Suspension befindlichen Kardiosphären abpipettiert, ohne dabei die angewachsenen Zellen vom Boden der Zellkultur abzulösen. Somit wurden nur Zellen weiterverwendet, die sich in den Kardiosphären befanden. Durch die Kulturmethode konnten Zellen, die am Kulturboden adhärierten oder ohne Adhäsion abstarben (v.a. Fibroblasten) aussortiert werden. Die gewonnene Zellsuspension wurde bei 180g für 10 Minuten zentrifugiert und das erhaltene Pellet in 3-4mL CGM resuspendiert. Damit erfolgte die Kulturanlage in mit Fibronektin beschichteten Zellkulturflaschen (meist 25cm²). (zur Beschichtung siehe Anhang Kapitel ) Die CDC wurden pro Flasche alle 3-4 Tage mit 4mL CGM versorgt, wobei bei der ersten Fütterung wegen möglicher noch nicht adhärenter Zellen kein Medium abpipettiert wurde. Später wurden jeweils 4mL altes Medium auf der Zellkultur belassen und 4mL neues CGM zugegeben. Nach 1-5 Wochen waren ausreichend viele Zellen auf dem Zellkulturboden erkennbar und es erfolgte die erste Passage von einer 25cm²-Flasche auf ein bis zwei 75cm²-Flaschen. Dazu wurde das Medium aus der Flasche verworfen und mit 4mL PBS gespült. Danach wurden 3mL der auf 37 C vorgewärmten Accutase zugegeben. Nach 15 Minuten im Inkubator konnte unter dem Mikroskop meist eine fast vollständige Ablösung der Zellen vom Zellkulturboden festgestellt werden. Daraufhin wurde dieses Enzymgemisch mit etwa 4mL CGM inaktiviert, abpipettiert und gesammelt. Zusätzlich wurde mit mindestens 4mL PBS kräftig nachgespült, bis unter dem Mikroskop keine anhaftenden Zellen mehr erkennbar waren. Die gesammelten abpipettierten Zellen wurden bei 180g für 10 Minuten zentrifugiert und das Pellet nach Verwerfen des Überstandes mit 15mL (bzw. bei 2 Flaschen in 30mL) CGM resuspendiert. In jede 75cm²-Zellkulturflasche, welche vorher nach der gleichen Methode wie oben beschrieben

24 17 MATERIALIEN UND METHODEN mit Fibronektin beschichtet worden war (250µL Fibronektin-Lösung in 10mL PBS pro 75cm²- Flasche) wurden 15mL dieser Zellsuspension pipettiert. Alle 3-4 Tage wurden diese Zellkulturen in den großen 75cm²-Flaschen mit 15mL CGM versorgt. Beim ersten Mal nach der Anlage, abhängig von der Zahl der noch nicht adhärenten Zellen, möglicherweise noch ohne Medium abzupipettieren. Sonst wurden jeweils 8mL altes Medium belassen und 15mL neues CGM zugegeben. Bei allen CDC-Kulturen wurde versucht, die zweite Passage zu erreichen. Dabei wurden die Zellen aus einer 75cm²-Flasche auf zwei bis drei dieser Flaschen aufgeteilt. Die hieraus wachsenden Zellen wurden für durchflusszytometrische Analysen verwandt. Für die Immunfluoreszenzfärbung wurden die Zellen der ersten Passage auf Kammerobjektträger verbracht und befanden sich dort dann ebenfalls in der zweiten Passage. Einige CDC-Kulturen wurden eingefroren. Dazu wurden die Zellen mit Accutase vom Boden der Zellkulturflasche abgelöst, die Zellsuspension zentrifugiert (180g*10min) und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde mit 250µL fetalem Kälberserum (FCS) resuspendiert und in ein im Eis stehendes Kryoröhrchen überführt. Daraufhin wurde sehr langsam und unter ständigem Rühren 250µL FCS mit 20% DMSO zur Zellsuspension zugegeben. Danach wurde das verschraubte Kryoröhrchen sofort auf -80 C gekühlt. Das FCS und das FCS/DMSO- Gemisch waren bereits vorgekühlt. DMSO schützt die Zellen vor der Zerstörung beim Einfrieren, wirkt über dem Gefrierpunkt aber toxisch. Zum Auftauen wurde das Kryoröhrchen in der Hand erwärmt, bis sich die eingefrorene Kultur von der Wand ablöste. Dann wurde der Inhalt des Gefäßes sofort in 37 C warmes CGM geleert. Nach Zentrifugation und Verwerfen des Überstandes wurde das Zellpellet wieder in CGM resuspendiert und daraufhin in eine mit Fibronektin beschichtete Zellkulturflasche überführt HUVEC-Zellkulturen HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) wurden mit einer nach Jaffe et al. 82 entwickelten Präparationsmethode aus Nabelschnurvenen gewonnen. Menschliche Nabelschnüre wurden mit PBS gespült, um Blut und anderen Verunreinigungen zu entfernen. Die Vene wurde mit Dispase-lösung aufgefüllt, und 15 min bei 37 C inkubiert. Danach wurde das Enzym mit den abgelösten Endothelzellen aus der Nabelschnurvene herausgespült. Diese Zellsuspension wurde zentrifugiert (200g für 5 min), das Zellpellet in E- CGM (Endothelial Cell Growth Medium) resuspendiert und so in 75cm²-Zellkulturflaschen verbracht. Die Zellkultur erfolgte im Inkubator bei 37 C, 7,5% CO2 und 100% Luftfeuchte. Das Medium wurde jeden zweiten Tag ausgetauscht. Die HUVEC wurden nach demselben Verfahren wie die CDC passagiert. Die zweite Passage dieser HUVEC-Kulturen wurde für die Immunfluoreszenzfärbung verwendet.

25 18 MATERIALIEN UND METHODEN THP-1-Zellkulturen Die eingefrorenen THP-1-Kulturen konnten über die American Type Cell Culture bezogen werden. THP-1-Zellen ( Human acute monocytic leukemia cell line ) sind eine von menschlichen, akut monozytämischen Leukämiezellen abgeleitete Zelllinie. Sie ähnelt in ihren Eigenschaften den von humanen Monozyten abgeleiteten Makrophagen. Die Zellen zeichnen sich durch eine sehr schnelle Zellteilung aus, sodass sie etwa alle 5 Tage passagiert werden konnten. Sie sind nicht adhäsiv und bleiben in Suspension. Die Zellkultur erfolgte im Inkubator bei 37 C, 5,0% CO2 und 100% Luftfeuchte. Alle zwei bis drei Tage wurden 2mL Nährmedium für THP-1 Zellen zugegeben (siehe Anhang, Kapitel ) Lichtmikroskopie Zur Begutachtung und Dokumentation der Vorgänge in den Zellkulturen wurde eine lichtmikroskopische Kontrolle vor jeder Zugabe von Medium durchgeführt. Abhängig von erkennbarer Entwicklung und erreichtem Wachstumsfortschritt wurde der Zeitpunkt für die nächsten Schritte in der Zellkultur festgelegt. Für routinemäßige Kontrollen wurde das inverse Mikroskop Olympus CK40 benutzt. Digitale Aufnahmen wurden mit der Digitalkamera Nikon DXM1200 am Mikroskop Olympus IX70 angefertigt Immunzytochemie Bei der Immunzytochemie werden Proteine durch an sie spezifisch bindende Antikörper detektiert. Diese Bindung des Primärantikörpers an sein Zielprotein wird mit Hilfe eines zweiten Antikörpers sichtbar gemacht. Dieser Sekundärantikörper bindet sich nur an Primärantikörper, welche einer bestimmten Spezies angehören. Er ist mit einem Fluorochrom gekoppelt, welches bei Anregung durch einen Laserstrahl einer bestimmten Wellenlänge mit der Emission von Lichtsignal einer leicht längeren Wellenlänge antwortet. Dieses Lichtsignal kann im Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden. Im konfokalen Fluoreszenzmikroskop wird immer nur ein bestimmter Punkt im Bild analysiert, wodurch eine exakte Rekonstruktion der Anordnung von fluoreszierenden Elementen in einer Schnittebene möglich wird Übertragung der Kardiosphären auf Objektträger Zur Immunfluoreszenzanalyse wurden die Zellen auf Kammerobjektträgern angezüchtet. Sobald sich ausreichend viele Kardiosphären im Nährmedium befanden, wurde diese Zellsuspension entnommen. Der Überstand wurde nach Zentrifugation (180g*10 min) verworfen. Das Zellpellet wurde in ca. 1mL CGM resuspendiert und auf unbeschichtete Kammerobjektträger gegeben. Innerhalb von 24 Stunden im Inkubator hafteten die Kardiosphären auf der Oberfläche an, wuchsen aber nur in sehr geringem Maße von diesen Zellkugeln aus. Dadurch blieb die

26 19 MATERIALIEN UND METHODEN Struktur der Kardiosphären (CS) erhalten. Nach 24 Stunden Kultur wurde der Überstand entfernt, die Zellen fixiert und mit der Färbeprozedur begonnen (siehe Kapitel ) Zwei weitere Methoden zur Befestigung der CS auf Objektträgern wurden überprüft und schließlich nicht weiter angewandt: Zum einen wurde das Zellpellet mit den Kardiosphären vor dem Färben nur kurz auf dem Objektträger angetrocknet. Zum anderen wurden die CS in Reaktionsgefäßen gefärbt und erst nachträglich auf die Objektträger aufgetragen. Mit diesen beiden Methoden konnte keine ausreichende Fixation der CS erreicht werden Übertragung der CDC auf Objektträger Auch die Cardiosphere Derived Cells wurden auf den Kammerobjektträgern angezüchtet. Bei genügend großer Zellzahl in einer CDC-Kultur nach der ersten Passage wurde der Überstand verworfen, mit PBS gespült und die Zellen mit Accutase abgelöst. Nach der Inaktivation des Enzyms mit CGM und Zentrifugation der Zellsuspension (180g*10min) wurde der Überstand wiederum verworfen. Das Zellpellet wurde in etwa 2mL CGM pro Kammerobjektträger resuspendiert und auf den mit Fibronektin beschichteten Objektträger überführt. Dies entsprach gleichzeitig der zweiten Passage der CDC-Kultur. Nach etwa fünf Tagen bildeten die Zellen meist einen konfluierenden Zellrasen, welcher nach Verwerfen des Überstandes gefärbt werden konnte Immunzytochemische Färbung Die Zellen wurden in den Kammern der Kammerobjektträger gefärbt. Hierbei musste vorsichtig vorgegangen werden, um die schwach anhaftenden Zellkugeln nicht wegzuspülen. Die Zellen durften zu keinem Moment völlig trocken liegen. Mit den Antikörperlösungen wurde nur in abgedunkelter Umgebung gearbeitet. Das Prinzip der immunzytochemischen Färbung beruht auf der Bindung von Antikörpern auf definierten, spezifischen Zellbestandteilen und Proteinen mit Antigencharakter. Die Antigen- Antikörper-Reaktion wird durch weitere Methoden sichtbar gemacht. Abb.2-2: Darstellung der Antigen-Antikörper-Reaktion, sichtbar gemacht durch einen fluoreszierenden Sekundärantikörper 198

27 20 MATERIALIEN UND METHODEN Zuerst wurden die gewonnenen Zellen fixiert, um eine nachträgliche Veränderung der Morphologie und Oberflächenmerkmale der Zellen zu verhindern. Alle weiteren Schritte zielten darauf ab, unspezifische Bindungsstellen zu blockieren und nur spezifische Bindungen von Primärantikörpern auf den gesuchten Epitopen zuzulassen. Die gebundenen Antikörper wurden mit Hilfe von fluoreszierenden Sekundärantikörpern im Laserscanningmikroskop sichtbar gemacht. Zur Fixierung wurde 4% PFA, Methanol (-10 C) und Ethanol getestet. Für die endgültigen Ergebnisse wurde mit unverdünntem Ethanol bei 4 C für 20min (bis maximal 3 Tage) fixiert. Darauf folgte eine absteigende Ethanolreihe nochmals 2min mit absolutem Ethanol, 2 mal 2 min mit 96%, 2 mal 2 min mit 85%, 2 mal 2 min mit 70% Ethanol. Es folgte eine Spülung mit PBS für 2 min. Danach wurden 200µL Verdünnungslösung pro Kammerobjektträger aufgebracht und diese für eine Stunde bei Raumtemperatur oder für 24 Stunden bei 4 C in einer feuchten Dunkelkammer inkubiert. Die Verdünnungslösung enthielt Tris-gepufferte Saline (TBS), 0,2% Bovines Serumalbumin (BSA), 0,2% Triton X, 5% Esel-Normalserum und die Primärantikörper in ihrer jeweiligen Konzentration (siehe Kapitel 5.1.2, Tab.5-2). Das Esel-Normalserum sollte die unspezifischen Bindungsstellen für die Esel-Sekundärantikörper blockieren. Durch BSA sollten weitere unspezifische Bindungen blockiert werden. Triton X wurde zur Permeabilisierung der Zellen eingesetzt, um intrazelluläre Proteine für die Antikörper zugänglich zu machen. Nach der Inkubation wurden die Kulturen dreimal mit TBS gespült. Daraufhin wurden die Sekundärantikörper ebenfalls in der oben beschriebenen Verdünnungslösung auf die Kulturen gegeben. Es folgte eine Inkubation in einer feuchten Dunkelkammer bei Raumtemperatur für 45 min. Danach wurden die Kulturen wiederum dreimal mit TBS gespült, die Kammern der Kammerobjektträger entfernt und die Objektträger mit Eindeckmedium und Deckgläschen eingedeckt. Die fertigen Objektträger wurden lichtgeschützt bei 4 C aufbewahrt. Für jede einzelne Kultur wurde bei der Färbeprozedur gleichzeitig eine eigene Negativkontrolle mit angefertigt. Anstatt des Primärantikörpers wurde hierbei das jeweilige Normalserum (von Maus, Ziege oder Kaninchen) in vergleichbarer Proteinkonzentration mit der Verdünnungslösung zugegeben. Alle anderen Schritte blieben dabei unverändert. Die Bewertung erfolgte am konfokalen Laserscanningmikroskop des Anatomischen Institutes I Kontrollfärbungen an THP-1 Zur Positivkontrolle der Antikörper gegen CD34 und CD45 wurden Zellen der Zelllinie THP-1 verwendet. Für diese human acute monocytic leukemia cell line ist eine Expression dieser Proteine bekannt. Da diese Zellen normalerweise nicht adhärieren, wurden sie vor der Übertragung auf die Objektträger mit Lipopolysaccharid (LPS) in einer Konzentration von 1:10000 für 24 Stunden stimuliert. Danach hafteten sie ausreichend stark auf den Objektträgern,

28 21 MATERIALIEN UND METHODEN um dieselbe Färbeprozedur wie bei CS und CDC durchführen zu können. Parallel dazu wurden auch Normalserumkontrollen mit diesen Zellen angefertigt Kontrollfärbungen an HUVEC Die konstitutionelle Expression von c-kit auf den HUVEC konnte zur Positivkontrolle eines Antikörpers genutzt werden. 97 Die Anzucht dieser Endothelzellen erfolgte wie bei den CDC auf Kammerobjektträgern. Sie befanden sich dort in der zweiten Passage. Nach einem Tag waren die Zellen ausreichend adhärent, um sie mit demselben Verfahren wie oben beschrieben für die immunfluoreszenztechnische Analyse mit dem Antikörper gegen c-kit zu färben Kontrollfärbungen am Explant Um die Funktion des Antikörpers gegen kardiales Troponin T (ctnt) zu kontrollieren, wurden Kryoschnitte von einem wie oben beschriebenen Explantat angefertigt und immunzytochemisch gefärbt. Die Gewebeprobe wurde unfixiert mit flüssigem Stickstoff gefroren, auf 12µm Schichtdicke geschnitten und auf Objektträgern mit 4% PFA fixiert. Nach einer Vorinkubation mit Verdünnungslösung und 5% Eselnormalserum für eine Stunde, erfolgte die Inkubation mit dem Primärantikörper in Verdünnungslösung (TBS, 1% BSA, 0,5% Triton-X-100) bei 4 C über Nacht. Der Sekundärantikörper (Alexa-Fluor-555 donkey anti-mouse) inkubierte in der Verdünnungslösung für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach dem Eindecken mit TBS- Glycerin und Deckgläschen konnte das Ergebnis am konfokalen Fluoreszenzmikroskop begutachtet werden Die Eigenschaften der untersuchten Markerproteine c-kit Das Protein c-kit (CD117) ist eine Rezeptor-Tyrosinkinase, welche als transmembranöser Rezeptor für den Stammzellfaktor funktioniert. C-kit wird von vielen hämatopoetischen Stammund Progenitorzellen, von mesenchymalen Stammzellen und von Mastzellen exprimiert. Es ist ein Proonkogen und Marker für Stammzellen, da es häufig auf Zellen mit stammzellspezifischen Eigenschaften lokalisiert ist. 15, 26, 96 Auch vaskuläre Stammzellen in den Koronargefäßen des Herzens exprimierten diesen Stammzellfaktorrezeptor. 107 C-kit ist auf neonatalen Herzzellen ein Marker für die kardialen Progenitorzellen, welche zur direkten Differenzierung zu Kardiomyozyten befähigt sind MDR (bzw. P-Glykoprotein) Mit MDR (multi drug resistance) wird ein Phänomen beschrieben, welches zum Versagen einer chemotherapeutischen Behandlung bei Neoplasien führt. Die Überexpression eines mdr-gens

29 22 MATERIALIEN UND METHODEN löst die vermehrte Bildung von ATP-abhängigen Transmembrankanälen aus, welche auch als P- Glykoproteine oder MDR-Proteine bezeichnet werden. Diese ABC-Transporter (ATP binding cassette) transportieren verschiedene Chemotherapeutika aus der Zelle, was zur Resistenz gegenüber diesem Agens führt. Dieses P-Glykoprotein tritt nicht nur bei malignen Neoplasien (z.b. Kolonkarzinomen, Leukämien), sondern auch bei verschiedenen Stammzellen auf. 15, 167 MDR zählt zu den üblichen Stammzellfaktoren Marker für Zellen aus dem Knochenmark CD34 ist ein transmembranöses Glykoprotein, welches auf hämatopoetischen Progenitorzellen, auf Gefäßendothelzellen und Fibroblasten nachweisbar ist. Wahrscheinlich spielt es eine Rolle bei der Signaltransduktion und möglicherweise auch bei der Adhäsion von Antigenen am 142, 164 Endothel. CD45 ist ein transmembranöses Glykoprotein, welches auf allen kernhaltigen hämatopoetischen Zellen exprimiert wird. Als Tyrosinphosphatase ist es an der Signaltransduktion der Zelle beteiligt Marker für Kardiomyozyten Bei Connexin43 (Cx43) handelt es sich um das am häufigsten an der Bildung von Gap- Junction-Kanälen beteiligte Connexin im menschlichen Myokard. Es spielt eine wichtige Rolle bei der synchronen Kontraktion des Herzmuskels und bei der embryonalen Entwicklung. Es wird ein Zusammenhang mit der Migration und Differenzierung von Zellen der Neuralleiste vermutet. 140, 157, 168 Außerdem ist Cx43 ein wichtiger Vermittler bei der Kardiomyogenese. 132 Das kardiale Troponin T (ctnt) ist die Tropomyosin-bindende Einheit des Troponin- Komplexes, der abhängig von der intrazellulären Kalziumkonzentration die Kontraktion der Muskelzelle steuert. Gewebespezifische Isoformen wie die kardiale Ausprägung des Proteins entstehen durch alternatives Splicen. Der verwendete Antikörper sollte nach Firmenangaben keine Kreuzreaktionen mit kardialem Troponin I, Troponin C oder skelettmuskulärem Troponin hervorrufen. Die Lokalisation ist zytoplasmatisch. 141 MEF2D gehört zur Familie der MEF 2 (Myocyte-specific Enhancer-binding Factor 2), welche zu den MADS-Box-Transkriptionsfaktoren gehören. MEF2D bindet vor allem, aber nicht ausschließlich, in Muskelzellen an eine spezielle DNA-Sequenz. MEF2D ist notwendig zur Transkription von Myogenin, weshalb ihm eine wichtige Rolle in der Myogenese und 35, 78, 89, 130, 131 Muskelzelldifferenzierung zugeschrieben wird.

30 23 MATERIALIEN UND METHODEN GATA4 (GATA binding factor 4) ist ein Zink-Finger-Transkriptionsfaktor, der bei Embryogenese und der myokardialen Differenzierung nachweisbar ist und eine wichtige Rolle für die spätere kardiale Funktion spielt. Er ist notwendig für die Entwicklung des Vorhof- und Kammerseptums. Er spielt eine wichtige Rolle bei der Aktivation von kardial-spezifischen Genen. GATA4 ist ein transkriptionaler Aktivator des myozytären Transkriptionsfaktors 48, 51, 128, 129, 135, 150 MEF2C. Das pankardiale Homeobox-Gen nkx2.5 (Syn.: cardiac spezific homeobox (Csx)) kodiert für die Homöodomäne nkx2.5, welche einen Transkriptionsfaktor darstellt. Es gehört zu Gruppe der nkx2 und ist essentiell für die myokardiale Differenzierung in vitro und die kardiale 38, 194 Morphogenese und Kammerdifferenzierung in vivo. Die beiden Transkriptionsfaktoren nkx2.5 und GATA4 sind wechselseitige Kofaktoren bei der 51, 150 Kardiogenese. FOX-H1 (Forkhead Box H1, Syn.: Schmalspur Protein, Forkhead activin signal transducer 1, FAST-1) ist ein Mitglied der HNF-3FKH-Familie. Es handelt sich um einen embryonalen Transkriptionsfaktor der über SMAD2 und SMAD4 Activin und TGF-beta aktiviert. Es interagiert außerdem mit nkx2.5 und ist damit für die Entwicklung des vorderen Herzfeldes (anterior heart field) notwendig. Defekte der FOXH1-Funktion sind verknüpft mit Herzfehlern und Symptomen der Holoprosencephalie. 194 Vimentin ist die wichtigste Untereinheit der Intermediärfilamente in mesenchymalen Zellen. Es wird vermutet, dass es am Transport von Proteinen zwischen dem Zellkern und der Zellmembran beteiligt ist. Neben mesenchymalen Zellen, lymphoidem Gewebe, Fibroblasten, Endothelzellen, glatten Muskelzellen, kann es auch in daraus hervorgehenden Tumoren wie in Sarkomen, Melanomen, Lymphomen und Gefäßtumoren nachgewiesen werden. Es gibt Hinweise darauf, dass Vimentin auch eine Rolle bei Signaltransduktion und Migration spielt Immunhistochemie Um die Ergebnisse der Immunzytochemie (ICC) an CS und CDC zu untermauern und um die Funktion von Antikörpern zu untersuchen wurden Western Blot und Immunhistochemie (IHC) zur Positivkontrolle eingesetzt. Da die Proteine Troponin I, Troponin T, Connexin 43 und Vimentin sicher im erwachsenen humanen Herzen vorhanden sind, sollten sie mit funktionierenden Antikörpern an kardialen Gewebeschnitten nachgewiesen werden können. 140, 141 Die verwendeten Antikörper waren sowohl für ICC, als auch für IHC zugelassen. Bei einer guten spezifischen immunhistochemischen Anfärbung konnte also davon ausgegangen werden,

31 24 MATERIALIEN UND METHODEN dass der Antikörper richtig funktionierte und deswegen auch für die Immunfluoreszenz verwendbar war. Für die Positivkontrolle wurden in Paraffin gegossene humane Gewebeschnitte aus dem rechten Vorhofsohr verwendet. Diese wurden geschnitten, auf Objektträger gezogen und immunhistochemisch mittels der zu testenden Antikörper in verschiedenen Verdünnungsstufen mehrfach gefärbt. Zum Test der Anti-MDR-Antikörper konnten MDR-positive Biopsien vom Kolonkarzinom eingesetzt werden. Diese in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitte wurden uns freundlicherweise vom Pathologischen Institut in Erlangen überlassen und konnten ebenfalls immunhistochemisch gefärbt werden. Gefärbt wurde mit dem CSA-System von DAKO, welches mit einem Streptavidin-Biotin- Peroxidase-Komplex arbeitet. 71, 77 (Herstellung der einzelnen Lösungen siehe Anhang, Kapitel ) Zuerst wurden die Schnitte durch zweimaliges, 15-minütiges Eintauchen in Roti-Histol vom Paraffin befreit. Danach wurden sie mit einer absteigenden Alkoholreihe rehydriert (zweimal für 5 min in 100%, einmal für 3 min in 96% und einmal für 3 min in 70% Ethanol) Nach einer mindestens 5-minütigen Lagerung der Präparate in TBS-T, wurden sie zur Antigendemaskierung in einer mit Citratpuffer gefüllten DAKO-Küvette dreimal für 5 Minuten in der Mikrowelle gekocht. Danach sollten sie für etwa 30 min abkühlen. Nachdem die Schnitte auf den Objektträgern mit dem DAKO-Pen eingegrenzt worden waren, wurde die endogene Peroxidase mit 3% Wasserstoffperoxid 5 min in der feuchten Kammer blockiert. Nach einem Waschgang mit TBS-T wurde der Proteinblock für 5 min aufgebracht. Danach wurde für die Positivkontrolle (d.h. die eigentliche Testfärbung) der Primärantikörper oder für die Negativkontrolle das Normalserum für 15 min auf die Schnitte gegeben. Nach einem weiteren Waschschritt mit TBS-T folgte die Zugabe des biotinmarkierten Brückenantikörpers für 15 min. Dieser wurde ebenfalls wieder mit TBS-T abgewaschen und der 30 min vorher vorbereitete Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex konnte für 15 min einwirken. Ein Verstärkungsreagenz konnte nach einem weiteren Waschschritt für 15 min einwirken. Nachdem dieses wiederum abgewaschen war, wurde die Streptavidin-Peroxidase auf die Objektträger gegeben. Das bereits vorbereitete Chromogensubstrat wurde nach einem weiteren Waschschritt dazugegeben. Beim Beginn der Braunfärbung der Schnitte (abhängig vom Antikörper nach Sekunden bis Minuten) wurde diese Chromogen-Substrat-Reaktion sofort mit Aqua dest. geblockt. Zur Gegenfärbung wurden die Objektträger kurz in Hämatoxylin getaucht, dessen Einwirkung ebenfalls sofort mit Aqua dest. gestoppt wurde. Daraufhin wurden die Schnitte für 5 bis 10 Minuten mit Leitungswasser gebläut. Nach kurzem Abtrocknen konnten die Objektträger mit Aquatex und Deckgläschen eingedeckelt werden. Die Färbungen wurden an den Mikroskopen Olympus IX70 und Aristoplan begutachtet.

32 25 MATERIALIEN UND METHODEN Western Blot Analyse Bei der Western Blot Analyse werden Proteine im Gel elektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Membran übertragen und dort mittels Antikörpern spezifisch nachgewiesen. 187 Zur Positivkontrolle der Antikörper gegen die intranukleären Transkriptionsfaktoren MEF2, GATA4 und nkx2.5 wurden die speziell für diesen Zweck angebotenen Zelllysate und Zellkernextrakte der Firma Santa Cruz verwendet. Durch die Western Blot Analyse wurde überprüft, ob diese Proteine, welche in der Entwicklung von kardialen Myozyten eine Rolle spielen sollen (siehe Kapitel ), durch die eingesetzten Antikörper detektiert werden können. Antikörper Positivkontrolle Hersteller MEF-2 HeLa Whole Cell Lysate Santa Cruz (sc-2200) nkx2.5 A549 Cell Lysate Santa Cruz (sc-2413) GATA4 NIH/3T3 Nuclear Extract Santa Cruz (sc-2138) Tabelle 2-1: Die eingesetzten Zelllysate und Zellkernextrakte zur Positivkontrolle der Antikörper gegen MEF2, nkx2.5 und GATA Proteinextraktion Die CDC einer Kultur wurden wie oben beschrieben abgelöst und pelletiert (180g für 10 min). Zu diesem Zellpellet wurde auf Eis 80µL des Lyse-Puffers zugegeben. Der Lyse-Puffer besteht aus 960µL Kralewsky-Puffer und 40µL Protease-Inhibitor, welcher eine Denaturierung der Proteine durch Zelleigene Enzyme verhindern soll. (Herstellung des Puffers siehe Anhang, Kapitel ) Die Lyse wurde durch eine 20-minütige Lagerung auf Eis und darauf folgende Zentrifugation bei 8000 rpm für 5 min bei 4 C erreicht. Der Überstand im Reaktionsgefäß konnte zum Messen der Proteinkonzentration und für die Gelelektrophorese verwendet werden Proteinquantifizierung Zur Proteinbestimmung wurde die Methode nach Pierce verwendet. Hierbei handelt es sich um eine Biuret-Reaktion, wobei die an Peptidbindungen reduzierten Kupfer-Ionen durch Bicinchoninsäure (BCA) komplexiert werden und dadurch photometrisch erfasst werden können. Der Proteinstandard wurde in verschiedenen Verdünnungsstufen mit Kralewski-Puffer vermischt. Vorher wurden diese beiden Komponenten, sowie auch die aus den Zellen extrahierte Proteinlösung zehnfach mit Wasser verdünnt. Das Pierce-Reagenz wurde aus BCA und Cu-II-sulfat im Verhältnis 1 zu 50 vermischt. Davon wurden 750µL jeweils zu 50µL der verdünnten Proteinlösungen gegeben. Daraufhin wurden diese Reagenzien im Heizblock für 30 min auf 37 C erhitzt. Mit dem Photometer konnte die von der Proteinkonzentration abhängige Extinktion bei 562nm gemessen werden. Durch einen Vergleich mit den Werten der

33 26 MATERIALIEN UND METHODEN Standardproteinreihe konnte die Proteinmenge in der extrahierten Proteinlösung ermittelt werden. Um vergleichbare Bedingungen zu gewährleisten, wurden für die folgenden Versuche immer dieselben Mengen Protein verwendet SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese Zur Auftrennung der Proteine nach ihrem Molekulargewicht wurde die SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) durchgeführt. Um die im Folgenden verwendeten Instrumente fettfrei zu bekommen, wurden sie vorher mit Wasser und Seife gewaschen. Die Zutaten für Trenn- und Sammelgel wurden unter ständigem Rühren zusammengemischt (siehe Tabelle 2-2). 30 Sekunden nach Zugabe von TEMED und APS (siehe Kapitel 7) konnte das Trenngel in die Gießkassette pipettiert werden. Zum Aushärten wurde es mit Wasser eingedeckt, welches nach 30 min wieder entfernt wurde. Auf das Trenngel wurde dann das frisch gemischte Sammelgel gegossen, in welchem durch einen Kamm Taschen für die Proben freigehalten wurden. Nach mindestens 30 Minuten in einer feuchten Kammer konnte das Gel für die Elektrophorese benutzt werden. Trenngel (12%) Sammelgel (3,5%) Acrylamid/Bis (30%) 18 ml 2 ml Tris, HCl 5,6 ml (3M, ph8,9) 2 ml (1M, ph6,7) SDS 10% (g/v) 0,45 ml 160µL dh2o 21 ml 11,7 ml TEMED 67,5 µl 24 µl APS 10% (g/v) 225 µl 200 µl Tabelle 2-2: Das Rezept für die Polyacrylamidgele Nach der Zugabe von Rotiload zu den Proben im Verhältnis 1 zu 3, wurde dieses Gemisch im Heizblock für 5 min auf 95 C erhitzt. Als Proben wurden die Positivkontrollen der Antikörper und die Zelllysate der CDC-Kulturen verwendet. Das Gel wurde aus der Gießkassette gelöst, und in die Elektrophoresekammer gespannt, welche dann mit Laufpuffer (15,13g Tris, 71,6g Glycin, 5,0g SDS, auf 500 ml Aqua dest.; 10fach verdünnt mit dh2o) gefüllt wurde. Die verschiedenen Probengemische wurden in die Geltaschen gefüllt und parallel dazu wurde mindestens eine Tasche mit 4 µl des Proteinstandards gefüllt. An die Elektrophoresekammer wurde für 30 min eine Stromstärke von 25 ma angelegt, beim Erreichen des Trenngels wurde sie auf 35 ma gesteigert. Die Elektrophorese wurde gestoppt, als die Lauffront das Ende des Gels erreichte Immunoblot In der Blot-Kammer erfolgte der Transfer der Proteine auf die PVDF-Membran. Diese Membran wurde zuerst kurz in Methanol und dann in Blotpuffer (Tris 7,25g; Glycin 3,65g; SDS

34 27 MATERIALIEN UND METHODEN 0,465g; 200mL Methanol, H 2 O ad 1000 ml) für 5 Minuten geschwenkt. Ebenso wurden die zugeschnittenen Blotting-Papiere und das Gel kurz in dieses Puffergemisch getaucht. Die Blot- Kammer wurde folgendermaßen befüllt: unten 6 Blot-Papiere, darauf die zugeschnittene und beschriftete PVDF-Membran, darauf das Gel aus der Elektrophoresekammer und oben wiederum 6 Blot-Papiere. Mit einer Handwalze wurden die Schichten blasenfrei aufeinander komprimiert. Für ein Gel wurde für eine Stunde 60mA bei 10V an die Kammer angelegt. Danach wurde der Erfolg der Elektrophorese durch Inkubation des Gels in Coomassie (0,1% Coomassie-Blue; H2O/Methanol/Eisessig: 8/1/1; für 24 h bei Raumtemperatur) überprüft. Die Membran wurde kurz in TBS-T getaucht. Um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren, wurde die Membran daraufhin für mindestens 30 min bei Raumtemperatur in 5% Pferdeserum/TBS-T gelegt. Der auf Spezifität zu untersuchende Antikörper wurde in 6mL TBS- T und 5% Pferdeserum auf 1:250 verdünnt. Darin inkubierte die Membran für 2 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Orbitalshaker. Es folgten drei 5-minütige Waschschritte mit TBS-T, bevor der Sekundärantikörper (mit Meerrettichperoxidase konjugiertes IgG) für eine Stunde bei Raumtemperatur einwirken konnte. Dieser zweite Antikörper war vorher mit TBS-T und 0,5% Pferdeserum auf 1:1000 verdünnt worden. Es folgten 3 weitere 10-minütige Waschschritte Für die Detektion der Antikörperbindungen wurde der ECL-Plus-Chemilumineszenz- Detektions-Kit von Amersham verwendet. In der Dunkelkammer wurden die darin enthaltenen Lösungen A und B im Verhältnis 40:1 vermischt und dann auf die Membran für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur gegeben. Schließlich konnte die Membran mit dem Luminescent Image Analyser LAS-1000 eingescannt und densitrometrisch analysiert werden Elektronenmikroskopie Für die elektronenmikroskopische Analyse der Kardiosphären wurden die Überstände von unterschiedlichsten Kardiosphären-Kulturen gesammelt und diese Zellsuspension bei 180g für 10 min zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurde das Zellpellet gekühlt und im Anatomischen Institut I für die elektronenmikroskopische Untersuchung vorbereitet. Zuerst wurden die Kardiosphären in Agar zentrifugiert. Daraufhin erfolgte die Osmierung und Dehydrierung des Pellets, gefolgt von der Einbettung in Epon und der Anfertigung von Semidünnschnitten für die Trimmung am Elektronenmikroskop. Schließlich wurden die mit Bleicitrat und Uranylacetat kontrastierten Ultradünnschnitte am Elektronenmikroskop Zeiss EM 906 mithilfe eines CCD-Camera-Controllers und einer Slow-scan-CCD-Camera begutachtet und digital photographiert. Die elektronenmikroskopischen Untersuchungen wurden im Anatomischen Institut 1 in Erlangen durchgeführt.

35 28 MATERIALIEN UND METHODEN Durchflusszytometrie der Überstände Für die Analyse der Kulturüberstände von Explantat-, Kardiosphären- und CDC-Kulturen kam der Human Cardiovascular 7plex von Bender MedSystems zur Anwendung. Über einen Zeitraum von 9 Wochen wurde beim Mediumwechsel von jeder Kultur und in jeder Kulturphase ein Teil des davon abgenommenen Zellkulturmediums eingefroren. Dieses durch Zellen konditionierte Nährmedium, wurde auch als Überstand bezeichnet. Ein kleinerer Anteil des Nährmediums befand sich zum Zeitpunkt der Entnahme etwas länger auf den Zellkulturen, auf den Kulturen der Kardiosphären teilweise bis zu zwei Wochen. Nach der Kulturanlage von Explantaten zweier Patienten konnten im gesamten Kulturverlauf und aus allen Kulturphasen Überstände gesammelt und durchflusszytometrisch untersucht werden. In der Durchflusszytometrie werden Zellen nach Größe, Granularität und anhaftenden fluoreszierenden Antikörpern analysiert. Dafür wird die Zellsuspension in eine dünne Flusskammer gesaugt, um die Zellen dort möglichst einzeln mit Laserlicht zu bestrahlen. Anhand des entstehenden Streulichts kann die Größe und Granularität festgestellt werden. Das fluoreszierte und deswegen etwas längerwellige Licht wird dort ebenfalls mit Detektoren erfasst. Die Lichtintensität verhält sich direkt proportional zur Beladung der Zellen mit konjugierten, fluoreszenzmarkierten Antikörpern, welche auf spezifischen Oberflächenepitopen haften. 14 Um Zytokine durchflusszytometrisch erfassen zu können, müssen diese wie bei einem 29, 93 Sandwich-Immunoassay an sogenannte Beads (Synonym: Mikrosphären) gebunden werden. Diese Beads sind mit zytokinspezifischen Antikörpern beschichtet. Die an diesen Partikeln anhaftenden Zytokine heften sich an konjugierte Antikörper, welche über mehrere Bindungsstellen für die PE-Fluorochrome verfügen (siehe Abb.2-3 und Abb.2-4). Dadurch kann anhand der Intensität des fluoreszierten Lichts die Anzahl der Zytokine auf den Beads gemessen werden. Die Beads können durch ihre jeweilige Größe und interne Fluoreszenzstärke ihren jeweiligen Zielantigenen wieder zugeordnet werden. Abb.2-3: Sandwich-Immunoassay mit antikörperbeschichtetem Bead links, gesuchtem Antigen in der Mitte und an Fluorochrom konjugiertem Antikörper rechts (nach Kellar et al. 93 )

36 29 MATERIALIEN UND METHODEN Abb.2-4: Sandwich-Immunoassay. Bead (grün) beschichtet mit Antikörpern (grau) binden an gesuchte Antigene (blau), werden sichtbar gemacht durch an Fluorochrom konjugierte Antikörper (grün) Herstellen der Reagenzien Zur Herstellung des Probepuffers wurde das Probepufferkonzentrat zehnfach mit sterilem Wasser verdünnt. Zur Vorbereitung der Standardkonzentrationen werden die Lyophilisate nach Herstellerangaben mit sterilem Wasser verdünnt. Nach 10min wurde diese Standardlösung gevortext und wenige Sekunden zentrifugiert. Je 10µL der Standardmischungen wurden zusammengeführt und mit Probepuffer auf 200µL aufgefüllt (Standard 1). Für die weiteren Standardmischungen (Standard 2 bis 7) wurden sechs Reaktionsgefäße mit 100µL Probepuffer gefüllt. Dann wurden aus dem Standard 1 50µL entnommen und in Standard 2 überführt. Davon wurden wieder 50µL in Standard 3 gegeben usw. Für den Bead-Mix werden die entsprechenden Beads nach intensivem Resuspendieren zusammengeführt und mit Reagenzverdünnnungspuffer verdünnt. Die erforderliche Menge der verschiedenen Beads war vorher mithilfe der Herstellersoftware errechntet worden. Es folgte die Zentrifugation bei 3000g für 5min. Bis auf 50µL wurde der Überstand verworfen und wieder durch dieselbe Menge Reagenzverdünnungspuffer ersetzt. Zur Vorbereitung des Biotin-Konjugats wurden die entsprechenden konjugierten Antikörper zusammengeführt und mit Reagenzverdünnungspuffer verdünnt. Zur Herstellung der Streptavidin-PE-Lösung wurde kurz vor ihrer Verwendung das Streptavidin-PE-Konzentrat mit Probenpuffer entsprechend verdünnt. Die Mengen der Reagenzien waren jeweils vorher nach Herstellerangaben errechnet worden Vorbereiten der Filter-Platte Nach Vorbereitung der Reagenzien wurden die Vertiefungen der Filterplatte mit 50µL Probenpuffer gereinigt und mit der Ansaugvorrichtung getrocknet. Alle Versuche erfolgten im Doppelansatz. Von den 96 Vertiefungen der Filterplatte wurden 18 für die Standardprobengemische verwendet. Deren Messergebnisse dienten später bei der Auswertung als Vergleichswerte für die Ergebnisse der Proben.

37 30 MATERIALIEN UND METHODEN Von den 18 Standardmischungen und 39 unterschiedlichen Kulturüberständen bzw. Proben wurden jeweils 25µL in getrennte Vertiefungen gefüllt. Daraufhin wurden zu jedem dieser Lösungen 25µL Bead-Mix und 50µL Biotin-Konjugat-Mix gegeben. Nach einer zweistündigen Inkubation auf dem Plattformschüttler bei Raumtemperatur und im Dunkeln wurde die Filterplatte mit der Absaugvorrichtung entleert. Zum zweimaligen Waschvorgang wurden die Vertiefungen jeweils mit 100µL Probenpuffer aufgefüllt und wieder leergesaugt. Schließlich wurden 100µL Probenpuffer und 50µL der frisch hergestellten Streptavidin-PE-Lösung zugegeben. Es folgte eine weitere Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur für eine Stunde. Daraufhin wurde die Platte wiederum komplett durch ihren Filter leergesaugt und zwei weitere Waschvorgänge folgten. Danach wurden 200µL Probenpuffer in jede der Vertiefungen gefüllt und nach ausreichendem Resuspendieren in FACS-Röhrchen überführt. Dort wurden weitere 200µL Probenpuffer zugegeben und die fertigen Proben konnten durchflusszytometrisch analysiert werden Durchflusszytometrische Messung Vor der Messung der Proben musste das Analyseprogramm des Durchflusszytometers mittels einer Setup-Beads-Lösung konfiguriert werden. Die Einstellung wurde so vorgenommen, dass die beiden verschieden großen Beads-Populationen im Streudiagramm in zwei Gattern erfasst werden konnten. Von diesen beiden wurden in weiteren Diagrammen die Signale der zwei verwendeten Fluoreszenzfarben dargestellt. Es wurden bei jeder Messung 600 Beads im Gatter R2 gemessen. Bei der Messung des Standard 1, welcher das höchste PE-Signal aufwies, wurde die Darstellung dieses Signals im Diagramm auf gerade noch darstellbare Werte eingestellt. Außerdem wurden die Beads-Populationen durch Anpassung der Kompensation zwischen den Fluoreszenzsignalen im Streudiagramm horizontal ausgerichtet. Eine genauere Einstellung war mit einer dafür mitgeführten weiteren Standardprobe möglich. Aus den Ergebnissen der Proben und Standardmischungen sollten später die Konzentrationen der verschiedenen Zytokine berechnet werden können Die Eigenschaften der untersuchten Zytokine Das CC-Chemokin MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein 1), auch bekannt als MCAF (Monocyte Chemotactic and Activating Factor) wurde als Chemoattraktans für Monozyten bezeichnet, wobei später auch seine chemotaktische Wirkung auf T-Lymphozyten und natürliche Killerzellen gezeigt wurde. Nach Ischämien des Herzmuskels konnten ebenfalls erhöhte MCP-1 Spiegel im Serum gemessen werden. MCP-1 spielt eine wichtige Rolle beim Entzündungsgeschehen nach dem Herzinfarkt und der darauf folgenden Regeneration des Herzmuskels. Bei Überexprimierung oder anderen Störungen hat dieses Chemokin aber einen negativen Effekt auf die regenerativen Vorgänge. Der Serumspiegel von MCP-1 ist bei der dilatativen Kardiomyopathie erhöht, was zur Zerstörung von Kardiomyozyten durch angelockte

38 31 MATERIALIEN UND METHODEN Monozyten führt. 144 Gleichzeitig verfügt dieses Chemokin aber auch über einen kardioprotektiven Effekt, welcher sich u.a. durch Zytoprotektion, IL-6-Sekretion und Anregung der Neovaskularisierung im Herzmuskel äußert. Dadurch wird eine Dysfunktion des Herzmuskels verhindert. 134, 143 Es schützt die Herzmuskelzellen vor hypoxieinduzierter Apoptose. 184 Bei Mäusen konnte durch ein Zusammenwirken von MCP-1, IL-6 und Hypoxie die Differenzierung von Fibroblasten in Myofibroblasten erreicht werden. 134 Insgesamt gesehen übt dieses CC-Chemokin positive und negative Effekte auf das Myokard aus, wobei sich seine Funktion nicht nur auf das Anlocken von Entzündungszellen beschränkt, sondern auch die direkte Einflussnahme auf die Genexpression der Kardiomyozyten beinhaltet. 143 Das Zytokin IL-6 (Interleukin 6) besitzt vielfältige Funktionen bei der Steuerung von Immunreaktionen, Akute-Phase-Reaktionen und der Hämatopoese. Es wird von den verschiedensten Zellen sezerniert und hat Einfluss auf Wachstum und Differenzierung von unterschiedlichsten Geweben. Außerdem führt IL-6 zur Migration von neutrophilen Granulozyten in das Infarktareal nach einem Myokardinfarkt. 74 Unter anderem kann die Konzentration von IL-6 im Serum als prognostischer Marker für das Risiko der Entwicklung einer Herzinsuffizienz verwertet werden. 10 IL-6 führt zu einer Erhöhung des STAT3, welches eine wichtige Rolle bei der Hypertrophie des Myokards und bei der Zytoprotektion von Kardiomyozyten bei Hypoxie und toxischem Stress spielt. Es wirkt also kardioprotektiv und erhält die Herzfunktion. 18 Zusammen mit MCP-1 löste dieses Zytokin bei hypoxischen Zuständen anscheinend die Differenzierung von Fibroblasten in Myofibroblasten aus. Weitere Faktoren wie pim-1, c-myc, wnt u.a. spielen bei der Regulation der Regeneration scheinbar auch 81, 101, 127, 134 eine wichtige Rolle. IL-8 (Interleukin 8), das auch als Neutrophilen-aktivierendes Peptid 1 bezeichnet wird, regt ausschließlich neutrophile Granulozyten und T-Lymphozyten zur Migration in verletztes oder entzündlich verändertes Gewebe an. Es wird von Monozyten, Endothelzellen, Epithelzellen, neutrophilen Granulozyten, T-Lymphozyten und Anderen sezerniert. Nach einem Myokardinfarkt ist seine Konzentration im Serum erhöht. IL-8 löst die Bildung von Granulationsgewebe aus und führt zur Abräumung von Zellschrott aus dem Infarktareal durch seine leukotaktische Funktion. Darüber hinaus ist er bei der Steuerung der Angiogenese beteiligt. Demgegenüber hat die durch IL-8 ausgelöste, verstärkte Neutrophilenmigration in das 56, 57, 192 Infarktareal eine vergrößerte Nekrosezone zur Folge. Der gewebespezifische Plasminogenaktivator t-pa ist eine Serin-Protease, welche im Blutplasma und anderen Körperflüssigkeiten und Geweben vorkommt. Es wandelt Plasminogen in die aktive Form Plasmin um, welches zur Fibrinolyse fähig ist.

39 32 MATERIALIEN UND METHODEN Das Plasminogen-System hat eine wichtige Funktion bei der kardialen Regeneration nach einem Infarktgeschehen. Bei einer Störung findet keine Einwanderung von Makrophagen statt, die Zahl der Myofibroblasten im Infarktareal ist verringert und es entwickelt sich kein Granulationsgewebe. 37 svcam-1 ist ein gelöstes vaskuläres Zelladhäsionsmolekül. In gebundener Form vermittelt es die Adhäsion von Leukozyten an Endothelzellen und greift dabei auch in die Signaltransduktion ein. Es spielt wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Atherosklerose. Das svcam-1 wird von sca-1-selektionierten kardialen Progenitorzellen sezerniert und hat auf diese positiven Einfluss. 120 Die Selektine gehören ebenfalls zur Gruppe der Zelladhäsionsmoleküle. P-Selektin wird von Blutplättchen und Endothelzellen exprimiert. Unabhängig von ischämischer oder nichtischämischer Ätiologie ist die Konzentration von des sp-selektin bei chronischer Herzinsuffizienz im Blut erhöht. 36 Der gelöste Ligand von CD40 heißt scd40-l und spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von atherothrombotischen Ereignissen im Rahmen kardiovaskulärer Erkrankungen. Der scd40-l-spiegel im Blut ist bei symptomatischer chronischer Herzinsuffizienz erhöht. Es wird von aktivierten T-Zellen, Blutplättchen und vielen anderen Zellen exprimiert und führt unter anderem zur Expression von Zelladhäsionsmolekülen auf Endothelzellen. 112 Die gelösten Faktoren (svcam-1, sp-selektin und scd40-l) sind für Untersuchungen leichter zugänglich und sollen meist als Marker für die ihnen entsprechenden gebundenen Zytokine fungieren. Die untersuchten Botenstoffe spielen eine wichtige Rolle bei Atherosklerose, Inflammation und Herzinsuffizienz, wobei sie bei letzterem auch ohne vaskuläre Genese sezerniert werden. Bei der Steuerung der Regeneration des Myokards übernehmen sie wichtige Aufgaben, die aber 18, 37, 58, 95, 144 bisher nur wenig erforscht wurden Statistik Die quantitativ auszuwertenden Ergebnisse dieser Arbeit wurden als Mittelwert ± Standardfehler angegeben und dargestellt. Um die statistische Signifikanz zu untersuchen wurden verschiedene statistische Tests mit SigmaPlot 11.0 durchgeführt. Mit dem Shapiro- Wilk-Test wurden die Werte auf ihre Normalverteilung überprüft. Davon abhängig wurde entweder der ungepaarte T-Test oder der Mann-Whitney-U-Test verwendet. Mit dem

40 33 MATERIALIEN UND METHODEN einseitigen ANOVA für Rangsummen nach Kruskal-Wallis wurden die beiden untersuchten Kulturen auf ihre Vergleichbarkeit überprüft. Als signifikant wurden die Ergebnisse mit einem Signifikanzniveau von p<0,05% bezeichnet

41 34 ERGEBNISSE 3 ERGEBNISSE 3.1 Morphologie und Entwicklung der Zellen Explantat-Kulturen Im Folgenden werden einerseits die Erfahrungen und daraus resultierenden Anpassungen in der kulturellen Methodik und andererseits die Struktur der sich entwickelnden Zellen in der Zellkultur beschrieben. Die beschriebenen Beobachtungen im Verlauf der Zellkultur wurden mit dem inversen Lichtmikroskop Olympus CK40 gemacht. Die Explantatproben durften auf dem leicht feuchten, mit Fibronektin beschichteten Zellkulturschalenboden nicht austrocknen. Um dies zu gewährleisten, wurden unterschiedliche Volumina des Mediums vor dem Aufbringen der Herzmuskelproben zugegeben. Aber bereits durch geringe Mengen von CEM wurde die mechanische Fixierung der Explantate am Schalenboden stark erschwert. Deshalb wurde das Medium schließlich erst nach dem Andrücken der Gewebsstückchen zugegeben. So konnten bis zur ersten enzymatischen Behandlung der Kulturen mehr als 80% der aufgebrachten Stückchen haften bleiben. Um die Explantate vor der Austrocknung zu bewahren musste spätestens nach 10min Medium vorsichtig zugegeben werden. Insbesondere kleine Stückchen trockneten schneller aus, weshalb die Explantate eine gewisse Mindestgröße nicht unterschreiten sollten. Dagegen schwammen zu große Stückchen bei Zugabe von Medium oder Transport der Kulturschalen leichter ab. Abb. 3-1: Explantat direkt nach Anlage im Lichtmikroskop Von den kleineren Gewebsstückchen wuchsen die fibroblastoiden Zellen besser und schneller aus. Bei den Explanat-Kulturen mit höherer Wachstumsgeschwindigkeit konnte in den meisten Fällen eine weitere gute und eher zügige Entwicklung in den folgenden Kulturphasen erwartet werden. Die ersten in dieser Kulturphase anwachsenden Zellen zeigten eine für Fibroblasten typische Morphologie und wuchsen nach etwa 5 bis 7 Tagen gleichmäßig von den Explantatstückchen aus. Schon wenige Tage danach fanden sich auch die kleineren, runden

42 35 ERGEBNISSE kardiosphärenbildenden Zellen auf dem bindegewebszellartigen Zellrasen. Nur in wenigen Einzelfällen konnten pflastersteinartige Zellen auf kleinen Arealen beobachtet werden, die wegen ihrer morphologischen Ähnlichkeit zu HUVEC möglicherweise Endothelzellen waren. Diese wurden nach einigen Tagen von den fibroblastenähnlichen Zellen überwuchert. Meist war nach zwei bis drei Wochen der gesamte Schalenboden von einem fibroblastoiden Zellrasen bedeckt. Schon bei Beginn der von den Explantaten ausgehenden Migration und Proliferation zeigten sich einzelne, verstreut liegende, kleinere Zellen (im Durchmesser etwa 10-15µm), die sich im Phasenkontrastmikroskop heller leuchtend darstellten. Diese kardiosphärenbildenden Zellen wanderten auf dem Zellrasen von den Explantaten weg. Abb. 3-2A: Auswachsende Zellen von einem Explantat (*); B: dichter fibroblastoider Zellrasen mit aufgelagerten kardiosphärenbildenden Zellen (), vom Explantat (*) auswachsend Kardiosphären Nach etwa zwei bis drei Wochen waren auf dem fibroblastoiden Zellrasen der Explantatkulturen ausreichend viele kardiosphärenbildende Zellen vorhanden, um davon nach einer möglichst selektiven Ablösung erfolgreich CS-Kulturen anlegen zu können. In den Explantat-Kulturen waren die fibroblastenähnlichen Zellen erkennbar stärker mechanisch untereinander verknüpft, als die darauf wachsenden Vorläuferzellen der Kardiosphären. Eine Einwirkzeit von 60 sec. für Versene und 70 bis 90 sec. für Trypsin erwies sich als ideal, um möglichst viele der kardiosphärenbildenden Zellen selektiv abzulösen. Nur durch sehr vorsichtiges Pipettieren konnten größere Beschädigungen des Zellrasens der Explantatkultur verhindert werden. Die erste Ernte von kardiosphärenbildenden Zellen einer Kultur war regelmäßig weniger erfolgreich, als eine zweite Ernte nach ca. einer Woche. Nach Anlage der Kardiosphärenkulturen adhärierten die wenigen fibroblastoiden Zellen am Zellkulturboden. Die nicht anhaftenden kleineren Zellen, bei welchen es sich vermutlich um

43 36 ERGEBNISSE kardiosphärenbildene Zellen aus der Explantatphase handelte, entwickelten sich zu Kardiosphären. Die Sphären entstanden sich unabhängig voneinander und in unregelmäßigen Zeitabständen. Sie zeigten dabei alle dasselbe Wachstums- und Adhäsionsverhalten. Eine kleine, aus nur wenigen Zellen bestehende und nicht adhärierende Sphäre wuchs innerhalb von 1 3 Tagen zu einer großen CS heran, die dann für die weitere Verarbeitung oder Analyse verwendbar war. Mit zunehmender Größe aber begannen die Kardiosphären, sich an den Zellkulturboden oder die dort proliferierenden fibroblastenartigen Zellen zu heften. Um die Sphären weiterverwenden zu können, mussten sie vor ihrer Adhäsion innerhalb des engen Zeitfensters aus der Kultur entnommen werden. Durch die zeitlich voneinander unabhängige Entwicklung der einzelnen Kardiosphären wurden sie gleichzeitig in zahlreichen verschiedenen Größen für die Analyse entnommen. Abb. 3-3A: Kleine Kardiosphären (), kurz nach CS-Kultur-Anlage in Suspension. Fibroblastoide Zellen auf dem Zellkulturboden in unscharfer Darstellung wegen Fokussierung auf die schwimmenden CS. B: Vergrößerung des Ausschnitts aus A mit einer einzelnen kleinen CS. Erkennbare umhüllende Struktur, einzelne Zellen bereits nicht mehr voneinander abgrenzbar. Nur bestimmte kugelige Zellansammlungen ließen sich zu CDC weiterverarbeiten und wurden deswegen als Kardiosphären bezeichnet. Im Gegensatz zu Zellschrotthaufen und anderen kugeligen Agglomerationen verfügten die CS über ein typisches Aussehen. Die Zellkugeln waren nur leicht assymmetrisch geformt, mit einer glatten Oberfläche und einer umhüllenden dünnen Schicht, welche sich im Lichtmikroskop doppelbrechend darstellte. Innerhalb der Kardiosphären waren die Zellen nicht voneinander abgrenzbar (Abb.3-3B). Die CS schwammen nur in geringer Höhe über dem Zellrasen. Im Gegensatz dazu entstanden vor allem in älteren Kulturen einige assymmetrische, himbeerartige Zellagglomerationen. Dabei handelte es sich vermutlich um abgestorbene, vom Kulturboden abgelöste Zellen.

44 37 ERGEBNISSE Im Verlauf der Kultur war individuell eine unterschiedlich schnelle Größenzunahme der CS festzustellen. Frühestens nach zwei Tagen, im Mittel nach ein bis zwei Wochen konnten die ersten Kardiosphären für die CDC-Kulturanlage entnommen werden. Danach konnte diese Prozedur mit ausreichend großer Ausbeute insgesamt etwa viermal, im Abstand von 2-3 Wochen wiederholt werden. Die Entwicklung der Kardiosphären konnte vor allem in den ersten Wochen nach der Anlage erreicht und beobachtet werden. Aber auch nach langen Phasen geringerer Zellproliferation zeigten sich oft plötzlich, gleichzeitig und unerwartet viele CS in ihren Kulturen. Dazwischen entwickelte sich meist nur eine geringe Anzahl von CS. Besonders während dieser Phase der Zellkultur zeigten sich große interindividuelle Unterschiede zwischen den Kulturen in ihrer Fähigkeit Kardiosphären zu bilden. Die maximale Größe der Kardiosphären betrug etwa 1200µm. Sie adhärierten aber häufig schon bei einer Größe von wenigen hundert Mikrometern am Boden der Zellkulturen, was anscheinend auch von der Menge der bereits am Boden anhaftenden fibroblastoiden Zellen abhing. Ab welcher Ausdehnung der Sphären dieses unerwünschte Phänomen der Adhäsion auftrat konnte nicht exakt ermittelt werden, aber mit zunehmendem Durchmesser erhöhte sich die Tendenz am Zellkulturboden anzuhaften. Vermutlich sind daran unterschiedlichste Einflussfaktoren beteiligt. Ab einer Größe von ca. 100µm waren sie durch ihre typische glatte Oberfläche und die stärkere Lichtbrechung im Phasenkontrastmikroskop als CS identifizierbar. Die zur Analyse oder Anlage einer CDC-Kultur entnommenen Kardiosphären hatten meist eine Größe von µm. Abb. 3-4A: große Kardiosphäre mit ca. 1200µm Durchmesser, doppelbrechende umhüllende Struktur () hier beispielhaft gekennzeichnet; B: Zwei CS, davon oberes schwimmend, unteres adhärent.

45 38 ERGEBNISSE Abb. 3-4C: Zwei CS, davon unteres schwimmend, oberes am Kulturboden haftend; D: Drei Kardiosphären; Assymetrien häufiger bei größeren Sphären feststellbar. Generell ist die Entwicklung von schwimmenden CS eine Grundvoraussetzung für die Durchführung dieser besonderen Art der Zellkulturmethode. Damit ist eine Selektion der Zellen nach ihrem unterschiedlichen Adhäsionsverhalten möglich. Ab einer bestimmten Anzahl und Größe der CS reichte die Zelldichte erfahrungsgemäß aus, um in den folgenden CDC-Kulturen anwachsen und proliferieren zu können. Nur in einem schmalen Zeitfenster waren die einzelnen Zellkugeln zuerst als CS erkennbar und für die weitere Verarbeitung bereit. Wenig später hafteten sie am Zellkulturboden an, wodurch ihre Isolation zur weiteren Verwendung unmöglich wurde. Die Kardiosphären waren in vielen Fällen nicht gleichzeitig in einer ausreichenden Anzahl vorhanden, aber durch das Zusammenführen von CS aus früheren und späteren Abnahmen aus einer CS- in eine CDC-Kultur konnte meist eine ausreichende Ausbeute erzielt werden Cardiosphere Derived Cells (CDC) Die CS adhärierten auf den mit Fibronektin beschichteten Zellkulturböden nach ein bis zwei Tagen. Die genaue Konzentration der Adhäsionsproteine bei der Beschichtung spielte dabei eine untergeordnete Rolle. Zuerst waren auswachsende Sphären zu beobachten, d.h. die rundlichen Zellhaufen waren umgeben von radiär angeordneten länglichen Zellen. Diese entstandene diskontinuierliche Zellverteilung war noch nach einigen Tagen Zellwachstum feststellbar. Auch der Ausgangspunkt des Wachstums war als dichtere Zellanhäufung erkennbar.

46 39 ERGEBNISSE Abb. 3-5A: Anwachsende CS in den ersten Tagen der CDC-Kultur. B: Sehr dichtes Wachstum der CDC nach einigen Wochen mit weiterhin als Ausgangspunkt erkennbaren angewachsenen CS (*); Die erste Passage von 25cm² auf 75cm²-Zellkulturflaschen erfolgte bei gutem Wachstum und einer ausreichenden Zelldichte über mindestens 2/3 des Zellkulturbodens. Ab jetzt konnte eine gleichmäßigere Verteilung und Proliferation der Zellen über den gesamten Flaschenboden beobachtet werden. Je höher die Zelldichte bei der Passage war, desto schneller fand das Wachstum in der neuen Kulturflasche statt. Die gleichmäßigere Zellrasenbildung führte bei einer höheren Zelldichte zu einer synchronen Ausrichtung der Zellen nebeneinander. Die Zellausläufer wurden länger und schmaler. Sie lagerten sich seitlich linear aneinander, wobei sich der Zellrasen strömungsartig und wellenförmig darstellte. Erst bei zu dichtem Wachstum bildeten sich wieder gelblichere, stärker lichtbrechende Stränge heraus. Teilweise befanden sich darauf rundliche Haufen, was als Zeichen für eine lokal hohe Zelldichte aufgefasst wurde. Es bestanden einige morphologische Ähnlichkeiten der CDC zu Fibroblasten. Beide entwickelten aus anfangs kurzen und spitzen Zellfortsätzen lange und sehr dünne Zellausläufer. Die von den CS abgeleiteten Zellen zeigten also ein fibroblastoides Zellrasenbild. Im Unterschied zu den Fibroblasten erschienen die CDC aber besonders zu Anfang in ihrer Struktur breiter. Außerdem zeigten sich im Verlauf auch quaderförmige, weniger lichtbrechende Zellen, welche einen faserigen Inhalt vermuten ließen.

47 40 ERGEBNISSE Abb. 3-6A+B: CDC der zweiten Passage mit zwei oder mehr Nukleolen im Zellkern (z.b.). C+D: CDC mit breiten, quaderartiger und faserig anmutenden Zellen (); E: dichter Zellrasen der CDC mit typischer dichter Anordnung (Variationen von Zelllänge und Zellbreite je nach Zelldichte)

48 41 ERGEBNISSE Die CDC enthielten häufig zwei Zellkerne und fast ausnahmslos mindestens zwei Nukleolen. Zur zweiten Passage war meist eine Verdopplung oder Verdreifachung der Kulturfläche möglich. Diese Prozedur hatte meist keinen lichtmikroskopisch sichtbaren Einfluss auf das bereits vorher gezeigte Wachstumsverhalten, welches abhängig von der Herkunftskultur und der ausgesäten Zellzahl war. Die aufgetauten CDC wiesen anfangs eine geringfügig andere Zell- und Zellrasenstruktur auf. Trotz guter Resuspension hafteten neben Einzelzellen vor allem Zellanhäufungen an, welche wiederum den Ausgangspunkt für das Wachstum in der Kultur bildeten. Sie ähnelten den Haufen, welche auch in einer Kultur mit sehr hoher Zelldichte auftraten. Diese Formationen waren bis zum Ende der Kultur als Zellansammlungen erkennbar. Das Wachstum erschien umso besser, je kürzer die Zellen eingefroren waren. Durch das Einfrieren, die Lagerung und den Auftauprozess musste mit einem Verlust von etwa 30% der Zellen gerechnet werden. Der anfallende Zellschrott wurde beim ersten Mediumwechsel entfernt. Nach einer längeren, mehrmonatigen Lagerung bei -80 C konnte neben der geringeren Zellzahl auch eine geringere Proliferationsrate beobachtet werden. Aus allen 28 sorgsam und keimfrei verarbeiteten myokardialen Gewebeproben konnten erfolgreich Explantat-Kulturen angelegt werden. Davon war es mit 25 Kulturen möglich, die Bildung von Kardiosphären anzuregen. Daraus wiederum konnten in 24 Fällen CDC-Kulturen erfolgreich entwickelt werden. Davon konnten 18 bis zur zweiten Passage gezüchtet werden. Die Verluste zwischen den Schritten beruhten größtenteils auf einer frühzeitigen Entnahme aus der Kultur zu verschiedenen Testanalysen. Nur zwei Explantat-Kulturen, keine CS-Kultur, und sechs CDC-Kulturen blieben ohne erkennbare Ursache im Wachstum soweit zurück, dass sie die nächste Kulturphase nicht erreichen konnten. Die verschiedenen Kulturen unterschieden sich teilweise stark in ihrer Wachstumsgeschwindigkeit. Von schneller wachsenden Zellpopulationen konnte auch eine höhere Ausbeute bei der Abtragung kardiosphärenbildender Zellen erwartet werden. Die Kulturdauer bis zur zweiten Passage lag zwischen 8 Wochen und 4 Monaten mit einem Durchschnittswert von etwa 3 Monaten. Häufigeres Ernten war bei Explantat- und CS-Kulturen möglich, sodass diese erst längere Zeit nach dem ersten Ernten verworfen wurden. Die kardiosphärenbildenden Zellen und die Kardiosphären wurden je nach mikroskopischem Befund der Kulturen etwa alle 2 bis 3 Wochen entnommen. Nach spätestens 3 Monaten war keine weitere erfolgreiche Ernte mehr möglich. Erst zu diesem Zeitpunkt wurden die Zellkulturen verworfen.

49 42 ERGEBNISSE Die Zellkulturen im Zeitverlauf Im Folgenden werden die Zellkulturen im zeitlichen Verlauf dargestellt. Dabei werden die Zeitabstände zwischen den jeweiligen Verarbeitungsschritten und die gesamte Zeitdauer der Zellkultur exemplarisch demonstriert. Die ausgewählten 6 Kulturen hatten alle angestrebten Zellkulturphasen bis zur zweiten Passage der CDC erreicht. Kultur 2 Kultur 4 Kultur 8 Kultur 10 Kultur 21 Kultur 24 Explantat- Kulturanlage Erstes Auswachsen von Zellen aus den Explantaten Erste Anlage von CS-bildenden Kulturen Erste Anlage einer CDC-Kultur Erste Passage der ersten CDC-Kultur Zweite Passage der ersten CDC-Kultur Analyse oder Einfrieren der Zellkultur Tab. 3-1: Zeitpunkte der Weiterverarbeitung in die nächste Kulturphase in Tagen; jeweils von Beginn der Explantat-Kulturanlage an gerechnet. Bei Kultur 24 erfolgte die Anlage der CDC auf Kammerobjektträgern als Passage 2, damit erfolgte die Passage 2 und die Analyse gleichzeitig.

50 43 ERGEBNISSE Zellkulturvergleich im Zeitverlauf Darstellung der Zeitdauer in Tagen bis zum nächsten in der Legende beschriebenen Ereignis Tage Analyse oder Einfrieren der Zellkultur Zweite Passage der ersten CDC- Kultur Erste Passage der ersten CDC- Kultur Erste Anlage einer CDC-Kultur Erste Anlage von CS-bildenden Kulturen Erstes Auswachsen von Zellen aus den Explantaten 0 Kultur 2 Kultur 4 Kultur 8 Kultur 10 Kultur 21 Kultur 24 Mittelwert Abb. 3-7: Darstellung der Zeitpunkte der Weiterverarbeitung in die nächste Kulturphase in Tagen; jeweils von Beginn der Explantat-Kulturanlage an gerechnet. Mittelwert in Tagen das entspricht Standardabweichung vom Mittelwert Standardfehler Explantat-Kulturanlage erstes Auswachsen von Zellen aus den Explantaten Erste Anlage von CSbildenden Kulturen Erste Anlage einer CDC- Kultur Erste Passage der ersten CDC-Kultur 4,67 5 Tagen 0,52 0,21 22,5 3 Wochen 7,06 2,88 42,33 6 Wochen 8,31 3, Wochen 14,48 5,91 Zweite Passage der ersten CDC-Kultur 84,67 12 Wochen 31,04 12,67 Analyse oder Einfrieren der Zellkultur 102,6 15 Wochen 38,73 15,81 Tab. 3-2: Zeitpunkte der Weiterverarbeitung in die nächste Kulturphase in Tagen im Mittelwert mit Angabe von Standardabweichung und Standardfehlern ebenfalls in Tagen.

51 44 ERGEBNISSE Durchschnittliche Dauer der Kulturphasen Darstellung der Zeitdauer in Tagen bis zum nächsten angegebenen Ereignis Tage Explantat- Kulturanlage Erstes Auswachsen von Zellen aus den Explantaten Erste Anlage von CSbildenden Kulturen Erste Anlage einer CDC- Kultur Erste Passage der ersten CDC-Kultur Zweite Passage der ersten CDC- Kultur Analyse oder Einfrieren der Zellkultur Abb. 3-8: Darstellung der durchschnittlichen Zeitdauer bis das angegebene Ereignis der Zellkultur eintritt bzw. bis die Zellen für die nächste Kulturphase weiterverarbeitet werden können. Durchschnittswerte errechnet aus den oben dargestellten Kulturen. Mit Angabe des jeweiligen Standardfehlers zum Mittelwert. 3.2 Immunzytochemie an Kardiosphären und CDC Das im Methodenteil dargestellte Verfahren der Immunzytochemie erzielte die besten Ergebnisse hinsichtlich Integrität der Zellstrukturen, Hintergrundfärbung und Stärke der spezifischen Färbung. Auf weitere Blockierungs- und Permeabilisierungsschritte konnte verzichtet werden. Die unspezifischen Bindungsstellen wurden durch die Beimengung von Esel- Normalserum und BSA in der Verdünnungslösung sehr effizient abgeblockt. Die Morphologie der Zellen wurde durch die relativ lange Triton-X-Behandlung nicht merklich beeinträchtigt. Ethanol erwies sich als Fixans wenig schädlich für die Struktur der zu detektierenden Proteine und ermöglichte im Vergleich zu 4% PFA oder Methanol (-10 C) die besten und wahrscheinlich am wenigsten verfälschten Färbungen. Die hier dargestellten Ergebnisse der immunzytochemischen Färbungen konnten mit denselben Verfahren mindestens an vier verschiedenen Kulturen reproduziert werden. Die Stärke unspezifischer Fluoreszenzsignale wurde durch parallel angefertigte Negativkontrollen ermittelt. Die Einstellungen am konfokalen Laserscanningmikroskop wurden dann in der Art vorgenommen, dass nur Signalstärken über dem Niveau der Kontrollen zur Darstellung kamen. Schwache unspezifische Fluoreszenzsignale wurden durch dieses Vorgehen schon vor der photographischen Aufnahme ausgeblendet und werden deswegen auch nicht auf den folgenden Abbildungen dargestellt. Die meisten trotzdem noch vorhandenen unspezifischen Fluoreszenzen können durch ihre untypische Lokalisation identifiziert werden.

52 45 ERGEBNISSE Immunzytochemie an Kardiosphären (CS) Die aufgesammelten Kardiosphären ließen sich problemlos auf den unbeschichteten Kammerobjektträgern anzüchten, so dass die meisten vitalen Kardiosphären bereits einen Tag nach dem Aussäen ausreichend fest am Objektträger anhafteten. Durch den guten Halt und eine vorsichtige Behandlung konnten größere Verluste der CS beim Färbevorgang verhindert werden. Durch die kurze Kulturzeit auf den Objektträgern konnte die für Kardiosphären typische Struktur weitgehend erhalten werden. Im Lichtmikroskop und im Fluoreszenzmikroskop war eine genaue Abgrenzung von einzelnen Zellen innerhalb der kugeligen CS nicht möglich. Auch im konfokalen Fluoreszenzmikroskop stellten sich in geringerem Maß Überlagerungseffekte ein. Somit war die Feststellung der genauen Lokalisation der Fluoreszenzsignale (im Zellkern, Zytosol, Zellmembran oder extrazellulär liegend) nicht zweifelsfrei möglich. Die Unterscheidung zwischen Zellen und Zellschrott war vor allem im Zentrum der CS schwierig oder gar nicht möglich Connexin43 Abb. 3-9: Cx43 (rot); A: Drei CS mit intensiv rot aufleuchtenden, punktförmigen Strukturen, welche Ansammlungen von Connexin 43 entsprechen dürften. B: Eine Kardiosphäre mit ähnlichem Fluoreszenzsignalmuster wie in A Durch das konfokale Fluoreszenzmikroskop konnte ein intensives spezifisches Signal detektiert werden, wobei insbesondere zahlreiche kleine hell-leuchtende Plaques auffielen. Diese befanden sich vermehrt am Rande der Kardiosphären. Darüber hinaus konnte eine diffuse, ziemlich kräftige Färbung der gesamten Kardiosphäre aufgezeichnet werden. Die Zellkompartimente konnten dabei nicht sicher voneinander abgegrenzt werden. (Abb.3-7A+B)

53 46 ERGEBNISSE c-kit Abb. 3-10: c-kit (rot); A: zwei CS mit beinahe signalhomogenem Inhalt und stärker fluoreszierender Hülle; B: Mehrere CS mit dezenten Aufhellungen in Zellgröße. Nach der Färbung mit c-kit-antikörpern zeigte sich ein diffuses, meist etwas schwächeres Signal, welche die CS als nahezu homogene Struktur darstellte. Die Kardiosphären fluoreszierten fast gleichmäßig über ihre gesamte Ausdehnung, was auf eine einheitliche Expression von c-kit hindeutete. Die Spezifität und Funktion des Antikörpers wurde mit einer Positivkontrolle an HUVEC überprüft. Diese immunzytochemische Färbung zeigte in der Fluoreszenzmikroskopie eine eindeutig positive und spezifische Färbung. In einigen Fällen präsentierte sich die umhüllende Struktur der Sphären überaus kräftig (Abb.3-8A).

54 47 ERGEBNISSE Kardiales Troponin T Abb. 3-11: ctnt (rot); A-B und E: kräftiges Signal umschriebener Strukturen in den Kardiosphären; C-D: Häufiger befanden sich diese signalstärkeren Gebilde am Rande der CS.

55 48 ERGEBNISSE Das kardiale Troponin T konnte mit einem eindeutig positiven Signal in den Kardiosphären detektiert werden. Einige unregelmäßig runde Strukturen, welche sich häufiger am Rand der Sphären befanden, zeigten eine besonders intensive Färbung MEF2D Abb. 3-12: MEF2D (rot); A: nur wenig über dem Hintergrund fluoreszierendes Signal an zwei undeutlich erkennbaren CS; B: eine Kardiosphäre mit einzelnen etwas schwer abgrenzbaren Aufhellungen in scheinbarer Zellkerngröße Im Gegensatz zu den CDC konnte bei der Färbung mit Anti-MEF2D nur ein schwaches Signal aufgezeichnet werden. Nur selten waren einige diskrete Aufhellungen, welche in Größe und Form teilweise an Zellkerne erinnerten, mit der Kernfärbung DRAQ5 kolokalisiert. Somit kann dieses Signal häufig nicht dem Kern zugeordnet werden. In den allermeisten Färbungen war das Signal etwas kräftiger als der unspezifische Hintergrund.

56 49 ERGEBNISSE GATA4 Abb. 3-13: GATA4 (blau); A+B: Intensiv leuchtende, granuläre Signale in den CS; C: Kleine, punktförmige und kräftige Aufhellung in der Peripherie mehrerer CS. Nur eine geringe, beinahe nicht über dem Niveau der Kontrollfärbungen liegende Fluoreszenz konnte detektiert werden. Nur in wenigen Fällen ließen sich etwas stärkere fleckförmige granuläre Signale feststellen (siehe Abb.3-11A+B). Ansonsten war das Fluoreszenzsignal meistens schwach und diffus über die Kardiosphären verteilt, wie in Abb3-11C dargestellt. Kleine, punktförmige und kräftigere Aufhellungen könnten auf eine intranukleäre Färbung des Transkriptionsfaktors hindeuten. Sie ließen sich aber keinem Zellkompartiment zuordnen und lagen häufig nur diffus über die Sphäre hinweg vor. Häufiger traten sie peripher auf, teilweise nur in der hüllenartigen Struktur der CS. (Abb.3-11C) Allgemein war die Signalstärke gering und befand sich meist nur wenig über der Hintergrundfluoreszenz. Dennoch waren die Fluoreszenzsignale eindeutig vorhanden und besonders in der Peripherie als lokale kräftige Aufhellungen erkennbar. Die Positivkontrollen mittels Western Blot zeigten eine normale Funktion des Antikörpers.

57 50 ERGEBNISSE nkx2.5 Abb. 3-14: nkx2.5 (grün); A: drei aneinander gelagerte CS mit wenigen intensiver leuchtenden Flecken in der Peripherie der Sphären; punktförmige Aufhellungen in der Hülle; B: Zwei CS mit typisch schwachen und diffusen Signalen; etwas stärker fluoreszierende Hülle. Hier konnte nur ein schwaches Signal detektiert werden, das sich zwar diffus und in vielen Fällen als unspezifisch darstellte, die Kardiosphären aber eindeutig stärker als in der Normalserumkontrolle fluoreszieren ließ. Bei direkter mikroskopischer Begutachtung waren die Farbsignale meist schwach und zeigten oft nicht die erwartete kräftig-grüne Farbschattierung. Darüber hinaus konnte eine geringe Anzahl heller fluoreszierender Flecken in einigen Kardiosphären festgestellt werden. Diese befanden sich meist in der Peripherie der Sphäre (Abb.3-12A). Die etwa zellkerngroßen, kräftiger leuchtenden Flecken waren aber in vielen Fällen nicht mit der Zellkernfärbung DRAQ5 kongruent. In einigen Fällen leuchtete die Struktur, die die CS umhüllte, etwas intensiver (Abb.3-12B). Deutlich leuchtende punktartige Strukturen befanden sich in seltenen Fällen ebenfalls an der äußersten Peripherie der Zellkugeln (Abb.3-12A). Insgesamt zeigte sich also eine zwar schwache, aber deutlich vorhandene Färbung, die besonders in der Peripherie der Kardiosphären festzustellen war. Transkriptionsfaktoren wie nkx2.5 und GATA4 sind in den Zellen naturgemäß in weit geringerer Konzentration vorhanden als beispielsweise Strukturproteine.

58 51 ERGEBNISSE FOXH1 Abb. 3-15: FOXH1 (blau); A+B: aneinander liegende CS; die umhüllende Struktur mit kräftigen, dicht gedrängten, punktförmigen Signalen; diffuses Fluoreszenzsignal der gesamten CS. Insbesondere die umhüllende Struktur der Kardiosphären, welche später elektronenmikroskopisch genauer abgeklärt wurde, konnte mit dem Antikörper gegen FOXH1 sehr intensiv leuchtend dargestellt werden. Die Kardiosphären leuchteten schwach über der Hintergrundfluoreszenz, wobei wieder einige Flecken und intensiv leuchtende Pünktchen in der Peripherie der CS festgestellt werden konnten (Abb.3-13A+B). Da dieser Antikörper vor allem bei der Färbung der CDC eher unspezifisch zu färben schien, kann nicht zwingend von einem positiven Ergebnis ausgegangen werden Vimentin Abb. 3-16: Vimentin (blau); A: die umhüllende Struktur leuchtet etwas intensiver; A+B: Diffuse gleichmäßige signalschwache Färbung von CS. Mit dem Antikörper gegen Vimentin war eine diffuse gleichmäßige, leicht fleckige, schwache und wahrscheinlich unspezifische Färbung über die gesamte CS hinweg feststellbar (Abb.3-

59 52 ERGEBNISSE 14A+B). Bei einigen Kardiosphären war eine intensive Fluoreszenz der umhüllenden Struktur erkennbar (Abb.3-14A) CD34 Dieser Marker zeigte auf den Kardiosphären ebenfalls nur eine sehr schwache Signalintensität, welche nie stärker als die Hintergrundfluoreszenz war. Somit war kein Nachweis von CD34 in den CS möglich. Auch hier konnte die einwandfreie Funktion des Antikörpers in der immunzytochemischen Färbung mit THP-1-Zellen nachgewiesen werden CD45 Es war kein Fluoreszenzsignal und somit kein Nachweis von CD45-spezifischen Epitopen in den CS möglich. Die Signalintensitäten blieben immer schwächer als die Hintergrundfärbung. In der Positivkontrolle mit THP-1 konnte hingegen eine kräftige und spezifische Immunreaktivität des Antikörpers festgestellt werden MDR Abb. 3-17: MDR (rot); schwache und diffuse Färbung einer Kardiosphäre. Trotz vielfachen Färbeversuchen konnten bei der Suche nach dem MDR-Transporter nur sehr schwache Signalintensitäten erreicht werden. Diese waren darüber hinaus diffus und gleichmäßig über die Zelle verteilt. Sie zeigten eine nicht über der Hintergrundfluoreszenz nachweisbare Signalstärke.

60 53 ERGEBNISSE Kernfärbung mit DRAQ5 Abb. 3-18A-C: Zellkerne (blau); Färbung der Kerne eines CS A: Schnitt durch Kuppel/oberen Anteil einer CS; B: Schnitt durch Zentrum der CS; C: Schnitt in Höhe des Zellkulturbodens mit auswachsenden Zellen; D: Doppelfärbung: Kerne blau, c-kit rot; drei CS in einer Reihe; erkennbare kleinere Zellkerne innerhalb der Sphären und größere Kerne außerhalb; Durch die Kernfärbung mit DRAQ5 war eine sehr gute räumliche Darstellung der Zellverteilung in den CS durch die Detektion der Zellkerne möglich. Diese befanden sich peripher und schalenartig in den Kardiosphären. Schon bei einer Größe der CS von etwa 70µm ließen sich in deren Zentrum weitestgehend keine Zellkerne mehr nachweisen. Bereits bei kleineren Sphären konzentrierten sich die Kerne stattdessen stärker in der Peripherie. Mit zunehmender Größe der Kardiosphären vergrößerte sich der Bereich der fast zellfreien Mitte. Der Rand der Sphären, der vitale Zellen enthielt, war etwa 30µm breit. Diese Zellverteilung ist am Beispiel der abgebildeten Kardiosphären gut erkennbar. Beim Schnitt durch die Hülle und den oberen Anteil der Sphäre zeigten sich die Zellkerne konzentriert nebeneinander liegend (Abb. 3-18A). Beim Schnitt durch das Zentrum befanden sie sich kreisförmig in der Peripherie (Abb. 3-18B). Am Ansatz der CS auf dem Objektträger zeigte sich ein ähnliches Bild wie auf der Kuppel der Sphäre (Abb. 3-18C). Damit wurde deutlich, dass sich die Zellen in der Peripherie der Kardiosphären befanden und dabei ein fast zellenloses Inneres umhüllten. Am Zellkulturboden befanden sich die Zellen, welche innerhalb eines Tages

61 54 ERGEBNISSE von der CS ausgewachsen waren. Sie besaßen einen größeren, weniger verdichteten Zellkern als die in der Kugel befindlichen Zellen (Abb. 3-18C). In den Kardiosphären waren die Zellkerne abgeflacht und kleiner.

62 55 ERGEBNISSE Immunzytochemie mit Cardiosphere Derived Cells (CDC) Vor der immunzytochemischen Färbung wurden die CDC auf unbeschichteten Kammerobjektträgern aufgebracht, wo sie schnell und stabil adhärierten. Nach spätestens zwei Tagen hafteten alle intakten Zellen am Zellkulturboden an. Die CDC konnten im Sinne einer Einzelzellschicht anwachsen und nach demselben Wachstumsverhalten wie in den Zellkulturflaschen einen Zellrasen bilden. Die Zelldichte war im Zentrum der Kulturfläche am höchsten und nahm zum Rand hin ab. Nach spätestens einer Woche konnten die Zellen fixiert und gefärbt werden Connexin43 Abb. 3-19: Connexin43 (rot); A-D: feine, punktförmige Aufhellungen im Zytoplasma und an Zellmembran der CDC unter Aussparung des Zellkerns (); D: dichtere Zellansammlung als in A-C Mit dem Antikörper gegen Connexin43 (Cx43) konnte an klar definierten Stellen im Zytoplasma der Zellen eine intensive Färbung erreicht werden. Hell fluoreszierende Punkte

63 56 ERGEBNISSE waren vor allem an der Zellmembran und zellkernnah im Zytoplasma lokalisiert. Die Zellkerne blieben ausgespart (Abb.3-19A-D). Die CDC waren also positiv für Cx c-kit Abb. 3-20: c-kit (rot); A: etwas dezentes, aber eindeutiges Fluoreszenzsignal aus dem Zytoplasma der CDC; B: etwas kräftigere Färbung, klar erkennbare Aussparung der Zellkerne Die durch den c-kit-antikörper erreichte Färbung war nicht überaus stark, aber dennoch intensiver als die Hintergrundfluoreszenz. Meist war das Fluoreszenzsignal unter Aussparung des Zellkerns eher diffus über die Zelle verteilt. Die Zellkonturen waren meistens nur unscharf erkennbar (Abb.3-20A). Das Fluoreszenzmuster glich dabei dem der Positivkontrolle an den HUVEC. Im Vergleich zu den Nabelschnurendothelzellen zeigte sich das Signal zwar etwas schwächer, befand sich aber noch deutlich über dem unspezifischen Hintergrund.

64 57 ERGEBNISSE Kardiales Troponin T Abb. 3-21: kardiales Troponin T (ctnt) (rot); A: starkes Fluoreszenzsignal der Zellkernmembran, des Zytoplasmas und des Zellkerns; B: klare Fluoreszenz der Zellkernmembran. (einige Zellkerne mit gekennzeichnet) Das herzmuskelspezifische Troponin T (ctnt) konnte an CDC mit einer besonders intensiven Fluoreszenz in der Nähe des Zellkerns lokalisiert werden. Diese Strukturen stellten vermutlich die Kernmembran und daran gelagerte zytoplasmatische Bereiche dar. In einigen Fällen schien der Zellkern ebenfalls durch ein kräftiges Leuchten auf eine nukleäre Anwesenheit dieses Proteins hinzuweisen (Abb.3-21A). Daneben war das ctnt auch im Zytoplasma nachweisbar. Die zytoplasmatische Lokalisation zeigte ein feingranuläres Muster mit leicht angedeuteter längs zum Zellkörper gerichteter Ausrichtung (Abb.3-21A+B) MEF2D Abb. 3-22: MEF2D (rot); A: intensive, granuläre Färbung der CDC-Zellkerne unter Aussparung der Nukleolen (); B: klar abgrenzbare Zellkerne im dichteren Zellrasen, ebenfalls unter Aussparung der Nukleolen ().

65 58 ERGEBNISSE Der Transkriptionsfaktor MEF2D zeigte sich immunzytochemisch etwas gröber granuliert und ausschließlich im Zellkern der CDC. Die Nukleoli blieben dabei ausgespart. (Abb.3-22A+B) Durch eine weitere Kernfärbung (nicht gezeigt) konnte die Lokalisation im gesamten Nukleus bestätigt werden. Auch im größeren Zellverband zeigte sich dasselbe Fluoreszenzmuster mit leuchtenden Nuklei und ausgesparten Nukleoli bei dichter aneinander liegenden CDC (Abb.3-20B) GATA4 Abb. 3-23: GATA4 (blau); A+B: intensiveres Signal in wenigen zellkernähnlichen Strukturen (), dort mehrere hell fluoreszierende Punkte; ansonsten schwache Fluoreszenz Neben einer wahrscheinlich eher unspezifischen diffusen Färbung ließen sich einige verstärkt fluoreszierende Zellkerne abgrenzen. Auch einige hell leuchtende kleine Punkte konnten in den Kernen gefunden werden. (Abb.3-23A+B) Einige Zellen können deswegen als positiv für GATA4 bezeichnet werden.

66 59 ERGEBNISSE nkx2.5 Abb. 3-24: nkx2.5 (grün); A+B: Nachweis von nkx2.5 nukleär (z.b. ) und im Zytoplasma Der Antikörper band, wie in der Produktinformation des Herstellers beschrieben, spezifisch an nukleäre und zytoplasmatische Epitope. Teilweise war eine Unterscheidung zwischen Zellkernen und rundlichen Zellschrottbestandteilen, welche in einigen Fällen lichtmikroskopisch festgestellt worden waren, nicht zweifelsfrei möglich, wobei nach der Form eher von unspezifischen Färbungen an Zellresten ausgegangen werden muss. Die hellen punktförmigen Strukturen befanden sich aber immer innerhalb der Zellen (Abb.3-24A+B) In wenigen Fällen zeigen die Kerne sogar weniger Signal, als die umgebenden Strukturen (ohne Darstellung) FOXH1 Abb. 3-25: FOXH1 (blau); gutes aber vermutlich unspezifisches Fluoreszenzsignal aus dem Zytoplasma der CDC, Zellkerne () ausgespart. Insbesondere zytoplasmatische Strukturen ließen sich durch diesen Antikörper, welcher eigentlich an Proteine im Zellkern binden sollte, anfärben. Regelmäßig blieben dabei die Zellkerne ausgespart, weshalb an der Spezifität dieses Antikörpers gezweifelt werden muss.

67 60 ERGEBNISSE Vimentin Abb. 3-26: Vimentin (blau) A-B: dezentes Signal des gesamten Zytoplasmas der CDC ohne Aussparung der Zellkerne (); zytoplasmatische, fasrige Strukturen u.a. in B erkennbar. Die immunzytochemische Anfärbung der CDC mit dem Vimentin-Antikörper erzeugte ein meist diskretes Signal, welches über das gesamte Zytoplasma der Zellen in gleichmäßiger Stärke vorhanden war. Fast alle Färbungen zeigten eine Signalstärke wie in Abb.3-26B. Der Kern war zwar meist abgrenzbar, zeigte aber ebenfalls ein schwaches Fluoreszenzsignal (Abb.3-26A). In einigen Fällen konnte die Ultrastruktur der Intermediärfasern erahnt werden (Abb.3-26B) CD34 Abb. 3-27: CD34 (blau); Konturen der CDC erkennbar Der ebenfalls in der Positivkontrolle mit THP-1-Zellen funktionierende Antikörper gegen CD34 zeigte ein schwaches Fluoreszenzsignal, welches die Konturen der Zellen sichtbar machte. Gegenüber der Negativkontrolle war also ein minimales Signal nachweisbar.

68 61 ERGEBNISSE CD45 Es konnte keine Immunreaktivität durch den in der Positivkontrolle funktionierenden CD45- Antikörper detektiert werden. Die Signalintensität lag bei allen Versuchen unter der Hintergrundfluoreszenz MDR Abb. 3-28: MDR (rot); diffuse und unspezifische Färbung, etwa in der Stärke der Negativkontrolle. Bei Verwendung des Anti-MDR-Antikörpers in der Immunzytochemie konnte kein kräftigeres Signal als in der Negativkontrolle detektiert werden. Der in der Immunhistochemie funktionierende Antikörper gegen MDR band dabei in Hintergrundstärke diffus und scheinbar gleichmäßig in allen Kompartimenten der CDC Zusammenfassung Die Zellen der CS zeigten folgende Antigene: Cx43, ctnt, c-kit und Vimentin; teilweise sehr viel schwächer waren die Marker nkx2.5, GATA4 und MEF2D nachweisbar. Unsere CDC zeigten folgende Antigene: Cx43, ctnt, c-kit und MEF2D; schwächer: Vimentin, nkx2.5, GATA4. In beiden Kulturphasen waren die Zellen negativ für CD34, CD45 und MDR.

69 62 ERGEBNISSE 3.3 Elektronenmikroskopie der Kardiosphären Die elektronenmikroskopischen Untersuchungen wurden durchgeführt, um die Ultrastruktur der Kardiosphären analysieren zu können. Die in der Immunzytochemie aufgefallene Hülle der CS war dabei von besonderem Interesse. Durch die Fluoreszenzfärbungen konnte nicht geklärt werden, ob Zellen oder extrazelluläre Matrix die Sphären umhüllte. Auch in der Lichtmikroskopie war diese hüllenartige Struktur beobachtet worden, und diente dort als wichtiges Unterscheidungsmerkmal zwischen Kardiosphären und anderen Zell- oder Zellschrotthaufen. Zur Untersuchung wurden die Sphären aus mehreren Kulturen abgesammelt, welche sich im Kulturalter stark unterschieden. Dennoch glichen sich die CS in ihrer im Folgenden beschriebenen Morphologie. Die elektronenmikroskopische Analyse ergab, dass die Kardiosphären umgeben waren von länglichen und schmalen Zellen mit langen Zellausläufern, welche die Kugeln in wenigen Zelllagen umfassten. Einige eher rundliche Zellen lagen noch innerhalb dieser Schale, andere hafteten von außen sichelförmig an den CS. Allgemein fielen große Zellkerne und zahlreiche Blasen unterschiedlichster Größe und Inhalt im Randbereich der Sphären auf. Neben den zahlreichen kleinen und dichten Zelleinschlüssen befanden sich dort auch größere Vesikel, die eine etwas hellere und fein granulierte Substanz enthielten. Teilweise waren in den Zellen mehrere Kerne mit dunklen Nukleolen und dunklem randständigem Chromatin nachweisbar (Abb.3-29A-D). Die Vermutung, dass sich im Inneren der Kardiosphären hauptsächlich nekrotische Areale befanden, konnte durch die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt werden. Nur im Randbereich der Kugeln konnten intakte Zellen detektiert werden. Im Zentrum fanden sich aufgeschwollene, asymmetrisch runde, sackartige Strukturen mit fein granuliertem, diffus verteiltem Inhalt. Daneben und davon eher verdrängt, lagen mögliche frühere Zellbestandteile und kleinere, dichtere Vesikel. Dazwischen befanden sich größere Mengen von extrazellulärer Matrix und faserige Formationen, welche wahrscheinlich verschiedenen Intermediärfilamenten entsprachen. Teilweise zeigten sich phagozytotisch anmutende Zellformationen am Übergang des von Zellen organisierten Rand der CS (Abb.3-29D). Die Größe der zellkernartigen Strukturen nahm von Innen nach Außen zu. Die Zellen im Randbereich besaßen meist abgeflachte, teilweise leicht unförmige Kerne (Abb.3-29C-F), welche einen großen Teil des Zytosols ausfüllten. Außerdem befand sich in den Zellen stets eine große Zahl unterschiedlichster Blasen, wobei es sich um Zellorganelle (z.b. Lysosomen), apoptotische Körperchen oder Vesikel nach Autophagie handeln könnte (Abb.3-29E+F).

70 63 ERGEBNISSE Abb. 3-29A: Überblick über eine CS mit Zellschrott und Vesikeln im Zentrum und umgebenden flachen Zellen; Zellkerne (*) mit randständig verdichtetem Chromatin (Vergrößerung ca. 400fach); B: Ausschnitt einer CS: von schmalen Zellen mit langen Zellausläufern () umgebene Vesikel und Zellschrott. (Vergrößerung ca. 1000fach); C: Ausschnitt einer CS: Umhüllende Zelle mit zwei Zellkernen (*), darauf aufgelagerter Zelle (), links davon verschieden dicht granulierter Zellschrott teilweise in Blasen organisiert. (Vergrößerung ca. 2000fach). D: Ausschnitt einer CS: randbildende flache Zellen mit teilweise mehreren Zellkernen (*); davon innerhalb eine scheinbar phagozytierende Zelle () mit zwei

71 64 ERGEBNISSE Zellkernen und jeweils gut erkennbarem Nukleolus; Zellschrott in großen Vesikeln (#); innerhalb der Zellen viele kleinere und dunklere Vesikel (Vergrößerung ca. 2000fach). E+F: Ausschnitt einer CS: randbildende Zellen () mit Zellkern (*) und vielen dunklen kleinen Vesikeln; (Vergrößerung ca. 2000fach) Es handelte sich also bei der fraglichen umhüllenden Struktur, welche die Kardiosphären umgab, um Zellen und deren Zellausläufer. Das vorher aufgefallene Fehlen von Zellkernen im Inneren der Sphären konnte durch den Nachweis der dort liegenden nekrotischen Areale erklärt werden. Je größer die CS waren, desto größer war das zellfreie Zentrum der Sphären. 3.4 Ergebnisse der Antikörper-Positivkontrollen Zur Sicherstellung der positiven Ergebnisse der immunzytochemischen Färbungen und um schlecht funktionierende Antikörper aussortieren zu können, wurden Positivkontrollen der Antikörper durchgeführt. Im Folgenden werden die Ergebnisse dieser Tests beschrieben. Nur die Antikörper mit nachgewieser korrekter Funktion wurden für die Endergebnisse der ICC verwendet Western Blot mit Anti-MEF2, Anti-nkx2.5 und Anti-GATA4 Im Rahmen der Positivkontrolle für die in der Immunzytochemie verwendeten Antikörper, wurden die vorwiegend nukleär lokalisierten Transkriptionsfaktoren mittels Western Blot getestet. Für die Tests wurden dafür geeignete Zell- und Zellkernlysate verwendet, da die Proteine nkx2.5, MEF2D und GATA4 nur in sich entwickelnden Kardiomyozyten exprimiert werden. Die vorher dargestellten Ergebnisse der Immunfluoreszenzfärbungen auf CS und CDC wurden ausschließlich mit den drei Antikörpern gegen diese nukleären Marker erreicht, nachdem sie im Western Blot ihre korrekte Funktion bewiesen hatten. Es wurden drei verschiedene nkx2.5 am vom Hersteller dafür vorgesehenen Zelllysat einer Zelllinie kontrolliert. Bei jedem Test wurde ein Proteinlysat einer unserer Kulturen mitanalysiert. Die Antikörper gegen nkx2.5(a-16) und nkx2.5(h-114) zeigten multiple Banden, welche nicht dem nach Herstellerangaben erwarteten Ergebnis entsprachen. Demgegenüber zeigte der nkx2.5-(n-19)-antikörper durch die Bindung an eine klar definierte Bande einen spezifischen und positiven Nachweis für dieses Protein im erworbenen Zelllysat. Gleichzeitig konnte ein nkx2.5-positiver Befund für das Lysat einer CDC-Kultur festgestellt werden. Die Analyse des MEF-2 (N-18)-Antikörpers erbrachte wiederholt unspezifische Befunde durch dessen Bindung an mehrere Banden mit verschiedensten Molekulargewichten. Der daraufhin stattdessen verwendete Antikörper gegen MEF2D zeigte ein klares positives und spezifisches

72 65 ERGEBNISSE Resultat in der Immunzytochemie, sodass auf eine weitere Testung dieses Antikörpers im Western Blot verzichtet wurde. Bei der Kontrolle des GATA4-Antikörpers der Firma Abcam zeigten sich wiederum unspezifische Bindungen an einer Vielzahl von Proteinen durch die Ausprägung multipler Banden. Demgegenüber konnte für den Anti-GATA4 der Firma Sigma eine spezifische Bindung an eine Bande nachgewiesen werden, wodurch er geeignet für aussagekräftige immunzytochemische Färbungen erschien. Im gleichzeitig getesteten Proteinlysat einer CDC- Kultur konnte die Anwesenheit des GATA4-Proteins ebenfalls festgestellt werden Immunhistochemie mit Anti-Vimentin, Anti-MDR, Anti- Troponin und Anti-c-kit Um die Funktion und Spezifität herzspezifischer Antikörper zu kontrollieren, wurden immunhistochemische Färbungen an in Paraffin eingebetteten Gewebsschnitten durchgeführt. Die Gewebeproben dafür stammten vom menschlichen rechten Vorhof. Dieser enhält bekanntermaßen kardiale Muskelzellen, Endothelzellen, Bindegewebe und wenige c-kit-positive Stammzellen. Deswegen erschien eine Kontrolle der im Normalfall an dieses Gewebe spezifisch bindenden Antikörper sinnvoll. Die Beurteilungen beziehen sich immer auch auf den Vergleich mit einer mitgeführten passenden Negativkontrolle. Die Testfärbungen mit dem erworbenen Anti-Troponin I zeigten nur schwache Reaktionen mit den Antigenen des Herzmuskelgewebes. Gegenüber der Negativkontrolle waren deswegen keine ausreichend starken Unterschiede erkennbar. Der bei den immunzytochemischen Färbungen besser funktionierende Antikörper gegen kardiales Troponin T (ctnt) wurde erfolgreich mittels ICC an Kryoschnitten eines humanen Herzohr-Explantats getestet. Bei Verwendung des Antikörpers gegen Vimentin konnten Bindegewebszellen und glatte Muskelzellen deutlich dargestellt werden. (siehe Anhang, Kapitel ) Da keine anderen Gewebebestandteile mitgefärbt waren, wurde von einem spezifischen Färbeverhalten ausgegangen. Die immunhistochemischen Färbungen mit dem ersten Antikörper gegen c-kit (CD117) waren in allen Fällen schwierig zu beurteilen, unter anderem auch wegen der geringen Anzahl von in diesem Gewebe anfärbbaren Zellen. Eine Testfärbung an interstitiellen Darmzellen erbrachte zwar einen möglicherweise positiven Befund, konnte aber am Herzgewebe und auf CS und CDC keine ähnlichen Ergebnisse erzeugen. Es wurde ein Versuch mit einem weiteren Anti-ckit-Antikörper durchgeführt, welcher in der immunzytochemischen Positivkontrolle auf HUVEC überzeugen konnte und für die endgültigen ICC-Färbungen eingesetzt wurde. Für die Funktionstestung des Anti-MDR-Antikörpers wurden vom Pathologischen Institut freundlicherweise in Paraffin gebettete Gewebeschnitte aus Kolonkarzinom zur Verfügung gestellt. Dieses bekanntermaßen für MDR-1 positive Gewebe zeigte keine deutlich spezifische

73 66 ERGEBNISSE Immunreaktion mit den anfangs getesteten Antikörpern. Demgegenüber entstand bei Verwendung des Anti-MDR der Firma Sigma ein kräftigeres und klarer lokalisierbares Signal, sodass dieser für die endgültigen Analysen eingesetzt werden konnte. (siehe Anhang, Kapitel ) Immunzytochemie an THP-1 mit Anti-CD34 und Anti-CD45 Die Zellen der monozytisch leukämischen Zelllinie THP-1 sind bekanntermaßen positiv für CD34 und CD45 (s.o.). Die auch bei unseren CS und CDC eingesetzten Antikörper gegen diese Antigene funktionierten einwandfrei, was durch eine intensive Fluoreszenz sichtbar wurde. (siehe Anhang, Kapitel und Kapitel ) Die mitgeführten Negativkontrollen blieben negativ Immunzytochemie an HUVEC mit Anti-c-kit Zur Positivkontrolle für den Antikörper gegen die membranständige Rezeptor-Tyrosinkinase c- kit (CD117) wurden HUVEC der zweiten Passage verwendet. Die Nabelschnurendothelzellen exprimieren diesen Wachstumsfaktorenrezeptor auf ihrer Zellmembran. Mit dem getesteten Anti-c-kit-Antikörper von Millipore konnte ein starkes und spezifisches Ergebnis erzeugt werden, sodass er auch für die immunzytochemische Analyse der CS und CDC eingesetzt werden konnte. (siehe Anhang, Kapitel ) Immunzytochemie am Explantat mit Anti-cTnT Mit dem Antikörper gegen kardiales Troponin T (ctnt) konnten in den CS und CDC starke Fluoreszenzsignale detektiert werden. Ungewöhnlich war dabei die kernnahe Lokalisation dieses Muskelproteins. Um die Funktionsfähigkeit des Antikörpers zu überprüfen, wurde deshalb eine Positivkontrolle an Kryoschnitten eines frisch gewonnenen menschlichen Herzmuskelexplantates angefertigt. Nach der immunzytochemischen Färbung zeigte sich im Myokard eine kräftige, spezifische Fluoreszenz im Zytosol der Kardiomyozyten. Die Zellkerne blieben davon ausgespart. Im Längsschnitt zeigte sich die quergestreifte Musterung, im Querschnitt ließ sich eine Cohnheimsche Felderung erahnen. Neben den Kardiomyozyten im Myokard kamen einzelne Zellen im Epikard ähnlich kräftig fluoreszierend zur Darstellung (Abb.3-30A+B). Die Negativkontrollfärbungen blieben gänzlich ohne rotes Fluoreszenzsignal.

74 67 ERGEBNISSE Abb. 3-30A+B: Randbereich eines Explantats. ctnt rot fluoreszierend aus dem Zytoplasma der Kardiomyozyten im Myokard und aus einzelnen Zellen im Epikard (); grüne Autofluoreszenz des extrazellulären Materials. (Vergrößerung 100fach) 3.5 Zytokine in den Überständen der Kulturen Aus den Explantaten zweier Patienten wurden im Verlauf Überstände (d.h. durch die Zellen konditionierte Nährmedien) von Explantatkulturen, Kardiosphärenkulturen und CDC-Kulturen gewonnen, eingefroren und schließlich durchflusszytometrisch gemessen. Damit wurde ein erster Einblick auf das Expressionsverhalten dieser Zellen bezüglich bestimmter Botenstoffe möglich. Folgende Zytokine wurden in den Überständen der Kulturen gesucht: MCP-1, IL-6, IL-8, t-pa, svcam-1, sp-selektin und scd40-l. Die ersten Überstände wurden schon kurz nach der Anlage der Explantatkulturen entnommen, die letzten nach der zweiten Passage der CDC-Kultur. Es wurden statistische Tests durchgeführt, um signifikante Unterschiede der Zytokinkonzentrationen zwischen den Kulturphasen und Zellkulturmedien darzustellen. Durch den Shapiro-Wilk-Test konnte festgestellt werden, dass die aus der Durchflusszytometrie erhaltenen Werte bis auf wenige Ausnahmen nicht normalverteilt waren. Deshalb wurde in diesen Fällen der Mann-Whitney-U-Test angewandt. Durch den Vergleich der beiden Kulturen mit der einseitigen ANOVA für Rangsummen nach Kruskal-Wallis konnte gezeigt werden, dass sich die Varianz der MFI-Werte (mittlere Fluoreszenzintensität) aller Zytokine zwischen den Zellkulturen nicht signifikant zur Varianz innerhalb der Kulturen unterschied. Daraus ließ sich folgern, dass die zwei Gruppen der Messergebnisse vergleichbar waren. Zusätzlich ließ sich bei der Betrachtung der graphischen Darstellungen der einzelnen Kulturen ein gleichartiger Verlauf erahnen. Die Zytokine zeigten

75 68 ERGEBNISSE eine von der Kulturphase und -alter abhängige mittlere Fluoreszenzintensität, die in beiden Kulturen ziemlich synchron auftrat. Grundsätzlich konnte festgestellt werden, dass die wiederholt durchflusszytometrisch gemessenen Werte der nicht-konditionierten Nährmedien einen gleichbleibenden Standard darstellten. CEM und CGM wurden während der hier untersuchten Zellkultur aus standardisierten Medien, Medienzusätzen und FCS aus identischen Chargen hergestellt. Die Nährmedien stellten den Ausgangswert für die Beurteilung der von Zellen verursachten Zytokinkonzentration in den Überständen dar. Tatsächlich befanden sich die MFI-Werte der nicht mit Zellen in Kontakt gekommenen Medien nahe dem Nullpunkt. Bei der Untersuchung der Zytokine t-pa, MCP-1, IL-6 und IL-8 unterschieden sich die Zellkulturüberstände in ihrer MFI und Zytokinkonzentration signifikant von den unbehandelten Medien. Bei der Analyse der Botenstoffkonzentrationen zeigten sich in der Kultur 1 häufig höhere Werte als in der Kultur 2, wobei sich beide im Kulturverlauf dennoch weitgehend synchron entwickelten. Bei der Darstellung der einzelnen Zytokinvorkommen sind in den Abbildungen A die Mittelwerte aus allen drei Kulturphasen und zwei Nährmedien zum Vergleich aufgeführt und mögliche signifikante Unterschiede gekennzeichnet. In den Abbildungen B sind die gewonnenen Daten der zwei Kulturen getrennt abgebildet. Die ermittelten Werte aus den Explantatkulturen V.Ex bis VII.Ex wurden nicht in die Darstellung C aufgenommen, weil diese Messwerte bereits durch Erntemaßnahmen zur Anlage von CS-Kulturen verfälscht sein dürften. Die Ergebnisse der Zytokine IL-6 und IL-8 sind mit ihrer mittleren Fluoreszenzintensität abgebildet, da hier durch einige unerwartet hohe Werte keine exakte Berechnung der Konzentrationen aus der MFI möglich war. Ansonsten erlaubte der Vergleich mit den mitgemessenen Standardkonzentrationen einen exakten Rückschluss auf die Zytokinkonzentrationen.

76 69 ERGEBNISSE t-pa In jedem der Überstände aus den Zellkulturen konnte eine signifikant höhere Konzentration des Zytokins t-pa ermittelt werden als in den unverwendeten, nicht konditionierten Zellkulturmedien, welche nur Werte in der Nähe des Nullpunktes erreichten. Je nach Kulturphase ließen sich unterschiedlich hohe Spiegel des Zytokins nachweisen. In den Überständen der Explantatkulturen herrschte noch die geringste Konzentration, während die höchste in den CS-Kulturen zu finden war. In den Kulturmedien der CDC konnte ein Absinken des Zytokinspiegels festgestellt werden (Abb.3-31A). Beide Kulturen zeigten ähnliche Verläufe der Konzentrationsschwankungen, wobei Kultur Nr. 2 in der Kardiosphärenphase höhere Werte erreichte (Abb.3-31B). Die zusammengefasste und zeitlich detailliertere Darstellung (Abb.3-31C) zeigt den Anstieg der t-pa-konzentration am Beginn jeder Kulturphase und den Abfall derselben besonders am Ende der CS und CDC-Kulturen. A Konzentration in pg/ml B C Konzentration in pg/ml CEM CGM Konzentration in pg/ml * ** CEM Explantatkulturen CGM CS-Kulturen CDC-Kulturen I. Ex Blau: Kultur Nr. 1 Grün: Kultur Nr. 2 II. Ex III. Ex IV. Ex V. Ex VI. Ex VII. Ex * I. CS * II. CS III. CS * IV. CS I. CDC II. CDC III. CDC Abb. 3-31: Konzentration von t- PA in den Überständen der Zellkulturen in Abhängigkeit von Kulturphase und -alter In römischen Ziffern ist das Alter der Kulturen in Wochen angegeben, dazu die Phase der Kultur (Ex: Explantatkultur, CS: Kardiosphären; CDC: von Kardiosphären abgeleitete Zellen) A: Vergleich alleine nach Kulturphasen und Medien; B: Rohdaten der beiden untersuchten Zellkulturen einzeln; C: Vergleichbare Werte aus B im zeitlichen Verlauf gemeinsam dargestellt; t-pa-konzentration in pg/ml; MW±SEM; signifikant nach Mann-Whitney-Wilcoxon *p<0,05; **p<0, CEM CGM I. Ex II. Ex III. Ex IV. Ex I. CS II. CS III. CS IV. CS I. CDC II. CDC III. CDC

77 70 ERGEBNISSE IL-6 Auch das Zytokin IL-6 war in jedem der Kulturüberstände in signifikant höherer Konzentration vorhanden als in den unverwendeten Nährmedien. Die gemessene mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) fiel in einigen Fällen unerwartet hoch aus, sodass daraus die Zytokinkonzentrationen nicht genau berechnet, sondern nur geschätzt werden konnten. Auf die Darstellung von Schätzwerten wurde aber verzichtet und stattdessen die gemessenen MFI-Werte aufgetragen. Im Gegensatz zum Verlauf des t-pa-spiegels erreichte IL-6 bereits in den Explantatkulturen die höchsten Werte, gefolgt von einem Abfall in den CS-Kulturen und einem weiteren Anstieg in den CDC-Kulturen (Abb.3-32A). Bei Betrachtung der einzelnen Werte (Abb.3-32B) zeigte die MFI der Kultur 2 gegenüber Kultur 1 einen verzögerten und kürzeren Anstieg in der Explantat- Phase und einen schnelleren, ebenfalls kurzen Anstieg in der CS-Phase. Wiederum zeigt die zeitlich detailliertere Darstellung (Abb.3-32C) einen anfänglichen Anstieg der IL-6-Konzentration am Beginn jeder Kulturphase und einen Abfall an deren Ende. A MFI B * * * CEM Explantatkulturen CGM CS-Kulturen CDC-Kulturen * * Blau: Kultur Nr. 1 Grün: Kultur Nr. 2 Abb. 3-32: Konzentration von IL- 6 in den Überständen der Zellkulturen in Abhängigkeit von Kulturphase und alter Beschriftung und Anordnung wie in Abb.3-29, aber hier jeweils auf die Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) bezogen. MW±SEM; signifikant nach Mann-Whitney-Wilcoxon *p<0,05; **p<0,01 MFI C MFI CEM CGM III. CS I. Ex II. Ex III. Ex IV. Ex I. CS II. CS IV. CS I. CDC II. CDC III. CDC CEM CGM I. Ex II. Ex III. Ex IV. Ex V. Ex VI. Ex VII. Ex I. CS II. CS III. CS IV. CS I. CDC II. CDC III. CDC

78 71 ERGEBNISSE IL-8 Das Zytokin IL-8 war ebenfalls in jedem der Überstände der Zellkulturen in signifikant höherer Konzentration vorhanden als in den unverwendeten Zellkulturmedien. Dieses Mal konnten keine signifikanten Konzentrationsunterschiede zwischen den einzelnen Kulturphasen festgestellt werden (Abb.3-33A). Beide Kulturen zeigten ähnliche Verläufe der Konzentrationsschwankungen. Ähnlich der Werte von IL-6 zeigt die MFI der Kultur 2 gegenüber der Kultur 1 einen (bis auf einen Ausreißer) verzögerten und kürzeren Anstieg in der Explantat-Phase und einen schnelleren, ebenfalls kurzen Anstieg in der CS-Phase der Kultur Nr. 2 (Abb.3-33B). In Darstellung C (Abb.3-33C) zeigt sich innerhalb der Explantatphase ein Anstieg der IL-8-Konzentration und einen gleichmäßigen Abfall derselben innerhalb der CS-Kulturen. A pg/ml * * CEM Explantatkulturen CGM CS-Kulturen CDC-Kulturen ** Abb. 3-33: Konzentration von IL-8 in den Überständen der Zellkulturen in Abhängigkeit von Kulturphase und alter Beschriftung und Anordnung wie in Abb.3-29, hier wieder auf die Konzentration des IL-8 in pg/ml bezogen. MW±SEM; signifikant nach Mann-Whitney-Wilcoxon *p<0,05; **p<0,01 B Konzentration in pg/ml Blau: Kultur Nr. 1 Grün: Kultur Nr CEM CGM I. Ex II. Ex III. Ex IV. Ex V. Ex VI. Ex VII. Ex I. CS II. CS III. CS IV. CS I. CDC II. CDC III. CDC C Konzentration in pg/ml CEM CGM I. Ex II. Ex III. Ex IV. Ex I. CS II. CS III. CS IV. CS I. CDC II. CDC III. CDC

79 72 ERGEBNISSE MCP-1 Auch das Zytokin MCP-1 war in jedem der Überstände aus den Zellkulturen in signifikant höherer Konzentration vorhanden als in den Nährmedien. In den konditionierten Medien der Explantatkulturen herrschte bereits die höchste Konzentration, während in den CS-Kulturen die niedrigsten Werte zu finden waren. In den Kulturmedien der CDC stieg der Zytokinspiegels nur wenig an (Abb.3-34A). Beide Kulturen zeigten fast identische Verläufe der Konzentrationsschwankungen (Abb.3-34B). Die zusammengefasste und zeitlich detailliertere Darstellung (Abb.3-34C) zeigt einen starken Anstieg der MCP-1-Konzentration im Verlauf der Explantat-Kulturphase. Während der CS-Phase zeigt sich ein gleichmäßiger Abfall der Messwerte. Wegen der teilweise hohen Werte wurden die Werte an einer logarithmischen Skala aufgetragen. Die scheinbar großen Differenzen zwischen den Kulturphasen (Abb.3-34A) sind, bedingt durch die großen Konzentrationsunterschiede innerhalb der Phasen (Abb.3-34B und C), nicht signifikant. A pg/ml B Konzentration in pg/ml * * CEM Explantatkulturen CGM CS-Kulturen CDC-Kulturen * Blau: Kultur Nr. 1 Grün: Kultur Nr. 2 Abb. 3-34: Konzentration von MCP-1 in den Überständen der Zellkulturen in Abhängigkeit von Kulturphase und alter Beschriftung und Anordnung wie in Abb.3-29, hier wieder auf die Konzentration des MCP-1 in pg/ml bezogen. In B und C wurden die Werte in eine logarithmische Skala aufgetragen. MW±SEM; signifikant nach Mann-Whitney-Wilcoxon *p<0,05; **p<0, CEM CGM I. Ex II. Ex III. Ex IV. Ex V. Ex VI. Ex VII. Ex I. CS II. CS III. CS IV. CS I. CDC II. CDC III. CDC C Konzentration in pg/ml CEM CGM I. Ex II. Ex III. Ex IV. Ex I. CS II. CS III. CS IV. CS I. CDC II. CDC III. CDC

80 73 ERGEBNISSE Nicht nachgewiesen: svcam-1, sp-selektin, scd40-l In keinem der Überstände zeigte sich gegenüber den Nährmedien eine signifikant höhere Konzentration von svcam-1, womit die Expression dieses Zytokins in keiner Kulturphase nachgewiesen werden konnte (Abb.3-35A). Bei den gefundenen Werten dürfte es sich um Zufallswerte handeln (Abb.3-35B und C). A * 100 * ng/ml 10 1 CEM Explantatkulturen CGM CS-Kulturen CDC-Kulturen B Konzentration in ng/ml Blau: Kultur Nr Grün: Kultur Nr CEM CGM I. Ex II. Ex III. Ex IV. Ex V. Ex VI. Ex VII. Ex I. CS II. CS III. CS IV. CS I. CDC II. CDC III. CDC Abb. 3-35: Konzentration von svcam-1 in den Überständen der Zellkulturen in Abhängigkeit von Kulturphase und alter Beschriftung und Anordnung wie in Abb.3-29, hier wieder auf die Konzentration des svcam-1 in ng/ml bezogen. Es bestehen keine Signifikanzen zwischen den Medien und den Kulturüberständen, womit ein sinnvolles Ergebnis vorerst ausgeschlossen ist. MW±SEM; signifikant nach Mann- Whitney-Wilcoxon *p<0,05; **p<0,01 C Konzentration in ng/ml CEM CGM I. Ex II. Ex III. Ex IV. Ex I. CS II. CS III. CS IV. CS I. CDC II. CDC III. CDC

81 74 ERGEBNISSE Noch eindeutiger fiel das Ergebnis bei den beiden Zytokinen scd40-l und sp-selektin aus: Es konnte in keiner Analyse eine messbare scd40-l-konzentration nachgewiesen werden. Die vom Auswertprogramm ermittelten Konzentrationen waren alle <=0pg/mL. Daraus kann gefolgert werden, dass die gezüchteten Zellen kein scd40-l sezernierten. Bei der Suche nach sp-selektin zeigte bereits die Darstellung der mittleren Fluoreszenzintensität, dass dieses Zytokin in den Kulturüberständen und Zellmedien nicht nachgewiesen werden konnte. Somit waren die Zellen unabhängig von Kulturphase und -alter negativ für eine sp-selektin-produktion. Die Überstände enthielten also MCP-1, IL-6, IL-8 und t-pa. svcam-1, scd40-l oder sp-selektin konnte nicht nachgewiesen werden.

82 75 DISKUSSION 4 DISKUSSION Ziel dieser Arbeit war eine Evaluation der von Messina et al. und Smith et al. vorgestellten Kulturmethode zur Isolation und Vermehrung von menschlichen kardialen Progenitorzellen. 124, 169 Zudem sollten die nach dieser Methode hervorgebrachten Kardiosphären und die davon abgeleiteten Zellen (CDC) durch die Untersuchung ihrer morphologischen Erscheinung und die Überprüfung auf verschiedene Differenzierungsmerkmale charakterisiert werden. Aus kleinen, vom rechten Herzohr stammenden Explantaten konnten Zellkulturen angelegt werden, aus denen durch enzymatische und selektive Ablösung kardiosphärenbildende Zellen entnommen werden konnten. Daraus bildeten sich im weiteren Verlauf Kardiosphären, welche sich unter anderen Kulturbedingungen wiederum zu CDC weiterentwickelten. Die Proliferation und grobe Morphologie wurde regelmäßig lichtmikroskopisch kontrolliert. Durch immunzytochemische Methoden wurden feinere morphologische Eigenschaften und Differenzierungsmerkmale analysiert, welche auf Herkunft und Entwicklung der Zellen hinweisen sollten. Um die Zahl der Artefakte dabei gering zu halten, kam ein konfokales Laserscanningmikroskop zum Einsatz. Zur Sicherung der Ergebnisse aus der Immunzytochemie wurden mit verschiedenen Methoden (ICC, IHC, WB) Negativ- und Positivkontrollen der verwendeten Antikörper durchgeführt. Um einige Strukturen der Kardiosphären detailliert erkennen zu können, wurden diese Zellkugeln auch im Elektronenmikroskop untersucht. Die folgenden Erkenntnisse konnten bei dieser Arbeit gewonnen werden: - Durch die angewandte Kulturmethode ist die Isolation und Expansion von potentiellen kardialen Progenitorzellen möglich - Die Zellen der Kardiosphären und die CDC sind positiv für c-kit, aber negativ für MDR - Zellen in Kardiosphären und CDC exprimieren herzmuskelzellspezifische Marker: ctnt, Connexin43, MEF2D, nkx2.5 und GATA4 - CS sind negativ für CD34 und CD45, CDC sind negativ für CD45 und schwach positiv für CD34 - Die Kardiosphären enthalten im Inneren zerfallene Zellreste nach Nekrose - Die Kardiosphären werden von umhüllenden Zellen umfasst - Die CS und CDC lassen sich von Fibroblasten abgrenzen - CS und CDC sezernieren die Zytokine MCP-1, IL-6, IL-8 und t-pa; sie sezernieren kein svcam-1, sp-selectin oder scd40-l

83 76 DISKUSSION 4.1 Die Isolation und Expansion von kardialen Progenitorzellen ist reproduzierbar durchführbar Bei der Zellkultur mit Explantaten, CS und CDC wurde die Methode von Smith et al. angewendet, deren Grundlage das Verfahren von Messina et al. gewesen war. 124, 169 Nur geringe Modifikationen wurden daran vorgenommen. So wurden den Medien keine zusätzlichen Wachstumsfaktoren wie bfgf, EGF, Cardiotrophin, Thrombin oder B27 zugegeben, da es in einem selbst durchgeführten Test keinen Wachstumsvorteil gegenüber den unter Kapitel beschriebenen, auf FCS basierenden Medien erbrachte. Durch die Verwendung der weitgehend identischen Zellkulturmethode wie bei Smith et al. wurde die Evaluation dieser Methode und ein Vergleich der daraus erzielten Ergebnisse möglich. Die hier dargestellten Resultate spiegeln neben neueren Erkenntnissen auch die von Messina und Smith dargestellten Ergebnisse wieder. Die von ihnen beschriebene Morphologie der Zellen und Kardiosphären, deren immunzytochemische Eigenschaften und Wachstumsverhalten konnte durch die hier 124, 169 geschilderten Ergebnisse sehr genau reproduziert werden. Die hier ausgewählte Entnahmestelle der Explantate aus dem rechten Vorhof hat sich durch andere Untersuchungen als sehr günstig erwiesen, da sich dort die meisten c-kit-positiven Zellen im Herzen befinden sollen. 79 Messina et al. hatten sich nicht auf eine bestimmte Entnahmestelle 124, 169 beschränkt, Smith et al. erhielten die Biopsien aus dem Septum des Herzens. Leider mussten bei der Wachstumsgeschwindigkeit und der Fähigkeit, eine ausreichende Zahl der gesuchten Zellen zu bilden, größere interindividuelle Unterschiede festgestellt werden. Die Kulturdauer variierte zwischen 8 Wochen und 4 Monaten von der Anlage der Explantate bis zur zweiten Passage der CDC. Die Geschwindigkeit des Zellwachstums hing direkt proportional mit der zahlenmäßigen Entwicklung der speziellen, gesuchten Zelltypen zusammen. Das hieß, dass aus schnell wachsenden Kulturen auch viele CS und CDC gewonnen werden konnten. Das lässt einen engen Zusammenhang zwischen der Proliferation und der dafür notwendigen Zelldifferenzierung vermuten. Deswegen konnten auch bestimmte morphologische Kennzeichen - wie sie die kardiosphärenbildenden Zellen, die CS und die CDC aufwiesen - Hinweise auf eine proliferationsfördernde Differenzierung geben. Welche Einflüsse für die Ausprägung dieser oben genannten interindividuellen Unterschiede eine Rolle spielten, ist wegen der vielen möglichen Störfaktoren unklar. Der Zusammenhang zwischen äußeren Einflüssen und der Anzahl von proliferierenden kardialen Stammzellen (CSC) wurde in früheren Veröffentlichungen dargestellt. Die Zahl der CSC ist anscheinend im rechten Vorhof, bei Frauen, bei Hypertonie und bei bestimmten Formen der Herzinsuffizienz erhöht. Keinen nennenswerten Einfluss haben das Alter und die üblicherweise bei Herzinsuffizienz eingesetzten Medikamente. 79 Nach einem Herzinfarkt findet sich vor allem in

84 77 DISKUSSION den Grenzzonen zum infarzierten Gewebe eine erhöhte Anzahl von CSC. 190 Als CSC werden in 12, 44, 126, 186 erster Linie die c-kit-positiven Zellen im Herzmuskel bezeichnet. Vermutlich hat die Behandlung mit Trypsin und Versene bei der Loslösung der kardiosphärenbildenden Zellen von der Explantat-Kultur ebenfalls einen positiven Effekt auf die Entwicklung der zu isolierenden Zellen. Trotz identischer Behandlung konnte nämlich bei einer zweiten Ablöseprozedur innerhalb einer Woche ein sehr viel besseres Ergebnis erzielt werden, d.h. es fanden sich in der darauf folgenden CS-Kultur sehr viel mehr Kardiosphären. Vor der immunzytochemischen Analyse wurden die Zellen mit Accutase abgelöst, da es laut Herstellerangaben weniger Schäden an Zellen und Oberflächenmolekülen bewirkt. Inwieweit der Einsatz unterschiedlicher Enzyme Einfluss auf die Ergebnisse hat, bleibt aber unklar. Die von Messina et al. und Smith et al. beschriebenen morphologischen und immunzytochemischen Eigenschaften der CS und CDC konnten bei den hier vorgestellten Untersuchungen nachvollzogen werden und werden im Folgenden beschrieben. Ob es sich bei den gefundenen Zellen tatsächlich um kardiale Progenitorzellen handelt, ist bisher noch nicht mit letzter Sicherheit nachgewiesen worden. Deshalb finden sich neben vielen Befürwortern. 12, 41, 42, 60, 114, 124, 125, 169 auch einige ernstzunehmende Zweifler dieser These. 6, 155, 204 Im Folgenden werden nun auch die durch eigene Versuche gewonnenen Argumente für die Existenz kardialer Progenitorzellen in CS- und CDC-Kulturen aufgeführt. 4.2 CS und CDC sind positiv für c-kit und negativ für MDR Durch die Immunzytochemie konnte nachgewiesen werden, dass Kardiosphären und die davon abgeleiteten Zellen den Stammzellfaktorrezeptor c-kit (CD117) exprimieren. Die korrekte Funktionsweise des verwendeten Antikörpers gegen diesen Rezeptor wurde durch die immunzytochemischen c-kit-färbungen an HUVEC kontrolliert. Diese Nabelschnurendothelzellen sind bekanntermaßen positiv für CD Um unspezifische Bindungen bei der Analyse im Fluoreszenzmikroskop ausblenden zu können, wurden, wie bei allen Färbungen üblich, Negativkontrollen mitgeführt. Dafür wurden anstatt des Primärantikörpers Normalseren der gleichen Spezies eingesetzt. Der Nachweis von c-kit auf CS und CDC bildet die wichtigste Grundlage für die Charakterisierung der kultivierten Zellen als Stammzellen. Demgegenüber zeigte sich bei wiederholten kontrollierten Versuchen an CS und CDC kein positives Signal für MDR. Auch Modifikationen in der Methodik hinsichtlich Fixation, Inkubationszeiten, Konzentration und Austausch von Antikörpern, Blockierungs- und Permeabilisierungsschritten an vielen verschiedenen Zellkulturen konnten keine Expression des für viele Stammzellen typischen ABC-Transporters nachweisen. Die einwandfreie Funktion des zuletzt verwandten Anti-MDR-Antikörpers wurde an immunhistochemisch gefärbten

85 78 DISKUSSION Kolonkarzinomschnitten festgestellt. Aufgrund dieser Ergebnisse wird daran gezweifelt, dass CS und CDC einen MDR-Transporter exprimieren. Auch andere Arbeitsgruppen kamen zu ähnlichen Ergebnissen. Smith et al. konnten keine MDR-1-positiven Zellen aus der Kultur nachweisen. Damit unterschieden sich die CS und CDC von in vivo detektierten kardialen Stammzellen. 169 Davis et al. stellten in ihrer Arbeit fest, dass nur 5% der Zellen im Zentrum der CS positiv für MDR waren. Nur die Hülle der Sphären zeigte bei ihnen ein kräftigeres Signal. 42 Im Gegensatz zu Davis et al. konnten im Rahmen dieser Arbeit auch in der Peripherie der CS keine MDR-Epitope nachgewiesen werden. 42 In den meisten Veröffentlichungen werden die kardialen Stammzellen (CSC) über die Marker MDR-1, c-kit, sca-1 oder isl-1 identifiziert und definiert (siehe 1.4.4). 12, 15, 28, 155, 158, 182, 189 MDRpositive Zellen konnten aber nur in vivo detektiert oder direkt aus dem Herzmuskel isoliert werden. 15, 158, 182, 189, 190 Die Selektion dieser nur sehr vereinzelt auftretenden Zellen erfolgte maschinell unterstützt durch MACS oder FACS. Erst danach erfolgte in wenigen Fällen die Anlage einer kurzen Zellkultur mit diesen gewonnenen Zellen, wobei MDR nach 7 Tagen noch 15, 182 nachweisbar war. Entweder besaßen die durch die Zellkultur gewonnenen Zellen eine andere Herkunft als die in vivo detektierten oder maschinell selektionierten Progenitorzellen, oder sie verloren ihren MDR-Marker im Laufe der Kultur, sodass dieser Transporter bei CS und CDC nicht mehr exprimiert wurde. Die Erkenntnis von Tomita et al., dass das MDR-1-Antigen spätestens nach zweiwöchiger Kultur nicht mehr auf Side-Population-CDC zu finden ist, deutet vielleicht eher auf die zweite Vermutung hin. 185 Um diese Stammzellen in Zukunft leichter identifizieren und detektieren zu können, müssten passendere Antikörper gefunden werden, die spezifischer an kardiale Progenitorzellen binden. Die bisher verwendeten Stammzellmarker (c-kit, MDR) stammen aus der Forschung um Blutstammzellen und finden sich auch in verschiedenen Tumoren. Möglichweise sind aber die Epitope von CS-Zellen und CDC nicht identisch mit den Epitopen an anderen bereits bekannten Geweben. Dies stellt möglicherweise auch eine Erklärung dar für die schwachen oder nicht eindeutigen Ergebnisse bei der Detektion anderer Proteine. 4.3 Die Zellen der Kardiosphären und die CDC exprimieren herzmuskelzellspezifische Marker Das exklusiv im Herzmuskel exprimierte kardiale Troponin T (ctnt) konnte immunzytochemisch in einigen Zellen der Kardiosphären und in stärkerem Maße in den davon abgeleiteten Zellen (CDC) dargestellt werden. Dies könnte auf eine Zunahme der ctnt- Expression im Laufe der Entwicklung der kardialen Progenitorzellen hindeuten.

86 79 DISKUSSION Zellen der CS zeigten sich positiv für das ctnt. Einige unregelmäßig runde Strukturen, die sich häufiger am Rand der Sphären befanden, zeigten eine besonders intensive Färbung. Am wahrscheinlichsten handelt es sich dabei um Kernmembranen und daran gelagerte zytoplasmatische Bereiche. Der Rest des Zytoplasmas enthielt weniger ctnt. Stattdessen fiel eine unklare Fluoreszenz auch in den Zellkernen auf. Als Gründe für diesen unerwarteten Befund wurde eine unspezifische Bindung des Antikörpers diskutiert, was aber durch die Positivkontrolle an humanem Herzmuskelgewebe ausgeschlossen wurde. Des Weiteren könnte eine Überstrahlung aus der intensiv fluoreszierenden kernnahen Region eine nukleäre Lokalisation dieses Antigens vortäuschen, was aber bei der einwandfreien Funktion des konfokalen Mikroskops unwahrscheinlich ist. Ob sich ctnt tatsächlich auch im Zellkern befindet, kann nach diesen Ergebnissen zumindest nicht ausgeschlossen werden. Andere Arbeitsgruppen konnten bereits die Anwesenheit des kardialen Troponin I bei kardialen 12, 17, 124, 169 Progenitorzellen nachweisen. Die ctnt-icc-färbungen der CDC zeigten weitgehend ähnliche Ergebnisse wie die der CS. Im Gegensatz zu den Kardiosphären war hier aber ein deutlich größerer Anteil der Zellen positiv für Kardiales Troponin T. Auch in den CDC hier fiel eine intensivere Fluoreszenz in der Nähe des Zellkerns auf, welche wahrscheinlich ebenfalls die Kernmembran und nahe liegende zytoplasmatische Bereiche darstellte. Wiederum schien dieses Protein in einigen Fällen auch im Zellkern anwesend zu sein. Die Ursache für diese ungewöhnliche Lokalisation bleibt unklar. Ob es sich um ein Artefakt handelt oder ob sich ctnt tatsächlich im Zellkern befindet, kann wie beim vergleichbaren Ergebnis in den Kardiosphären mit diesem Verfahren nicht zweifelsfrei entschieden werden. Etwas weniger kräftig zeigte sich die Anwesenheit des kardialen Troponin T auch im restlichen Zytosol. Dort ließ sich teilweise ein feingranuläres Muster mit leicht angedeuteten längs zum Zellkörper gerichteten Strukturen erahnen. Die zellkernnahe Lokalisation des kardialen Troponin T könnte darauf hinweisen, dass die Entwicklung der Muskelfibrillen bei der ersten Differenzierung der Zelle zuerst in der Nähe des Zellkerns stattfindet. Zumindest das ctnt- Epitop kann in der Nähe des Zellkerns nachgewiesen werden. Dort befindet sich auch das endoplasmatische Retikulum, in dem ein großer Teil der zellulären Proteinsynthese stattfindet. Andere Arbeitsgruppen konnten die Expression des kardialen Troponin I bei verschiedenen kardialen Progenitorzellen, bei Kardiosphären und CDC nachweisen. ctnt wurde in diesem 2, 12, 17, 124, 169 Zusammenhang zum ersten Mal detektiert. Bei der Durchführung der Positivkontrolle des Anti-cTnT an adultem humanem Herzgewebe aus dem rechten Vorhof fand sich Troponin-T nicht nur im Myokard, sondern auch in epikardial gelegenen Zellen. Diese waren kleiner, rundlicher und wiesen eine für Kardiomyozyten

87 80 DISKUSSION untypische Morphologie auf. Es handelte sich dabei möglicherweise um die schon häufiger im 11, 45, 54, 66, 154, 163, 191 Epikard detektierten, multipotenten Vorläuferzellen des Herzens. Sowohl in Kardiosphären als auch an CDC konnte mit einer immunzytochemischen Färbung gegen Connexin 43 ein intensives, spezifisches Signal detektiert werden. Es fielen zahlreiche kleine hell leuchtende Plaques auf, die an der Zellmembran und im Zytoplasma der CDC lokalisiert waren, wobei besonders in Zellkernnähe kräftige Fluoreszenzsignale beobachtet werden konnten. Die Zellkerne blieben dabei ausgespart. Dass sich dieses Kanalprotein auch an Zell-Zell-Kontakten verstärkt darstellte, deutet nochmals besonders auf die laufende Differenzierung zu kooperierenden Kardiomyozyten hin. 12, 41, 64, 124, 132, 157, 169 Vermutlich hatte sich durch die Entwicklung von Nexus schon eine erste Form der elektrischen Koppelung und des schnellen Stoffaustausches zwischen den Zellen ausgebildet. An den Kardiosphären befanden sich die kräftigen Fluoreszenzsignale besonders am Rand. Dort befanden sich ja auch die meisten vitalen Zellen der CS, wie unter Kapitel 3.3 dargestellt werden konnte. Bei der Darstellung des Transkriptionsfaktors MEF2D, der in seiner Funktion als Verstärker bei 35, 78, der transkriptionellen Steuerung der frühen Entwicklung von Kardiomyozyten bekannt ist, 89, 130, 131 konnte bei den CDC ein sehr viel größerer Anteil dafür positiver Zellen als bei den CS festgestellt werden. In den Kardiosphären waren nur sehr wenige Fluoreszenzsignale erkennbar, welche zwar in ihrer Form Zellkernen ähnelten, aber bei einer gleichzeitigen Kernfärbung mit DRAQ5 in den meisten Fällen nicht kolokalisiert waren. Somit handelt es sich bei diesen Signalen aus den CS wahrscheinlich um Artefakte. Dennoch war in einigen Kulturen ein schwaches Signal gegen MEF2D erkennbar und fast alle Kulturen zeigten ein diffuses Fluoreszenzsignal, das sich kräftiger als die Hintergrundfärbung darstellte. Vermutlich wird also während dieser frühen Kulturphase weniger MEF2D exprimiert. Im Gegensatz dazu konnte in den meisten CDC eine MEF2D-Expression nachgewiesen werden, welche sich ausschließlich im Zellkern unter Aussparung der Nukleolen befand. Die nukleäre Lokalisation dieser Immunreaktion konnte durch eine gleichzeitige Kernfärbung bestätigt werden. Wie bei ctnt nimmt also die Expression von MEF2D im Laufe der Entwicklung der Zellen zu. Der kulturphasenabhängige Unterschied in der Ausprägung dieser Marker kann auch einen Hinweis auf die von Zell-Zell- und Zell-Matrix-vermittelte Steuerung der Differenzierung von CSC darstellen. MEF2D wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals auf seine Expression in CS oder CDC überprüft. Vorher war MEF2C an CSC in Rattenherzen 15, 182 und beim Menschen 190 in situ nachgewiesen worden. MEF2D konnte im menschlichen Herzen in situ 158 und nach Kultur 40 detektiert werden.

88 81 DISKUSSION Der Transkriptionsfaktor FOX-H1 konnte nicht spezifisch nachgewiesen werden. Das Signal des verwendeten Antikörpers war, häufig unter Aussparung des Zellkerns, in allen Zellkompartimenten vorhanden. Besonders die Hülle der Kardiosphären ließ sich gut mit dem verwendeten Antikörper darstellen. Höchstwahrscheinlich liegen hier unspezifische Bindungen zu den verschiedensten zytoplasmatischen Antigenen vor. FOX-H1 spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Herzens. 194 Die Expression des Transkriptionsfaktors nkx2.5 war lediglich sehr schwach ausgeprägt. Die Intensität des Fluoreszenzsignals aus den CS lag aber ein wenig über dem Niveau der Hintergrundfärbung mit Normalserum. Das Signal zeigte sich diffus und gleichmäßig über die gesamte Sphäre verteilt. Wegen der hohen Zellkonzentration in den Kardiosphären konnten Überstrahlungs- und Verstärkungseffekte des fluoreszierten Lichtes nicht ausgeschlossen werden. Wahrscheinlich hatten diese Artefaktquellen Einfluss auf die unspezifisch anmutenden Ergebnisse. Außerdem waren die einzelnen Zellkompartimente in den dichten Zellansammlungen nur schwerlich voneinander zu unterscheiden. Stärker leuchtende, zellkerngroße Flecken konnten manchmal am Rand der Kardiosphären entdeckt werden, wobei diese in vielen Fällen nicht mit der DRAQ-5-Zellkernfärbung kongruent waren. Auch die seltenen, hellen, punktartigen Strukturen konnten in den meisten Färbungen nicht reproduziert werden. Bei der immunzytochemischen Färbung der CDC stellte sich ein ähnliches Färbemuster mit einem vergleichsweise kräftigen Fluoreszenzsignal aus dem Zytoplasma dar. Trotz der seltsamen Lokalisation dieser schwachen Signale konnte für den Antikörper gegen nkx2.5 in der Western Blot Positivkontrolle eine normale Funktion festgestellt werden. Zudem war im Hersteller-Datenblatt des Anti-nkx2.5 bereits vorbeschrieben, dass durch ihn nukleäre und zytoplasmatische Epitope dieses Transkriptionsfaktors detektiert und spezifisch gebunden werden können. Einige rundliche, etwa zellkerngroße Strukturen nahmen den Antikörper besonders gut auf, waren aber lichtmikroskopisch eher als Zellschrott identifiziert worden. Insgesamt kann trotz einiger, sicherlich vorhandener Artefakte auf eine reproduzierbare, spezifische immunzytochemische Färbung von CS und CDC geschlossen werden, welche sich zwar schwach darstellte, aber dennoch vorhanden war. Nkx2.5 ist für die myokardiale Differenzierung wichtig und arbeitet dabei auch mit GATA4 zusammen. 38, 51, 150, 194 Als Zeichen der stattfindenden Kardiomyogenese wurde es in CSC 15, 19, 103, 133, 145, 182, in CS 42 und CDC 169 nachgewiesen. Eine Ausnahme stellt das Ergebnis von Pouly et al. dar, die keine Kolokalisation des nkx2.5-signals auf c-kit-positiven Zellen in situ fanden, was bei Ihnen Zweifel an der Existenz von CSC erzeugte. Durch methodische Unterschiede sind die Ergebnisse aber nur 99, 155 bedingt vergleichbar.

89 82 DISKUSSION Auch bei der Detektion des GATA4 konnte nur ein schwaches Signal festgestellt werden. Dabei war bei den Kardiosphären die Lokalisation etwas schwerer festzustellen und die Fluoreszenz weniger kräftig als bei den CDC. An den CS konnte nur eine wenig stärkere Signalintensität als die unspezifische Hintergrundfluoreszenz erzielt werden. Neben der schwachen, diffusen und gleichmäßig schwachen Färbung der Kardiosphären, wurden kleine punktförmige Aufhellungen gefunden, die insbesondere peripher und in der hüllenartigen Struktur der Kardiosphären beobachtet werden konnten. Außerdem fanden sich seltener kräftigere, granuläre Fluoreszenzmuster in Zellkerngröße. Diese kleineren Flecken waren eher einer spezifischen nukleären Immunreaktion mit dem Anti-GATA4 zuzuordnen. Eine sichere Lokalisation in den Zellkompartimenten war aber in den dicht gedrängten Zellen der CS nicht möglich. Auch die CDC zeigten neben einer wahrscheinlich eher unspezifischen diffusen Färbung einige verstärkt fluoreszierende Zellkerne. Da bei den einzeln liegenden Zellen die Zellkompartimente besser unterschieden werden konnten, ließen sich die auch hier auftretenden, hell leuchtenden, kleinen Punkte in den Kernen lokalisieren. Damit handelt es sich vermutlich doch um ein zwar schwaches, aber spezifisches Signal bei CS und CDC. GATA4 ist durch Aktivation bestimmter Gene an der kardialen Entwicklung beteiligt. Es 38, 48, 51, 128, 129, 135, arbeitet dabei auch mit MEF2 und nkx2.5-transkriptionsfaktoren zusammen. 150, , 40, 158 GATA4 wurde in c-kit-positiven CSC nachgewiesen. Bei Transkriptionsfaktoren wird zwar eine vorrangig nukleäre Lokalisation erwartet, aber auch im Zytoplasma ist eine Detektion nicht ungewöhnlich. Die zytoplasmatische Lokalisation der Transkriptionsfaktoren GATA4 und nkx2.5 kann teilweise durch die natürlich notwendige 90, 152 Synthese dieser Proteine außerhalb des Zellkerns erklärt werden. Die Schwäche der Signale rührt vermutlich auch von der im Vergleich zu Strukturproteinen geringen Menge an synthetisierten GATA4 und nkx2.5 her. 4.4 Die Zellen der CS sind negativ für CD34 und CD45, CDC sind negativ für CD45 und schwach positiv für CD34 Es konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass sowohl die Zellen der Kardiosphären, als auch die davon abgeleiteten Zellen (CDC) negativ für CD45 sind. In keinem der zahlreichen immunzytochemischen Versuche konnte ein ausreichend fluoreszierendes Signal erzeugt werden. Damit sind unsere Zellen klar abgrenzbar von allen kernhaltigen hämatopoetischen Zellen, die dieses transmembranöse Glykoprotein konstitutiv exprimieren. 49 Die einwandfreie Funktion des von uns dafür verwendeten Anti-CD45-Antikörpers wurde durch immunzytochemische Färbungen an LPS-stimulierten THP-1-Zellen sicher bestätigt. Damit wurde außerdem ein unspezifisches Bindungsverhalten des Antikörpers weitestgehend ausgeschlossen.

90 83 DISKUSSION Wie auch schon Smith et al. und Davis et al. feststellten konnten, finden sich also keine Zellen aus dem blutbildenden System in den CS und bei den CDC. Somit steht fest, dass die Mehrzahl 42, 169 der kultivierten Zellen sicherlich nicht aus einer Kontamination mit Blutzellen herrühren. Im Gegensatz dazu konnte die Expression für CD34 auf CDC nicht ausgeschlossen werden. Es handelt sich beim CD34 um ein transmembranöses Glykoprotein, welches auf hämatopoetischen Zellen, Gefäßendothelzellen, einigen Fibroblasten und Satellitenzellen im Muskel detektiert werden kann. 142, 164 Bei der immunzytochemischen Analyse zeigte sich ein schwaches Fluoreszenzsignal, welches die Konturen der Zellen sichtbar machte. Auf LPSstimulierten THP-1 konnte eine kräftige Färbung und damit eine normale Funktion des verwendeten Anti-CD34-Antikörpers nachgewiesen werden. Da das CD34-Signal minimal stärker war als die Negativkontrolle, dürfte dies ein Hinweis auf eine vorliegende schwache CD- 34-Expression in den CDC sein. Die von uns kultivierten und untersuchten CDC waren also negativ für CD45, aber vermutlich schwach positiv für CD34. Bei den CS ergaben sich keinerlei Hinweise auf eine Expression von CD45 oder CD34. Zu vergleichbaren Ergebnissen kamen auch schon viele andere Arbeitsgruppen, die mit Kardiosphären und davon abgeleiteten Zellen arbeiteten: Während bei Messina et al. zusätzlich noch eine CD34-Expression in den ersten Stunden der Entwicklung von Kardiosphären beschrieben wurde 124, kommt Davis et al. zu dem Ergebnis, dass CS regelmäßig negativ für diesen Endothelzellmarker waren , 169 Positivität der CDC für CD34 festgestellt. Bei Smith et al. wie auch bei Davis et al. wird die White et al. konnten mit verschiedenen Methoden nachweisen, dass die Zellen der CS und CDC ihren Ursprung direkt im Herzen haben. Es existieren keinerlei extrakardiale Herkunftsorte dieser Zellen. Die Zellen aus denen sich CS und CDC entwickeln, sind also nicht ins Herz eingewandert, sondern entstanden endogen aus residenten Vorläuferzellen. 98, 197 Auf eine Überprüfung der Wachstumsaktivität der gezüchteten Zellen mit dem Proliferationsmarker Ki67 wurde verzichtet, da schon die ständige lichtmikroskopische Beobachtung eine Einschätzung der Wachstumsvorgänge ermöglichte. Einige Positivkontrollen für in der Immunzytochemie eingesetzte Antikörper konnten nicht immunzytochemisch durchgeführt werden. Stattdessen wurden in einigen Fällen WB und IHC als Testmethoden verwandt. Dies dürfte aber die Aussagekraft der Tests nicht beeinträchtigen. Die teilweise für die Positivkontrollen eingesetzte Immunhistochemie (bei Anti-MDR, Anti- Vimentin, Anti-Troponin, Anti-c-kit) erreicht zwar durch Verstärkungsreagenzien möglicherweise eine höhere Sensitivität. Dies hat aber keinen Einfluss auf die Spezifität, welche das eigentliche Ziel der Testung war. So könnte man zwar bei schwacher Sensitivität das in der

91 84 DISKUSSION Immunzytochemie vermeintlich schwächere Signal durch Konzentrationserhöhungen und Signalverstärkung intensivieren, würde dabei aber bei unspezifischer Bindung gleichzeitig auch die Hintergrundfluoreszenz steigern. Dieser unspezifische Hintergrund wurde aber bei der Auswertung der detektierten Fluoreszenz durch die Absenkung der Signalstärke wieder fast vollständig ausgeblendet. 4.5 Die spezielle Morphologie der Kardiosphären Während der regelmäßigen lichtmikroskopischen Kontrollen konnte festgestellt werden, dass sich die Kardiosphären vermutlich aus den kleinen, nicht auf Poly-D-Lysin anhaftenden kardiosphärenbildenden Zellen entwickelten. Nach einem scheinbar ereignislosen Intervall entstanden zuerst unvermittelt kleinere Sphären und daraus innerhalb von wenigen Tagen große, am Zellkulturboden adhärente CS. Im Verlauf der Kultur konnte keine Ablösung von Kardiosphären von der mit Poly-D-Lysin beschichteten Oberfläche oder vom Fibroblastenrasen festgestellt werden. Vermutlich entwickelten sich die CS aus den in Suspension befindlichen kardiosphärenbildenden Zellen. Ab einer bestimmten Größe begannen die Kardiosphären sich wieder am Boden anzuhaften. Die später entstehenden CS entwickelten sich wahrscheinlich ebenfalls aus Einzelzellen, die sich aber vorher aus dem Zellrasen ablösten. Die Ablösung ganzer Kardiosphären konnte nicht beobachtet werden. Bei der immunzytochemischen Untersuchung der Kardiosphären waren in deren Zentrum das Fehlen von Zellkernen und eine teilweise intensiv fluoreszierende Hülle aufgefallen. Die umhüllende Struktur war auch schon bei der lichtmikroskopischen Begutachtung ein wichtiges empirisch erfasstes Kriterium zur Unterscheidung der Kardiosphären von anderen Zellhaufen. Die dichte Hülle, die die Kardiosphären eng anliegend umgab, ließ sich mit beiden Methoden leicht von den CS abgrenzen. Bei der anschließenden elektronenmikroskopischen Analyse konnte die Morphologie und Ultrastruktur dieser Sphären detaillierter dargestellt werden. Dabei stellte sich heraus, dass die hüllenartige Struktur meist nur von einer einzigen Lage flacher Zellen und deren Zellausläufern gebildet worden war. Vermutlich hatten diese eine stützende Funktion für den Rest der Sphäre Die Hülle der Kardiosphären Das intensive immunzytochemische Signal der umhüllenden Struktur ließ sich vor allem mit den Antikörpern gegen FOXH1 und Vimentin nachweisen. Beim Anti-FOXH1 wird wegen seiner fast exklusiven Lokalisation im Zytoplasma ein unspezifisches Bindungsverhalten vermutet. Dennoch zeigte sich wie beim Anti-Vimentin eine im Vergleich zur restlichen Sphäre

92 85 DISKUSSION sehr viel stärkere Fluoreszenz aus der Hülle. Für den Antikörper gegen Vimentin konnte in der immunhistochemischen Analyse eine normale Funktion festgestellt werden. Es handelt sich also um eine dichte Ansammlung dieses Intermediärfilamentes in den umhüllenden Zellen der Sphäre, welche am wahrscheinlichsten der Stabilisierung der Hülle und damit der gesamten CS dient. Aus Zellhaufen, die diese glatte Umhüllung nicht besaßen, konnten erfahrungsgemäß in der Regel keine CDC-Kulturen entwickelt werden. Diese für die weitere Verarbeitung unbrauchbaren Zellagglomerationen hatten anstatt einer glatten Hülle assymmetrische und himbeerartigen Umrisse. Sie entstanden häufiger bei älteren Kulturen und stellten vermutlich abgestorbene, vom Kulturboden abgelöste Zellen dar Der Kern der Kardiosphären Elektronenmikroskopisch konnte festgestellt werden, dass sich im Inneren der CS tatsächlich keine intakten Zellen befanden. Stattdessen zeigte sich ein buntes Bild von Blasen verschiedenster Größe, welche mit meist homogenem Material unterschiedlichster Dichte aufgefüllt waren. Daneben zeigten sich faserige Strukturen und andere Bestandteile, welche sonst in Zellen oder im extrazellulären Raum vorkommen. Vermutlich handelt es sich um einen Zustand nach einem gleichmäßigen, großflächigen Zelluntergang im Kern der Sphären. In der maximalen Ausprägung befand sich nur noch eine Zellschicht um einen mit Zelldetritus gefüllten Inhalt. Möglicherweise sind bei zerstörten oder nekrotisierten Zellen Epitope aus dem Zellkern freigesetzt worden. Damit ließe sich erklären, warum einige spezifisch nukleäre Antikörper im Zytoplasma von Zellen der Kardiosphären binden und somit zu einem scheinbar unspezifischen Ergebnis beitragen. Grundlage für die Ansammlung von Zellbestandteilen im azellulären Kern der Kardiosphären ist wahrscheinlich ein durch Minderversorgung ausgelöster Zelltod, wobei andere Mechanismen wegen der fehlenden ultrastrukturellen Verlaufsbeobachtung nicht gänzlich ausgeschlossen werden können. Dass die im Zentrum gefundenen Zellbestandteile das sezernierte Produkt der umliegenden Zellen darstellt, erscheint sehr unwahrscheinlich. Aufgrund der Morphologie und im Vergleich zu den Vorgängen in Sphären anderer Zellkulturen, wird eher angenommen, dass es sich um eine Art des Zelltodes handelt. Bartosh et al. vermuten, dass mit der zunehmenden Größe der Sphären der Energiegradient von außen nach innen zunimmt, was zu Nekrose oder Apoptose im Zentrum führt. 13, 100, 195 Welcher dieser Mechanismen zum Zelltod in den CS geführt hat, konnte bisher noch nicht festgestellt werden.

93 86 DISKUSSION Korff et al. konnten in Versuchen mit endothelialen Zellen ebenfalls die Anordnung einer geschlossenen Zellschicht um eine Sphäre, welche mit einem azellulären Inhalt aufgefüllt ist beobachten. 100 In ihrer speziellen Kultur bildeten die Endothelzellen zuerst eine unorganisierte Sphäre, welche später eine eigene einlagige Zellschicht entwickelte und davon umfasst wurde. Da diese Zellen alle abhängig waren von der ständigen Zufuhr von Wachstumsfaktoren, wurde beim Ausbleiben dieser Faktoren der Zelltod durch Apoptose ausgelöst. Die apoptotischen Vorgänge begannen im Kern der Sphären und weiteten sich zur Peripherie hin aus. Schließlich blieb, wie bei einigen Kardiosphären, nur die äußerste Zelllage übrig, die den Zelldetritus umgab. Möglicherweise liegen hier einige Analogien zwischen Morphologie und Entwicklung von endothelialen Sphären und den CS vor. Auch andere Zellarten bildeten unter bestimmten Kulturbedingungen Sphären mit im Zentrum abgestorbenen Zellen. Bei Sphäroiden, die in der Kultur von Tumorzellen entstehen können, ist der Kern der Zellkugel ab einer bestimmten Sphäroidgröße nekrotisch verändert. Hier wurde die Form des Zelltodes durch ATP-Mangel im schlecht versorgten Zentrum ausgelöst (Abb.4-1). Für die geordnete Ausführung der Apoptose wäre hingegen eine ausreichende Energiezufuhr nötig, um beispielsweise aktiv Vesikel bilden zu können, die die zellulären Fragmente 63, 195 aufzunehmen vermögen. Abb. 4-1: In der Tumorsphäroide entwickeln sich Gradienten im Hinblick auf Proliferationsund Stoffwechselaktivität, Nekrose und Differenzierung, d.h. es bilden sich konzentrische Schichten unterschiedlich organisierter Zellen. 63 Im Folgenden werden die verschiedenen denkbaren Arten des Zelluntergangs innerhalb der Kardiosphären und deren Ursache und Ablauf erläutert. Es existieren drei verschiedene Möglichkeiten des Zelltodes: die Apoptose, der mit Autophagie assoziierte Zelltod und die Nekrose. 52, 102 Eine eindeutige Unterscheidung, ob nekrotische oder apoptotische Vorgänge für den Zelltod ursächlich waren, ist in vielen Fällen anhand von morphologischen Kriterien nicht zweifelsfrei möglich. Dennoch gilt die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) als präziseste Methode, um zwischen Nekrose und Apoptose bei Zellkulturen zu unterscheiden. 102 Die bei der elektronenmikroskopischen

94 87 DISKUSSION Untersuchung begutachteten Sphären erlitten den Ergebnissen nach durch die Präparation keine gröberen Beschädigungen. Dabei kann aber nicht ausgeschlossen werden, dass ein weiterer Zelluntergang im Zentrum der CS nach deren Entnahme aus der Kultur stattgefunden hatte. Es wird bezweifelt, dass die meisten Kardiosphären schon in vivo von einem ähnlich großen Kern aus Zellschrott angefüllt waren. In der immunzytochemischen Untersuchung stellte sich dieser Bereich nämlich vergleichsweise kleiner dar, was durch die im breiteren Randbereich nachweisbaren Zellkerne erkennbar war. Die dort in den CS zentraleren Zellkerne waren elektronenmikroskopisch nicht mehr nachweisbar. Vermutlich weitete sich eine schon bestehende Zone von abgestorbenen Zellen während der kurzen Vorbereitungszeit zur Färbung bzw. zur TEM außerhalb des Kulturmediums aus. Nach den immunzytochemischen Untersuchungen entstand dieses zellfreie Areal im Zentrum ab einer bestimmten Größe der Sphären von schätzungsweise 50µm. Die im Inneren der CS durch Diffusion mit Nährstoffen, Sauerstoff und Wachstumsfaktoren schlechter versorgten Zellen sind wahrscheinlich während des unversorgten Intervalls zwischen Entnahme aus der Kultur und Fixation nochmals stärker betroffen. Allgemein reagieren proliferierende Zellen bekanntermaßen empfindlicher auf eine Minderversorgung. Sie können in ihrer anabolen Stoffwechsellage nicht ausreichend auf die Verwertung von Aminosäuren und Fettsäuren umstellen, sodass der ATP-Spiegel im Zytoplasma abfällt, was schließlich zur Nekrose der Zelle führt. 52 Dem morphologischen Bild im TEM nach zu urteilen, lag im Inneren der Kardiosphären wahrscheinlich ebenfalls eine Nekrose vor. Die Zuordnung zum nekrotischen oder zum apoptotischen Zelluntergang ist aus dieser Momentaufnahme dennoch erschwert, da nach Apoptose mit anschließend fehlender Phagozytose auch eine sekundäre Nekrose auftreten kann. Morphologisch ähnelt der schließlich entstehende Zustand in vielerlei Hinsicht der primären Nekrose. 102 Außerdem treten manche Mechanismen des Zelluntergangs in beiden Fällen auf und weiterhin besteht die Vermutung, dass es ein größeres Spektrum von Zelluntergangsformen zwischen Apoptose und Nekrose gibt 102, 178 als bisher angenommen. Morphologisch zeigen sich bei der Apoptose üblicherweise eine Karyopyknose mit kondensiertem Chromatin, gefolgt von der Karyorrhexis, und der Bildung von dicht gepackten Vesikeln - den apoptotischen Körperchen - welche schließlich phagozytiert werden. Bei den elektronenmikroskopisch dargestellten Vesikeln innerhalb der Kardiosphären könnte es sich auch teilweise um die eben genannten Reste eines apoptotischen Zelluntergangs handeln. Wie unter anderem von Edinger et al. vermutet, wäre der gleichzeitige oder kurz hintereinander folgende Ablauf mehrerer Zelluntergangsformen zwischen Apoptose und Nekrose je nach Lokalisation und Zustand in der Sphäre denkbar. 52

95 88 DISKUSSION Außerdem befanden sich Zellen in den Kardiosphären, die anscheinend zur Phagozytose fähig waren (z.b. Abb.3-29D). Wegen der langen Kulturdauer von mindestens sechs Wochen und der fehlenden Exprimierung von CD45 ist eine Herkunft dieser fraglich phagozytotischen Zellen aus dem Blut oder dem Knochenmark eher unwahrscheinlich. 49 Bei der Suche nach Ursachen für den Zelltod in den Sphären gibt es ein Indiz für die Annahme dass es sich um ein apoptotisches Geschehen handelte: Hypoxische Zustände treten bei zunehmendem Wachstum der Sphäre zuerst im Kern auf, da dort die diffusionsabhängige Versorgung am schlechtesten ist. Nach einer Phase der Anpassung und Proliferation, leiten die Zellen ab einem gewissen Grad der Minderversorgung ihre Apoptose ein. Dafür ist aber ein noch ausreichender ATP-Vorrat in den Zellen notwendig, da der apoptotische Zelluntergang nur unter Energieverbrauch ablaufen kann. Bei gravierendem ATP-Mangel, wie er unter anderem bei einem länger anhaltenden, hypoxischen Zustand im Zentrum der Sphäre entstehen kann, 52, 63, 188, 195 wird die Nekrose die vorherrschende Form des Zelluntergangs. Dass sich im Zentrum der CS nekrotische oder apoptotische Bestandteile befinden, wurde bisher in der Literatur noch nicht beschrieben. Die genannten Feststellungen sind von anderen Arbeitsgruppen nachgewiesen worden für Zellen im Allgemeinen, 52, 102, 178 Sphären ähnlicher Art 4, 25, 63, 160, 177, 185, 195 und andere kardiale Stammzellen. 13, 188 Aufgrund der neuen Beobachtungen an den CS, die den Ergebnissen von anderen vorgestellten Zellkulturen weitgehend entsprechen, dürften sich vermutlich auch die Aussagen zu Ursache und Art des Zelltodes auf die Vorgänge im Zentrum der Kardiosphären übertragen lassen. Eine weitere Zellart, die unter geeigneten Kulturbedingungen ebenfalls Zellkugeln bildet und die für die Entwicklung der Kardiosphärenmethode wohl eine bedeutende Rolle gespielt hat, sind neurale Stammzellen. Sogenannte Neurosphären enthalten ebenfalls multipotente Vorläuferzellen von Zellen des Zentralnervensystems. Ebenso kann die besondere Fähigkeit zur Kugelbildung zur selektiven Isolation dieser Zellen genutzt werden. Unter dem Lichtmikroskop zeigen die Sphären aus Herz und Nervensystem ein ähnliches Erscheinungsbild und vergleichbare Größenverhältnisse. 4, 25, 160, 177, 185 Schon mehrmals konnte die Einwanderung von Zellen der Neuralleiste während der embryonalen Entwicklung des Herzens nachgewiesen werden. 162, 185 Da die CS einige für Neurosphären typische Marker wie Nestin und Musashi aufwiesen, kann eine gewisse Verwandtschaft zwischen den beiden Zellkugeln bzw. der darin enthaltenen Zellen vermutet werden. 106, 185 Auch in sich organisierenden Narben nach einem Myokardinfarkt konnten Nestin-positive Zellen nachgewiesen werden, wobei es sich vermutlich ebenso um kardiovaskuläre Vorläuferzellen handelt. Allerdings fanden diese Untersuchungen an 50, 180 neonatalen Rattenherzen statt. Eine weitere Analogie ergibt sich aus der kürzlich nachgewiesenen parakrinen Aktivität der neuronalen Progenitorzellen, die in Neurosphären

96 89 DISKUSSION kultiviert wurden. Es wird vermutet, dass die sezernierten Zytokine verantwortlich sind für die verbesserte strukturelle Plastizität und axonalen Transport im ischämischen Gehirn. 7 Bei den Neurosphären wird ein nach Differenzierungsstufen angeordneter schichtweiser Aufbau der Sphären vermutet. 177 Für Kardiosphären wurde dieser Umstand zwar bereits festgestellt, 42 konnte aber bei unseren Untersuchungen nicht in diesem Maß beobachtet werden. Bis auf den höheren Zellreichtum am Rand der Sphäre, eine etwas veränderte Form der dort befindlichen Zellen und der beschriebenen Hüllenbildung konnte immunzytochemisch keine in Schalen angeordnete Zellentwicklung nachgewiesen werden. Auch Messina et al. haben schon vermutet, dass die CS einen ähnlichen Aufbau aufweisen könnten wie die Sphären der Endothelzellen, der neuralen Stammzellen, der Tumorzellen u.a. Nachweise für diese Ähnlichkeit wurden damals aber noch nicht erbracht. Die vorher schon bekannten Sphären bestehen aus einer oberflächlichen Schicht differenzierter Zellen, welche unorganisierte Zellen beinhalten, die dann im Verlauf verschwinden bzw. zugrunde gehen. Die Zellen im Kern dieser Sphären scheinen ohne Wachstumsfaktoren den apoptotischen Zelluntergang einzuleiten, wohingegen die Zellen der Hüllschicht unabhängig von diesen Faktoren sein können. Es wurde vermutet, dass diese in der Sphärenhülle entstehende Umgebung eine Nische darstellt, in der die für Stammzellen notwendigen Zell-Zell-Kontakte ausgeprägt werden. 124 Bei hämatopoetischen Stammzellen ist bekannt, dass sie ihre Fähigkeit zur Vermehrung und Entwicklung zu verschiedenen Blutzelltypen nur bei passender zellulärer Umgebung ( Nische ) besitzen. 63 Bei Versuchen mit Hydrogel-Kulturmatrizes konnte nachgewiesen werden, dass die Konsistenz der Matrix die Differenzierung der CDC stark beeinflusst. Durch die Kultur im Hydrogel wurde die Differenzierung und Proliferation dieser Zellen gefördert und gleichzeitig scheint es sich um ein geeignetes Material für die intramyokardiale Injektion zu handeln. 111 Apoptose und Nekrose treten nicht nur in vitro innerhalb der Kardiosphären auf, sondern natürlich auch im ischämischen Herzmuskel. Neben den Einflussfaktoren der Minderversorgung, wirken auch Botenstoffe regulierend auf die zumindest teilweise programmierten Zelluntergangsformen. Häufig wurde die positive Wirkung von kardialen Stammzellen auf beschädigtes Herzmuskelgewebe hauptsächlich auf deren parakrine Einflussnahme zurückgeführt. Durch die Hemmung von apoptotischen Vorgängen und die Förderung der Proliferation von bereits ansässigen Zellen ergab sich eine gewisse Besserung der 31, 34, 67, 113, 183 Herzfunktion. Nach unseren Ergebnissen werden Zytokine bei der Kultur von Kardiosphären, CDC und Explantatzellen sezerniert. Besonders das dabei stark exprimierte MCP-1 ist für seinen Einfluss bei der Steuerung des Zelluntergangs bekannt, was auch bei der Entwicklung der Kardiosphären

97 90 DISKUSSION eine bedeutende Rolle spielen könnte. MCP-1 löst je nach Konzentration und verschiedenen weiteren Bedingungen in der Zelle entweder die Apoptose aus, oder verhindert sie. 143 Zusammenspiel mit anderen Zytokinen könnte die MCP-1-Konzentration als Schalter in der hypoxischen Ischämiephase fungieren. Einerseits wird möglicherweise ein früher Zelltod der Kardiomyozyten in hypoxischen Phasen verhindert. Andererseits kann in ausreichend ungünstigen Situationen umgeschaltet werden, um durch einen programmierten Zelluntergang gezielt der Nekrose zuvorzukommen. Nachgewiesenermaßen bewahren erhöhte MCP-1 Spiegel die Kardiomyozyten vor der durch Hypoxie ausgelösten Apoptose. Da in den Überständen unserer Kulturen erhöhte Spiegel dieses Chemokins nachgewiesen werden konnten, wurde der apoptotische Zelluntergang vermutlich 134, 143, 184 bis zu einem gewissen Maß verhindert. Ebenso gibt es aber auch Hinweise, dass hohe Spiegel von MCP-1 Apoptose und Autophagie auslösen. Ab welcher Konzentration welcher Zellmechanismus ausgelöst oder verhindert wird 95, 144, 201 ist dabei noch unklar. Im Ein Bindeglied zwischen den in der Literatur häufig beschriebenen Mechanismen zur Steuerung der Apoptose in kardialen Progenitorzellen und der vorher dargestellten teilweise nekroseähnlichen Areale in den Kardiosphären bildet die Beschreibung der sekundären Nekrose von apoptotischen Zellen. 102 Falls es einen normalen lebenslangen Austausch von alten Kardiomyozyten durch neue, aus Stammzellen entstandene geben soll, 87, 154 wird es auch einen irgendeinen Mechanismus geben, der die älteren entfernt. Die Möglichkeit der Zellfusion und Nekrose ist zwar nicht ausgeschlossen, dennoch scheint ein geordneter apoptotischer Zelluntergang am plausibelsten unter physiologischen Bedingungen. Ischämisch-hypoxische Situationen führen sicherlich auch zur Nekrose. Die durch sie ausgelöste Inflammation beseitigt Zellschrott und steht am Anfang der Regenerationsbemühungen. Vermutlich führt besonders der Kontaktverlust zwischen den Zellen zur Sekretion von Faktoren, die die Migration, Proliferation und Differenzierung von kardialen Progenitorzellen anregen. Solange ein Zelle Kontakt zu ihren Nachbarzellen hat, besteht eine Kontaktinhibition, die Zellteilung und Proliferation verhindert. In der Zellkultur führt dieses Phänomen zur Einschränkung des Zellwachstums ab einer gewissen, ausreichend hohen Zellkonzentration. Im adulten Organ wird dadurch ein ungehemmtes Zellwachstum verhindert. Umgekehrt wird diese proliferative Kontakthemmung durch den Verlust der direkten juxtakrinen Zell-Zell- und Zell- Matrix-Kommunikation aufgehoben. Nach einem Zelluntergang fällt die gegenseitige Kontaktinhibition mit den jeweiligen Nachbarzellen weg. Die verbliebenen Zellen werden somit

98 91 DISKUSSION nicht mehr daran gehindert sich zu teilen und zu vermehren. Dies dürfte das erste Signal darstellen, welches Proliferation und Regeneration im Gewebe nach einer Schädigung ermöglicht bzw auslöst. Natürlich müssen dafür auch weitere entsprechende Voraussetzungen gegeben sein. Dazu gehören eine ausreichende Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff und die grundsätzliche Fähigkeit zu Proliferation und Differenzierung. Die juxtakrinen Faktoren erfüllen neben ihrer proliferationshemmenden Funktion auch weitere Aufgaben: sie spielen eine wichtige Rolle bei der Kommunikation und Zusammenarbeit der Zellen im Gewebsverband und unterstützen vermutlich auch die Differenzierung der jeweiligen Nachbarzellen. In Tumoren kann ein Verlust der Zelladhäsionsmoleküle zur ungebremsten 22, 63, 153, 161 Proliferation führen. Vermutlich werden Progenitorzellen durch Kontaktinhibition an intakten, definierten Parenchymzellen in Wartestellung gehalten. Ein Wegfall dieser Proliferationshemmung mag die Wirkung von parakrinen Faktoren ermöglichen. Diese lösen wahrscheinlich über verschiedene Signalkaskaden und wechselseitige Kommunikation die Migration, Proliferation und Differenzierung der Vorläuferzellen aus. Dabei dürfte ein enger Zusammenhang mit inflammatorischen Prozessen bestehen (siehe Kapitel 4.7). Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die neuerdings gefundenen, zellfreien Zonen im Zentrum der Kardiosphären vermutlich hauptsächlich und letztendlich durch Nekrose entstanden sind. Die Sphären sind anscheinend ein selbst geschaffenes Modell, in welchem auf kleinstem Raum Proliferation, Zelldifferenzierung und Zelltod stattfinden. Insbesondere die Erforschung der parakrinen Kommunikation zwischen den Zellen der CS dürfte interessante Einblicke in die Regulationsmechanismen der kardialen Progenitorzellen im Herzmuskel bieten. Daraus ergäben sich vielleicht in Zukunft Möglichkeiten zur gezielten medikamentösen Förderung der kardialen Regeneration. 4.6 Abgrenzung der CS und CDC von Fibroblasten Lichtmikroskopisch ließen sich die Zellen der CS wegen ihrer engen räumlichen Lage in den Sphären nicht einzeln erkennen. Durch ihr Adhäsionsverhalten auf mit Poly-D-Lysin beschichteten Oberflächen unterschieden sie sich von den fibroblastoiden Zellen, die in dieser Phase der Zellkultur darauf sofort adhärierten. 124 Immunzytochemisch ließ sich das bindegewebstypische Vimentin auf einigen Bestandteilen der Kardiosphären nachweisen. Die umhüllende Struktur fluoreszierte in einigen Fällen besonders gut. Wie vorher beschrieben besteht diese Hülle vermutlich aus einer sehr flachen Zellschicht. Eine gewisse Ähnlichkeit zu Fibroblasten kann für diese Zellen daher nicht ausgeschlossen werden. Das diffuse Fluoreszenzsignal aus dem Inneren der Sphären dürfte vorherrschend auf unspezifischen

99 92 DISKUSSION Bindungen beruhen. Ob sich Vimentin in Zellen oder Extrazellulärraum befand, konnte in den CS nicht festgestellt werden, da eine Unterscheidung der Kompartimente im dichten Zellhaufen nicht eindeutig möglich war. Vimentin hat nicht nur die strukturelle Funktion eines Intermediärfilamentes, sondern greift auch in die Signaltransduktion, Migration und Entwicklung der Zellen ein. 80 Demgegenüber konnte die Morphologie der einzelnen Zellen im Monolayer der CDC sehr viel leichter untersucht werden, was auch die Zuordnung von Fluoreszenzsignalen zu den verschiedenen Kompartimenten vereinfachte. Auf den ersten Blick mag das Aussehen der CDC durch ihre längliche Form mit langen und spitz endenden Zellausläufern an Fibroblasten erinnert haben. 1 Sie unterschieden sich aber von typischen Bindegewebszellen durch eine meist breitere, plumpere Form. Häufig waren zwei Zellkerne mit je zwei Nukleoli erkennbar. 176 Außerdem zeigten sich im weiteren Verlauf auch quaderförmige, weniger lichtbrechende Zellen, welche einen faserigen Inhalt vermuten ließen. Auch die CDC wurden immunzytochemisch auf die Anwesenheit des bindegewebstypischen Vimentin untersucht. Dabei konnte nur ein schwaches Signal festgestellt werden, das im Zytoplasma und auch etwas weniger im Zellkern detektiert werden konnte. In wenigen Fällen ließ das Fluoreszenzmuster die Struktur von Intermediärfasern erahnen. Die Abgrenzung zu den Fibroblasten ist also morphologisch nicht eindeutig möglich. Auch die zwar schwache Expression von Vimentin lässt eine zweifelsfreie Unterscheidung nicht zu. Die CS und CDC unterscheiden sich dennoch eindeutig von den Fibroblasten durch die Ausprägung von Stammzellmarkern wie c-kit und herzmuskelspezifischen Proteinen wie TnT, 5, 41, 42, 124, 169 Cx43, MEF2D, nkx2.5 und GATA Die CS und CDC sezernieren die Zytokine MCP-1, IL-6, IL-8 und t-pa Die untersuchten Zytokine konnten bisher bei Atherosklerose, Inflammation und Herzinsuffizienz nachgewiesen werden. Besonders interessant ist hierbei die Expression von MCP-1 und t-pa bei den muskulären Kardiomyopathien, denen keine vaskuläre Genese zugrunde liegt. 33, 95, 144 Die Erforschung der Funktionen von MCP-1, IL-6, IL-8, t-pa, etc. für 10, 18, 37, 57, 58, 95, 134, 143, 144, die Regeneration des Myokards hat erst vor wenigen Jahren begonnen. 184, 192 Auf der Suche nach Zytokinen in den Überständen der Zellkulturen konnte eindeutig die Expression von t-pa, IL-6, IL-8 und MCP-1 festgestellt werden. Um die von Kulturphase und

100 93 DISKUSSION -alter abhängigen, wiederkehrenden Veränderungen der Zytokinspiegel zu erklären, kommen verschiedene Phänomene in Betracht. Am Beginn der Zellkulturphasen ist sicherlich die geringe Zellzahl für die niedrige Zytokinkonzentration im Überstand zum großen Teil verantwortlich. Die Zytokinproduktion pro Zelle lässt sich aus den gewonnenen Ergebnissen nur grob abschätzen. Das exponentielle Wachstum der Zellen steht dabei im Gegensatz zur eher langsamen Steigerung der Zytokinkonzentrationen in den Überständen; MCP-1 und IL-6 zeigen in der vierten Kulturwoche sogar wieder fallende Werte. Deshalb ist die Expression von t-pa, IL-6 und IL-8 pro Zelle vermutlich direkt nach Anlage der Explantatkultur am höchsten und fällt danach stetig ab. Eine Ausnahme könnte MCP-1 bilden, da es in der dritten Kulturwoche plötzlich extrem hohe Werte erreicht, die nicht durch das Zellwachstum allein erklärbar sind. Somit liegt hier vermutlich eine kurzfristige, maximale Expression dieses Botenstoffs vor. Bei der Detektion von MCP-1 befand sich der höchste Zytokinspiegel dann auch in der Explantatphase. Die anfänglich hohe Zytokin-Expression der Explantatzellen hat möglicherweise bereits im 18, 37, 56, 57, 58, 59, 192 erkrankten Herzen des Patienten begonnen. Der Anstieg (t-pa) oder Abfall (IL-6, MCP-1) der Zytokinkonzentrationen in den Kardiosphären-Kulturen kann unter anderem folgende Gründe haben: Die im Gegensatz zu den Explantat-Kulturen höhere Aufreinigung der kardiosphärenbildenden Zellen, die verschieden starke Stimulation zur Zytokinsekretion durch die besondere Lage in den Sphären oder das fortschreitende Zellkulturalter könnten Einfluss auf den Zytokinspiegel gehabt haben.. Im Gegensatz zu den anderen positiv getesteten Zytokinen lag das Konzentrationsmaximum des t-pa erst in der Kardiosphärenphase. Ausnahmsweise stieg dabei dessen Spiegel im Verlauf anfangs an und fiel erst in der letzten Woche dieser Kulturphase ab. Dass die Prozedur des Ablösens von der Explantatkultur den Erfolg bei darauf folgenden Erntemaßnahmen erhöht, wurde bereits bei den morphologischen Ergebnissen (siehe Kapitel 3.1.2) beschrieben. Diese kulturtechnische Maßnahme könnte auch die Expression einiger Botenstoffe angeregt haben. Damit könnten die am Beginn der CS-Phase hohen Zytokinspiegel von IL-6, IL-8 und MCP-1 erklärt werden, die im Verlauf sofort wieder fielen. Für die fallenden Werte dürfte die sinkende Expression dieser Botenstoffe pro Zelle verantwortlich sein, da gleichzeitig die Zellmenge durch Proliferation anwuchs. Nach der Anlage von CDC-Kulturen stiegen die Werte dieser drei Zytokine wiederum an. Möglicherweise reagieren die Zellen auf die veränderten Bedingungen, die enzymatischen oder mechanischen Reizungen mit Proliferation und gleichzeitiger Sekretion von IL-6, IL-8 und MCP-1.

101 94 DISKUSSION Vermutlich bestehen hier Analogien zur Funktion der inflammatorischen Zytokine in vivo. Die durch sie ausgelöste Entzündungsreaktion entfernt nekrotische Anteile und bereitet den Boden für die myokardiale Regeneration. Eine zu aggressive oder länger andauernde Inflammation 57, 95, 144 würde hingegen kontraproduktiv wirken. Da die beschriebenen Botenstoffe auch unmittelbar in die Regeneration eingreifen durch kardioprotektive Mechanismen 18, 134, 143 und durch Förderung von Angiogenese, Proliferation und gezielter Differenzierung, , 56, 57, 58, 59, 74, 83, 85, 192 längerfristige Anwesenheit notwendig und in vivo auch nachgewiesen. ist ihre Da der Abfall der Zytokinkonzentrationen am Ende aller CS- und CDC-Kulturphasen nicht durch eine Verringerung der Zellzahl erklärt werden kann, lässt hier vermutlich die Expression pro Zelle nach. Beim Vergleich der drei Kulturphasen unterscheiden sich die hohen Zytokinspiegel von IL-8 und MCP-1 nicht signifikant. IL-6 zeigt in der CS-Phase eindeutig niedrigere Werte als in beiden anderen Kulturphasen. t-pa hingegen zeigt den signifikant höchsten Wert klar in der Kardiosphärenphase. Die löslichen Zelladhäsionsmoleküle svcam, sp-selektin und der lösliche Entzündungsmediator scd40-l konnten in den Überständen nicht nachgewiesen werden. Damit besteht auch ein weiteres Unterscheidungsmerkmal zu den nach sca-1 selektionierten und von Matsuura et al. als CPC bezeichneten Progenitorzellen, welche svcam-1 in Kultur sezernierten. 120 Da der Nachweisversuch von scd40l, sp-selektin und svcam-1 gleichzeitig mit allen anderen Zytokinen im gleichen Versuchsaufbau und mit denselben Reagenzien durchgeführt wurde, können diese Ergebnisse als weitere gesonderte Negativkontrolle für die anderen positiven Ergebnisse angesehen werden. Zudem besteht dadurch ein Unterscheidungsmerkmal zu Endothelzellen, die fähig wären diese Marker zu exprimieren. Als kommunikative Elemente ist für die Zytokine der exakte Zeitpunkt ihres Einsatzes in genau definierter Konzentration enorm wichtig. Im Zusammenwirken mit vielen anderen parakrinen Faktoren werden wohl unterschiedliche Entwicklungsschritte ausgelöst und der Ablauf von Proliferation, Differenzierung oder Zelltod gesteuert. 67 Die häufig beschriebene Multipotenz der 15, 41, 88, kardialen Progenitorzellen bietet diesen Zellen vielfältige Entwicklungsmöglichkeiten. 103, 124, 190 Der Eingriff mit Wachstumsfaktoren oder Medikamenten in diese komplexen Steuerungsmechanismen dürfte deshalb aber mit Schwierigkeiten verbunden sein. Dass Fehlregulationen von Zytokinen bezüglich Zeitpunkt und Konzentration in beide Richtungen ungünstig sind, kann am Beispiel des MCP-1 festgestellt werden. MCP-1 beeinflusst, wie unter Kapitel 4.5 schon beschrieben, das Schicksal der Kardiomyozyten. Es bewahrt sie in einigen Fällen (Entzündung, Ischämie, Hypoxie)

102 95 DISKUSSION nachgewiesenermaßen vor dem Zelltod, löst aber bei anhaltendem hohem Stress, bei kongenitalen Kardiomyopathien und Überexpression Apoptose oder Autophagie der Zelle aus. 143, 144, 184, 201 Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen haben gezeigt, dass nur 20-50% der positiven Effekte durch die Transplantation von Zellen des Knochenmarks, von CS und CDC in ein geschädigtes Herzmuskelgewebe durch die Integration der implantierten Zellen erklärbar sind. Eine mindestens genauso große Rolle spielen die parakrinen Effekte. Auch sie tragen zur Erhöhung 34, 117 von Kapillardichte, Muskelzelldichte und Überlebensfähigkeit des Gewebes bei. Nicht mit allen Explantaten aus verschiedenen Patienten konnte dasselbe gute Ergebnis mit schnell wachsenden Zellen erreicht werden, was wahrscheinlich auf die individuell unterschiedliche Fähigkeit zur Zellregeneration hinweist. Es wurde bereits häufiger auf den 34, 67, ausgeprägten Einfluss von parakrinen Faktoren auf die kardiale Regeneration hingewiesen. 113, 122, 123, 139, 183, 199 Deshalb stellen die nachgewiesenen Unterschiede der Zytokinsekretion in Konzentration und zeitlichem Ablauf wahrscheinlich einen wichtigen Faktor für die Regenerationsfähigkeit dar. In der Kardiosphärenphase zeigen sich die interindividuellen Unterschiede bezüglich Morphologie, Immunzytochemie und Zytokinsekretionsmuster am deutlichsten. Schon zur Bildung von Kardiosphären ist die Kommunikation zwischen den Zellen äußerst wichtig. Durch die geschaffene Architektur ist der parakrine Austausch wohl um einiges vereinfacht, was Einfluss auf die weitere Entwicklung der Zellen (Proliferation, Differenzierung und Sekretion von Zytokinen) hat. Um die Aussagekraft dieser Ergebnisse zu erhöhen, müsste die Anzahl der getesteten Zellkulturen in weiteren Untersuchungen gesteigert werden. Die dargestellten Daten geben nur einen Hinweis auf die tatsächlich vorherrschenden Verhältnisse. Das parakrine Verhalten der kardialen Progenitorzellen und ihrer begleitenden Zellen bietet möglicherweise Angriffspunkte für diagnostische oder therapeutische Anwendungen. 4.8 Vorteile der Kardiosphärenmethode Nach bisherigen Ergebnissen gibt es kardiale Stammzellen, welche nach Anregung migrieren, proliferieren und die Funktion des Herzmuskels wieder verbessern. Die Herkunft dieser Zellen ist noch nicht vollständig geklärt. 190 Es wurde nachgewiesen, dass sich Zellen aus dem Knochenmark im Herzmuskel ansiedeln. Durch eine Transplantation dieser Zellen lässt sich aber eher nur kurzfristig die Herzfunktion verbessern. 119 Der beobachtete günstige Effekt auf die Funktion des Herzmuskels erscheint nicht vorrangig durch die Entstehung oder Umwandlung von ansässigen oder transplantierten Progenitorzellen zu funktionierenden Herzmuskelzellen

103 96 DISKUSSION bewirkt zu werden. Der Haupteffekt der hämatopoetischen und mesenchymalen Stammzellen wird deshalb in der parakrinen Anregung und Unterstützung der Kardiomyozyten und deren Vorläuferzellen vermutet. Das passiert wahrscheinlich durch eine Unterdrückung des kardialen fibrotischen Umbaus nach einem Myokardinfarkt ( cardiac remodelling ), der Verhinderung des Zelluntergangs von ansässigen Zellen und der Anregung der Angiogenese. Diese Effekte werden vermutlich über bisher noch wenig untersuchte parakrine Faktoren, Zytokine und Zell- 34, 67, 70, 109, 113, 117, 122, 123, 139, 183 Zell-Interaktionen erreicht. Durch die vorliegende Arbeit konnte gezeigt werden, dass auch einige inflammatorische Zytokine von kardialen Progenitorzellen sezerniert werden. Diese Botenstoffe wurden unter anderem auch bei nicht von Atherosklerose bedingter Herzinsuffizienz im Serum nachgewiesen und waren dabei für verschiedene günstige und ungünstige zelluläre Effekte verantwortlich. Deshalb stellt dieses Ergebnis einen weiteren interessanten Ansatzpunkt für die genauere Erforschung der für die Regeneration wichtigen inter- und intrazellulären Kommunikation dar. Für die Erforschung der wichtigen parakrinen Wirkmechanismen scheint die Kulturmethode mit Kardiosphären besonders gut geeignet zu sein. Es handelt sich bei der Zellpopulation der CS oder CDC nämlich nicht um dieselben Zellen wie bei den nach bestimmten Markern selektionierten Zellen. Bei den durch die Kulturmethode gewonnenen Zellen handelt es sich um eine heterogene Mischung von Zellen verschiedenster Differenzierung. 124 Demgegenüber wird die Entnahme von bestimmten Zellen mit gewissen Antigenen wie c-kit oder sca-1 mittels MACS oder ähnlichem meist direkt nach der Gewebeentnahme aus dem Herzen durchgeführt. Dadurch werden die Zellen selektioniert, welche sich schon im Normalfall im Herzen befinden. Deren Rolle beim Zusammenspiel mit den aussortierten Zellen, die die Stammzellen bei ihrer Entwicklung normalerweise umgeben würden, kann nach Anwendung dieser Methoden nicht untersucht werden. Bei der Kardiosphärenmethode wird die Selektion stattdessen durch die Kulturmethode erreicht. Dadurch wird die Untersuchung an einem wahrscheinlich physiologischeren Zustand der Zellen möglich. Die dicht gedrängten und morphologisch unterschiedlichsten Zellen in der Kardiosphäre kommunizieren sicherlich durch Zell-Zell-Kontakte und parakrin miteinander. 124 Als Nische wurden solche Areale im Gewebe bezeichnet, in denen sich durch besondere Gegebenheiten und unterstützende Zellen Stammzellen entwickeln können. Somit kann vor allem für die Randbereiche der CS eine Nischenfunktion vermutet werden. Die Zell-Zell- Interaktionen und Zell-Extrazellularmatrix-Interaktionen 63 bilden sich in der Sphäre eigenständig und ermöglichen so vielleicht erst die hier festgestellte gerichtete und anhaltende 61, 109, 115 Proliferation und Differenzierung.

104 97 DISKUSSION So konnte auch auf den künstlichen Zusatz von Stoffen verzichtet werden, die meist nötig sind, um die Differenzierung bei selektionierten Zellen erst auszulösen (5-Azacytidin 145, 146, 202, Oxytocin 148, Isoproterenol 8 usw.). Darüber hinaus kann in vielen Fällen eine ausreichend starke Vervielfältigung der Zellen erreicht werden, welche die Erfolgsaussichten bei einer autologer Transplantation erhöht. Dies 84, 124, 169 wurde in Tierversuchen bereits überprüft. Für die Erforschung der parakrinen Effekte, sowie für deren Nutzung zur Produktion von Progenitorzellen, kann die Kardiosphärenmethode also ein wichtiger Baustein sein. 4.9 Nachteile der Kardiosphärenmethode Nachteilig bei der Anwendung der CS- und CDC-Kulturmethode ist die bisher noch lange Kulturzeit bis zur Verwertbarkeit von Kardiosphären oder CDC. Die angestrebte autologe Zelltransplantation könnte erst nach einer längeren Wartezeit für den Patienten durchgeführt werden. Durch die lang dauernde Zellkultur steigt auch die Gefahr von Kontaminationen. Durch die direkt nach einem Infarkt stattfindenden inflammatorischen Prozesse sind die Erfolgsaussichten einer sofortigen Zelltransplantation zwar eher schlecht. 47 Dennoch muss versucht werden, schneller und sicherer an verwendbare Zellen zu kommen, als bisher möglich. Weitere Probleme sind der hohe Arbeitsaufwand und die eingeschränkte Untersuchbarkeit der Strukturen im Inneren der Kardiosphäre. Von Davis et al. wurde diskutiert, ob die Zwischenschritte über die Kardiosphären bei der Kultur von kardialen Progenitorzellen notwendig sind. Er erreichte bei der direkten Verarbeitung von Herzzellen der Ratte aus der Primärkultur angeblich den CDC vergleichbare Zellen. 40 Gegen dieses Vorgehen sprechen die oben genannten Vorteile der CS als vermutlich architektonisch ideales Milieu für wachsende kardiale Progenitorzellen. Weiterhin bleibt fraglich, ob die Weiterentwicklung der Kardiosphären zu CDC Vorteile für den klinischen Einsatz bringt. Möglicherweise wäre der direkte Einsatz von CS nach einer kürzeren Kulturdauer erfolgversprechender Die Einordnung als adulte kardiale Progenitorzellen Die Ergebnisse dieser Arbeit sind ein weiterer Hinweis dafür, dass es sich bei den hier kultivierten und analysierten Zellen um adulte kardiale Progenitorzellen handelt. Die aus humanem Herzmuskelgewebe erwachsener Patienten gewonnenen und kultivierten Zellen zeigten dieselbe morphologische Entwicklung innerhalb der verschiedenen Kulturphasen wie von den Erstbeschreibern dargestellt. Dort waren sie ebenfalls positiv für c-kit, Cx43, Troponin

105 98 DISKUSSION und negativ für MDR und CD45 und wurden adulte kardiale Progenitorzellen genannt. 124, 169 Für eine Übernahme dieser Benennung spricht außerdem der neuerliche Nachweis von MEF2D, nkx2.5 und GATA4 als Marker der frühen kardialen Entwicklung und sowohl ctnt als auch Cx43 als Zeichen differenzierter Kardiomyozyten bei erhaltener Proliferationsfähigkeit. Besonders die nachgewiesene Expression des Stammzellmarkers c-kit (CD117) gilt als herausragendes Charakteristikum für kardiale Progenitorzellen. Da c-kit auch von hämatopoetischen Stammzellen, verschiedenen Tumoren und Mastzellen exprimiert wird, muss gegenüber diesen Zellpopulationen immer eine Abgrenzung erfolgen. Wie auch hier fehlten bei der Untersuchung kardialer Progenitorzellen die Marker des blutbildenden Systems zuverlässig. 42, 169 Die Mitnahme von Tumorzellen bei der Entnahme der Explantate ist wie die tumoröse Entartung während der Zellkultur sehr unwahrscheinlich. 84 Eine Zuordnung zu Mastzellen wird von den meisten Arbeitsgruppen ausgeschlossen oder gar nicht in Erwägung gezogen. 99 Bisher wurde noch kein besserer oder allein spezifischer Marker für kardiale Progenitorzellen gefunden, der die jetzige Rolle des c-kit übernehmen könnte. Wieso die untersuchten Zellen teilweise nur langsam proliferierten und sich bisher nicht zu vollständig funktionierenden Kardiomyozyten differenzierten, bleibt weiterhin unklar. Für die typischerweise geringere Selbsterneuerungsfähigkeit der adulten Stammzellen gegenüber embryonalen Stammzellen ist unter anderem ein gewebeabhängig niedrigerer Telomerasespiegel verantwortlich. 30, 69, 189, 193 Ceselli et. al schlagen deswegen vor zu, nur Zellen mit hohem therapeutischem Potential für die Transplantation auszuwählen. Kurze Telomere können als Marker alte und durch Herzinsuffizienz geschädigte Zellen identifizieren, die bisher 27, 69 schlechtere Ergebnisse bezüglich der Verbesserung der Herzfunktion erbrachten Ausblick Die großen Erwartungen zur Behandlung der Herzinsuffizienz mit (adulten) Stammzellen konnten bisher noch nicht erfüllt werden. Die Lösungsansätze und Ergebnisse verschiedenster Arbeitgruppen unterschieden sich zum Teil beträchtlich und offenbarten weitere ungelöste Fragen. Vor einem ersten und erfolgreichen klinischen Einsatz beim Menschen müssen erst noch erfolgreiche, längerfristige und zahlreiche Tests am Tiermodell durchgeführt werden, die möglichst nebenwirkungsfrei signifikante Verbesserungen der Herzfunktion herbeiführen. Die dabei eingesetzte Methodik wird im Laufe dieser Versuche sicherlich noch verbessert werden können. Nebenwirkungen der Zelltransplantation könnten Arrhythmien, tumoröse Entartungen, Infektionen und Entzündungsreaktionen sein, insbesondere wenn die Integration dieser Zellen ins Myokard nicht angemessen funktioniert.

106 99 DISKUSSION Kardiosphären und CDC aus humanen adulten Explantaten zeigten bisher noch keine für Kardiomyozyten typischen Spontankontraktionen. Nur in der Kokultur mit neonatalen Kardiomyozyten der Ratte konnte dieses Reifheitsmerkmal nachgewiesen werden. Trotzdem konnten diese Zellen bei Transplantation in die Grenzzone eines Infarktes bei immundefizienten Mäusen die Herzfunktion verbessern und zeigten histologische Hinweise auf eine stattgefundene Regeneration. Die Kokultur von CDC mit neonatalen Zellen reicht aus unklaren Gründen aus, um die Proliferations- und Differenzierungsfähigkeit von adulten kardialen 124, 169 Progenitorzellen zu steigern. Auch das kann auf den Einfluss der Zell-Zell-Kontakte und parakrinen Faktoren bei der Steuerung der Zellentwicklung hinweisen. Diese Botenstoffe dürften in Zukunft vermutlich im Zentrum der Forschungen stehen. Um die Effektivität einer Zelltherapie zu erhöhen, muss die Fähigkeit zur Proliferation und zur gezielten Differenzierung gefördert werden. Die nachgewiesenen (inflammatorischen) Zytokine dürften Einfluss auf den komplexen Regelmechanismus der Vorläuferzellen haben. Versuche mit verschiedenen Wachstumsfaktoren wie FGF 169, 179 EGF 3 und IGF 43 zeigten bereits kleinere Erfolge. Es konnte auch nachgewiesen werden, dass humane CS und CDC selbst VEGF, HGF und IGF sezernieren, sich also selbst oder gegenseitig stimulieren. 34 Faktoren wie Oxytocin, Azacytidin, 145, 146 usw. konnten kardiomyogene Differenzierungen von selektionierten Progenitorzellen auslösen. Auch mesenchymale Stammzellen konnten durch Botenstoffe 73, 139 kardiale Stammzellen zu Proliferation und Differenzierung stimulieren. Das Ziel wäre hier die Entwicklung eines spezifischen Faktors, der die residenten kardialen Stammzellen zur Regeneration des defekten Herzmuskelareals befähigt. Vielleicht ließen sich die Progenitorzellen damit auch in situ zu Proliferation und Differenzierung bewegen. 68 Auch die Kulturbedingungen werden sich noch genauer an die Bedürfnisse der Zellen anpassen lassen. Möglicherweise kann die zielgerichtete Entwicklung der Progenitorzellen durch Schaffung einer bestimmten Umgebung von Zellen, EZM, Atmosphäre und Zellmedien günstig beeinflusst werden. Vermutlich ist dabei die Bildung einer sogenannten Nische, wie sie in der Kardiosphäre existieren mag, von Vorteil. 76, 192 Es hat sich beispielsweise herausgestellt, dass leicht hypoxische Verhältnisse das Wachstum und die Differenzierung der kardialen 110, 181 Progenitorzellen fördern. Für die klinische Anwendung ist die Kulturzeit momentan noch zu lang: für CS dauerte sie mindestens vier bis fünf Wochen; für CDC mindestens sechs bis acht Wochen. Auch deshalb wird die Hauptindikation für diese Zelltherapie vermutlich erst die chronische Herzinsuffizienz sein, da eine kurzfristige Verfügbarkeit von Progenitorzellen mit dieser Methode nicht möglich ist. Auch die direkt nach dem Infarktgeschehen stattfindende Inflammation verhindert eine

107 100 DISKUSSION erfolgreiche sofortige Zelltransplantation. 47 Der günstigste Zeitpunkt für die autologe Transplantation muss noch gefunden werden. Der sicherste und einfachste Applikationsweg für diese Zellen wäre vermutlich die perkutane koronare Intervention. Auch die endomyokardiale Biopsie könnte in Zukunft über diesen Zugang durchgeführt werden. Über den interventionellen Weg kann die für die Regeneration wichtige Reperfusion erfolgen. Hier erscheint auch erwähnenswert, dass neben der Ausbildung von Kardiomyozyten auch die Angiogenese durch multipotente Progenitorzellen nicht außer Acht gelassen werden sollte, weil sie für die Versorgung der entstehenden Zellen enorm wichtig sein dürfte. Am interessantesten wäre wohl die Beantwortung der Frage, wieso die im Herzen vorhandenen Zellen nicht selbst ausreichend zur Regeneration des Herzmuskels beitragen können. Liegt es an verstärkter Apoptoseauslösung, überschießender Inflammation, zu geringer Anzahl von Progenitorzellen, der vaskulären Minderversorgung oder einer Fehlregulation der Zellen? Bereits häufiger wurde versucht, die Regenerationsfähigkeit von Progenitor- und Stammzellen am infarzierten Herzen genau zu messen. Wegen unterschiedlicher Methodiken an mehreren Spezies und verschiedenen primären Endpunkten ist aber ein direkter Vergleich des 99, 170 regenerativen Potentials meist nicht möglich. Die Zelltransplantation von Progenitorzellen hat sicherlich großes Potential bei der Behandlung der chronischen Herzinsuffizienz. Welche Quelle und Verarbeitungstechniken der Zellen am erfolgreichsten in Zukunft eingesetzt werden können, kann derzeit noch nicht sicher beantwortet werden. Die Verwendung von adulten kardialen Vorläuferzellen unter Einbezug der Kultur von Kardiosphären, erscheint nach den bisherigen und im Rahmen dieser Arbeit größtenteils bestätigten Ergebnissen ein erfolgversprechender Ansatz zu sein. Die nach dieser vorgestellten Kulturmethode gewonnenen Zellen wurden noch nicht am Menschen angewandt. Es sind weitere Untersuchungen nötig, um diese Methode effizienter zu machen und die Differenzierung der entstehenden Zellen gezielter zu fördern. Eingriffe in die noch weitgehend unbekannten parakrinen Wechselwirkungen auf kardiale Vorläuferzellen dürften hierbei wichtige Angriffspunkte für die Erhöhung des Regenerationspotentials im Myokard bieten. Durch die Erforschung der kardialen Progenitorzellen könnte es zukünftig möglich sein, entweder diese zu vermehren und autolog zu transplantieren, oder auch spezifische Aktivatoren/Wachstumsfaktoren zu entwickeln, welche bei einer Herzinsuffizienz die Fähigkeit besäßen, ansässige Stammzellen anzuregen und zu unterstützen.

108 101 ANHANG 5 ANHANG 5.1 Materialien Zellkultur Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) 100Units/mL Penicillin, 100µg/mL Streptomycin L-Glutamin 2-Mercaptoethanol Trypsin B27 Cardiotrophin-1 bfgf EGF Endothelial Cell Growth Medium (E-CGM) Very low endotoxin Roswell Park Memorial Institute 1640 (VLE- RPMI 1640) Penicillin Streptomycin L-Glutamat Fötales Kälberserum (FCS) Trypanblau Accutase PBS Dimethylsulfoxid (DMSO) Thrombin Kryoröhrchen Nunclon Delta Surface mit Filterkappe, 25cm² Zellkulturflaschen: BD Falcon 25cm² und BD Falcon 75cm² Zellkulturschalen: BD 60*15mm und BD 100*20mm Invitrogen, Karlsruhe Promocell, Heidelberg Biochrom, Berlin PAA, Pasching, Österreich Sigma, Taufkirchen Nalge Nunc, Rochester, USA Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA Becton Dickinson, Heidelberg

109 102 ANHANG Falcon konisches Röhrchen: 15mL und 50mL Falcon Einwegpipette: 10mL und 25mL Fibronektin Poly-D-Lysin Kanülen: 40*0,8mm Zellkulturflaschen: Corning CellBIND Surface (25cm² und 75cm²) Reaktionsgefäße 2-Propanol (70%) THP-1 (Zelllinie) kleine Scheren und Pinzetten (steril) Tab.5-1: Materialien zur Zellkultur. Corning, Lowell, USA Eppendorf, Hamburg Brüggemann Alkohol, Heilbronn American Type Culture Collection, Wesel Immunzytochemie Protein Spezies Verdünnung Hersteller *c-kit Mouse 1/50 BD (bd555713) c-kit Mouse 1/50 Millipore (mab 1163) *MDR-1 Mouse 1/500 Millipore (mab 4334) *MDR (C-19) Goat 1/50 Santa Cruz (sc-1517) MDR (F4) mouse 1/500 Sigma (P7965) CD45 Goat 1/100 Santa Cruz (sc-1123) CD34 rabbit 1/100 Santa Cruz (sc-9095) Vimentin rabbit 1/5 (prediluted) Abcam (ab8545) Connexin43 mouse 1/50 Millipore (mab 3068) *Troponin I (C-4) mouse 1/50 Santa Cruz (sc ) *cardiac Troponin I mouse 1/50 Abcam (ab19615) cardiac Troponin T mouse 1/400 Abcam (ab10214) *GATA4 rabbit 1/500 Abcam (ab61767) GATA4 rabbit 1/200 Sigma (G8794) *MEF-2 (N-18) Goat 1/50 Santa Cruz (sc-13917) MEF2D mouse 1/200 BD (bd ) *nkx2.5 (A-16) Goat 1/100 Santa Cruz (sc-12514) *nkx2.5 (H-114) Goat im WB neg. Santa Cruz (sc-14033) nkx2.5 (N-19) Goat 1/100 Santa Cruz (sc-8697)

110 103 ANHANG FOXH1 rabbit 1/500 Millipore ( ) *ki-67 rabbit 1/200 Abcam (ab15580) Tab.5-2: Primärantikörper für die Immunfluoreszenz. Sie wurden von folgenden Herstellern bezogen: Abcam (Cambridge, UK); BD (Heidelberg); Millipore (Schwalbach/Ts.); Santa Cruz (Heidelberg). Mit * markierte Antikörper wurden getestet, jedoch ohne überzeugendes Ergebnis. Die dargestellten Verdünnungen wurden häufig variiert. DRAQ5 1/1000 Axxora, Lörrach (BOS ) Tab.5-3: Antikörper zur Kernfärbung Name Verdünnung Hersteller: Invitrogen, Karlsruhe Alexa Fluor 488 donkey anti-goat 1/500 Invitrogen (A11055) Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse 1/500 Invitrogen (A31570) Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit 1/500 Invitrogen (A31573) Alexa Fluor 488 goat anti mouse 1/500 Invitrogen (A11001) Tab.5-4: Sekundärantikörper Kammerobjektträger Lab-Tek II Nunc, Langenselbold Fluorescence Mounting Medium DAKO, Hamburg Deckgläschen Menzel-Gläser, Braunschweig Esel-Normalserum Ziegen-Normalserum Dianova, Hamburg Maus-Normalserum Kaninchen-Normalserum PFA BSA Triton-X-100 Methanol Sigma, Taufkirchen Ethanol LPS (Lipopolysaccharid) Tween-20 Dunkelkammer selbst hergestellt aus Frischhaltebox und Strohhalmen Tris Roth, Karlsruhe NaCl (Natriumchlorid) Tab. 5-5: weitere Materialien zur ICC

111 104 ANHANG Immunhistochemie CSA-System von DAKO DAKO-Pen DAKO-Küvette DAKO, Hamburg Aquatex Deckgläschen Menzel-Gläser, Braunschweig Roti-Histol Roth, Karlsruhe Ethanol Zitronensäure Sigma, Taufkirchen Dunkelkammer selbst hergestellt aus Frischhaltebox und Strohhalmen Tab.5-6: Materialien zur Immunhistochemie Western-Blot ECL-Plus Western Blot Detection Kit Pferdeserum PVDF-Membran Meerrettichperoxidase-konjugierte IgGs (anitrabbit, anti-goat) Complete Protease Inhibitor Cocktail Trishydroxymethylaminomethan (Tris) Glycin Bromophenol-Blau 30% Acrylamid/Bis-acrylamid Ammoniumperoxodisulfat (APS) Natriumdodecylsulfat (SDS) Proteinauftragspuffer Rotiload 1 Coomassie colloidal gel stain solution Methanol HEPES NaCl EDTA Triton-X-100 Tetramethylendiamin (TEMED) Protein-Standard Pierce Amersham, München PAA, Pasching, Österreich Macherey-Nagell, Düren Santa Cruz, Heidelberg Roche, Freiburg i. Br. Roth, Karlsruhe Sigma, Taufkirchen Santa Cruz, Heidelberg Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA

112 105 ANHANG Glycerol Zelllysate und Zellkernlysate: - für MEF-2: HeLa Whole Cell Lysate (sc-2200) - für nkx2.5: A549 Cell Lysate (sc-2413) - für GATA4: NIH/3T3 nuclear extract (sc-2138) Tab.5-7: Materialien für den Western-Blot Fluka, Taufkirchen Santa Cruz, Heidelberg Durchflusszytometrie Zytokin-Kits: Human Cardiovascular 6plex FlowCytomix Multiplex und Human svcam-1 FlowCytomix Simplex mit den Antikörpern gegen scd40l, IL-6, IL-8, MCP-1, P-Selectin, t-pa und svcam-1. Außerdem waren in diesem Paket eine Filterplatte, das Probenpufferkonzentrat, der Reagenzienverdünnungspuffer, die Standard-Lyophilisate, die fluoreszierenden Beads (Setup-Beads und Proben-Beads), die Biotin-Konjugat-Lösung, die Streptavidin-PE- Lösung und das Zytometer-Setup enthalten. Tab.5-8 Materialien für die Durchflusszytometrie Bender MedSystems, Wien, Österreich Geräte Begasungsbrutschrank: Digitalkamera: Durchflusszytometer: Feinwaage: Gefrierschrank (-80ºC): Heizblock: Mikroskope: INCO2/108 (Memmert, Schwabach) Nikon DXM1200, inkl. LUCIA Measurement 4.71 (Nikon, Düsseldorf) am Olympus IX70 FACS Calibur inkl. Cellquest-Pro-Software (Becton Dickinson, Heidelberg) BP221S (Sartorius, Göttingen) (Haereus, Hanau) Thermomixer Comfort (Eppendort, Hamburg) Olympus CK40 und Olympus IX70 (Olympus, Hamburg), Fluoreszenzmikroskop Aristoplan (Leitz, Wetzlar), konfokales Laserscanningmikroskop Bio-Rad MRC 1000 (Bio-Rad, München) mit Krypton-Argon-Mischgaslaser (Melles Griot, Bensheim) an Nikon Diaphot 300 (Nikon, Düsseldorf), konfokales Fluoreszenzmikroskop Nikon Eclipse 1000 C1 (Nikon, Düsseldorf),

113 106 ANHANG Elektronenmikroskop Zeiss EM 906 (Zeiss, Oberkochen) mit CCD- Camera-Controller (Schneider Systemtechnik, Germering) und Slowscan-CCD-Camera for TEM (Troendle, Moorenwies) Mikrowelle: Privileg 9021 (Privileg, Fürth) Photometer: Spectra Max plus (Molecular Devices, München) Soft Max Pro Software (Molecular Devices, München) Pipetten: Eppendorf Reference (Eppendorf, Hamburg) Gilson Pipetman (Gilson, Middleton, USA) Plattformschüttler: Unimax 1010, Duomax 1030 (Heidolph, Schwabach) Wasserbad: GFL Typ 1002 (GFL, Burgwedel) Werkbank: Hera safe HS12 (Thermo Fisher scientific, Waltham, USA) Elektrophorese-Gerät: Electrophoresis Power Supply EPS 201 (GE Healthcare, Freiburg) Elektrophoresekammer: Mighty Small Electrophoresis Chamber (Hoefer, Amstetten, Österreich) Filterplattenabsauggerät: Flow Cytomix Vacuum Manifold (Bender MedSystems, Wien, Österreich) Western Blot-Gerät: Trans-Blot semi-dry electrophoresis transfer cell (BioRad, München) Western Blot-Detektor: Luminescent Image Analyser LAS-1000 (Fujifilm Life Science, Düsseldorf) Zentrifugen: 3K15 und 4K15 (Sigma, Taufkirchen) Eppendorf 5417R (Eppendorf, Hamburg)

114 107 ANHANG Herstellung von Kulturmedien, Beschichtungen, Pufferlösungen und Reagenzien für die IHC und WB Die Materialien für die die Medien, Beschichtungen, Pufferlösungen und Reagenzien wurden von den oben erwähnten Firmen bezogen Herstellung von Kulturmedien Complete Explant Medium (CEM) für Explantatkulturen Medium Supplement (MS) Cardiosphere Growing Medium (CGM) für CS- und CDC-Kulturen Endothelial cell growth Medium (E-CGM) für HUVECs; Zellmedium für THP-1 - Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), - 100Units/mL Penicillin, - 100µg/mL Streptomycin, - 2mM L-Glutamin, - 0,1mM 2-Mercaptoethanol, - 20% Fötales Kälberserum (FCS). - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12), - 100Units/mL Penicillin, - 100µg/mL Streptomycin, - 2mM L-Glutamin, - 0,1 mm 2-Mercaptoethanol. - 35% CEM, - 65% MS, - 10% FCS. (Eine Variante des CGM wurde vor verglichen und schließlich nicht verwendet: sie enthielt: 35% CEM, 65% MS, 2% B27, 4nM Cardiotrophin-1, 10ng/mL bfgf, 5ng/mL EGF und 20nM Thrombin.) - Basalmedium für Endothelzellen - SupplementMix - VLE-RPMI (Very low endotoxin Roswell Park Memorial Institute 1640), - 1% Penicillin und Streptomycin, - 1% L-Glutamat, - 10% FCS

115 Herstellung von Beschichtungen 108 ANHANG Fibronektin-Lösung - für Explantat- und CDC-Kulturen; - 1mg Fibronektinpulver wurde in 10mL PBS aufgelöst, auf 40 Reaktionsgefäße aliquotiert und bei -20 C eingefroren. - Zur Beschichtung einer 25cm²-Kulturflasche werden 125µL aufgetaute Fibronektin-Lösung in 4mL PBS gelöst und auf den Flaschenboden aufgebracht. Nach mindestens 20 Minuten Inkubation bei 37 C wurde der Überstand verworfen und der Zellkulturboden mit 3mL PBS gespült. Poly-D-Lysin (PDL) -Lösung - für CS-Kulturen; - 20mg PDL-Pulver in 10mL DMEM/F12 aufgelöst, auf 40 Reaktionsgefäße aliquotiert und bei -20 C eingefroren. - Zur Beschichtung einer 25cm²-Kulturflaschen wurden 250µL PDL-Lösung in 4mL DMEM/F12 gelöst und auf den Flaschenboden aufgebracht. Nach einer Inkubation bei 37 C für mindestens 20 min, wurde der Überstand verworfen und der Zellkulturboden mit 3mL PBS gespült Pufferlösungen Tris-gepufferte Saline (TBS) Tris-gepufferte Saline-Tween 20 (TBS-T) - 121g Tris und - 180g NaCl - in ca. 1800mL Aqua dest.; - ph mit 37%iger Salzsäure auf ph 7,4 eingestellt; mit Aqua dest. auf 2 Liter aufgefüllt; - dieses 10*TBS zum Gebrauch mit Aqua dest. 10fach verdünnt - 2mL Tween-20 auf - 2 Liter 1*TBS (50mM Tris, 154mM NaCl)

116 109 ANHANG Reagenzien für die Immunhistochemie (IHC): - ca. 1800mL Aqua dest., Citratpuffer (10mM, ph 6) - 4,2g Zitronensäure (Nr. C-0759), - mit 2M NaOH auf ph 6,0 einstellen, - mit Aqua dest. auf 2 Liter auffüllen - 30 min vor Gebrauch angesetzt: Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex - 1mL Puffer des Verdünnungsmediums, - je ein Tropfen des Streptavidin-Biotin- Komplex-Reagenz A und B Tropfen des Tris-Pufferkonzentrats Chromogen-Substrat-Komplex - mit Aqua dest. auf 10mL aufgefüllt - eine Tablette des DAB-Chromogen Chromogen-Substrat - 2mL Chromogen-Substrat-Komplex - ein Tropfen 0,8% Wasserstoffperoxid. Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex, Chromogen-Substrat-Komplex und Chromogen- Substrat wurden im CSA-Kit mitgeliefert, mussten aber vor Gebrauch vorbereitet werden Reagenzien für Western Blot (WB): Kralewski-Puffer Lyse-Puffer - HEPES (ph 7,4 50 mm), - NaCl (150mM), - Triton-X-100 (1% w/v), - EDTA (1mM), - Glycerol (10%), - bei 4 C gelagert µL Kralewski-Puffer, - 40µL Proteaseinhibitoren (Complete)

117 ANHANG Weitere Ergebnisse der Antikörper-Positivkontrollen Immunhistochemie MDR am Kolonkarzinompräparat Abb.5-4 A-C: MDR lässt sich in Zellen des Kolonkarzinoms nachweisen. Die Pfeile in A und B zeigen kräftig angefärbte Zellmembranen. Auch in Abbildung C findet sich diese Lokalisation des Anti-MDRAntikörpers. Somit zeigt der Anti-MDRAntikörper eine normale Funktion in der Positivkontrolle Vimentin am Herzmuskelpräparat Abb.5-5A+B: Vimentin ist durch Anti-Vimentin-Antikörper an Gefäßendothel und Bindegewebszellen im Myokard und Epikard nachweisbar. Bild B stellt einen vergrößerten Ausschnitt aus Bild A dar. Es konnte eine normale Funktion des Anti-Vimentin-Antikörpers nachgewiesen werden.

118 111 ANHANG Immunzytochemie CD34 auf THP-1-Zellen Abb.5-2: Die LPS-stimulierten THP-1 Zellen erwiesen sich erwartungsgemäß positiv für CD34. Es konnte eine normale Funktion des verwendeten Anti-CD34-Antikörpers nachgewiesen werden CD45 auf THP-1-Zellen Abb.5-3: LPS-stimulierte THP-1 Zellen zeigten sich positiv für CD45. Die normale Funktion des Anti-CD45-Antikörpers konnte nachgewiesen werden c-kit auf HUVEC Abb.5-1: Der verwendete Anti-c-kit-Antikörper erzeugte auf den HUVEC ein kräftiges Fluoreszenzsignal. Durch die Positivkontrollen konnte eine normale Funktion des Antikörpers nachgewiesen werden.