Mentype Nonaplex QS Anwendung mit dem ABI 3500

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1 Mentype Nonaplex QS Anwendung mit dem ABI 3500 Kurzanweisung zur Anwendung der Verwendung der Mentype Nonaplex QS Produkte mit dem ABI , 400, Mai Biotype Diagnostic GmbH Moritzburger Weg 67 D Dresden Germany Made in Germany

2 2 Inhalt 1. Elektrophorese mit ABI PRISM 3500/3500xL Genetic Analyzer Spektralkalibrierung / Matrixerstellung Vorbereitung des Matrix Standards zur Spektralkalibrierung Vorbereitung des Instruments Durchführung der Spektralkalibrierung Matrix prüfen Probenvorbereitung Signalintensitäten Einstellungen für den Run Erstellen des Instrument Protocol Einstellungen für den Längenstandard Einrichten des QC (Size Calling) Protocol Starten des Runs... 10

3 3 Anwendung der Mentype Nonaplex QS Produkte mit dem ABI Elektrophorese mit ABI PRISM 3500/3500xL Genetic Analyzer Allgemeine Anweisungen zum Analysegerät, zur Spektralkalibrierung und der Anwendung der Applied Biosystems 3500 Series Data Collection Software Version 1.0 und der GeneMapper ID-X software Version 1.2, können dem entsprechenden Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzers User Guide entnommen werden. Das 8-Kapillarsystem trägt die Bezeichnung AB 3500, das 24-Kapillarsystem heißt ABI 3500xL. Für den kombinierten Einsatz der vier Fluoreszenzfarbstoffe 6-FAM, HEX, NED und R0X ist die Nutzung des virtuellen Filter Sets DS-30 vorgesehen. Material Kapillare Polymer Puffer 36 cm Capillary Array for 3500/3500xL POP-4 Polymer for 3500/3500xL 10x Genetic Analyzer Buffer with EDTA for 3500/3500xL 1.1 Spektralkalibrierung / Matrixerstellung Vor der Durchführung der Fragmentlängenanalyse muss zunächst eine Spektralkalibrierung mit PCR-Fragmenten der entsprechenden vier Fluoreszenzfarbstoffe 6-FAM, HEX, NED und ROX für das jeweilige Analysegerät durchgeführt werden. Auf diese Weise wird eine Matrix erstellt, die das Überlappen der farbspezifischen Fluoreszenzemissionsspektren korrigiert. Die Spektralkalibrierung gliedert sich in die folgenden Abschnitte: - Vorbereitung des Matrix Standards zur Spektralkalibrierung - Laden des Standards in die 96-Well Platte (je Kapillare eine Probe) - Vorbereitung des Instruments für die Erstellung Dye Set DS-30 - Durchführung des Laufs zur Spektralkalibrierung und prüfen der Matrix

4 4 1.2 Vorbereitung des Matrix Standards zur Spektralkalibrierung Beispiel für 8 Kapillaren/ABI 3500 Komponente Volumen Hi-Di Formamide µl Matrix Standard DS µl -12 μl des Gemisches in eine 96-Well Platte laden, z.b. Position A1-H1-3 min bei 95 C denaturieren - abkühlen auf 4 C und zur Analyse in das Gerät stellen Beispiel für 24 Kapillaren/ABI 3500xL Komponente Volumen Hi-Di Formamide µl Matrix Standard DS µl -12 μl des Gemisches in eine 96-Well Platte laden, z.b. Position A1-H1, A2-H2 and A3-H3* - 3 min bei 95 C denaturieren - abkühlen auf 4 C und zur Analyse in das Gerät stellen * Bei Verwendung einer 384-Well Platte sollten 10 μl des Gemisches in die Positionen 1, 3, und 5 der Reihen A, C, E, G, I, K, M, und O gegeben werden. 1.3 Vorbereitung des Instruments Stellen Sie sicher, dass vor der Spektralkalibrierung eine Spatial Calibration erfolgt ist. Dieser Schritt ist nur nach dem Einbau eines neuen Capillary Arrays nötig. Der Prozess ist detailliert im Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzers User Guide aufgeführt. Vorbereitung des Dye Set DS-30 Vor der Spektralkalibrierung muss das Dye Set für den Matrix Standard DS-30 eingerichtet werden. 1. In Library wählen Sie Analyze und Dye Sets und klicken dann Create. 2. Bennennen Sie das Dye Set unter Dye Set Name z.b. DS Wählen Sie Matrix Standard als Chemistry und F-Template als Dye Set Template. 4. Unter Calibration Peak Order müssen die Farben, wie folgt aufgeführt, zugeordnet werden: 4 blue, 3 green, 2 yellow und 1 red. 5. Im Feld Parameters müssen keine Änderungen vorgenommen werden. 6. Klicken Sie Save, um die Änderungen zu bestätigen.

5 5 Abb. 5 Einstellungen für die Spektralkalibrierung des Dye Set DS Durchführung der Spektralkalibrierung Geben Sie die Multi-Well Platte nach Beladen mit dem Gemisch für die Spektralkalibrierung in den Autosampler und starten Sie die Spektralkalibrierung. 1. Wählen Sie Maintenance auf dem Dashboard der 3500 Series Data Collection Software, um den Spectral Calibration Screen zu öffnen. 2. Die Anzahl der Kavitäten der Multi-Lochplatte sowie deren Position im Instrument muss angegeben werden. 3. Wählen Sie Matrix Standard als Chemistry Standard und DS-30 für das Dye Set (zuvor erstellt). 4. Aktivieren sie Allow Borrowing (optional). 5. Klicken Sie Start Run.

6 6 Abb. 6 Elektropherogramm der Spektralkalibrierung mit dem Matrix Standard DS-30 auf dem ABI 3500 Instrument. 1.5 Matrix prüfen -Jede Kapillare sollte einen Qualitätswert (Q Value) größer als 0.8 sowie eine Konditionszahl (Condition number range) zwischen 1 und 20 haben - Bewerten Sie, ob eine stabile Basislinie vorhanden ist. Es müssen vier Peaks mit Peakhöhen von mind RFU (Y-Achse) in jeder Kapillare erkennbar sein (optimaler Bereich: RFU), siehe Abbildung - Eine erfolgreiche Kalibrierung wird für jede Kapillare in Overall in grün angezeigt. - Wurden alle Kapillaren erfolgreich kalibriert klicken Sie Accept Results - War die Kalibrierung nicht erfolgreich klicken Sie Reject Results. In diesem Fall verweisen wir auf das Kapitel spectral calibration troubleshooting des Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzers User Guides

7 7 1.6 Probenvorbereitung Komponente Volumen Hi-Di Formamide 12.0 µl DNA Size Standard 550 (ROX) 0.5 µl 12 µl Gemisch (Formamid + DNA Size Standard) für alle Proben vorlegen 1 µl PCR-Produkt (ggf. verdünnt) oder Allelleiter zugeben - 3 min bei 95 C denaturieren - abkühlen auf 4 C und zur Analyse in das Gerät stellen Da die Injektion gleichzeitig an allen Kapillaren stattfindet, müssen am Mehrkapillargerät immer 8 oder 24 Proben auf der Platte pipettiert werden. Falls weniger Proben zu messen sind, müssen die entsprechenden Positionen mit 12 µl Hi-Di Formamide aufgefüllt werden. Um eine sichere Allelzuordnung am Mehrkapillargerät zu gewährleisten, sollten unabhängig von der Probenanzahl mehrere Allelleitern mitlaufen. Die Raumtemperatur kann das Laufverhalten der PCR-Produkte an Mehrkapillargeräten stark beeinflussen und bei zu geringer Temperatur zum Auftreten von Doppelpeaks (Split Peaks) führen. Unter Umständen nimmt die Temperatur auch Einfluss auf die Laufgeschwindigkeit der Fragmente. Bitte achten Sie darauf, dass die vom Gerätehersteller empfohlene Arbeitstemperatur eingehalten wird. Optimal sind stabile Raumtemperaturen > 22 C. 1.7 Signalintensitäten Möglichkeiten zur Erhöhung der Signalintensitäten: - Reduzierung der Anteile am DNA Längenstandard 550 (ROX) auf Peakhöhen von ca. 500 relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) - Aufreinigung der PCR-Produkte vor der Analyse 1.8 Einstellungen für den Run Für den ersten Run mit der Anwendung Mentype Nonaplex QS müssen spezifische Protokolle innerhalb der 3500 Series Data Collection Software erstellt werden.

8 8 1.9 Erstellen des Instrument Protocol - In Library wählen Sie Analyze / Instrument protocol und klicken Create - Ändern Sie die Parameter wie in der Tabelle unten aufgeführt: Instrument Protocol für Mentype Nonaplex QS Parameter Einstellung Application Type HID / Microsatellite Capillary Length Polymer Dye Set DS-30 Run Module Protocol Name z..b. Mentype Nonaplex Oven Temperature [ C] Run Voltage [kv] Injection Voltage [kv] 3.0 Run Time [s]** 1320 PreRun Time [s] Injection Time [s]* 10 Data Delay Time [s] Advanced Options * Abweichend von den Standardeinstellungen kann die Injektionszeit je nach Probentyp zwischen 1s und 20s variiert werden. Bei Proben mit sehr hoher Signalintensität (z.b. Referenzproben) sollte eine geringere Injektionszeit gewählt werden, um pull-up Peaks zu vermeiden. Bei Proben mit niedriger DNA-Konzentration oder kritischen Patientenproben kann eine Injektionszeit von bis zu 20s erforderlich sein. ** Abhängig von den Analysebedingungen sollte die Run Time für Mentype Nonaplex QS so angepasst werden, dass Fragmente bis zu einer Länge von 450 bp analysiert werden können. - Klicken Sie Save um die Einstellungen zu bestätigen 1.10 Einstellungen für den Längenstandard - In Library wählen Sie Analyze / Size Standards und klicken Create - Ändern Sie die Parameter wie in der Tabelle unten aufgeführt: Parameter Size Standard Dye Color Einstellung ROX_550 Red Der DNA Size Standard 550 (ROX) muss mit folgenden Fragmentlängen angewendet werden: 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 425, 450, 475, 500, 525, und 550 bp - Klicken Sie Save, um die Einstellungen zu bestätigen

9 Einrichten des QC (Size Calling) Protocol - In Library wählen Sie Analyze / QC (Size Calling) und klicken Create - Ändern Sie die Parameter wie in der Tabelle unten aufgeführt: Parameter Protocol Name Size Standard Sizecaller Einstellung Name z.b. ROX_550 ROX_550 (vorher eingerichtet) Size Caller v In Analysis Settings / Peak Amplitude Treshold wählen Sie Disable Purple und Orange. Alle anderen Farben müssen aktiviert sein - Alle anderen Einstellungen bleiben auf default - Klicken Sie Save, um die Einstellungen zu bestätigen Etablieren des Assays - In Library wählen Sie Manage / Assays und klicken Create - Ändern Sie die Parameter wie in der Tabelle unten aufgeführt: Parameter Assay Name Color Application Type Instrument Protocol QC Protocols Genemapper Protocol Einstellung z.b. Mentype Nonaplex HID z.b. Mentype Nonaplex z.b. ROX_550 could be defined - Klicken Sie Save, um die Einstellungen zu bestätigen.

10 Starten des Runs - Die vorbereitete 96-Well Platte in den Autosampler setzen - Im Dashboard der Data Collection Software klicken Sie Create New Plate - In Define Plate Properties wählen Sie Plate Details - Ändern Sie die Parameter wie in der Tabelle unten aufgeführt: Platten Details Parameter Einstellung Name z.b. Mentype Nonaplex Number of Wells 96 or 384 Plate Type* HID Capillary Lenght 36cm Polymer POP4 - Klicken Sie Assign Plate Contents, um die Einstellungen zu bestätigen - Definieren Sie die Position jeder mit einer Patientenprobe oder Allelleiter belegten Kavität für die Data Collection und Auswertung - Ordnen Sie jeder benannten Kavität ein Assay (erforderlich), File Name Conventions und eine Result Group zu - Klicken Sie Link the plate for Run und geben Sie den Name des Runs ein - Klicken Sie Start Run