WHITE PAPER. Wie finde ich die richtige Digitalkamera für meine Mikroskopie-Anwendung? Inhalt. 1. Monochrom- oder Farbkamera?

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1 WHITE PAPER Wie finde ich die richtige Digitalkamera für meine Mikroskopie-Anwendung? In verschiedensten Anwendungsbereichen der optischen Mikroskopie findet man heutzutage Bildverarbeitung. Beispiele hierfür sind medizinische und biologische Forschung, Diagnostik, Arzneimittelprüfung oder Materialwissenschaften. Mikroskopie eröffnet den direkten Zugang zum Studium von Struktur und Funktion unterschiedlichster Objekte. Doch selten ist es möglich, alle gewünschte Information mit nur einer Methode zu gewinnen. Daher wurden mit der Zeit viele unterschiedliche Mikroskopie-Techniken entwickelt, die eine Vielzahl von Darstellungsmöglichkeiten und Auflösungen bieten. Dieses White Paper beleuchtet die verschiedenen Aspekte, die bei der Kameraauswahl zu beachten sind. Inhalt 1. Monochrom- oder Farbkamera? Sensortypen (CCD vs. CMOS), Verschlusstechnik, Bildwiederholrate Auflösung, Sensor- und Pixelgrößen Gekühlte CCD/CMOS-Sensoren versus nicht gekühlte CCD/CMOS-Sensoren in Mikroskopie- Anwendungen Schnittstelle Fazit...08 Grundlage für den Einsatz der Bildverarbeitung in der Mikroskopie ist zunächst die optimale Auswahl der Komponenten für die entsprechende Mikroskopie- Anwendung. Dazu zählt neben dem Mikroskop selbst auch die Auswahl der richtigen Objektive, der Beleuchtung, Filtersätze und Polarisatoren, je nach Verwendung von Farbstoffen und Kontrastverfahren. Die speziellen Anforderungen der Anwendung sind nicht zuletzt auch maßgeblich für die Auswahl der geeigneten Mikroskopie-Kamera sowie einer passenden Bildverarbeitungssoftware. Die digitale Mikroskopie-Kamera macht das mikroskopische Bild in optimaler Weise in Form von Bilddaten verfügbar. Die Bilddaten können erfasst, gespeichert, gedruckt oder in Dokumente eingebunden werden. Im PC oder im mobilen Endgerät können die Bilddaten der Mikroskopie-Kamera mit Hilfe spezieller Software digital bearbeitet oder ausgewertet werden. Bilder der digitalen Mikroskopie-Kamera können bequem am großen Monitor dargestellt werden und sind damit live für Demonstrations- oder Beobachtungszwecke vorhanden. Doch wie finde ich die richtige Digitalkamera für meine Mikroskopie-Anwendung und worauf muss ich bei der Wahl achten? Typischer Mikroskopie-Arbeitsplatz für Routine- Laboranwendungen mit einem binokularen inversen Mikroskop (vorne) und einem aufrechten Mikroskop (im Hintergrund). 1. Monochrom- oder Farbkamera? Farbkameras sind sehr flexibel einsetzbar und insbesondere aus dem breiten Feld der konventionellen Lichtmikroskopie nicht mehr wegzudenken. Viele mikroskopische Routineanwendungen im biomedizinischen und klinischen Laborbereich sowie in Industrie und Materialforschung basieren auf konventioneller Lichtmikroskopie unter Ausnutzung unterschiedlicher Beleuchtungs- und Kontrastierungsverfahren. Häufig kommen zusätzlich spezielle Färbetechniken an mikroskopischen Präparaten zum Einsatz, die eine detaillierte Betrachtung ansonsten kontrastarmer Strukturen ermöglichen, so z. B. im Rahmen der histopathologischen Diagnostik von Krankheiten und zum Monitoring von Krankheitsverläufen. Farbtreue und Farbwiedergabe bei Mikroskopie-Aufnahmen sollten daher so genau wie möglich sein, um feinste Strukturen in Materialen oder biologischen Proben reproduzierbar differenzieren zu können. Digitale Farbsensoren in Mikroskop-Kameras verwenden zur Erfassung der Farbinformation verschiedenfarbige Filter, die auf den Sensorchip aufgebracht sind. 1

2 Monochrom-Sensor (links) und Sensor mit Farbfilter in Form des Bayer-Patterns auf einem Sensorchip (rechts). Um die gleiche echte Auflösung zu erreichen, werden beim Farbsensor häufig kleinere, dafür aber mehr Pixel verwendet. Der schwarze Bereich symbolisiert einen Punkt der Abbildung. Typische Farbsensoren erfassen nur eine Farbe pro Bildpunkt, es werden aber meist alle Farben für jeden Bildpunkt ausgegeben. Hierfür werden für jeden Bildpunkt die Informationen auch der benachbarten Pixeln verwendet. Um jedem Sensorpixel die volle Farbinformation zuordnen zu können, müssen die Lücken für jede der drei Grundfarben mit interpolierten Werten aufgefüllt werden ( De-Bayering ). Das kann zu Interpolationsartefakten führen und der Farbfilter führt zu einer reduzierten Effizienz der Lichtaufnahme, insbesondere unter schwierigen Lichtbedingungen. Trotzdem kann eine Vielzahl von Anwendungen mit durchaus niedriger Lichtintensität, wie z. B. in der Standard-Fluoreszenzmikroskopie, durch Farbkameras mit entsprechend hoher Empfindlichkeit abgedeckt werden. Farbkameras eignen sich hervorragend für Mikroskope, die das Arbeiten im Hellfeld- und Dunkelfeld, optional in Kontrastverfahren sowie auch im Fluoreszenzbereich erlauben. Sie eignen sich auch für die gleichzeitige Beobachtung und Dokumentation von mehreren Fluorophoren unter Verwendung von Multiband-Filtern. monochromen Kamera nicht. Jedoch befindet sich beim monochromen Sensor oft ein flächiges IR-Cut- Filter vor dem Sensor, der Infrarotanteile der Lichtquelle beseitigt. Diese Anteile tragen bei vielen Anwendungen nicht zur Bildinformation bei und reduzieren ansonsten lediglich den Bildkontrast. Wenn man also auf die Farbinformation verzichten kann, gewinnt man dafür Empfindlichkeit und Informationsgehalt. Damit eignen sich Monochrom-Kameras perfekt für die Anwendung in der anspruchsvollen Fluoreszenzmikroskopie. Belichtungszeiten können verkürzt und damit empfindliche Fluoreszenzproben geschont werden. Die lichtempfindlicheren Sensoren liefern rauscharme Abbildungen, auch bei schwachen Lichtsignalen. Spezielle NIR-Varianten der Sensoren bieten ein verbessertes Sensitivitätsspektrum bis in den Nah-Infrarotbereich. Fluoreszenzmikroskopisches Bild lebender menschlicher Melanom-Zellen: nach Fluoreszenzfärbung erscheinen bestimmte zytoplasmatische Bestandteile in grüner und der Zellkern in blauer Fluoreszenz. 2. Sensortypen (CCD vs. CMOS), Verschlusstechnik, Bildwiederholrate Der nächste wichtige Schritt ist die Frage nach dem geeigneten Sensor. Aus technologischer Sicht unterscheidet man hier zwischen CMOS- und CCD-Sensoren. Außerdem überlegt man, welche Bildwiederholrate nötig ist, d: h. wie viele Bilder pro Sekunde die Kamera liefern muss, um ihre Aufgabe lückenlos zu erfüllen. Lichtmikroskopisches Bild von Nierengewebe: zur Unterscheidung verschiedener Zell- und Gewebestrukturen wurde ein feingeweblicher Schnitt mit Hämatoxylin und Eosin (HE-Färbung) angefärbt. Lückenlose Information über die Helligkeitswerte auf dem Bildsensor, wenngleich ohne Farbinformation, liefert die Monochrom-Kamera. Hier steht die Information für jeden Bildpunkt ohne weitere Berechnung zur Verfügung. Ein Verlust von Intensität, wie sie bei der Farbkamera durch die Absorption von Lichtenergie durch die Farbfilter zustande kommt, gibt es bei der Sensortypen Auf dem Markt für Bildsensoren für Mikroskopie- Kameras gibt es eine breite Palette an CCD- (charge coupled device) und CMOS- (complementary metal oxide semiconductor) basierten Sensoren. Diese Sensortypen unterscheiden sich grundlegend im technischen Aufbau und haben dadurch ihre charakteristischen Eigenschaften. Die Wahl des richtigen Sensortyps hängt von der Anwendung ab. Sowohl CCD- als auch CMOS Sensoren wandeln Licht (Photonen) in elektrische Signale um. Interessant sind ihre unterschiedlichen Eigenschaften und wie sich diese im Zuge der technischen Weiterentwicklung verändert haben. 2

3 Welche Eigenschaften zeichnen Kameras mit CCD- Sensoren aus? Im Allgemeinen sind bei CCD-Sensoren der geringe Rauschfaktor, der hohe Füllfaktor, ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis sowie die Farbtreue für Bilder mit sehr hoher Bildqualität verantwortlich. Diese Eigenschaften machen Kameras, die auf CCD-Sensoren basieren, zu einer guten Wahl für Anwendungen bei denen wenig Licht zur Verfügung steht. CMOS-Sensoren sind heute zum Teil besser als viele CCD-Sensoren. Sie haben in den letzten Jahren im Vergleich zu CCD-Sensoren aufgeholt und eine grundlegende Weiterentwicklung erfahren. Inzwischen haben sie dank ihrer hohen Geschwindigkeit (Bildrate) und Auflösung (Anzahl der Pixel), der geringeren Leistungsaufnahme, der inzwischen verbesserten Rauscheigenschaften, Dynamik, Quanteneffizienz und verbesserter Farbkonzepte ihren Weg in Bereiche gefunden, die vorher CCD-Sensoren vorbehalten waren. Das gilt auch für die Mikroskopie, wo insbesondere hohe Geschwindigkeit und neue Farbkonzepte moderner CMOS- Sensoren für exzellente Live-Bilder sorgen. Für viele Systeme steht die Betrachtung verzögerungsfreier Live-Bilder direkt am Monitor im Vordergrund, was ein flüssiges Durchmustern von Präparaten sowie schnelles Fokussieren erlaubt. Das menschliche Gehirn nimmt ca. 14 bis 16 Bilder pro Sekunde wahr, deutlich mehr bei trainierten Menschen. Die Bildfrequenz normaler Kinofilme beträgt 24 fps, in neuesten Produktionen sogar 48 fps. Idealerweise liegt die Bildwiederholrate für eine Standard-Mikroskop-Kamera innerhalb dieses Bereiches. Aber nicht nur flüssige Wiedergabe, sondern auch gute Bildqualität und -schärfe bewegter Bilder definieren den Komfort während des Live-Monitoring. Hier bietet die Progressive Scan Technologie einen entscheidenden Vorteil. Für automatisierte Anwendungen, bei denen neben Bildqualität ebenfalls hoher Durchsatz im Vordergrund steht, können deutlich höhere Frameraten wichtig sein so z. B. für das automatisierte Scannen des Probenbereichs, für automatisiertes Fokussieren sowie multiple Aufnahmen zur Abbildung der gesamten Probe innerhalb kürzester Zeit. Verschlusstechnik (Shutter) Verbunden mit der Wahl des Sensors ist auch die Wahl der Verschlusstechnik. CMOS-Flächensensor Angesichts der Entwicklungen der letzten Jahre sind auch für die Zukunft interessante Neuerungen in der CMOS-Technologie zu erwarten. Der Trend am Markt zeigt, dass neueste CMOS-Technologie die CCD- Technologie in großem Maße ersetzen wird. Bildwiederholrate Dieser Begriff wird synonym mit Bildrate oder Bildfrequenz verwendet. Häufig werden Sie auch auf die englischen Begriffe frame rate oder die Abkürzung fps -frames per second stoßen. All diese Begriffe bezeichnen die Anzahl an Bildern pro Sekunde, die der Sensor aufnehmen und übertragen kann. Je höher die Bildrate, also je schneller der Sensor, desto mehr Aufnahmen pro Sekunde, und demzufolge auch höheres Datenvolumen können übertragen werden. Welche Bildrate möglich und erforderlich ist, hängt davon ab, mit welchen Mikroskop-Systemen die Kameras betrieben werden und was die Kameras im Mikroskop erfassen müssen. Man unterscheidet hier zwischen Global und Rolling Shutter. Der Shutter zu Deutsch: der Verschluss schützt den Sensor in der Kamera vor Licht und öffnet sich im Moment des Auslösens. Die eingestellte Verschluss- oder Belichtungszeit sorgt für die richtige Dosierung des Lichts und bestimmt, wie lange der Verschluss offen bleibt. CCD-Sensoren verfügen grundsätzlich nur über Global Shutter, CMOS-Sensoren bieten beide Modellvarianten. Der Unterschied zwischen beiden Shutter-Varianten liegt in der Art, wie der Sensor Bilder belichtet: Beim Global Shutter wird der gesamte Sensor gleichzeitig belichtet, d.h. das Licht trifft gleichzeitig auf die gesamte Sensoroberfläche. Sensoren mit Rolling Shutter hingegen belichten sukzessive Zeile für Zeile in schneller zeitlicher Folge (innerhalb von Mikrosekunden). Durch die Weiterbewegung des Objekts während der Belichtung können je nach gewählter Belichtungszeit und Geschwindigkeit des Objekts Verzerrungen entstehen. Dieser Effekt wird als Rolling Shutter-Effekt bezeichnet. In der Mikroskopie gibt es durchaus Situationen, z. B. während sehr schneller Bewegung der Probe/des Probentisches oder bei der Beobachtung hochdynamischer Vorgänge, in denen sich dieser Effekt ungünstig auswirkt. Für die meisten Standardanwendungen jedoch sind Sensoren mit Rolling Shutter sehr gut einsetzbar, zumal sie gegenüber Sensoren mit Global 3

4 Shutter einige Vorteile bieten. Durch das geringere Auslese-Rauschen glänzen sie mit deutlich höherem Dynamikbereich. Bei hoher Dynamik können detaillierte Strukturinformationen besonders gut aufgenommen und ausgewertet werden. Zudem hat man mithilfe von Belichtungszeiten innerhalb gewisser Grenzen die Möglichkeit, dem Rolling Shutter-Effekt vorzubeugen. Einige der leistungsfähigsten CMOS-basierten Kameras für wissenschaftliche Anwendungen arbeiten im Rolling Shutter-Modus. 3. Auflösung, Sensor- und Pixelgrößen Zunächst einmal verliert der Begriff der Vergrößerung, welche sich bei der herkömmlichen Mikroskopie aus den Vergrößerungen von Objektiv und Okular zusammensetzt, in der digitalen Bildverarbeitung seine ursprüngliche Bedeutung. Ein digitales Bild kann in unterschiedlichen Größen ausgedruckt oder an verschieden großen Displays dargestellt werden. Wichtig dagegen bleibt die optische Auflösung des Objektivs, die hauptsächlich durch die numerische Apertur des Objektivs (NA) gegeben ist. Der Begriff der Auflösung begegnet einem auch in der Welt der digitalen Kamerasensoren. Häufig wird er verwendet, um die Anzahl aller Pixel auf einem Sensor anzugeben. Eine Kamera habe z. B. eine Auflösung von 8 MegaPixel. Gemeint damit ist, dass das Bild, das von der Optik auf den Sensor projiziert wird und dann dort mit 8 Mio. Pixeln aufgelöst wird. Nach dieser Begrifflichkeit gibt es typischerweise Sensoren mit Auflösungen zwischen 1 MegaPixel bis 32 MegaPixel. Aussagekräftiger ist dagegen die Angabe der Pixel- Auflösung. Würde man die Kantenlänge eines Kamera- Pixels rückwärts durch die Optik auf das Objekt verfolgen, bezeichnet die Pixelauflösung entsprechend die Länge einer Strecke auf dem Objekt, die von einem Kamerapixel idealerweise erfasst werden könnte. Bei einer Mikroskop-Kamera sollte bei keinem der verwendeten Objektive am Mikroskop die Pixelauflösung schlechter als die optische Auflösung des Objektivs sein. Stattdessen empfiehlt sich eine Pixelauflösung, die mindestens drei Mal so groß ist wie die optische Auflösung des Objektivs. Numerische Aperturen bei Mikroskop-Objektiven bewegen sich im Bereich zwischen 0,1 (typ. für 4fach vergrößerndes Objektiv) und 1,3 (typ. für 100fach) entsprechend einer optischen Auflösung von 3,4 m bis 0,26 m bewegen, für die kleinsten optisch aufgelösten Strukturen eine ausreichende Anzahl an Pixeln zur Verfügung stellen. Arbeiten Sie beispielsweise mit kleinen Vergrößerungen, benötigen Sie eine Kamera mit entsprechend hoher Auflösung für die ideale Erfassung und Abbildung aller Details des mikroskopischen Bildes. Hier können Auflösungen von 5 MegaPixel oder mehr durchaus sinnvoll sein. Bei großen Vergrößerungen hingegen liefert solch eine hohe Auflösung aufgrund der Limitierungen des optischen Systems häufig keine zusätzliche Bildinformation. Je nach Anwendung sind hier 3 bis 5 MegaPixel zumeist völlig ausreichend. Das gleiche Bild von einer Kamera mit unterschiedlicher Pixelanzahl aufgenommen. Auflösung Der Begriff Auflösung bezeichnet in der Mikroskopie den minimalen Abstand dmin, den zwei kontrastreiche Objekte haben dürfen, damit sie im Mikroskop noch als zwei Objekte erkannt werden können und nicht im Bild schon zu einem Objekt verschmelzen. Beim konventionellen Lichtmikroskop ist bei optimaler Beleuchtung die Auflösung bestimmt durch die Wellenlänge des verwendeten Lichtes λ (für Rechnungen wir in der Regel 550 nm eingesetzt) und die numerische Apertur NA des eingesetzten Mikroskop-Objektivs. Es gilt das Rayleigh-Kriterium: dmin = 0,61 λ/na. Achten Sie auch auf die Pixelgröße. Bei sehr kleinen Pixeln setzt die Optik Grenzen in Bezug auf die kleinsten auflösbaren Strukturen. Sinnvoll sind für monochrome Sensoren Pixelbreiten von 5 m oder mehr und für Farbsensoren Pixel ab einer Seitenlänge von 2,5 m. Sensorgröße und Sehfeld / Field of View (FOV) Ist größer in jedem Fall besser? Vorteil eines großen Sensors ist seine große Fläche, auf der viele Pixel, also eine hohe Auflösung, Platz finden. Der eigentliche Vorteil dabei ist, dass die einzelnen Pixel hier immer noch groß genug sind, um ein gutes Signal-Rausch- Verhältnis zu garantieren im Gegensatz zu kleineren Sensoren, auf denen weniger Fläche für weniger große Pixel zur Verfügung steht (siehe auch Abschnitt Pixelgröße und Sensitivität). 4

5 Wie groß muss nun aber der Sensor tatsächlich sein? Hier spielt neben gewünschter Pixelgröße und Pixelzahl vor allem auch die optimale Abbildung des Sehfeldes (Field of View, FOV) eine wichtige Rolle. Adaption einer digitalen Mikroskop-Kamera an ein Mikroskop Kamerafokus Zwischenbild ohne Nachvergrößerung Kameraadapter mit integrierter Vergrößerungslinse Okularfokus Trinokulartubus Tubuslinse Mikroskopobjektiv Objektebene Lichtquelle Stark vereinfachte, schematische Darstellung der Adaption einer digitalen Mikroskop- Kamera an ein Durchlichtmikroskop. Entscheidend für eine perfekte Abbildung des Objektes sind u.a. sowohl die korrekte Lage der Bildebene sowie die korrekte Größe des Bildfeldes. Je nach Mikroskop-Typ und Kamera gibt es auf dem Markt eine Vielzahl unterschiedlicher Kameraadapter, z. B. zum Einstecken in den Okularschacht oder wie hier gezeigt zur Montage an den Trinokulartubus, typischerweise für C-Mount-Gewinde, aber auch für CS-Mount oder Bajonettverschluss. Sensorgrößen digitaler Mikroskop-Kameras liegen typischerweise bei 1/3" bis 1". Um einen optimalen Bildausschnitt übertragen zu können, ist es häufig notwendig, mit einer zusätzlich in den Kamera adapter integrierten Zwischenoptik zur Bildverkleinerung oder nachvergrößerung zu arbeiten. Das Bild des Objektivs wird durch das Okular seinerseits vergrößert. Den maximalen Durchmesser des Bereichs, den das Okular noch scharf vergrößern kann, nennt man Sehfelddurchmesser (FoV des Okulars). Sehfelddurchmesser des Okulars und Bildfelddurchmesser des Objektivs sollten aufeinander angepasst sein, um die optimale Abbildungsleistung des analogen Mikroskops zu erreichen. Wie groß das Bildfeld des Objektivs für ein bestimmtes Mikroskop ausgelegt ist, kann man daher u.a. auch am Sehfelddurchmesser (der Sehfeldzahl) eines Okulars für dieses Mikroskop ablesen. Gängige Sehfeldzahlen für Okulare sind z. B. 18, 20 oder 22 mm. Aber auch Sehfelddurchmesser von mehr als 23 oder 25 mm sind in der Praxis nicht selten zu finden. Adaptiert man eine Mikroskop-Kamera über den passenden Trinokulartubus (zumeist mittels C-Mount- Anschluss) oder den Okularstutzen an das Mikroskop, so umgeht man für die Kamera die Optik des Okulars und betrachtet mit der Kamera direkt das Zwischenbild des Objektivs. Für die Mikroskop-Kamera ist dann der Bildfelddurchmesser des Objektivs die entscheidende Größe, denn das Bild, das durch das Mikroskop-Objektiv erzeugt wird, wird direkt auf dem Sensor der Mikroskop- Kamera abgebildet. Die Sensorgröße der Mikroskop- Kamera sollte also optimal auf den Bildfelddurchmesser abgestimmt sein einerseits um einen maximalen Ausschnitt des runden Bildfeldes auf dem eckigen Sensor abzubilden und andererseits um Abbildungsfehler am unmittelbaren Rand des Bildfeldes zu vermeiden. D. h. die Bilddiagonale des Sensors sollte etwas kleiner als der Bildfelddurchmesser des Objektivs sein, damit alle Bereiche im Sensorbild mit optimaler Schärfe abgebildet werden. Eine Vielzahl von Sensoren mit unterschiedlichen Bilddiagonalen sind auf dem Markt erhältlich. Folgende Abbildung zeigt die gängigsten Sensorgrößen. Im Mikroskop entsteht das Bild in zwei Stufen: das Objektiv des Mikroskops erzeugt ggf. zusammen mit einer Tubuslinse im Mikroskop ein Zwischenbild. Dieses Zwischenbild betrachtet der Anwender durch das Okular. Die gesamte Vergrößerung setzt sich aus der Vergrößerung des Objektivs und der des Okulars zusammen. Durch physikalische und technische Beschränkungen kann das Objektiv nur ein Zwischenbild erzeugen, dass in einem begrenzten Bereich die volle Bildschärfe aufweist. Den Durchmesser des runden Objektivbildes, für den dies gilt, nennt man Bildfeldweite des Objektivs. Die Größenangaben für den Sensor in Zoll sind historisch bedingt und folgen einer Konvention, die sich an den Durchmessern früherer Bildaufnahme-Röhren orientiert. Ein Zoll in dieser Konvention entspricht nicht 25,4 mm, sondern etwa 16mm. Für viele Standardmikroskop-Optiken bieten CCD- und CMOS-Sensoren mit der Größe von 2/3" einen guten Kompromiss zwischen Vergrößerung, Auflösung und der Größe des Bildausschnitts des mikroskopischen Bildfeldes. 5

6 Sensorgröße und Bildausschnitt Durch eine adaptierte Digitalkamera mit definierter Sensorgröße erfasster Bildausschnitt im Vergleich zu dem durch das Okular sichtbaren Bild: Objektivvergrößerung 10 Okularvergrößerung 10 Sehfeldzahl des Okulars 18 C-Mount-Adapter mit Vergrößerungsfaktor 1 Der von einem 1/3 Zoll-Sensor übertragene Anteil des sichtbaren Zwischenbildes beträgt unter diesen Voraussetzungen lediglich 7%, wohingegen ein 1 Zoll-Sensor ca. 50% des Bildfeldes wiedergibt. 1/3 Zoll 1/2 Zoll 2/3 Zoll 1 Zoll Wählt man einen deutlich kleineren oder größeren Sensor, wird es notwendig, das Bildfeld des Objektivs über eine im Adapter integrierte Zwischenoptik an den Sensor anzugleichen, d.h. entsprechend zu verkleinern oder nachzuvergrößern. Anpassung von Sensorgröße und Bildfeld Optimierung und Anpassung von Sensorgröße und Bildfeld mittels eines C-Mount-Adapters mit integrierter Zwischenoptik: Objektivvergrößerung 10 Okularvergrößerung 10 Sehfeldzahl des Okulars 18 Sensorgrößen 1/2 Zoll (innerer Bildausschnitt) und 4/3 Zoll (äußerer Bildausschnitt). Der von einem 1/2 Zoll-Sensor übertragene Anteil des sichtbaren Zwischenbildes beträgt ohne Anpassung ca. 12% (innerer Bildausschnitt). Mit Hilfe eines C-Mount-Adapters mit integrierter Verkleinerungsoptik (0,65 oder wie in diesem Fall 0,5 ) kann der Bildausschnitt entsprechend optimiert werden (mittlerer Bildausschnitt). Sensoren, die deutlich größer sind als 1 Zoll (äußerer Bildausschnitt) und über den Rand des Bildfeldes hinausreichen, können über einen entsprechenden Adapter mit integrierter Vergrößerungsoptik an das Bildfeld angeglichen werden (z. B. 1,2 oder 1,6 ). Am weitesten verbreitet und für mikroskopische Anwendungen durchaus gut geeignet sind Sensoren mit einem Seitenverhältnis von 4:3. Sensoren mit einem Seitenverhältnis von 1:1 geben den maximalen Anteil des visuell sichtbaren Zwischenbildes des Objektivs wieder. Weitere Sensorformate wie 3:2 oder 16:9 können ebenfalls eingesetzt werden, haben aber bei gleicher Pixelzahl wie 4:3 Sensoren eine geringere Bildhöhe und geben somit einen kleineren Anteil des Bildfeldes wieder. Die mittlerweile für Film und Fernsehen als Standard erwarteten HD (high-definition) bzw. Full HD Formate sind für die Mikroskopie nach wie vor etwas umstritten, jedoch perfekt geeignet, um z. B. Live-Bilder für die Diskussion auf große Monitore zu projizieren. Durch Kombination von Videotechnik und digitaler Bildverarbeitung lassen sich hochdynamische Prozesse hervorragend betrachten, studieren und auswerten. diagonal horizontal Sensorformate (Seitenverhältnis) 4:3 3:2 16:9 1:1 Pixelgröße und Sensitivität Wie zuvor besprochen, spielt die Anzahl der Pixel bzw. die Auflösung eines Bildsensors eine zentrale Rolle für Informationsgehalt und Qualität eines mikroskopischen Bildes. Ein genereller Trend hin zu größtmöglicher Auflösung ist unübersehbar, aber höhere Auflösung heißt auch kleinere Pixel. Allgemein wird größeren Pixeln eine höhere Empfindlichkeit zugesprochen als kleineren Pixeln. Letztendlich gilt es aber für jede Anwendung die optimale Kombination aus Bildrauschen, Signal-Rausch-Verhältnis (SNR), Sättigungskapazität und dem damit im Zusammenhang stehenden Dynamikumfang zu wählen. Bildrauschen: Verschiedene Rauscheffekte, wie z. B. Dunkelrauschen, photonisches Rauschen oder Digitalisierungsrauschen, können ein Signal überlagern und somit ein digitales Bild negativ beeinflussen. In hochempfindlichen Sensoren macht sich das Bildrauschen besonders dann bemerkbar, wenn das Mess-Signal bei 6

7 wenig Licht sehr klein ist. Die Detektionsgrenze wird hier maßgeblich durch das Dunkelrauschen bestimmt, welches durch thermische Effekte, also Wärmeentwicklung am Sensor, verursacht wird. Dieser Anteil kann durch passives oder aktives Kühlen des Sensors, etwa durch einen Luftstrom, Wasser oder mit Hilfe eines Peltier-Elements deutlich reduziert werden (siehe auch Abschnitt Gekühlte Sensoren vs. nicht gekühlte Sensoren ). Sättigungskapazität: Die Sättigungs- oder auch Full- Well-Kapazität beschreibt die maximale Anzahl an Elektronen, die ein einzelner Pixel aufnehmen kann. Elektronen werden im Sensor durch auftreffendes Licht erzeugt. SNR: Große Pixel besitzen eine höhere Sättigungskapazität als kleine Pixel. Das bedeutet, dass sie ein größeres Fassungsvermögen für Elektronen besitzen, die durch das Licht im Pixel erzeugt werden. Sie können also anders gesagt mehr Licht verarbeiten. Eine hohe Sättigungskapazität führt zu einem besseren Signal-Rausch-Verhältnis. Das bedeutet: je größer die Pixelfläche, desto besser das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR). Das Signal-Rausch-Verhältnis bezeichnet den Faktor, um den sich der Anteil der Kameradaten mit dem eigentlichen Bildinhalt vom unerwünschten Rauschsignal unterscheidet. Je besser das SNR, desto höher ist die Bildqualität. Einfach ausgedrückt: Je mehr Pixel der Sensor Ihrer Kamera bei gegebener Sensorgröße hat, desto ungünstiger, d. h. kleiner das Signal-Rausch-Verhältnis. Dynamikbereich: Nachdem die untere und obere Grenze der Sensorantworten auf Licht definiert sind, können wir schließlich den noch fehlenden Begriff Dynamikbereich (DR) erklären: Er wird durch das Verhältnis der Sättigungskapazität (Full-Well-Kapazität) zur Nachweisgrenze definiert. Anders ausgedrückt: Der Dynamikbereich ist das Verhältnis der hellsten und dunkelsten Werte, die ein Pixel als echte Reaktion auf einfallendes Licht detektieren kann. Erfordert Ihre Anwendung einen hohen Dynamikbereich, wählen Sie lieber einen Sensor mit entsprechend größeren Pixeln. Heute bieten Pixel mit Größen zwischen 3,5 m und 6 m das, wofür man früher 10 m Pixel brauchte: einen guten Kompromiss zwischen Lichtempfindlichkeit und hoher Auflösung. Hochauflösende und günstige Sensoren haben Pixelgrößen von 2,2 m bis unter 1,4 m sie bieten hohe Pixel-Auflösung, aber aufgrund ihrer kleinen Fläche eine geringere Lichtempfindlichkeit. gutes Signal-Rausch-Verhältnis verfügen, um sehr schwache Lichtsignale noch detektieren zu können und trotzdem gute Bildqualität zu gewährleisten. 4. Gekühlte CCD/CMOS-Sensoren versus nicht gekühlte CCD/CMOS-Sensoren in Mikroskopie-Anwendungen Jeder Sensor-Chip erzeugt sogenanntes Dunkelrauschen oder Dunkelstrom. Im Pixel auf dem Sensorchip werden durch Wärme Elektronen erzeugt, die sich mit den durchs Licht erzeugten Elektronen vermischen. Dadurch wird der gewünschten Bildinformation eine Störung überlagert und der Bildinhalt verfälscht. Dazu kommt, dass bei ungekühltem Sensor der Dunkelstrom und das Rauschen je nach Sensortemperatur unterschiedlich sind. Das führt zu Schwankungen je nach Raum- und Betriebstemperatur des Sensors, der sich während des Betriebs erwärmt. Auch im Falle von Langzeitbelichtungen steigen Spannung und Temperatur am Sensor, was wiederum in Form von Bildpunkten interpretiert und als Rauschen sichtbar wird. Der Dunkelstrom kann durch Kühlen des Chips reduziert werden. Ein Absenken der Sensortemperatur um 7 Celsius gegenüber Zimmertemperatur reduziert den Dunkelstrom bei gleichbleibendem Bildsignal auf etwa die Hälfte. Neue Sensortechnologien versprechen hier deutliche Vorteile, so z. B. auch die neue Generation der CMOS Sensoren. Durch geringere Leistungsaufnahme und optimierte Elektronik zeigen diese Sensoren ein deutlich verbessertes Rauschverhalten. Digitale Kameras mit ungekühlten Sensoren sind für eine Vielzahl von Standard-Mikroskopie-Anwendungen bestens geeignet, um eine hervorragende Bildqualität zu gewährleisten und allen Anforderungen an Bildverarbeitung- und -analyse gerecht zu werden. Gekühlte Sensoren sind dann die richtige Wahl, wenn unter schwierigen Lichtbedingungen besonders lange Belichtungszeiten erforderlich sind oder wenn man besonders konstante und reproduzierbare Ergebnisse für Bildanalyse oder Weiterverarbeitung benötigt. Solche Anforderungen findet man z. B. in anspruchsvollen Anwendungen der modernen Fluoreszenzmikroskopie, in In vivo-biolumineszenz-anwendungen oder in der Astronomie. Die Empfindlichkeit eines Sensors spielt besonders bei Anwendungen mit wenig Licht, wie z. B. in der Fluoreszenzmikroskopie, eine große Rolle. Unter solch schwierigen Lichtverhältnissen muss die Kamera über ein 7

8 5. Schnittstelle Grundsätzlich haben Sie als Anwender der Kamera häufig die Wahl zwischen mehreren Schnittstellen. Die wichtigsten Interfaces, die in Frage kommen, sind USB 2.0, USB 3.0, FireWire, Gigabit Ethernet oder Camera Link. Mehr und mehr kristallisiert sich USB 3.0 als neuer, einfacher Standard für eine Vielzahl von Anwendungen heraus. USB 3.0, auch bekannt als Super Speed USB, ist die nächste Generation der populären Plug & Play Universal Serial Bus Spezifikation, die auf die Stärken von USB 2.0 aufbaut und dessen Schwächen ausbügelt. USB 3.0 steht als Standard-Schnittstelle schon heute in Standard-PCs ohne zusätzliche Hardware zur Verfügung. Auf absehbare Zeit wird USB 3.0 sowohl FireWire als auch USB 2.0 aus dem Spektrum verfügbarer Schnittstellen verdrängen. FireWire wird schon heute durch einige Betriebssysteme nicht mehr als Standard unterstützt. Eine USB 3.0-Kamera wird man dagegen auch in Zukunft an jedem handelsüblichen PC ohne zusätzliche Schnittstellen-Hardware betreiben können. Das schnelle Interface ist echtzeitfähig, darüber hinaus schont die technische Implementierung der USB 3.0-Schnittstelle durch einen Transfer der Bilddaten direkt in den Arbeitsspeicher Prozessor-Ressourcen. Diese freie Prozessorleistung ist für die bildverarbeitende Anwendung nutzbar. Das ermöglicht komplexere Verarbeitungsschritte sowie eine schnellere Darstellung der Ergebnisse für den Anwender. Ein starkes Plus für die Gigabit Ethernet-Schnittstelle ergibt sich, wenn große Kabellängen gefordert sind. 6. Fazit Für Ihre Anwendung können Sie aus einer breiten Produktpalette Ihre Mikroskopie-Kamera auswählen. Das Angebot umfasst sowohl Farb- als auch Monochrom- Modelle mit diversen Sensor-Technologien, Sensorgrößen, Auflösungen und Bildraten. Kameras mit CMOS-Sensoren werden dank Weiterentwicklung und deutlicher Leistungsverbesserungen zukünftig eine wichtige Rolle in der Mikroskopie spielen. Der CMOS-Sensor ist nicht nur kostengünstig, kompakt und vielseitig, sondern weist auch die Vorteile eines Halbleiter-Sensors auf, ohne dass dabei Blooming- oder Smearing-Effekte auftreten können. Neuere CMOS- Sensoren weisen darüber hinaus nur noch geringes Rauschen auf. Es ist vorauszusehen, dass die CMOS- Sensoren CCD-Sensoren in digitalen Kameras in vielen Anwendungsbereichen bald ersetzen werden. Für die Auswahl der richtigen Mikroskop-Kamera können die folgenden Aspekte wichtig sein: Authentische Live-Bilder für flüssige Probenbewegungen und einfaches Fokussieren Höchste Bildqualität, Farbtreue und guter Kontrastumfang, für Dokumentation, Bildbearbeitung und -analyse. Exzellente Empfindlichkeit für Anwendungen mit niedriger Lichtstärke Charakteristika der Anwendung legen u. U bestimmte Sensortypen nahe, z. B.: CCD-, CMOS-, NIR- (Nah- Infrarot)-optimierte Varianten Gewünschte Pixelgröße und Auflösung für eine optimale Abbildung des Sehfeldes haben Einfluss auf die benötigte Sensorgröße Baugröße, Gewicht, Bedienerfreundlichkeit, Konformität mit Software-Standards wie DirectShow, TWAIN, USB3 Vision, GenICam, je nach Vorgängersystem oder angestrebter Universalität. Tipps zur Kamerawahl: Farbkameras sind universell einsetzbar, wenn Sie eine Farbkamera verwenden möchten, stellen Sie sicher, dass die Kamera eine Farbprofilerstellung enthält. Ziehen Sie bei anspruchsvollen Fluoreszenz- Anwendungen monochrome Kameras in Betracht, da diese ein geringeres Rauschen aufweisen. Entscheiden Sie sich für eine hohe Auflösung, wenn sie große Bereiche der Probe bei geringer Vergrößerung darstellen möchten, die Bilder für Dokumentationszwecke nutzen und archivieren möchten. Wählen Sie den passenden Kamera-Mikroskop- Adapter, um das Sehfeld optimal auszunutzen. Wenn Sie Proben größtenteils am Bildschirm betrachten möchten, sind Bildqualität der Live- Bilder und Geschwindigkeit der Kamera wichtig. In Standard-Mikroskopie-Anwendungen reichen oft Kameras mit geringerer Bildrate aus. Bildqualität kann oft durch die richtige Software entscheidend verbessert werden. Stellen Sie also sicher, dass Sie die neueste Softwareversion für Ihre Kamera verwenden. 8

9 Autor Dr. Kristina Lotz Market Manager Medical Dr. Kristina Lotz ist Market Managerin Medical bei der Basler AG. Sie ist promovierte Molekularbiologin und begann im März 2013 ihre Laufbahn bei Basler im Bereich Market Management. Kontakt Dr. Kristina Lotz Market Manager Medical - Market Management Tel kristina.lotz@baslerweb.com Basler AG An der Strusbek Ahrensburg Deutschland In ihrer aktuellen Position ist sie verantwortlich für die Entwicklung des Vertikalmarktes Medical & Life Science mit seinen vielfältigen Applikationen und speziellen Anforderungen. Sie betreut Baslers Kunden aus diesem Bereich und ist verantwortlich für den Einsatz des breiten Kamera-Portfolio in bekannten Anwendungsfeldern sowie für die Erschließung neuer Segmente. Über Basler Basler ist ein führender Hersteller von hochwertigen digitalen Kameras für Anwendungen in Fabrikautomation, Medizin und Verkehr. Die Produktentwicklung wird von den Anforderungen aus der Industrie gesteuert. Die Kameras bieten einfache Integration, kompakte Größen, exzellente Bildqualität und ein hervorragendes Preis-Leistungs-Verhältnis. Basler verfügt über mehr als 25 Jahre Erfahrung im Bereich der Bildverarbeitung. Das Unternehmen beschäftigt nahezu 500 Mitarbeiter an seinem Hauptsitz in Ahrensburg und an Standorten in den USA, Singapur, Taiwan, China, Japan und Korea. Informationen zu Haftungsausschluss und Datenschutzerklärung finden Sie unter Basler AG, 06/2015 Basler AG Germany, Headquarters Tel Fax sales.europe@baslerweb.com Basler, Inc. USA Tel Fax sales.usa@baslerweb.com Basler Asia Pte Ltd. Singapore Tel Fax sales.asia@baslerweb.com