Use of TROSY for the sequential NMR assignment of very large proteins

Transkript

1 Research Collection Doctoral Thesis Use of TROSY for the sequential NMR assignment of very large proteins Author(s): Salzmann, Michael Publication Date: 1999 Permanent Link: Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For more information please consult the Terms of use. ETH Library

2 Diss. ETH Nr Use of TROSY for the Sequential NIVIR Assignmentof Very Large Proteins A dissertation submittedto the Swiss Federal Institute of Technology Zürich for the degree of Doctor of Natural Sciences presented by Michael Salzmann Dipl. Chem. Universität Zürich born on October20, 1966 Citizen of Ittigen (Bern) accepted on the recommendation of Prof. Dr. Kurt Wüthrich, Referent Prof. Dr. Beat H. Meier, Koreferent PD Dr. Gerhard Wider, Koreferent 1999

3 Summary The assignment of chemical shifts to individual nuclei is a prerequisite for proteins by nuclear magnetic resonance (NMR) NMR, when the reso the structure determination of spectroscopy.m Since the early days of biomolecular nance assignment was performed using non-labeled proteins, the introduction of 13C/15N-labeled and later on 2H/13C/15N-labeledproteins extended the molecularsize limit for protein structure determination to approximately30 kda. The size limit is mainly imposed by rapid transverse relaxation of the carbon and nitrogen spins. The introduction of transverse relaxation-optimized spec troscopy(trosy)74 opened an avenue to extend the molecular size ränge for Solution NMR to proteins beyond 100 kda. The implementationof the TROSYprinciple into the key triple resonancenmr experiments used for the sequential assignment of 2H/13C/15N-labeledproteins designatesthe main subject of this thesis. The sequential assignment of a 110 kda protein demonstrates the practical use of the new experiments and the extended scope of biomolecularnmr by the developmentof these TROSY-based NMR experiments. After a general introduction, a short overview on the available methods for resonance assignments and a description of the key triple resonance experi ments commonly used for the sequential assignment of isotope-labeled pro teins is given in the second chapter. The third chapter contains a descriptive explanation of the main relaxation mechanismsin Solution NMR and describes the foundations of TROSY Chapter four describes the TROSY-type triple reso nance experiments used for the sequential assignment of 2H/13C/15N-labeled proteins, with initial applicationsto the 23 kda protein gyrase-23b.s5,86,s7the comparison of these experiments with the corresponding conventional implementations showed up to three-fold sensitivity gains with this protein. For the two most sensitive triple resonanceexperiments, HNCO and HNCA, up to 40- fold sensitivity gains were obtained when the TROSY-type experiments were compared with the conventional experiments for the 110 kda protein 7,8-dihy-

4 droneopterin aldolase from S.aureus (DHNA). Chapter five describes the sequential assignment of the DHNA and evaluates the structural information obtained so far from the NMR data in light of the crystal structure.39 Chapter 6 finally provides a general view of the perspectives and expected limitations of the novel NMR techniques introduced in this thesis.

5 Zusammenfassung Die Zuordnung von chemischen Verschiebungen zu individuellen Atomen ist eine Voraussetzung für die Protein-Strukturbestimmungmittels magnetis cher Kernresonanz-Spektroskopie (NMR).n3 Nach den Anfängen der NMR- Spektroskopie an biologischen Molekülen, als die Resonanz-Zuordnung mit unmarkierten Proteinen durchgeführt wurde, ermöglichte die Einführung von 13C/15N- und später von 2H/13C/15N-markiertenProteinen die Strukturbestim mung von grösseren Proteinen bis zu ungefähr 30 kda Molekulargewicht. Die Limitierung bezüglich der Grösse ist vorwiegend durch die schnelle transver sale Relaxation der Heteroatome gegeben. Die Einführung von 'transverse relaxation-optimizedspectroscopy' (TROSY)74 eröffnete die Möglichkeit,diese Limitierung zu Molekulargewichten von über 100 kda zu verschieben. Die Implementierung des TROSY-Prinzips in diejenigen Triple-Resonanz NMR Experimente, die vorwiegend zur sequentiellen Zuordnung von 2H/13C/15Nmarkierten Proteinen benutzt werden, stellt den Hauptteil dieser Dissertation dar. Die sequentielle Zuordnung eines 110 kda Proteins zeigt den praktischen Nutzen der neu entwickelten Experimente und demonstriert die generelle Erweiterung der biologischen NMR-Spektroskopie durch die Entwicklung dieser TROSY-basiertenExperimente. Nach einer generellen Einführungwird im zweiten Kapitel ein kurzer Über blick über die verfügbaren Methoden der Resonanz-Zuordnung sowie eine Beschreibung der wichtigsten Triple-Resonanz Experimente gegeben, die gewöhnlich für die sequentielle Zuordnung von markierten Proteinen verwendet werden. Das dritte Kapitel enthält eine einfache Beschreibung der hauptsächli chen Relaxations-Mechanismenvon grossen Molekülen in Lösung und die Grundlagen von TROSY Im vierten Kapitel werden die auf TROSY basier enden Triple-Resonanz Experimente für die sequentielle Zuordnung von 2H/13C/15N-markierten Proteinen anhand ihrer Anwendung an dem 23 kda Protein Gyrase-23B vorgestellt.85>s6>87 Ein Vergleich dieser Triple-Resonanz

6 Experimente mit deren konventioneller Implementierung zeigt für dieses Pro tein Sensitivitäts-Gewinne im Bereich von Faktor drei. Der Vergleich mit den zwei sensitivsten Experimenten, HNCA und HNCO, an der 110 kda 7,8-Dihydroneopterin Aldoiase von S.aureus (DHNA) zeigt Sensitivitäts-Gewinne von bis zu Faktor 40, wenn anstatt der konventionellen die TROSY-basiertenExper imente verwendet werden. Im fünften Kapitel sind die sequentielle Zuordnung der DHNA sowie erste, aus den NMR Daten erhaltene, strukturelle Informa tionen beschrieben,die mit der Kristall-Strukturverglichen werden.39 Das sech ste Kapitel enthält eine Diskussion der neuen TROSY-basierten NMR Experimente bezüglich deren Perspektiven und Grenzen.