Bestimmung von Hämoglobin nach der AHD-575-Methode

Größe: px

Ab Seite anzeigen:

Download "Bestimmung von Hämoglobin nach der AHD-575-Methode"

Sabine Manuela Bruhn
vor 5 Jahren
Abrufe

1 Illumina-Chemie.de - Artikel Analytik Bestimmung von Hämoglobin nach der AHD-575-Methode Für die Bestimmung von Hämoglobin, einem der wichtigsten klinisch-chemischen Parameter, gibt es mehrere Methoden. Lange Zeit war die Cyanmethämoglobinmethode (HiCN) Standard. Hier wird die AHD-575-Methode dargestellt, die gegenüber der älteren HiCN-Methode mehrere Vorteile hat. Die Abkürzung steht für Alkaline Hemin Detergent und die Zahl 575 gibt die Wellenlänge an, bei der die Extinktion gemessen wird. Geräte: Messkolben 5 ml und 100 ml, Vollpipette 10 ml, Messpipette 5 ml, Kolbenhubpipetten 1000 µl und 20 µl, Analysenwaage, Reagenzgläser, Photometerküvetten (1 cm Schichtdicke), Photometer Chemikalien: Häminchlorid (Hämin B) Natronlauge 1 N (C) Triton X-100 (Sigma) (N, Xn) Analysengut: Blutproben (B) Hinweis: Blutproben müssen wegen des biologischen Risikos mit Handschuhen gehandhabt werden! Durchführung: Das AHD-575-Reagenz wird folgendermaßen hergestellt: Man legt etwas Wasser im 100 ml-messkolben vor, wiegt 1 g Triton-X 100 ein und lässt unter häufigem Schwenken einige Stunden stehen, bis sich das sirupöse Detergens zu einer klaren Flüssigkeit gelöst hat. Umschütteln ist zu vermeiden, da sonst eine starke Schaumbildung eintritt! Dann gibt man 10 ml 1 N Natronlauge zu und füllt mit dest. Wasser auf 100 ml auf. Die Proben werden zur Messung im Verhältnis (1:151) verdünnt. Dazu befüllt man Reagenzgläser Artikel im Web: mit Hilfe einer Messpipette mit genau 3 ml der Reagenzflüssigkeit und gibt mit einer Kolbenhubpipette 20 µl Copyright illumina-chemie.de, lemmi, Geschriebenmuss am von 6 Blut zu. Das RöhrchenAutor: mit der Blutprobe zuvor 20 mal gekippt werden, um den Inhalt gut zu

Entsorgung: Die Lösungen können über das Abwasser entsorgt werden Erklärung: Das menschliche Hämoglobinmolekül ist ein Tetramer, das aus vier Untereinheiten besteht.

2 Entsorgung: Die Lösungen können über das Abwasser entsorgt werden Erklärung: Das menschliche Hämoglobinmolekül ist ein Tetramer, das aus vier Untereinheiten besteht. Diese Untereinheiten kommen in verschiedenen Varianten vor, die sich in ihrer Aminosäuresequenz unterscheiden und dem Gesamtmolekül unterschiedliche Eigenschaften verleihen. Beim Erwachsenen dominiert Hämoglobin A1 mit etwa 97% des gesamt-hb. Es besteht aus je zwei alpha- und zwei beta-ketten (Kurzschreibweise α2β2). Daneben kommen kleine Mengen Hämoglobin A2 (α2δ2) und fetales Hämoglobin (Hämoglobin F, α2γ2) vor. Die durchschnittliche Molmasse des Hämoglobin-Tetramers beträgt g/mol. Jede Untereinheit enthält als prosthetische Gruppe ein Molekül Häm gebunden. Das zur Kalibrierung eingesetzte Häminchlorid hat die Molmasse 651,95 g/mol. Daraus ergibt sich daß 40,4 mg Häminchlorid 1 g Hämoglobin (Tetramer) äquivalent sind. Das AHD-Reagenz lysiert die Erythrozyten (das Detergens löst die lipoidhaltige Zellmembran auf) und bildet mit dem Häm des Hämoglobins einen in seiner Zusammensetzung nicht genau bekannten Komplex von olivgrüner Farbe, dessen Extinktionsmaximum bei 575 nm liegt, und der in einem weiten Konzentrationsbereich dem Lambert-Beer schen Gesetz folgt. Der Inhaltsstoff von Triton x-100 ist Octoxinol-9, ein p-(tert)-octyl-phenol-polyethylenglycol. Es handelt sich um ein nichtionisches Detergens, das Proteine nicht denaturiert (x = 9-10): Die hier beschriebene Methode hat gegenüber der klassischen Cyanmethämoglobinmethode mehrere Vorteile. Einmal ist das AHD-Reagenz für die HiCN-Methode wird eine Kaliumcyanid-haltige Lösung verwendet ungiftig und kann leicht selbst hergestellt werden. Die Konzentrationen der Bestandteile sind relativ unkritisch, kleine Schwankungen der Zusammensetzung fallen nicht ins Gewicht. Die Reaktion in der Probemischung läuft schnell ab (Messungen zeigten, daß sie nach 120 Sekunden vollendet ist) und die Extinktion ist über mehrere Stunden stabil. Am wichtigsten ist aber, daß die Messung mit Hilfe des Häminchlorids an einem absoluten, leicht rein erhältlichen Standard kalibriert werden kann. Für die HiCN-Methode muss dagegen ein biologischer Hämoglobinstandard verwendet werden, dessen Gehalt wiederum bestimmt werden muss. Ich habe für meine Messung bei 578 nm einen Umrechnungsfaktor von 374,5 gefunden. 2 von 6

Wenn bei 575 nm gemessen wird, ist laut Literatur ein Faktor von 349,6 zu verwenden. Der normale Hämoglobingehalt des Blutes ist alters- herkunfts- und geschlechtsabhängig.

3 Wenn bei 575 nm gemessen wird, ist laut Literatur ein Faktor von 349,6 zu verwenden. Der normale Hämoglobingehalt des Blutes ist alters- herkunfts- und geschlechtsabhängig. Die untere Grenze (2,5-Perzentile) beträgt bei kaukasischen Männern im mittleren Lebensalter 137 g/l, bei Frauen g/l. Die WHO hat einfacherheitshalber eine Untergrenze von 120g/l für Frauen und 130 g/l für Männer definiert, die zur Diagnose einer Anämie (Blutarmut) verwendet werden soll. Literatur: Zander R, Lang W, Wolf U: Alkaline haematin D-575, a new tool fort he determination of haemoglobin as an alternative tot he cyanmethaemoglobin method. I. Description of the method; Clinica Chimica Acta 136 (1984): Wolf U, Lang W, Zander R: Alkaline haematin D-575, a new tool fort he determination of haemoglobin as an alternative tot he cyanmethaemoglobin method. II. Standardisation of the method using pure chlorohaemin; Clinica Chimica Acta 136 (1984): Zander R und Lang W: The Determination of Haemoglobin as Cyanmethaemoglobin or al aklaine Haematin D-575 Comparision of Method-Related Erros; Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry 27 (1989): Heuck CC, Reinauer H, Wood WG: The Alkaline Haematin Detergent (AHD575) Method for the Determination of Haemoglobin in Blood a Candidate Reference Measurement Procedure; Clinical Laboratroy 54 (2008): Danksagung: Danke an Cyanwasserstoff für die Bereitstellung des Hämin-Standards! Bilder: 3 von 6

4 Ansetzen des AHD-575-Reagenzes Verdünnung der Blutprobe 4 von 6

5 Hämin-Standard Das von mir verwendete Photometer 5 von 6

6 Extinktion 0,325 6 von 6

Ähnliche Dokumente

Maßanalytische Bestimmung von Formaldehyd und Acetaldehyd

Illumina-Chemie.de - Artikel Analytik Maßanalytische Bestimmung von Formaldehyd und Acetaldehyd Im Folgenden beschreibe ich eine Methode, den Gehalt einer Formaldehyd- oder Acetaldehyd-Lösung durch Titration