7 Einfluss von Zuckerersatzstoffen auf E.coli Bakterien

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1 7 Einfluss von Zuckerersatzstoffen auf E.coli Bakterien 7.1 Vorwort Um zu beurteilen, welche der untersuchten Stoffe eine gute Alternative zur Saccharose darstellen, interessierte uns der Einfluss der Zuckerersatzstoffe auf Bakterien, speziell der auf die tierischen und menschlichen Darmbakterien Escherichia Coli (E.coli). Dabei unterzogen wir dem Vergleich mit Saccharose Glucose, Stevia, Fructose, Xylitol und Cyclamat, also sowohl Zuckeralkohole, Süßstoffe und andere Zuckeraustauschstoffe. Stoppen, verlangsamen oder begünstigen sie gar dessen Wachstum? Und was genau bedeutet das für uns und unseren Körper? 37

2 7.2 Theoretische Grundlagen Escherichia coli ist ein Bakterium, welches im menschlichen und tierischen Darm vorkommt. Im menschlichen Darm dient es als Vitaminproduzent, ist jedoch auch häufigster Verursacher menschlicher Infektionen. Als ein Maß für die Bakterienkonzentration lässt sich die Transmission einer Lösung, die sowohl Bakterien als auch Nährmedium enthält, bestimmen. Als Transmission bezeichnet man die Menge eines Lichtes bestimmter Wellenlänge die nach Bestrahlen der Lösung messbar ist. Je höher die Transmission, je höher also auch die Bakterienkonzentration. Als Nährmedium wurde dafür ein sogenanntes Minimalmedium verwendet, welches die wie der Name schon sagt minimal nötige Menge an Energie, welche durch den jeweiligen Zucker bzw. -ersatzstoff zur Verfügung gestellt wird, sowie andere Inhaltsstoffe (z.b. Salze) enthält, um das Überleben und die Vermehrung der Bakterien zu ermöglichen. Die zeitliche Änderung der Transmission stellt dabei ein Maß für die Bakterienkonzentration dar, wobei der Referenzwert der jeweiligen Lösung die Transmission zum Zeitpunkt t 0 ist. Da E.coli Bakterien sich optimal mit Glucose als Energiequelle vermehren, dient das Wachstumsverhalten mit Glucose als eingesetzter Energiequelle als Referenzwert aller untersuchten Zucker und dessen Ersatzstoffen. Da sich Bakterien durch Zellteilung (bei optimal 37 ) vermehren, wird ein exponentielles Wachstum und somit auch ein exponentieller Anstieg der Transmission erwartet. 38

3 7.3 Relevante Formeln Masse des Zuckers / -ersatzstoffes Lambert-Beersches Gesetz: m M c V (1) E 0 c d (2) mit: m = Masse in g M = Molare Masse in g/mol c = Konzentration in mol/l V = Volumen in l = molarer Absorptionskoeffizient d = optische Schichtdicke des Reagenzglases ( 1,3 cm = 0,013m) 39

4 7.4 Apparaturbeschreibung und Versuchsdurchführung Zunächst wird das Minimalnährmedium ohne Zucker hergestellt. Dafür werden 6 g Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4), 3 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4), 1 g Ammoniumchlorid (NH4Cl), 0,5 g Natriumchlorid (NaCl), 0,12 g Magnesiumsulfat (MgSO4), 0,01g Calciumchlorid (CaCl) und jeweils 30mM des Zuckers bzw. dessen Ersatzstoffes in 1 l Wasser gelöst, wobei die Bakterien noch nicht hinzugegeben werden. Um sicherzustellen, dass sich ausschließlich die antibiotikaresistenten E.coli Bakterien bilden/ teilen und wachsen, werden ca. zehn Milliliter des Antibiotikums Ampicillin hinzugegeben. 50 ml Nährmedium werden in je einen Erlenmeyerkolben pro Substanz gefüllt und der Zucker bzw. -austauschstoff direkt darin vollständig gelöst. Sind alle Erlenmeyerkolben vorbereitet, wird je ein Reagenzglas mit drei ml dieser Lösung befüllt. Er dient als einerseits als Transmissionswert für den Zeitpunkt t 0, welcher mit dem in Abbildung 7.1 dargestellten Transmissionsmessgerät gemessen wird und andererseits als Nullkalibrierung vor jeder weiteren Messung, da der Zucker selbst eine bestimmte Menge an Licht absorbiert, was die nachfolgenden Messwerte verfälschen könnte. Abbildung 7.1: Transmissionsmessgerät Zu den verbliebenen Lösungen im Erlenmeyerkolben werden nun 13 ml der zuvor angesetzten Bakterienkulturen gegeben. Anschließend werden die Erlenmeyerkolben durchgängig auf 37 40

5 temperiert und gleichmäßig gerührt um ein optimales und gleichmäßiges Wachstum zu ermöglichen. Dafür dient das in Abbildung 7.2 dargestellte Gerät. Abbildung 7.2: Bakterienaufbewahrung während der Wachstums- und Vermehrungsphase Nun wird so oft wie möglich (am besten alle halbe Stunde) die Transmission gemessen. Dabei wird zuerst mit der bakterienfreien Zuckerlösung kalibriert und anschließend jeweils drei Milliliter der temperierten, bakterienhaltigen Zuckerlösung in ein Reagenzglas gefüllt und dieses anschließend ins Messgerät gestellt. Die Flüssigkeit wird anschließend wieder möglichst verlustfrei in den dazugehörigen Erlenmeyerkolben überführt. Erreicht die Transmission einen Wert (deutlich) größer als eins, so muss die Lösung verdünnt werden, um einen zuverlässigen Wert zu erhalten. Gleichzeitig ist nach Erreichen dieses Wertes die Messreihe für diese Substanz beendet. 41

6 7.5 Messwerte und Auswertung Mittels Gleichung (1) werden zunächst die einzuwiegenden Massen von Glucose und den Zuckerersatzstoffen berechnet. Die Konzentration beträgt jeweils Volumen 0,05 l. Lediglich die Molmasse unterscheidet sich. m M ( Glu cose) mol / l 0,05l 180g / mol mol / l und das Die Molmassen und daraus resultierenden einzuwiegenden Massen sind in Tabelle 7.1 zusammengetragen. Anhand von Glucose wird eine Beispielrechnung durchgeführt. m M c V 3 3 mol / l 0,05l 0,27g Molmasse [g/mol] einzuwiegende Masse [g] Glucose 180 0,27 Stevia 804,9 1,21 Saccharose 342,3 0,51 Fructose 180 0,27 Xylitol 152,15 0,23 Cyclamat 201,22 0,30 Tabelle 7.1: einzuwiegende Massen Nachdem alle Lösungen wie oben beschrieben präpariert wurden, ließen sich die in den Tabellen dargestellten Messwerte aufnehmen. In der dazugehörigen Abbildung wurde die Extinktion gegen die Zeit aufgetragen, um den zeitlichen Verlauf des Bakterienwachstums zu veranschaulichen. 42

7 t [min] E 0 0, , , , , , , , , , , Tabelle 7.2: Messwerte für Glucose 43

8 Abbildung 7.3: Zeit-Extinktion-Verlauf für Glucose t [min] E 0 0, , , , , , , , , , , , ,17 Tabelle 7.3: Messwerte für Stevia 44

9 Abbildung 7.4: Zeit-Extinktion-Verlauf für Stevia t [min] E 0 0, , , , , , , , , , , , ,20 Tabelle 7.4: Messwerte für Saccharose 45

10 Abbildung 7.5: Zeit-Extinktion-Verlauf für Saccharose t [min] E 0 0, , , , , , , , , , , , , ,15 Tabelle 7.5: Messwerte für Fructose 46

11 Abbildung 7.6: Zeit-Extinktion-Verlauf für Fructose t [min] E 0 0, , , , , , , , , , , , , , ,73 Tabelle 7.6: Messwerte für Xylitol 47

12 Abbildung 7.7: Zeit-Extinktion-Verlauf für Xylitol t [min] E 0 0, , , , , , , , , , , , ,09 Tabelle 7.7: Messwerte für Cyclamat 48

13 Abbildung 7.8: Zeit-Extinktion-Verlauf für Cyclamat Es zeigt sich in allen Kurvenverläufen eine Unregelmäßigkeit im Bereich von ungefähr min. Dieser ist darauf zurückzuführen, dass das Gerät statt bei den benötigten 37 nur mit 26,5 heizte, wodurch die Bakterien ein verlangsamtes (bis gar kein) Wachstum zeigten. Wie aus Gleichung (2), dem Lambert-Beerschen Gesetz ersichtlich, verhalten sich Konzentration und Extinktion proportional zueinander. Da der molare Adsorptionskoeffizient der einzelnen untersuchten Substanzen nicht in der Literatur zu finden ist und demnach experimentell bestimmt werden müsste, lassen sich keine genauen Konzentrationen berechnen. Für die E.coli Bakterien in glucosehaltigem Nährmedium lässt sich der erwartete Wachstumsverlauf beobachten. Auch E.coli Bakterien in fructosehaltiger oder xylitolhaltiger Lösung zeigen eine ähnliche Wachstumskurve. Dies scheinen also eine mögliche Alternative für E.coli Bakterien zu sein. In saccharosehaltigem Nährmedium hingegen kann nur eine geringe Zunahme der Extinktion und somit auch der Bakterienkonzentration verzeichnet werden, obwohl Saccharose aus Glucose und Fructose besteht. Offensichtlich scheinen E.coli Bakterien nicht in der Lage zu sein, Saccharose in seine beiden Bestandteile zu spalten, bzw. es als Energiequelle zu nutzen. Auch Cyclamat und Stevia stellen anhand der Extinktions-Zeit-Verläufe scheinbar kein Ersatz für Glucose als Energiequelle zu sein. Es ist lediglich vorstellbar, dass Saccharose, Cyclamat und Stevia die gerade zum Überleben nötige Energie zur Verfügung stellen, die aber keineswegs ausreichend für eine Fortpflanzung durch Zellteilung ist. 49

14 7.6 Diskussion und Fehlerbetrachtung Das verwendete Gerät zur Messung der Transmission stellt eine große Fehlerquelle dar. Es zeigte teilweise deutliche Schwankungen innerhalb einer Messung einer Probe zu einem beliebigen Zeitpunkt t auf. Es musste mehrmals mit der jeweiligen bakterienfreien Zuckerlösung kalibriert und dann die bakterienhaltige Lösung gemessen werden, um einen verlässlichen Wert zu erhalten. Dadurch sind ebenfalls (neben der Zeitspanne mit ungünstiger Wachstumstemperatur) Unregelmäßigkeiten während den Messreihen zu erklären. Unreinheiten auf dem Reagenzglas beeinträchtigten ebenfalls eine exakte Messung der Extinktion. Durch Überführen der je Messung entnommenen Probe aus dem Reagenzglas zurück in den dazugehörigen Erlenmeyerkolben entstanden geringe Verluste von Nährmedium und Bakterien, welche jedoch während aller Messungen mit allen Lösungen entstanden, wodurch dieser Fehler alle Werte ungefähr im gleichen Maß beeinflusst. Er ist somit zu vernachlässigen. 50

15 7.7 Zusammenfassung Das Bakterium E.Coli ist ein natürlicher Bestandteil unseres Darmtrakts, liegt dort jedoch lediglich in einer Konzentration von unter einem Prozent vor. Colibakterien sind lebenswichtig zur Erhaltung der Darmflora, indem andere Bakterien durch deren Anwesenheit abgetötet werden. Im Übermaß agieren sie jedoch auch als Krankheitserreger und können so zu starken Infektionen führen. Für ein intaktes Stoffwechselsystem ist somit die richtige Konzentration von E.Coli Bakterien von großer Bedeutung. Wichtig ist eine gleichbleibende Konzentration, da Colibakterien aus unterschiedlichsten Gründen (z.b Regeneration) absterben und durch Zellteilung die Darmflora intakt bleibt. Denn auch eine Konzentrationsabnahme und somit das Absterben dieser Bakterien ist ein Auslöser für Krankheiten, da sich Krankheitserreger sonst ungehindert im Darmtrakt vermehren und auch andere Organe infizieren könnten. Dieser Versuch zeigte, dass Cyclamat und Stevia aufgrund der Konzentrationsabnahme zu solch einer Infektion im Körper führen könnten, da diese für E.Coli Bakterien kein geeignetes Nährmedium darstellen und die Bakterien somit absterben würden. Somit können Süßstoffe im übermäßigen Verzehr laut Versuch zu einer Zerstörung der Darmflora führen. Eine kalorienbewusste Alternative wäre Xylitol. Jedoch ist hier mit hoher Wahrscheinlichkeit das Wachstum zu gering, um eine einwandfreie Funktionsweise des Darmtrakts zu garantieren. Glucose und Fructose in hohem Maß hingegen würden nach den Versuchsergebnissen zu einer übermäßigen Vermehrung führen, sodass eine Eigeninfektion durch E.coli daraus resultiert. Unsere optimalste Lösung wäre Saccharose, da nur ein leichter Anstieg zu verzeichnen war. Das Wachstum würde dann in etwa dem Absterben der Bakterien im Darmtrakt entsprechen, was wie gewünscht zu einer konstanten Konzentration führen würde. Diese Schlussfolgerungen basieren jedoch auf dem theoretischen Wissen aus dem Versuch, unabhängig davon, ob das verwendete Minimalnährmedium dem des Darmtrakts entspricht. 51