WWU-Münster Prof. Jörg Kudla

Transkript

1 Aufbau-Modul: Zellbiologie, Physiologie und Genetik Vorlesung: Phytohormone: Wirkung und Signaltransduktion WWU-Münster Prof. Jörg Kudla Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption und primären Signalweiterleitung Auxin (ähnliche Mechanismen bei GA und JA) Cytokinin Brassinosteroid Abscisinsäure Ethylen 1

2 Auxin, Jasmonat und Gibberellin Auxin JA GA Degradation von negativen Regulatoren resultiert in der Transkription von Antwortgenen Auxin Signalweg Das Prinzip kein Auxin Auxin Inhibition von Transkriptionsfaktoren durch Interaktion mit negativen Regulatoren Degradation der negativen Regulatoren hebt die Transkriptionsfaktorinhibiton auf Keine Auxinantwort Transkription der Auxinantwort Gene 2

3 Auxin Signalweg Abkürzungen TIR1: Transport Inhibitor Response 1 (Rezeptor, F-box Protein) AUX/IAAs: Auxin/Indole-3-Acetic Acid Proteins (TF-Inhbitoren) SCF: Ubiquitinligase Komplex (markiert Proteine für folgende Degradation) Ub: Ubiquitin (Degradationssignal) 26S: 26S Proteasome Der Ubiquitin / 26S Proteasom Weg: Das Prinzip K: Lysine Ub: Ubiqitin Ub-target conjugate Das stark konservierte Ubiquitin Protein (Ub) dient als wiederverwendbares Signal für gezielten Proteinabbau Ubiquitinierung: kovalente Bindung von Ub an ein freies Lysin des Zielproteins Ub-Zielprotein Fusionen werden durch das 26S Proteasom erkannt 26S Proteasom degradiert die Ub-markierten Zielproteine Endprodukte: Aminosäuren und Ub 3

4 Der Ubiquitin / 26S Proteasom Weg: Ub-Bindung und Wiederverwendung E1: Ub-aktivierendes Enzym (ATP abhängige Ub- Aktivierung ) E2: Ub-Bindungs Enzym (liefert Ub zu Zielprotein und nutzt E3 als Katalysator) E3: Ub-Protein Ligase (Substraterkennung und Initiation der Bindung) DUBs: Deubiquitinierendes Enzym Der Ubiquitin / 26S Proteasom Weg: Ub Bindung durch den SCF Komplex Fünf E3 Arten wurden identifiziert (hier: SCF) SCF E3 ist ein Komplex aus vier Proteinen die zusammen Ub-Ligaseaktivität besitzen RBX1 vermittelt Bindung von E2-Ub an den SCP Komplex E3 hat eine Gerüstfunktion und bringt E2-Ub in räumliche Nähe zum Zielprotein E2 transferiert Ub an freie Lysine des Zielproteins Zielprotein ist durch Ub für die Degradation markiert 4

5 Der Ubiquitin / 26S Proteasom Weg und Auxin = SCF complex TIR1 Auxinrezeptor TIR1 Aux/ IAA AUX/IAA TF-Inhibitoren der Auxinantwort Details des Auxin Signalwegs AFB1-5 Auxin Rezeptoren an SCF gebunden TIR1: Transport Inhibitor Response 1 Auxinrezeptor (Tasche an der Oberfläche für Auxin) F-Box Protein welches SCF TIR1/AFBs bildet AFB1-5: Auxin-Signaling F-Box Proteins Auxinrezeptoren F-Box Proteine TIR1 Homologe 5

6 Details des Auxin Signalwegs Auxin Für Degradation markiert AUX/IAAs: Auxin/Indol-3-Essigsäure-Proteine Negative Regulatoren von Transkriptionsfaktoren Bindet alleine kein Auxin, bindet nur Auxin, das sich bereits in TIR1 Auxinbindetaschen befindet Ubiquitinierung von AUX/IAA Proteinen (im Komplex mit SCF TIR1 ) markiert diese negativen Transkriptionsregulatoren für die Degradation durch den 26S Proteasom Weg Auxin - Effekte auf das Transkriptom Ohne Auxin: Transkriptionsfaktoren sind durch physikalische Interaktion mit Repressoren (AUX/IAA) inaktiviert Auxin-Antwortgene werden nicht transkribiert Nach Auxinbindung an Rezeptor (TIR1): Repressoren (AUX/IAA) werden degradiert Transkriptionsfaktoren werden nicht mehr inaktiviert Auxin-Antwortgene werden transkribiert 6

7 ABP1: ein weiterer Auxin-Rezeptor Auxin-binding protein 1 (ABP1): ER-lokalisiertes Protein geringe Mengen ABP1 wirken an der PM als Auxin Rezeptor Auxin blockt ABP1 vermittelt Endocytose von PIN- Proteinen Der ABP1 Signalweg aktiviert K + Kanäle und H-ATPasen Der ABP1 Signalweg aktiviert des weiteren Rho GTPasen, welche Auxin Signale weiterleiten Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Jasmonat Signalweg - Abkürzungen COI1: Coronatine Insensitive 1 (Rezeptor, F-box Protein) JAZs: Jasmonat ZIM-Domänen Proteine (Transkriptionsfaktor- Inhibitoren) SCF: Ubiquitinligase Komplex JA Jasmonatrezeptor 7

8 Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Jasmonat Effekte auf das Transkriptom Ohne Jasmonat: Transkriptionsfaktoren sind durch physikalische Interaktion mit Repressoren (JAZ) inaktiviert Jasmonat-Antwortgene werden nicht transkribiert Nach Jasmonatbindung an Rezeptor (COI1): Repressoren (JAZ) werden degradiert Transkriptionsfaktoren werden nicht mehr inaktiviert Jasmonat-Antwortgene werden transkribiert Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Gibberellin Signalweg - Abkürzungen GA Gibberellinrezeptor GID1: GA Insensitive Dwarf 1 (GA Rezeptor aus Reis, kein F-Box Protein) DELLA: Aminosäuresequenz einer charakteristischen N-terminalen Domäne (Inhibitor von Transkriptionsfaktoren) SCF: Ubiquitinligase Komplex (markiert Proteine für folgende Degradation) SCF complex F-box proteins : GID2: GA Insensitive Dwarf 2 SLY1: SLEEPY1 (Arabidopsis) 8

9 Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Gibberellin Effekte auf das Transkriptom Ohne Gibberellin: Transkriptionsfaktoren sind durch physikalische Interaktion mit Repressoren (DELLA) inaktiviert Gibberellin-Antwortgene werden nicht transkribiert Nach Gibberellinbindung an Rezeptor (GID1): Repressoren (DELLA) werden degradiert Transkriptionsfaktoren werden nicht mehr inaktiviert Gibberellin-Antwortgene werden transkribiert Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Unterschiede in der SCF-Komplex Bildung Auxin Jasmonat Gibberellin TF- Inhibitor Rezeptor TF- Inhibitor Rezeptor Direkte Interaktion zwischen Rezeptor und SCF-Komplex möglich, da der Rezeptor selbst ein F-Box Protein ist Gerüstprotein (F-Box Protein) vermittelt SCF Interaktion GID2: Reis SLY1: Arabidopsis 9

10 Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Unterschiede in der SCF-Komplex Bildung Auxin Jasmonat Gibberellin * * * * = F-box Protein Rezeptor = F-box Protein Rezeptor ǂ F- box Protein Durch austauschen der F-Box Untereinheit kann ein SCF-E3 Komplex spezifisch verschiedene Zielproteine erkennen und ubiquitinieren. Cytokinin, Brassinosteroid und Abscisinsäure Signalwege Signalweiterleitung geschieht durch reversible Phosphorylierungskaskaden, die die Regulation von Transkriptionsfaktoren steuern 10

11 Cytokinin Signalweg das Prinzip Signal Perzeption Phosphorylierung einer Histidin Kinase receptor Phosphorylierung von Transkriptionsfaktoren (TFs) Phosphorylierte TFs steuern die Expression von Cytokinin Antwortgenen Cytokinin Signalweg Abkürzungen AHK: Arabidopsis Histidin Kinase receptor AHPs: Arabidopsis Histidin Phosphotransfer Proteine ARRs: Arabidopsis Response Regulators (Transkriptionsfaktoren) CRF: Cytokinin Response Factors (Transkriptionsfaktoren) 11

12 Cytokinin Signalweg Teil 1: Phosphotransfer receptor cytosol P = Phosphorylierung nucleus + - AHK bindet über die CHASE Domäne Cytokinin Cytokinin Bindung führt zur Phosphorylierung von AHK AHPs (5 in Arabidopsis) Positive Regulatoren des Signalwegs Können zwischen Cytoplasma und Zellkern pendeln Bringen das Phosphat zu ARRs im Zellkern ARRs (durch Phosphotransfer aktiviert) Typ B: aktivieren Cytokinin Antwortgene Typ A: inhibieren Typ-B ARRs Cytokinin Signalweg Teil 1: Regulation der Transkription cytosol nucleus Durch B-ARRs positiv regulierte Gene: 1) A-ARRs 2) CRFs 3) andere Cytokinin Antwortgene CRFs regulieren Cytokinin-vermittelte Antworten der Pflanze positiv P = Phosphorylierung A-ARRs Regulieren Cytokinin Antwortgene negativ Inhibition von B-ARRs (negative Rückkopplung) 12

13 Cytokinin Signalweg: Effekt auf das Transkriptom kein Cytokinin inaktiv Cytokinin Bindung cytosol nucleus kein Cytokinin: Rezeptorkinase inaktiv, kein Phosphotransfer TF nicht phosphoryliert (inaktiv) Antwortgene werden nicht transkribiert Cytokinin Bindung durch Rezeptor (AHK): Rezeptorkinase ist aktiv, Phosphotransfer zum Zellkern TFs werden phosphoryliert Antwortgene werden transkribiert Brassinosteroid Signalweg Das Prinzip BR bindet an eine Rezeptor ähnliche Kinase BAK1 PM Heteromerisierung, Phosphorylierungen Freisetzung der BR-Signalkinase Phosphorylierungen / Dephosphorylierungen Nicht phosphorylierte TFs aktivieren BR Antwortgene 13

14 Brassinosteroid Signalweg Teil 1 Abkürzungen BRI1: Brassinosteroid Insensitive 1 BAK1 (Rezeptor-ähnliche-Kinase) BKI1: BRI1 Kinase Inhibitor BAK1: BRI1-Assoziierter Rezeptor BRI1 = BR-Rezeptor Kinase 1 (Positiv regulierende Komponente des Rezeptors) BSK: BR-Signal Kinase (vermittelt die Signaltransduktion in den Zellkern) Brassinosteroid Signalweg Teil 1: Freisetzen der Kinase BAK1 BR Bindung an den Rezeptor initiiert die Dissoziation des Kinase Inhibitors BKI1 Anschließend interagiert der positive Regulator BAK1 mit dem Rezeptor BRI1 = BR-Rezeptor inhibiert BRI1 BAK1 aktiviert BRI1 Zahlreiche Phosphorylierungsereignisse führen letztendlich zur Phosphorylierung und Freisetzung der Kinase BSK1 P = Phosphorylierung 14

15 Brassinosteroid Signalweg Teil 2 Abkürzungen TF = Transkriptionsfaktor BSK: BR-Signalkinase BSU1: BRI1 Supressor (Phosphatase) TF aktiv TF inaktiv BIN2: Brassinosteroid Insensitive 2 (Kinase) BES1: BRI1-EMS Suppressor BZR1: Brassinazole Resistant 1 (TFs, positive Regulatoren der BR Antwort) PP2A: Protein Phosphatase 2A Brassinosteroid Signalweg Teil 2 Regulation der Transkription TF = Transkriptionsfaktor BSK bindet an die Phosphatase BSU1 Anschließend dephosphoryliert und inaktiviert BSU die Kinase BIN2 TF aktiv TF inaktiv Die Inaktivierung von BIN2 führt zur Akkumulation der nicht phosphorylierten und damit aktiven TFs BES1/BZR1 (PP2A dephosphoryliert diese TFs zusätzlich) Aktive BES1/BZR1 rekrutieren weitere TF-Proteins und induzieren die Expression von Antwortgenen 15

16 Brassinosteroid - Effekt auf das Transkriptom inaktiv P Kein Brassinosteroid: Rezeptor-ähnliche-Kinase ist inaktiv, Signalkinase (BSK) wird nicht freigesetzt Transkriptionsfaktoren sind phosphoryliert (inaktiv) Brassinosteroid-Antwortgene werden nicht transkribiert aktiv Brassinosteroid Bindung an den Rezeptor(BRI1): Rezeptor-ähnliche-Kinase ist aktiv, Signalkinase (BSK) wird freigesetzt Transkriptionsfaktoren sind nicht phosphoryliert (aktiv) Brassinosteroid-Antwortgene werden transkribiert Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Ethylen Signalweg Das Prinzip Rezeptor bindet Ethylen Inhibition der Ethylenantwort durch den Rezeptor wird aufgehoben Die Degradation positiver Regulatoren durch das 26S Proteasom wird inhibiert Unbekannte Mechanismen steuern die Transkriptionskaskade Transkription von Ethylen Antwortgenen 16

17 Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Ethylen Signalweg - Abkürzungen integral membrane protein ETR1: Ethylene Response 1 (Rezeptor) CTR1: Constitutive Triple Response (MAPKK Kinase) EIN2: Ethylene Insensitive 2 (überaus mysteriöses Transmembranprotein) EIN3: Ethylene Insensitive 3 (TF) EIL1: EIN3-Like Protein (TF) SCF Komplex Komponenten: ETP1+2: EIN2 Targeting Protein 1/2 EBF1+2: EIN3 Binding F-Box 1/2 Der Ethylen Signalweg ETR1 wirkt als negativer Regulator Kein Ethylen Der Ethylen Rezeptor ETR1 bindet CTR1 (MAPKKK) und inhibiert EIN2 ETR1 wirkt als konstitutiv aktiver negativer Regulator, wenn kein Ethylen gebunden ist Proteinmengen von EIN2 und von Signalweg TFs EIN3/EIL1werden durch 26S Proteasom Degradation reduziert Keine Transkription von Antwortgenen 17

18 Ethylen Signalweg ETR1 ist ein negativer Regulator Ethylen an ETR1 gebunden Ethylenbindung durch ETR1 führt zur Dissoziation und Inaktivierung von CTR1 TF Inhibition der 26S Proteasom vermittelten Degradation von EIN2 und TFs sowie Aufhebung der Inhibition von EIN2 Aktiviertes EIN2 wirkt als positiver Regulator von EIN2/EIL1 (TFs) EIN3/EIL1 aktivieren downstream Signalkomponenten sowie spezifische TFs für die Transkription weiterer Antwortgene Ethylen Signalweg EIN2 C-Terminus wird nach Proteolyse in den Zellkern transportiert -Ethylen + Ethylen ETR1 bindet CTR1 (MAPKKK) und inhibiert EIN2 Phosphorylierung des EIN2 C- Terminus erfolgt durch CTR1 Phosphoryliertes EIN2 ist inaktiv 18

19 Ethylen Signalweg EIN2 C-Terminus wird nach Proteolyse in den Zellkern transportiert -Ethylen + Ethylen Ethylenbindung an ETR1 führt letztendlich zur Dephosphorylierung vom EIN2 C-Terminus Proteolytische Spaltung des C- Terminus erfolgt an einer dephosphorylierten Position EIN2 C-Terminus wird vom ER in den Nukleus transportiert uns ist an der Transkriptionsaktivierung beteiligt Ethylen Signalweg Effekt auf das Transkriptom Kein Ethylen Ethylene gebunden Kein Ethylen: ETR1 (Rezeptor) reprimiert die Ethylenantwort 26S Proteasome degradiert positive Regulatoren Antwortgene werden nicht transkribiert Ethylen bindet an den Rezeptor (ETR1): ETR1-Ethylenbindung hebt die Repression von Signalwegkomponenten auf Degradation von positiven Regulatoren durch das 26S Proteasome wird reduziert Transkription von Antwortgenen 19

20 Abscisinsäure wird durch verschiedene Rezeptoren gebunden Plasmamembran Nucleo/Zytoplasmatisch Chloroplast??? GTG1+2: GPCR-Typ G-Protein??? ABAR: ABA Receptor CHlH: Chelatase H Subunit bestätigt PYR: Pyrabactin Resistant PYL: Pyrabactin Resistant Like RCAR: Regulatory Component of ABA Receptors Abscisinsäure wird durch verschiedene Rezeptoren gebunden ABA bindet an PYR/PYL/RCAR Nach der ABA Bindung interagiert der Rezeptor mit PP2Cs (Protein Phosphatase 2C) Die Bildung des Rezeptor/ABA/PP2C Komplex hebt die Phosphataseaktivität der PP2Cs auf, diese können SnRK2 Kinasen nicht mehr inhibieren Autophosphorylierung der SnRK2s ermöglicht die Phosphorylierung von TFs Phosphorylierte TFs aktivieren die langfristige ABA Antwort 20

21 Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Abscisinsäure wird durch verschiedene Rezeptoren gebunden Ohne ABA: Ohne ABA können die PYR/PYL/RCAR Rezeptoren PP2Cs nicht inhibieren, diese inhibieren SnRK2 Kinasen TFs werden nicht phosphoryliert (inaktiv) ABA Antwortgene werden nicht transkribiert inaktiv inhibition inhibition released ABA wird vom Rezeptor gebunden (PYR/PYL/RCAR): ABA bindet an Rezeptor und inhibiert PP2Cs, was zu aktiven SnRK2s führt TFs werden phosphoryliert Transkription der Antwortgene Stomata molekulare Details einer kurzfristigen ABA Antwort 21

22 ABA schnelle und langfristige Antwort Sowohl kurzfristige ABA-Antworten, wie der Stomataschluss bei Wassermangel (reguliert über Aktivität von Ionenkanälen), als auch langfristige Antworten, wie Keimungshemmung und Wachstumsinhibition durch das Hormon (reguliert durch Aktivität von Transkriptionsfaktoren), werden durch die gleichen Signalwegkomponenten vermittelt! WT abi1-1 Beispiel: Die abi1-1 Phosphatase Mutante zeigt sowohl in kurzfristigen als auch in langfristigen Prozessen Phänotypen! Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Subzelluläre Lokalisation von Phytohormonrezeptoren 22

23 Integration von Hormonwegen a) d) b) d) d) c) a) Hormonsignalwege beeinflussen sich gegenseitig! Ein Hormon kann den Signalweg eines anderen auf drei Arten regulieren: 1. Synthese des zweiten Hormons wird reguliert a) Ethylen und Auxin kontrollieren für die Synthese des anderen Hormons kritische Gene 2. Transport des zweiten Hormons wird verändert b)cytokinin inhibiert Expression von PIN Auxintransportern 3. Zwei Signalwege wirken parallel auf das gleiche Zielprotein c) die BR-regulierte BIN2 Kinase reguliert den eigentlich Auxin-regulierten TF ARF2) d) Die Stabilität der DELLA Proteine wird durch andere Hormonwege beeinflusst Integration von Hormonwegen Beispiel: ABA inhibiert GA-induzierte DELLA Degradation nach GA-Gabe werden DELLA:GFP Fusionsproteine abgebaut (links) durch Behandlung mit 20 µm ABA wird dieser Effekt aufgehoben 23

24 Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Zusammenfassung Auxin, Jasmonat, Gibberellin: Degradation negativer Regulatoren führt zur Transkription von Antwortgenen. Cytokinin: Durch Phosphotransfer vom Rezeptor am ER zu TFs im Zellkern wird das Signal weitergeleitet. Brassinosteroid: Nach Hormonbindung an den Rezeptor and der PM wird eine Kinase freigesetzt, die eine Phosphorylierungs- / Dephosphorylierungskaskade startet, die schließlich TFs reguliert. Abscisinsäure: ABA Bindung an den Rezeptor inhibiert eine Familie von Phosphatasen, die sowohl kurzfristige Antworten wie das Schließen von Stomata als auch langfristige Transkriptionsantworten steuern. Ethylen: Ethylenbindung an den Rezeptor am ER hebt die Degradation positiver Regulatoren des Signalwegs auf und startet so die Transkription von Antwortgenen. 24