2. Seminar:

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1 2. Seminar: Ballaset al. (1993): Identification of the Auxin-responsive Element, AuxRE, in the Primary indoleacetic Acid-inducible Gene, PS- IAA4/5, of Pea (Pisumsativum). J Mol Biol 233: Abel et al. (1994): Early auxin-induced genes encode short-lived nuclear proteins. PNAS 91:

2 preliminary model (1993) Ub AXR1? Ub E3 E2 Ub repressor? Ub Ub Ub Ub AXR1similar to ubiquitin-activating enzyme E1 auxin response

3 Hintergründe bis dahin bekannt (1993): schnelle Induktion der Zellelongation durch Auxin (~15-25 min) transkriptionelleinduktion verschiedener Gene geht der phys. Reaktion voraus Hypothese: Auxin reguliert Zellelongation über Veränderung von Genexpressionsmustern Auxin-responsiveGene wurden in Erbse, Sojabohne und Arabidopsisidentifiziert, die untereinander eine sehr hohe Homologie aufweisen und Kriterien als primäre Auxinresponsegene erfüllen: Induktion der Expression schnell und spezifisch durch Auxin Induktion erfordert keine de novo Proteinbiosynthese erforderliche Signalelemente liegen bereits vor

4 1. paper Ziel: Identifizierung der Promotorsequenz, die für die Auxin Response in Auxin-induzierbaren Genen verantwortlich ist = Auxin-responsive Element (AuxRE) = Versuchen den Signalweg vom Ende her zu entschlüsseln (erst die Promotorsequenz, dann Transkriptionsfaktoren, Interaktionsproteine der Transkriptionsfaktoren...) 4

5 Voraussetzung: Etablierung eines Auxin-induzierbaren Protoplastensystems / Reportersystems Lokalisation des AuxREerfordert das Testen vieler verschiedener (chimärer) Konstrukte stabile Trafo(sehr aufwändig+ zeitintensiv + funktioniert nicht mit jeder Pflanzenart gleich gut) transiente Transfektionmit Protoplasten (leichter zugänglich für die Aufnahme von DNA-Konstruktenund Chemikalien als komplexe Gewebe) NotwendigerTest: Überprüfen ob sich die Protoplasten genauso verhalten wie intakte Keimlinge (Auxin response)

6 test protoplasts vs. epicotyls Kontrolle IAA 2,4-D NAA GA ABA BA IAA4/5 IAA4/5 IAA6 pwi1 pwi1 + IAA Kontrolle 20 µm IAA 6 Protoplasten Epicotyle

7 test protoplasts vs. epicotyls IAA4/5 Kontrolle IAA 2,4-D NAA GA ABA BA IAA4/5Induktionin Protoplasten IAA6 IAA4/5 pwi1 gleicht der in Epicotylen wird spezifisch durch Auxine induziert erfolgt schnell, pwi1 Transkriptmengeakkumuliert + IAA in Abhäng. Kontrolle der Behandlungsdauer µm IAA Protoplasten Epicotyle 7

8 Konz. abhängigkeit IAA4/5 pwi1 Auxin responsein Protoplasten ist mit der von Epicotylen vergleichbar kann für weitere Experimente genutzt werden IAA4/5 Expression nimmt mit steigener Auxinkonz. zu Inhibierungder Proteinbiosynthese aktiviert Expression auch in Abwesenheit von Auxin! 1. Signalelemente müssen nicht erst gebildet werden 2. fehlende Aktivierung im Grundzustand vermutlich durch Repressorproteine 8

9 Transkriptionelle Fusion (chimäre Konstrukte) Promotor XY Gen XY GFP Promotor XY + Reportergen Luciferase ß-Glucuronidase(GUS) CAT Aktivierung Promotor XY Reportergen Nachweis der mrna Nachweis der Promotoraktivität

10 CAT reporter system CAT = Chloramphenicol acetyltransferase Enzym kann das Antibiotikum Chloramphenicolneutralisieren, indem Acetylgruppen übertragen werden -CAT + CAT 10

11 CAT reportersystem IAA Test des CAT reporter systems K kein Promotor konstitutiver Promotor IAA4/5 Promotor IAA4/5::CAT CAT-Aktivität spiegelt die Auxin responsedes Promotors zeit-und konzentrationsabhängig wider 11

12 AufklärungderPromotorstruktur primer extension: i.d.r. ersterschritt zur Charakterisierung von Promotorbereichen/Erhalt vollständiger Transkripte Identifizierungdes Transkriptionsstarts (TATAbox, 5 UTR) TATA? ATG Promotor? 5 UTR? reverse Transkription IAA4/5 IAA4/5 (mrna) P 32 Primer 12

13 Primer extension IAA4/5 (mrna) P 32 Primer 3 Transkriptionsstarts identifiziert: 93, 95 und 99 bpvor dem Start ATG Experiment wurde auch mit Primer Extension aus dem chimärenkonstrukt (IAA4/5:CAT) wiederholt = gleiches Ergebnis ACGT Pr Epi 13

14 promoter deletion analysis basale CAT Aktivität vermindert Seq. für basale Expression! aber Auxin response funktioniert noch keine/kaum CATAktivität CAT Aktivität Vom 5 Ende her markiert Position -318 die Grenze zur Position des AuxRE

15 promoter deletion analysis : basale Expr. OK, aber Induktion verloren! -154 markiert 3 Endedes AuxRE 15

16 promoter deletion analysis Das AuxREliegt im Bereich von -154 bis

17 Testender core sequence min. Promotor = keine CAT Aktivität AuxRE= Auxin-induzierter Anstieg der CAT Aktivität inv. AuxRE = geringe Induktion der CAT Aktivität min. Promotor = kaum CAT Aktivität AuxRE= Auxin-induzierter Anstieg der CAT Aktivität inv. AuxRE = geringe Induktion der CAT Aktivität (-318 AuxRE -154) reicht für die Auxin response aus korrekte Orientierung ist essentiell! 17

18 in vivo reporter assay Konstrukte in Tabak transformiert GUS IAA4/5 Promotor GUS -318 IAA4/5 Prom. GUS -188 IAA4/5 GUS Bestätigung der Region -318 bis -154 als notwendig für die Auxin response + Faktoren die dafür in Erbse nötig sind finden sich auch in Tabak 18

19 Bereichwurdeauf 164 bp eingegrenzt(-318 bis-154) DNaseI footprinting Liegen Bindestellen für kernlokalisierte Proteine (Transkriptionsfaktoren) in diesem Bereich? DNase I footprinting 19

20 Nr. 3 / 10 Nr. 4 / 5 / 6 (-IAA) Nr. 7 / 8 / 9 (+IAA) - IAA + IAA 20

21 - IAA komplementärer Strang - IAA + IAA 21

22 - IAA komplementärer Strang - IAA + IAA 22

23 Strukturdes AuxRE II-VI: five sequence motifs identified by Oeller et al. (1993) footprint C/E CACATGCTCATGTTTC palindrome sequence TGTCCCAT (1993) found in: auxin-responsive genes of P. sativum, soybean and A. thaliana 23

24 1. paper Fazit: Es konnten zwei verschiedene Sequenzbereiche identifiziert werden, die zusammen die Auxin response vermitteln. Für beide Bereiche konnte die Bindung von Kernproteinen gezeigt werden + konservierte Sequenzen gefunden werden die in Auxin-responsivenGenen verschiedener Arten auftreten 24

25 Approaches to Dissect Auxin Signaling Auxin Receptor Auxin-related Mutants Early Genes Late Genes Ion Flux Cell Elongation Cell Division Cell Differentiation min Day Week

26 Classic Experimental Systems

27 Straight Growth Assays

28 Minus IAA Plus IAA

29 Major Classes of Early Auxin Genes ACS SAUR Aux/IAA GH3-like GH2/4-like ACC Synthase?? Labile Nuclear Transcription Factors Glutathione S-Transferase Ethylene Detoxification Cellular Redox State Intercellular Signaling Regulation of Gene Expression Stress Response

30 Some Features of Aux/IAA Genes

31 Some Features of Aux/IAA Genes

32 Approaches to Dissect Auxin Signaling Auxin Receptor Auxin-related Mutants Early Genes Late Genes Promoter Protein?

33 Question: Where are the proteins expressed in planta? First Approach: Immunolocalization BIG FAILURE!!!

34 ... because Aux/IAA proteins are labile

35 ... but where are the proteins? Hypothesis: In the cell nucleus.

36 The data say: Yes, they are!

37 Domain III is similar to the DNA-binding domain of prokaryotic transcription factors

38 Domain III is similar to the DNA-binding domain of prokaryotic transcription factors

39 +IAA Highlights of Aux/IAA Gene Expression +IAA

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41 Modelle(1993/1994) 41