Funktion. Transkriptionsfaktor in der Ethylen-Signaltransduktion

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1 Modifiziertes Funktion Funktionen Protein des Target Ubiquitinierung Phytochrom Polyubi.: (Ubiquitylierung) AUX/IAA EIN2 Auxin-Signaltransduktion Transkriptionsfaktor in der Ethylen-Signaltransduktion Abbau über 26S Monoubi.: Histone, Sumoylierung LAF1 Phytochrom A- Signal- Transduktion Ran-GAP Nukleärer Transport -Antagonistisch zu Ubiquitin (stabilisierend) - subnukleäre -Kernlokalsiation Rubylierung Cul1 Aktivierung des SCF TIR - Komplexes (E3), Auxin- Signaltransduktion SUMO: Small ubiquitin-like modifier

2 Lehrbücher: Splicing: Polyadenylierung: Promoteranalyse: Molecular Biology of the Cell. 4rd ed. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Martin; Roberts, K. and Walter, P. (2002) New York and London: Garland Publishing. + CD Genes VII, Lewin (2000) Oxford University Press and Cell Press. Biochemistry & Molecular Biology of Plants, Buchanan, Gruissem and Jones (2000) American Society of Plant Physiologists, Rockville, Maryland Lorkovic,Z.J., Wieczorek-Kirk,D.A., Lambermon,M.,H. and Filipowicz,W. (2000) Pre-mRNA splicing in higher plants. Trends Plant Sci., 5, Rothnie,H.,M. (1996) Plant mrna 3'-end formation. Plant Mol. Biol., 32, Lebel,E., Heifetz,P., Thorne,L., Uknes,S., Ryals,J. and Ward,E. (1998) Functional analysis of regulatory sequences controlling PR-1 gene expression in Arabidopsis. Plant J., 16, Arabidopsis Transkriptionsfaktoren: Riechmann,J.,L, Heard,J., Martin,G., Reuber,L., Jiang,C., Keddie,J., Adam,L., Pineda,O., Ratcliffe,O.,J., Samaha,R.,R., Creelman,R., Pilgrim,M., Broun,P., Zhang,J.,Z., Ghandehari,D., Sherman,B.K. and Yu,G. (2000) Arabidopsis transcription factors: genome-wide comparative analysis among eukaryotes. Science, 290, Yeast one-hybrid und yeast two-hybrid system: Homeobox Proteine:

3 Nukleäre Genexpression Struktur Promotor und regulatorische Sequenzen Exons Introns Terminator Transkription RNA Polymerasen Allgemeine Transkriptionsfaktoren 5 Cap Splicing Spliceosome Splice-Signale Splicing Reaktion RNA editing Bildung des 3 -Endes

4 Promoter und regulatorische Sequenzen der RNAPol II TATA Box: Die TATA Box wird vom allgemeinen Transkriptionsfaktor TFIID erkannt. Die Transkription beginnt ca. 25 Nukleotide downstream der TATA Box...YYCA*YYY (Initiator Region InR). Wenn keine TATA-Box, (InR..nt24...AGAC (DPE, downstream prom. element) Regulatorische Sequenzen: Steuern die Transkriptions-Initiations-Rate. Durch DNA-looping können regulatorische Proteine (Transkriptionsfaktoren) mit Promoter- bzw. RNA Pol assoziierten Proteinen interagieren.

5 Gen: Nukleinsäure-Sequenz, die für die Synthese eines funktionellen Polypeptids oder einer funktionellen RNA notwendig ist. Zusätzlich zur kodierenden Region umfaßt ein Gen Elemente wie Promoter, regulatorische Sequenzen, Introns und Terminator. Promoter: DNA-Sequenz, welche die Position der Transkriptions- Initiation der RNA Polymerasen bestimmt. Am Promoter binden die allgemeinen Transkriptionsfaktoren und die RNA-Polymerase. Regulatorische Sequenzen: DNA-Elemente, welche die Aktivität eines Promoters steuern. Diese DNA-Sequenzen können bis zu bp vom Promoter entfernt liegen.

6 Basaler Transkriptionsapparat Transkription Allgemeine Transkriptionsfaktoren: TFIID: TATA-binding protein (30 kda,tbp) erkennt TATA Box + ca. 11 TBP-assoziierte Faktoren (TAFs) TFIID ca. 800 kda TFIIDs mit unterschiedlichen TAFs erkennen unterschiedliche Promotoren. TFIIF: RAP74 ATP-abhängige DNA Helicase entwindet DNA RAP38 bindet an RNA Pol II TFIIF- RNA Pol Komplex TFIIH: ATPase, Helicase und Kinase phosphoryliert CTD-Tail (52x[YSPTSPS]) Phosphorylierung des CTD-Tails befreit die RNA Pol II von Transkriptionsfaktoren und die Elongation der RNA startet. Capping enzyme, splicing Faktoren und Komponenten binden an phosphorylierten CTD-Tail (Kopplung Transkription/ Modifizierung)

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9 5 Cap 5 Cap Phosphohydrolase Guanyltransferase Guanosin-N-methyltransferase S-Adenosylmethionin S-Adenosylhomocystein Cap-Synthese durch RNA Pol II assoziierte Enzyme Cap-binding Protein RNP mit pre-mrna Funktionen: Markierung der pre-mrna Schutz for RNAi Initiation der Proteinsynthese RNA-Prozessierung

10 Splicing splicing Spliceosomen: small nuclear RNAs (snrnas) + >50 Proteine snrnas existieren als Ribonucleoprotein-Komplexe (snrnp,snurps) Splicing-Maschine Interaktionen: RNA/RNA, Protein/RNA, Protein/Protein Größe: 50-60S (vergleichbar mit ribosomaler Ue.)

11 Exons, Intron, Spleißen Exon: DNA-Segment eines unterbrochenen Gens, welches in der reifen mrna repräsentiert ist. Intron: DNA-Segment, welches transkribiert wird, und durch Zusammen- Spleißen der Exons aus dem Transkript entfernt wird. Spleißen: Vorgang des Entfernens der Introns und des Fusionierens der Exons in einer RNA. R-loop technique: Bildung eines mrna/dna-komplexes, EM-Aufnahme (Schema)

12 Kartierung von Exons Splicing S1 entfernt Loop und überhängende Enden Exonuclease VII schneidet überhängende Enden, Loops bleiben intakt dsdna- markiert (Sonde) Informationen über: Anzahl der Introns, Intron Größe Berk and Sharp Technik

13 Splicing splicing 4 Typen Introns: Die meisten Introns können in 4 Kategorien eingeteilt werden. Unterscheidungsmerkmale: strukturelle Eigenschaften, Spleißmechanismus G Gruppe II-Typ: Mitochondrien in Pilzen, pflanzlichen Mitochondrien und Plastiden, GU-AG Regel, mit Nuclear pre-mrna Typ verwandt, splicing in vitro (Pilze)

14 Splice-Signale (RNA) splicing GU-AG Regel: Das Intron wird durch GU- und AG-Dinukleotide begrenzt. Intron-Enden werden direktional definiert. 5 -splice site (Donor, left splice site) 3 -splice site (Akzeptor, right splice site) Branch-point (splicing Reaktion)

15 Splice-Signale Splicing^- Die GU-AG Regel gilt für Vertebraten, Hefe und Pflanzen. Unterschiede: z.b. polypyrimidin-tract (10xY) in Vertebraten und UA-reiche Sequenzen in Pflanzen Programme zur Intronvorhersage NetPlantGene Genscan

16 Splicing Reaktion Splicing wird durch Spliceosome katalysiert: u.a. U1,U2,U5 und U4/U6 snrnps (grüne Kreise) Schritt 1: Branch point A Nukleotid aus Intron greift 5 splice site an und das 5 Ende des Introns wird kovalent mit Branchpoint A verbunden (5-2 Bindung!) U2,U6 Schritt 2: Das 3 -OH Ende des ersten Exons wird mit dem Anfang des zweiten Exons verknüpft. Dabei wird die 3 splice site des Introns freigesetzt - snrnp-u5 interagiert mit 3 splice site.

17 Splicing-Reaktion Splicing 2x Transesterifizierung pre-mrna erste Transesterifizierung (S N 2) (2,5 -Phosphodiester Bindung!) zweite Transesterifizierung RNA-katalysierte Reaktion! lariat intron (Lasso) + mrna T. Cech (Nobelpreis)

18 Splicing-Reaktion Splicing Struktur der verzweigten RNA, die während des Splicings gebildet wird.

19 Splicing Alternatives splicing: Eine pre-mrna wird unterschiedlich gespleist. Dadurch werden Exons unterschiedlich kombiniert. (Immunglobuline) Pflanzen: HPR-Gen (Hydroxypyruvat Reduktase) HPR2 enthält peroxysomales Targeting Signal, HPR1 nicht.

20 Splicing Trans-splicing: Typische Spleißreaktionen bei Pflanzen sind intramolekular (cis-splicing). Es gibt jedoch auch Reaktionen an denen zwei oder mehr RNA Moleküle beteiligt sind (trans-splicing): in Plastiden. Tabak Gen für Chloroplastenprotein rps12 Chlamydomonas psaa

21 RNA editing Splicing Posttranskriptionelle Veränderung der proteinkodierenden Sequenz mancher mrnas idr in Organellen Vorkommen: mitochondriale Gene in Trypanosonen und Pflanzen, Chloroplastengene! 2 Arten von RNA Editing: a) Insertion oder Deletion b) Nukleotid Konversion C U (idr, zum Teil U nach C)

22 Splicing RNA editing Vorkommen des RNA Editings Information zum RNA Editing wird durch guide RNAs geliefert, welche komplementär zu Bereichen der zu editierenden RNA ist. Beteiligung von trans-faktoren (Pentatricopeptid Repeat Protein PPR)

23 RNA editing Splicing Veränderung der Proteinprodukte durch Editing

24 Splicing Domain shuffeling Rosetta Stein-Module interspezifischer Vergleich der Domänenzusammensetzungen gibt Hinweise auf Funktionsmodule

25 Exon shuffeling Splicing