Von Hautzellen zu anderen Körperzellen From skin to other cell types of the body

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1 Eingereicht: Angenommen: Interessenkonflikt Keiner. DOI: /ddg English online version on Wiley Online Library Von Hautzellen zu anderen Körperzellen From skin to other cell types of the body Daniel Novak, Kasia Weina, Jochen Utikal Klinische Kooperationseinheit für Dermato-Onkologie, Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Heidelberg und Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie, Medizinische Fakultät Mannheim der Ruprecht-Karl Universität, Heidelberg, Mannheim Zusammenfassung Die regenerative Medizin erlaubt die individuelle Anpassung von Geweben und Organen und bietet damit Patienten mit unheilbaren Erkrankungen und schweren Verletzungen eine hoffnungsvolle Perspektive. Dafür müssen sichere und verlässliche Methoden für die Generierung spezifischer Zelltypen entwickelt werden. Es sind in letzter Zeit verschiedene Strategien zur Umwandlung somatischer Zellen in entsprechend differenzierte Zelltypen entwickelt worden. Eine davon ist die zelluläre Reprogrammierung, welche die Umwandlung somatischer Zellen in induzierte pluripotente Stammzellen (induced pluripotent stem cells, ipscs) erlaubt. Besagte ipscs ähneln embryonalen Stammzellen, besitzen als solche ein fast unbegrenztes Entwicklungspotenzial und können in spezifische Zellinien differenziert werden. Alternativ kann die Methode der Transdifferenzierung verwendet werden, bei der eine terminal differenzierte Zelle direkt in einen anderen Zelltyp umgewandelt wird. Das Potenzial beider Methoden hat die regenerative Zelltherapie wesentlich vorangebracht. In diesem Zusammenhang ist die Haut von besonderem Interesse, da sie eine ideale Quelle somatischer Zellen darstellt, die entweder zu pluripotenten ipscs reprogrammiert oder transdifferenziert werden können. Diese Übersichtsarbeit vergleicht kurz beide oben genannte Methoden und fasst die aktuellen Fortschritte dieses hochdynamischen Forschungsfeldes zusammen. Summary Regenerative medicine allows for the customization of tissues and organs which may bring hope to patients with incurable diseases and severe injuries. Therefore, reliable and safe methods for the generation of specific cell types must be established. Recently, different strategies have emerged to convert somatic cells into differentiated cells of interest. One of these strategies is cellular reprogramming, which converts somatic cells into induced pluripotent stem cells (ipscs). These ipscs are embryonic stem cell-like cells with almost unlimited developmental potential and can be differentiated into specific lineages. Alternatively, the method of transdifferentiation can be used to directly convert one terminally differentiated cell into another cell type. Both of these methods have proven to have the potential to push the field of cell replacement therapy forward. In this context, the skin is of particular interest because it represents an ideal source of somatic cells for reprogramming to pluripotency as well as transdifferentiation. In this review, we briefly compare both above-mentioned strategies and summarize the latest advances in this highly dynamic field of research. 789

2 Abbildung 1 Strategien zur Zellersatztherapie. Die Generierung patientenspezifischer Zellen für die Zellersatztherapie könnte mit der Isolation primärer Hautzellen beginnen, welche zu ipscs reprogrammiert und in der Folge in vivo differenziert werden. Alternativ ensteht bei der Transdifferenzierung der gewünschte Zelltyp, ohne dass ein pluripotentes Zwischenstadium durchlaufen wird. Die differenzierten Zellen können zur Zellersatztherapie oder zu Forschungszwecken genutzt werden. Die Reprogrammierung von Hautzellen in einen pluripotenten Zustand und ihre Differenzierung Takahashi and Yamanaka läuteten 2006 eine neue Ära der Stammzellforschung ein, indem sie zeigten, dass die ektope Überexpression von vier Transkriptionsfaktoren (Oct4, Sox2, Klf4 und cmyc) ausreicht, um murine somatische Zellen in induzierte pluripotente Stammzellen (ipscs), welche embryonalen Stammzellen (embryonic stem cells, ESCs) stark ähneln, zu transformieren [ 1 ]. Die Einfachheit der Methode und die vielfältigen Möglichkeiten, die sich aus dieser revolutionären Entdeckung ergeben, haben die Entwicklung eines neuen Forschungsfeldes im Bereich der zellulären Reprogrammierung angestoßen. Wenig später gelang es mehreren Forschergruppen, humane Körperzellen zu pluripotenten Zellen zu reprogrammieren [ 2, 3 ]. Die ips-zell-technologie erlaubt nicht nur die Erforschung fundamentaler Mechanismen von Stammzellwachstum und Differenzierung, sondern hatte einen substanziellen Einfluss auf die medizinische Forschung, v.a. im Bereich der regenerativen Medizin. Das Ziel der regenerativen Medizin ist die Behandlung schwerer Erkrankungen oder Verletzungen durch Ersatz des geschädigten Gewebes mit individualisierten neuen Organen oder Geweben. Mit Entdeckung der ips-zell-technologie ist die Forschung nun in der Lage, die nächsten Schritte hin zu personalisierten medizinischen Behandlungen zu gehen [ 4 ]. Der Weg zu einer Zellersatztherapie könnte mit der Erzeugung patientenspezifischer humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (human induced pluripotent stem cells, hipscs) beginnen (Abbildung 1 ). Die Haut ist eine leicht zugängliche Quelle somatischer Zellen, die mit wenig Aufwand isoliert werden können. Das bei einer Stanzbiopsie gewonnene Material genügt für die Generierung von ipscs. Zudem ist für verschiedene Zelltypen der Haut (Fibroblasten, Keratinozyten oder Melanozyten) eine relativ leichte Reprogrammierung in mehreren Fällen gezeigt worden [ 5, 6 ]. Des Weiteren können ipscs unter Verzicht auf ektope Reprogrammierungsfaktoren erzeugt werden [ 7 ]. Um ipscs für regenerative Therapien einsetzen zu können, müssen sie spezifisch zu den benötigten Organen oder Geweben differenziert werden. Zahlreiche Wissenschaftler arbeiten weltweit intensiv an der Entwicklung geeigneter Protokolle; bislang sind in vitro Differenzierungen von hipscs zu Hepatozyten [ 8 ], Kardiomyozyten [ 9 ], Retinazellen [ 10 ], verschiedenen neuronalen Zellen [ 11, 12 ] und verschiedenen anderen Zelltypen gelungen. Neben den genannten Fortschritten ist es das letztendliche Ziel der wissenschaftlichen Bemühungen, funktionelle Ersatzorgane für Patienten zu generieren, die diese benötigen. Obwohl noch viel Arbeit geleistet werden muss, illustriert ein kürzlich publizierter Artikel von Takebe et al. dass hipscs als Quellmaterial für die Produktion funktioneller Organe dienen können [ 13 ]. Die Autoren beschreiben darin die Generierung einer vaskularisierten, funktionellen humanen Leber aus hipscs. Diese wurden zuerst in vitro zu hepatischen endodermalen Zellen differenziert, um dann mit humanen Nabelvenenendothelzellen (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) und humanen mesenchymalen Stammzellen (human mesenchymal stem cells, MSCs) kokultiviert zu werden. Unter diesen Bedingungen bildeten die von hipscs abstammenden hepatischen Zellen dreidimensionale Leberknospen aus, die den während der Embryogenese in vivo entstehenden Leberknospen ähnelten. Nach Transplantation in immundefiziente Mäuse verband sich das Gefäßsystem der Leberknospen 790

3 mit der Zirkulation des Wirtsorganismus, und die Leberknospen reiften zu einem der adulten Leber vergleichbaren Organ. Des Weiteren konnte in einem Mausmodell des medikamenteninduzierten letalen Leberversagens gezeigt werden, dass die Transplantation entsprechender Leberknospen die Tiere retten kann, womit gezeigt ist, dass unter entsprechenden Kulturbedingungen aus hipscs in der Tat funktionelle Organe entstehen können. Im Bereich der regenerativen Dermatologie könnten aus ipscs differenzierte Zellen für die Transplantation von Keratinozyten oder Melanozyten genutzt werden, z.b. für Patienten mit Vitiligo. In ipscs können Genmutationen durch Methoden wie die homologe Rekombination korrigiert werden, so dass Zelltransplantationen auch für Patienten mit angeborenen Hauterkrankungen wie Epidermolysis bullosa oder Xeroderma pigmentosum von großem Interesse wären [ 4 ]. Neben ihrem hohen Differenzierungspotenzial erlauben hipscs autologe Transplantationen, ohne Anstoßungsreaktionen zu provozieren, da die Transplantate patientenindividuell aus ipscs generiert würden. Des Weiteren entfallen die ethischen Bedenken, die bei Forschungsarbeiten mit humanen embryonalen Stammzellen problematisch sind. Andererseits gilt es derzeit noch, eine Reihe von Hindernissen zu bewältigen, bevor hipscs therapeutisch einsetzbar werden. Das wichtigste Problem hierbei ist die Tatsache, dass hipscs immortal und potenziell tumorigen sind, und ihre Herstellung Mechanismen beinhaltet, die bei der Tumorentstehung auftreten, wie z.b die negative Regulation des Trp53-Tumorsuppressorgens [ 14 ]. Daher können Tumoren oder Teratome im Rahmen der Transplantation von aus ipscs generierten Geweben und Organen entstehen, falls undifferenzierte oder teildifferenzierte Zellen im Transplantat verbleiben. Es ist weiterhin noch unklar, in wie weit die Reprogrammierung die genetische Integrität und den epigenetischen Status einer Zelle beeinflusst. Transdifferenzierung von Hautzellen zu verschiedenen Zelltypen Die Reprogrammierung somatischer zu pluripotenten Zellen und nachfolgende gerichtete Differenzierung der hipscs ist nicht die einzige Möglichkeit der Gewebsherstellung. Eine alternative Strategie zur Änderung von Zellidentität und weiterer Entwicklung ist es, somatische Zellen direkt in einen anderen Zelltyp zu transdifferenzieren, ohne dass diese einen pluripotenten Intermediärzustand durchlaufen (Abbildung 1 ). Aus technischen Gesichtspunkten sind die Reprogrammierung zu pluripotenten Zellen und die Transdifferenzierung vergleichbar. Generell führt die ektope Überexpression spezifischer Transkriptionsfaktoren zu einer Unterdrückung des aktuellen Transkriptionsprogramms und startet eine für eine andere, nicht verwandte Zellinie typische transkriptionelle Aktivität. Den ersten experimentellen Nachweis eines induzierten Zellinienwechsels erbrachten Davis et al. in den späten 1980er Jahren, indem sie durch Überexpression des myogenen Transkriptionsfaktors MyoD erfolgreich murine Fibroblasten in Myoblasten umwandelten [ 15 ]. Die Entdeckung von Takahashi und Yamanaka, dass somatische Zellen zu Pluripotenz reprogrammiert werden können, wurde mit dem Nobelpreis honoriert, führte aber auch zu einer Intensivierung der Forschungsanstrengungen auf dem Gebiet der Transdifferenzierung, welche in den letzten Jahren zu bemerkenswerten Ergebnissen geführt hat [ 16 ]. Oftmals wurde die erste Transdifferenzierung in eine spezifische Zellinie an murinen Zellen vorgenommen und die Ergebnisse in der Folge auf den Menschen übertragen. Im Jahr 2010 wurde von der direkten Transdifferenzierung muriner Fibroblasten in Neurone durch ektope Überexpression der Transkriptionsfaktoren Ascl1, Brn2 und Myt1l berichtet [ 17 ]. Ein Jahr später transdifferenzierten Pang et al. humane Fibroblasten zu Neuronen, indem sie NeuroD1 der genannten Kombination von Transkriptionsfaktoren hinzufügten [ 18 ]. Fast gleichzeitig wandelten Pfisterer et al. humane Fibroblasten durch die ektope Überexpression von Ascl1, Brn2 und Myt1l in dopaminerge Neurone um [ 19 ]. Die zusätzliche Überexpression der Transkriptionsfaktoren Lmx1a und FoxA2 zu der genannten Dreierkombination erlaubte sogar die Generation dopaminerger Neurone, dem spezifischen neuronalen Subtyp, der beim Morbus Parkinson pathologisch verändert ist. Die Möglichkeit der Generierung definierter Subtypen funktioneller Neurone würde die therapeutischen Optionen neurologischer Erkrankungen wesentlich verbessern. Trotz der existierenden Vielzahl von Beispielen der erfolgreichen Transdifferenzierung somatischer Zellen sind die zugrundeliegenden Mechanismen dieses Prozesses weiterhin unklar. Kürzlich publizierte Studien geben erste Einblicke in den Transdifferenzierungsprozess. Wapinski et al. untersuchten die Transdifferenzierung muriner Fibroblasten in Neurone und zeigten dabei, dass Ascl1 als so genannter Pionierfaktor fungiert, in dem es an gebundenes Chromatin bindet und in der Folge Brn2 zu dessen Bindungsstellen rekrutiert. Diese Aktivität von Ascl1 ist mit einem spezifischen Histonmarker assoziiert, dessen Menge zelltypspezifische Unterschiede zeigt, was erklären könnte, warum einige Zelltypen einfacher zu transdifferenzieren sind als andere [ 20 ]. Es bleibt zu zeigen, ob dieses Modell auf Transdifferenzierungsansätze angewandt werden kann oder nicht. Weitere Beispiele der erfolgreichen Transdifferenzierung humaner Körperzellen waren u.a. die Umwandlung von Fibroblasten in hämatopoetische Progenitorzellen [ 21 ] und retinale pigmentepithelähnliche Zellen [ 22 ] (Tabelle 1 ). Die Transdifferenzierung somatischer Zellen zu Kardiomyozyten ist ein weiterer Themenbereich, in dem derzeit intensiv 791

4 Tabelle 1 Beispiele erfolgreicher Transdifferenzierungen aus humanen somatischen Hautzellen. Ausgangszelltyp Faktorenkombination Generierter Zelltyp Referenz Fibroblasten Ascl1, Brn2, Myt1l, NeuroD1 Neurone [ 18 ] Fibroblasten Ascl1, Brn2 and Myt1l Dopaminerge Neurone [ 19 ] Fibroblasten Oct4 + Zytokinbehandlung Hämatopoetische Vorläuferzellen [ 21 ] Fibroblasten cmyc, Mitf-A, Otx2, Rax, Crx Retinales Pigmentepithel [ 22 ] Fibroblasten GATA4, Hand2, Tbx5, Myocardin, mir-1, mir-133 Kardiomyozyten [ 23 ] Fibroblasten cmyc, Klf4, Sox9 Chondrogene Zellen [ 25 ] Keratinozyten PDX-1 Pankreatische insulinproduzierende Zellen [ 26 ] geforscht wird. Kürzlich konnten humane Fibroblasten zu Kardiomyozyten differenziert werden, interessanterweise durch die ektope Überexpression der kardialen Transkriptionsfaktoren GATA4, Hand2, Tbx5 und Myocardin sowie der Mikro-RNAs mir-1 und mir-133 [ 23 ]. Wie erwähnt besteht ein wesentlicher Vorteil der Transdifferenzierung im Vergleich zur ipsc-differenzierung im Hinblick auf den klinischen Einsatz in der Vermeidung eines potenziell tumorigenen Intermediärstadiums. Daher könnte die Transdifferenzierung sowohl zum in vivo Gewebsersatz als auch zur in vitro Herstellung von Geweben und Organen genutzt werden. Qian et al. zeigten in einem Mausmodell, dass kardiale Fibroblasten durch die ektope Überexpression dreier kardialer Transkriptionsfaktoren in vivo zu Kardiomyozyten transdifferenziert werden können [ 24 ]. Nach experimenteller Induktion eines Myokardinfarkts wurden die Transdifferenzierungsfaktoren mittels eines retroviralen Vektors in den Grenzbereich zwischen dem infarzierten und dem umliegenden Gewebe injiziert, eine Behandlung, die sowohl zu einer Verbesserung der kardialen Funktion als auch zu einer Reduktion des Narbenareals führte. Im Vergleich zur in vitro Transdifferenzierung entstanden in vivo aus Fibroblasten Kardiomyozyten, die den endogenen Kardiomyozyten deutlich ähnlicher waren, vermutlich bedingt durch das umgebende native Mikromilieu. Die Transdifferenzierung somatischer Zellen hat großes Potenzial für die Zukunft der regenerativen Medizin. Ähnlich wie die Differenzierung von hipscs erlaubt sie die Herstellung autologer Transplantate ohne ethische Bedenken, und vermeidet zusätzlich den tumorigenen zellulären Intermediärzustand der pluripotenten Zelle, womit ihre klinische Anwendbarkeit wahrscheinlicher wird. Die Proliferationskapazität transdifferenzierter somatischer Zellen ist jedoch limitiert, was zu Zellalterung führt. Dies könnte dann problematisch werden, wenn große Zellzahlen für den Gewebsersatz nötig werden. Zudem können hipscs in jeden benötigten somatischen Zelltyp differenziert werden, und es bleibt zu zeigen, ob dies auch durch Transdifferenzierung möglich wird. Trotz zahlreicher Hindernisse und offener Fragen ist der aktuelle Fortschritt auf dem Gebiet der regenerativen Medizin vielversprechend. Die Regeneration von Organen und Geweben durch hipsc-technologie oder Transdifferenzierung könnte in naher Zukunft Realität werden. Korrespondenzanschrift Prof. Dr. med. Jochen S. Utikal Klinische Kooperationseinheit für Dermato- Onkologie, Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Heidelberg und Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie, Medizinische Fakultät Mannheim der Ruprecht-Karl Universität Heidelberg Theodor-Kutzer-Ufer Mannheim, Germany jochen.utikal@umm.de Literatur 1 Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006, 126 : Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007, 131 : Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 2007, 318 : Galach M, Utikal J. From skin to the treatment of diseases the possibilities of ips cell research in dermatology. Exp Dermatol 2011, 20 ( 6 ): Maherali N, Ahfeldt T, Rigamonti A et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 2008, 3 ( 3 ): Utikal J, Maherali N, Kulalert W, Hochedlinger K. Sox2 is dispensable for the reprogramming of melanocytes and 792

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