ThromboType 1 Test (HPA- 1)

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1 GEBRAUCHSANLEITUNG ThromboType 1 Test (HPA- 1) REF THROMBOTYPE1 IVD ThromboType1 Reagenzien E-Gel 48 TABLE OF CONTENTS Inhaltsverzeichnis GEBRAUCHSANLEITUNG... 2 ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNGEN... 2 TESTPRINZIP... 2 REAGENZIEN... 2 VORSICHTSMAßNAHMEN... 2 WARNHINWEISE... 3 PROBENGEWINNUNG... 3 DURCHFÜHRUNG... 4 Mitgelieferte Materialien... 4 Weitere benötigte Materialien... 4 Testdurchführung... 4 QUALITÄTSKONTROLLE... 8 INTERPRETATION DER ERGEBNISSE... 8 LIMITATIONS Einschränkungen... 8 SPEZIFISCHE CHARAKTERISTIKA DES TESTS... 9 BIBLIOGRAFIE... 9 ThromboType1 Test IFUDE REV D

2 GEBRAUCHSANLEITUNG Der ThromboType1 Test ist ein Test zur molekulargenetischen Bestimmung des Thrombozytenalloantigensystems HPA-1 (PL A ) mittels PCR-Amplifikation humaner genetischer DNA. ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNGEN Grundlage der humanen Plättchenalloantigensysteme (HPAs), in diesem Fall HPA-1 (PL A ), sind individuelle Unterschiede einzelner Aminosäuren in den thrombozytären Glykoproteinen. Obwohl ein Einfluss der Aminosäuremodifikationen auf die Funktion der Proteine nicht unmittelbar erkennbar ist, führen sie zu Veränderungen der Proteinstruktur. Die daraus resultierenden antigenen Determinanten können Ziel der Immunantwort werden und zur Bildung von Allo- oder Autoantikörpern führen. Diese wiederum können lebensbedrohliche Blutgerinnungsstörungen hervorrufen. Hierzu gehören die Transfusionsrefraktärität bei Therapie mit Thrombozytenkonzentraten, die Posttransfusionspurpura und die neonatale Alloimmunthrombozytopenie. Bisher verwendete serologische Methoden zur Typisierung von Plättchenantigenen HPA-1 haben ihre Grenzen, da es an gut charakterisierten Alloantiseren mangelt und Plättchen bei thrombozytopenischen Patienten häufig schwer zu isolieren sind. Durch Fortschritte auf dem Gebiet der Plättchenimmungenetik ist es inzwischen möglich, die Unterschiede einzelner Nukleotide, die die HPA-1 Allelen charakterisieren, zu bestimmen. ThromboType1 Test ist eine Alternative zur serologischen Typisierung von Plättchenmerkmalen. Bei der Auswahl kompatibler Plättchenkonzentrate für alloimmunisierte Empfänger stellt der Test eine Ergänzung zum HLA-Matching dar. ThromboType1 Test enthält Reagenzien zur Durchführung einer Allel-spezifischen PCR unter Verwendung von isolierter genomischer DNA und zur Identifizierung des individuellen Genotyps HPA 1. Die Auswertung erfolgt mittels Gelelektrophorese. TESTPRINZIP Der Test nutzt eine gesetzlich geschützte, modifizierte Form der Polymerasekettenreaktion unter Verwendung Allel-spezifischer Primer, bei der es zur Entstehung eines PCR-Produktes kommt, wenn das entsprechende Allel in der Probe vorliegt. Über die Amplifikation kann das Vorhandensein von Allelen für den Plättchenpolymorphismen HPA-1: HPA-1a(PL A1 ) oder HPA-1b(PL A2 ), in einer DNA-Probe bestimmt werden. Zunächst wird genomische DNA aus der Probe des Patienten isoliert. Hierfür können kommerzielle Systeme oder in der Fachliteratur beschriebene Techniken für die Isolierung von hoch-reiner genomischer DNA verwendet werden. Mit Hilfe der beigelegten Gefäße und Reagenzien wird eine Amplifikation der isolierten DNA durchgeführt. Nach der Amplifikation wird ein Aliquot jeder Reaktion in eine Vertiefung eines Agarosegels pipettiert. Die PCR-Produkte werden mittels Elektrophorese ihrer Größe nach aufgetrennt (Dauer min.). Die Auswertung des Gels erfolgt auf einem UV-Tisch (UV- Transilluminator). Das Vorliegen eines PCR-Produkts von spezifischer Größe zeigt das Vorhandensein des jeweiligen Allels in der DNA-Probe an. Produktbanden von internen Kontrollprimern zeigen an, dass in jeder PCR-Reaktion geeignete Reaktionsbedingungen vorgelegen haben. Zur Dokumentation der Testergebnisse kann ein Foto des Gels angefertigt werden. REAGENZIEN Maximale Anzahl an Bestimmungen pro Testpackung: ThromboType1 Test: 24 Bestimmungen pro Testpackung Alle Reagenzien müssen entsprechend den Angaben der Etiketten gelagert werden. REF PT 1a/1b HPA-Primer Gefäße: PCR-Gefäße mit innen anhaftenden getrockneten Allel-pezifischen Primern. Die Gefäße befinden sich in wieder verschließbaren Beuteln. Gebrauchsfertig. 1a: Rosa Gefäße mit rosa Verschlußkappen 1b: Gelbe Gefäße mit gelben Verschlußkappen LAD bp DNA-Leiter: Einzelne Fragmente doppelsträngiger DNA, beginnend bei 100 bp und in 100 bp- Schritten aufsteigend bis 1000 bp in einem Tris-Puffer. Gebrauchsfertig. PR fach konzentriertes PCR Reagenz: Tris-HCL-Puffer mit Magnesiumchlorid, Oligonukleotidprimern, freien Desoxynukleotid-Triphosphaten (dntp s) sowie andere gesetzlich geschützte Komponenten. Vor Gebrauch verdünnen. E-Gel E-Gel 48 Gel: vorgefertigte Agarosegele (4%), die für die Auftrennung der PCR-Produkte verwendet werden. Gebrauchsfertig. VORSICHTSMAßNAHMEN Reagenzien oder Gele nicht über das Verfallsdatum hinaus verwenden. Keine trüben oder kontaminierten Reagenzien verwenden. ThromboType1 Test IFUDE REV D

3 Gele, die beschädigt oder ausgetrocknet sind, sollen nicht verwendet werden. Die in der Testpackung enthaltenen PCR-Gefäße und Reagenzien dürfen nicht in Verbindung mit anderen Testsystemen verwendet werden. Austausch von Komponenten, die nicht zu dieser Testpackung gehören, kann zu widersprüchlichen oder fehlerhaften Ergebnissen führen. Aufgrund von Schwankungen in der Leistung verschiedener Thermocycler kann es notwendig werden, dass die Laufparameter des PCR-Programms durch das Labor angepasst werden müssen. DNA nicht aus heparinisiertem Blut isolieren. Heparin kann die Amplifikation stören. Das PCR-Verfahren ist geschützt durch mehre Patente, deren Inhaber die Firmen Roche Molecular Systems und F. Hoffmann LaRoche Ltd. sind. Informationen bzgl. Lizenzen zur Durchführung der PCR erhalten Sie (für die USA) beim Director of Licensing at Roche Molecular Systems, Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California 94501, oder (außerhalb der USA) beim PCR- Lizenzmanagement, F. Hoffmann-La Roche Ltd., Grenzacherstr. 124, CH-4070 Basel, Schweiz. PCR-Laborpraxis Die ausgeprägte Fähigkeit der PCR zur Vervielfältigung von DNA-Sequenzen macht die Methode empfindlich gegen Kontaminationen mit Fremd-DNA, auch wenn es sich nur um geringe Mengen handelt. Daher sollte alles unternommen werden, um die Verschleppung von bereits amplifizierter DNA in die zu testende DNA-Probe zu vermeiden. Das Risiko einer Kreuzkontamination kann reduziert werden, indem man Bereiche für Arbeiten vor der Amplifikation von Arbeitsbereichen für Arbeiten nach der Amplifikation trennt. Vorzugsweise sollten die Arbeiten in separaten Räumen erfolgen, wenigstens jedoch in getrennten Bereichen eines Raumes. Um freigesetzte Aerosole als Kontaminationsquelle zu vermeiden, kann eine biologische Sicherheitswerkbank für die DNA-Präparation genutzt werden. Zur Herstellung einer kontrollierten Arbeitsumgebung für PCR- Ansätze im Prä-Amplifikationsbereich kann eine Dead Air Box verwendet werden. Sämtliche Arbeiten im Post- Amplifikationsbereich sollten auf saugfähigen wasserundurchlässigen Papierunterlagen zum Auffangen von Spritzern durchgeführt werden. Die Unterlagen sind unter Beachtung der gültigen nationalen Abfallrichtlinien für biologische Stoffe zu entsorgen. Jeder Arbeitsbereich sollte über einen eigenen Satz von zweckgebundenen Pipettiergeräten verfügen. Der Austausch von Laborzubehör zwischen Prä- und Post-Amplifikationsbereichen sollte so gering wie möglich gehalten werden. Jegliches Zubehör aus dem Post-Amplifikationsbereich sollte vor Einbringen in den Prä-Bereich mit einem DNA-inaktivierenden Agens behandelt werden (geeignet ist z.b. 10%-ige Bleichlösung für Haushaltszwecke). Für jeden Pipettierschritt sollte eine frische Pipettenspitze verwendet werden. Sofern keine Direktverdränger-Pipetten ( positive displacement ) verwendet werden, empfiehlt sich die Verwendung von Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere. Für jeden Arbeitsbereich sollten separate Laborkittel vorgesehen sein. Während der Arbeiten sollten die Handschuhe häufiger gewechselt werden. Weiterhin sollten bei der Testdurchführung die Kontrollprobe und die Umgebungskontrolle (Negativkontrolle Verwendung von Wasser anstatt DNA als Probe) nach den Patientenproben angesetzt werden. WARNHINWEISE Nach Beendigung des Tests sind für die Entsorgung der Abfälle die lokalen Vorschriften für die Entsorgung potentiell biogefährdender Abfälle zu beachten. Wieder verwendbare Materialien sind mit 10%-iger Bleichlösung oder anderen DNAinaktivierenden Wirkstoffen zu behandeln. Die UV-Tische, mit deren Hilfe PCR-Produkte sichtbar gemacht werden, emittieren energiereiches ultraviolettes Licht, welches Augen und die Haut schädigen kann. Tragen Sie bei Arbeiten am UV-Tisch immer entsprechende Schutzkleidung und eine UV- Schutzbrille oder einen Gesichtsschutz. E-Gels enthalten zum Anfärben der DNA eine geringe Menge Ethidiumbromid. Ethidiumbromid ist als humanes Mutagen bekannt. Gelkassetten dürfen nicht geöffnet werden. Entsorgen Sie die Gele entsprechend den lokalen Vorschriften für die Entsorgung von Gefahrstoffabfällen. PROBENGEWINNUNG Isolieren Sie DNA nach einer in der Fachliteratur beschriebenen Methode oder mittels eines kommerziellen für diesen Zweck hergestellten Kits. Die DNA sollte in sterilem destilliertem Wasser oder 10 mm Tris-Puffer, ph 8,0-9,0, gelöst werden. Die Proben sollten nicht in Lösungen rehydriert werden, die mehr als 0,5 mm EDTA oder andere Chelatbildner enthalten. Diese können die PCR-Reaktion beeinträchtigen. DNA-Proben sofort nach der Isolation untersuchen oder in einem Gefrierschrank (ohne Abtauautomatik) bei 20 C oder kälter für längere Zeit (ein Jahr oder länger) lagern. Der Einsatz von gefrorenen Proben ( 20 C) im ThromboType1 Test, verdünnt in TRIS/EDTA-Puffer (10 mm TRIS, ph 8,0-9,0/0,5 mm EDTA) und gelagert in Röhrchen mir O-Ring Schraubverschluss, zeigte eine 100% Übereinstimmung mit den Ergebnissen der DNA-Sequenzierung dieser Proben frisch getestet. Weitere Stabilitätsdaten zu gefrorenen Proben erhalten Sie auch auf den Webseiten von zwei Herstellern von DNA-Isolationskits: Gentra Systems und Qiagen. DNA-Proben sollten in einem Konzentrationsbereich von ng/µl vorliegen und ein Verhältnis der Absorptionen 260nm/280nm zwischen 1,60 und 1,90 aufweisen. Die Anwesenheit größerer Mengen an Protein, RNA, Heparin, EDTA oder anderer Chelatbildner können die PCR-Amplifikation stören. ThromboType1 Test IFUDE REV D

4 DURCHFÜHRUNG Die Gefäße in der Testpackung können mehr Reagenz enthalten, als auf dem Label angegeben ist. Entnehmen Sie deshalb immer die benötigten Mengen mit kalibrierten Pipetten. Mitgelieferte Materialien Verpackt für die Lagerung bei 2-8 C 1. Enthält drei wieder verschließbare Beutel mit jeweils 8 HPA-1a (PL A1 ) PCR-Gefäßen (rosa) 8 HPA-1b (PL A2 ) PCR-Gefäßen (gelb) 2. 2 x 450 µl 2-fach konzentrierte PCR-Reagenz x 200 µl 100 bp-dna-leiter-standard FS 4. 3 Verschlussfolien NCT 5. Negative Kontrollgefäße: 1x8 leere PCR-Gefäße in einem wieder verschließbaren Beutel für die negativen Kontrollamplifikationen Verpackt für die Lagerung bei C 1. 3 x 4% E-Gel 48 Weitere benötigte Materialien (nicht im Lieferumfang enthalten) Für die Durchführung der PCR Taq-Polymerase, nativ oder rekombinant hergestellt, 5 U/µl. Keine anderen hitzeresistenten Polymerasen oder hot start Modifikationen von Taq-Polymerase verwenden. Programmierbarer Thermocycler mit Heizblock für 0,2 ml PCR-Gefäße Silikon-Andruckmatte Verstellbare Mikropipetten für µl Volumen, sterile Pipettenspitzen mit Aerosolschutz DNA- und DNase-freies Wasser Eisbad oder Kühlblock für 0,6 ml oder 1,5 ml Gefäße und 0,2 ml PCR-Gefäße PCR-Gefäßständer für 0,2 ml Gefäße Vortexer Polypropylen-Mikrozentrifugengefäße mit anhängendem Verschlussdeckel (0,5 1,7 ml), DNA und DNase-frei 10 %-ige Bleichlösung oder anderes DNA-inaktivierendes Mittel Für die Elektrophorese und Auswertung Elektrophoreseeinheit E-Base-Motherbase Ständer für PCR-Gefäße (0,2 ml) Verstellbare Mikropipetten (Volumen 1-20 µl) und sterile Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere Wasserdichte saugfähige Unterlage für den Labortisch UV-Tisch UV-Transilluminator 10 %-ige Bleichlösung oder anderes DNA-inaktivierendes Mittel deionisiertes Wasser Gel-Dokumentationssystem Optional verstellbare Mehrkanalmikropipette, Volumina 5 µl und 10 µl, sterile Pipettenspitzen mit Aerosolschutz elektronische Pipette oder Dispensierpipette (20-25 µl) und Pipettenspitzen mit Aerosolschutz Testdurchführung Zur Vorbereitung 1. Isolieren Sie genomische DNA von allen zu testenden Proben. Jede Probe sollte eine DNA-Konzentration im Bereich von ng/µl und ein Absorptionsverhältnis 260 nm/280 nm zwischen 1,60 und 1,90 aufweisen. ThromboType1 Test IFUDE REV D

5 2. Programmierung des Thermocyclers mit dem ThromboType1 Test PCR-Programm. Die Parameter lauten wie folgt: 94 C 30 Sekunden 94 C 1 Sekunde 57 C 30 Sekunden 6 Zyklen 72 C 10 Sekunden 94 C 1 Sekunde 65 C 30 Sekunden 27 Zyklen 72 C 10 Sekunden 72 C 12 Sekunden 4 C Halten Dieses Protokoll wurde für den ABI PE9700 im Max mode entwickelt. Aufgrund unterschiedlicher Eigenschaften der PCR-Geräte muss der Test für jeden Gerätetyp individuell validiert werden, indem bekannte Proben zur Überprüfung der einwandfreien Funktion des Tests amplifiziert werden. Erhöhen Sie bei Auftreten von schwachen Banden die Zeiten für beide Annealing-Schritte um 3 Sekunden und danach in 1-Sekunden-Schritten bis die Produktmengen ausreichend sind. Bei Auftreten von schwachen readthrough Banden oder störenden Primer-Dimer-Produkten sind die Zeiten für beide Annealing-Schritte um 3 Sekunden und danach in 1-Sekunden-Schritten zu erniedrigen, bis das readthrough oder die Dimerbanden verschwunden sind. PCR 3. Nehmen Sie den Thermocycler einige Zeit vor Beginn des Laufs in Betrieb, damit der beheizbare Deckel seine Arbeitstemperatur erreichen kann. Überprüfen Sie, ob das PCR-Programm korrekt eingestellt ist. 4. Die Taq-Polymerase und das 2-fach konzentrierte PCR-Reagenz sollten auf Eis oder einem Kühlblock verarbeitet werden. 5. Pipettiergeräte und Arbeitsoberflächen sollten mit 10 %-iger Bleichlösung oder anderen DNA-inaktivierenden Mitteln gereinigt werden. 6. Legen Sie die Anzahl der zu testenden Proben fest. Für jede Probe sind zwei Gefäße zu beschriften: eins für 1a/PL A1 (rosa) und eins für 1b/PL A2 (Gelb). Ein weiteres Gefäß ist für die Negativkontrolle (Wasser) zu beschriften. 7. Erstellen Sie ein PCR-Protokoll mit den Positionen für jedes Gefäß jeder Probe. 8. Entnehmen Sie die benötigte Anzahl an PCR-Gefäßen aus der Packung und lagern Sie sie in der Reihenfolge Ihres Protokolls auf einem Kühlblock oder auf Eis. Verschließen Sie die restlichen Gefäße wieder in ihrem Beutel und lagern Sie sie bei 2-8C. 9. Entnehmen Sie die Gefäße der negativen Kontrolle dem Beutel und trennen Sie ein Gefäß für den Ansatz ab und lagern Sie es auf einem Kühlblock oder auf Eis. Verschließen Sie die restlichen Gefäße wieder in ihrem Beutel und lagern Sie sie bei 2-8C. Wenn Sie mehr als eine negative Kontrolle pro Ansatz mitlaufen lassen, dann muß das Volumen im folgenden PCR Setup auf das Extragefäß angepasst werden. 10. Eine Methode wird im folgenden beschrieben. Stellen Sie einen individuellen Mastermix, der alle notwendigen Bestandteile enthält, für jede Probe her. Ein 25 µl liquot jedes Mixes wird danach in ein 1a und ein 1b Primergefäß pipettiert. Stellen Sie auch ein negatives Kontrollmastermix her und pipettieren Sie 25 µl dieses Mix in das negative PCR-Kontrollgefäß. Alternativ kann ein eigenes Protokolle geschrieben werden, sofern jedes PCR-Mix pro Ansatz folgende Bestandteile enthält: 12,5 µl 2-fach konzentrierte PCR Reagenz 0,5 Unit Taq-Polymerase ng humane genomische DNA ( ng) DNA-freies Wasser bis zu einem max. Volumen von 25 µl Validieren Sie eigene Protokolle mit bekannten positiven und negativen Proben. 11. Herstellung des Master-Mix für jede Probe a) Beschriften Sie für jede DNA-Probe ein Gefäß und eins für die negative Kontrolle und ein Gefäß für die Taq-Verdünnung. b) Stellen Sie in DNA-freiem Wasser die Taq-Polymerase auf 0.5 Units/µl ein. Jedes Probenmastermix benötigt 2,4 µl und die negative Kontrolle 1,6 µl. Orientieren Sie sich an Tabelle 1. ThromboType1 Test IFUDE REV D

6 Verdünnung der Taq-Polymerase A # Patienten- Proben B Verdünnte Taq- Polymerase (Taq) 1.0 l Taq 9,0 l Wasser 10 l 1.2 l Taq 10.8 l Wasser 12 l 1.6 l Taq 14.4 l Wasser 16 l 1.8 l Taq 16.2 l Wasser 18 l 2.0 l Taq 18.0 l Wasser 20 l 2.4 l Taq 21.6 l Wasser 24 l 2.6 l Taq 23.4 l Wasser 26 l Rechnen Sie für mehr als 8 Proben entsprechend um. c) Herstellung der Proben-Mastermixe gemäß Tabelle 2. Herstellung der individuellen Proben-Mastermixe Volumen Wasser 2-fach konz. PCR Reagenz Taq-Polymerase 0,5 U/µl DNA-Probe Master-Mix Gesamtvolumen 18 µl 30 µl 2.4 µl 9.6 µl 60 µl d) Stellen Sie einen negativen Kontroll-Mastermix her mit 20 µl der 2-fach konzentrierten PCR-Reagenz + 1,6 µl Taq- Polymerase (0,5 U/µl) + 18,4 µl DNA-freies Wasser. e) Verschließen Sie die Gefäße und vortexen Sie alle Ansätze für 3 5 Sekunden. f) Pipettieren Sie 25 µl jedes Proben-Mastermix in ein 1a und 1b Primergefäß. Pipettieren Sie 25 µl negatives Kontroll-Mastermix in das negative Kontrollgefäß. 12. Verschließen Sie die Gefäße mit der Verschlussfolie. 13. Der Folienverschluss muss auf Dichtigkeit überprüft werden. Luftblasen am Boden der PCR-Gefäße müssen entfernt werden. Die gesamte Flüssigkeit sollte sich am Gefäßboden befinden. Dazu können die Gefäße sanft auf den Tisch geklopft oder kurz in einer Mikroplattenzentrifuge mit Ausschwingrotor zentrifugiert werden. Es ist wichtig, dass sich keine Luftblasen am Boden der PCR-Gefäße befinden und keine Flüssigkeitsreste an den Gefäßwänden verbleiben. Nichtbeachtung kann zum Ausfall der Allel-spezifischen Amplifikationen führen. 14. Starten Sie das ThromboType1 Test Programm am Thermocycler. Schalten Sie auf Pause oder halten Sie das Programm an, sobald die Blocktemperatur von 70 C erreicht ist. Überführen Sie die PCR-Gefäße aus dem Eisbad oder vom Kühlblock in den Thermocycler. Plazieren Sie einen oder mehrere leere PCR-Gefäßstreifen als Ausgleich auf der gegenüberliegenden Seite des Heizblocks. 15. Setzen Sie die Silikon-Andruckmatte über die Folienverschlüsse, so dass jedes PCR-Gefäß bedeckt wird. Der korrekte Sitz der Matte sollte sichergestellt sein und es ist darauf zu achten, dass die Matte bei Schließen des Heizdeckels nicht verrutscht. ThromboType1 Test IFUDE REV D

7 Ein gleichmäßiger Druck auf die Verschlussfolie auf den PCR-Gefäßen ist wichtig, um den Luftabschluss während der Programmschritte mit hohen Temperaturen zu erhalten. Um dies zu Erreichen, sollten gesonderte PCR-Gefäße im Block derart um die Probengefäße positioniert werden, dass der Heizdeckel waagerecht aufliegt. Die Silikonmatte dient zur Erzeugung eines ausreichenden Anpressdrucks und zum Ausgleich feiner Höhenunterschiede zwischen den PCR- Gefäßen. 16. Lassen Sie das Programm nun weiter laufen. Es dauert ca. 55 Minuten. 17. Entnehmen Sie die Gefäße nach Erreichen des letzten Programmschritts (4 C-Halten) und stellen Sie sie auf einen Ständer. Wenn die Elektrophorese nicht direkt im Anschluss erfolgt, können die Gefäße bis zu 3 Tage bei 2-8 C oder bis zu 7 Tagen bei 20 C gelagert werden. Nachweis Der Nachweis der PCR-Produkte muss an einem vom Prä-PCR-Bereich getrennten Arbeitsplatz erfolgen. Labormaterialien sollen zur Vermeidung von Probenverschleppungen nicht zwischen den Bereichen hin- und hergetauscht werden. 18. Der Arbeitsplatz sollte mit einer saugfähigen wasserundurchlässigen Unterlage vorbereitet werden. Die Elektophoreseeinheit (E- Base-Motherbase), deionisiertes Wasser, 100 bp DNA-Leiterstandard und Pipetten sollten bereitstehen. 19. Gefrorene PCR-Proben vor Gebrauch auftauen. 20. Nehmen Sie das E-Gel aus der Verpackung und entfernen Sie die Kämme. Wenn notwendig kann die obere Fläche der Gelkassette mit einem feuchten Labortuch gereinigt werden. Beschriften Sie diesen Bereich mit dem Marker. 21. Schieben Sie das Gel unter die 2 Elektroden der Elektophoreseeinheit (E-Base Motherbase) und drücken Sie es so nach unten, dass die beiden Elektroden Kontakt zum Gerät bekommen. 22. Piptieren Sie in jede Vertiefung, in die PCR-Produkte gegeben werden, 10 µl deionisiertes Wasser (2 Vertiefungen pro Probe und eine Vertiefung für jede Negativkontrolle). Kein Wasser in die 4 Vertiefungen am Rand geben (markiert mit M ). Diese sind für den 100 bp DNA-Leiterstandard reserviert. Eine der äußeren Vertiefungen (markiert mit M ) kann für die negative Kontrolle genommen werden, wenn alle anderen Vertiefungen für die Patientenproben benutzt werden. 23. Durchstechen Sie für jede PCR-Probe die Verschlussfolie mit einer frischen Pipettenspitze. Pipettieren Sie 5 µl jedes PCR- Produkts in die entsprechende Vertiefung des Gels. Durchstechen Sie die Verschlussfolien erst dann, wenn das Produkt auf das Gel transferiert wird. Die Verwendung einer Mehrkanal-Mikropipette beschleunigt die Beladung des Gels und vermindert das Risiko von Pipettierfehlern. Pipettieren Sie von jeder Probe die a und b Amplifikationen von jedem Polymorphismus in benachbarte Vertiefungen des Gels, um die Interpretation der Ergebnisse zu erleichtern. 24. Durchstechen Sie die Folie der Negativkontrolle und pipettieren Sie 5 µl der Negativkontrolle in die entsprechende Vertiefung. 25. Pipettieren Sie 15 µl des 100 bp DNA-Leiterstandard in die vier äußeren Vertiefungen (markiert mit M ), soweit nicht mit der negativen Kontrolle belegt. Jede Probe sollte zusammen mit dem 100 bp-leiterstandard laufen, damit die Größe des Amplifikats richtig bestimmt werden kann. 26. Der Netzstecker der Elektophoreseeinheit (Motherbase) kann nun eingesteckt werden. Es leuchtet ein rotes Licht und die Zeitanzeige erscheint. Mit dem Power -Knopf (rechter Knopf) in den EG-Modus (anstatt EP-Modus) wechseln. 27. Mit dem linken Knopf wird die Zeituhr auf 17 Minuten eingestellt. Eine geeignete Auftrennung kann mit einer Laufzeit von 15 Minuten erreicht werden. Die Auftrennung wird jedoch mit einer Laufzeit von Minuten verbessert. Gele nicht länger als 20 Minuten laufen lassen. 28. Zum Start auf Power (rechter Knopf) drücken. Das rote Licht wechselt mit dem Lauf auf grün. 29. Am Ende der Elektrophorese ertönt ein Alarmton und das grüne Licht wechselt zu einem roten Blinklicht. Drücken Sie auf Power um den Lauf zu stoppen. Das rote Blinklicht wechselt zu einem roten Dauerlicht. Der Netzstecker kann nun gezogen und das Gel aus der Elektrophoreseeinheit entnommen werden. ThromboType1 Test IFUDE REV D

8 30. Legen Sie das Gel auf den UV-Tisch (UV-Transilluminator), um die Produktbanden sichtbar zu machen. Das Gel sollte innerhalb von 20 Minuten beurteilt und dokumentiert werden. Wenn eine Dokumentation des Tests gewünscht wird, kann ein Foto mit Hilfe eines Geldokumentationssystems angefertigt warden. QUALITÄTSKONTROLLE Das interne Kontroll-Primerset erzeugt ein Produkt mit 85 bp, sofern amplifizierbare humane DNA in einer Menge von 40 ng oder mehr in die PCR-Reaktion gegeben wurde. Diese Bande sollte für jede PCR-Reaktion außer für die Negativkontrolle auf dem Gel erscheinen. Die Allel-spezifische Amplifikation und die interne PCR-Kontrolle konkurrieren miteinander; die internen Kontrollbanden können in Proben, die positiv für ein Allel sind, sehr schwach ausfallen oder sogar fehlen. Das Fehlen der internen Kontrollbanden bei Vorhandensein einer Allel-spezifischen Bande ist daher möglich und tolerabel. Sofern ein PCR-Ansatz jedoch DNA enthält und weder eine Kontrollbande noch eine Allel-spezifische Bande auf der Gelspur erkennbar ist, ist ein Ausfall der Amplifikation sehr wahrscheinlich. Ein Ausfall der PCR-Reaktion kann bedingt sein durch einen Verfall der Reagenzien, falsch programmierte Thermocycler, qualitativ schlecht aufgereinigte DNA, zu geringe DNA-Menge für die Reaktion oder durch fälschlich nicht pipettierte Reagenzien beim Ansatz der PCR-Reaktionen. Die Ergebnisse sind in diesen Fällen nicht verwertbar. Die Proben sollten reanalysiert werden, vorzugsweise mit einer frisch isolierten DNA-Probe. Der 100 bp DNA-Leiterstandard stellt einen unabhängigen Größenstandard für die PCR-Produktbanden dar. Er sollte bei jeder Elektrophorese mitgeführt werden. Die Banden des 100 bp-dna-leiters sollten scharf und gut voneinander getrennt erscheinen. Jeder Test, bei dem die Banden des Größenstandards zerlaufen oder komprimiert erscheinen, sollte wiederholt werden. Die Ergebnisse sollten nicht als Befund ausgegeben werden. Primer-Dimer-Banden können abhängig von der DNA-Probe oder vom verwendeten PCR-Gerät entstehen. Diese Banden mit einer Größe von weniger als 85 bp beeinträchtigen die Typisierung mit ThromboType1 Test nicht. Wenn Dimerbanden ein Problem darstellen, kann die Anpassung des PCR-Programms ihr Auftreten vermindern. Die Negativkontrolle (Wasser) sollte keine PCR-Produktbanden aufweisen, weder Allel-spezifische Banden noch interne Kontrollbanden. Das Auftreten von PCR-Banden in den Negativkontrollen spricht für technische Fehler oder kontaminierte Reagenzien. Wenn eine Kontrolle nicht wie erwartet ausfällt, sind die Ergebnisse nicht verwertbar und der Test sollte wiederholt werden. In diesem Fall können die Ergebnisse nicht als Befund ausgegeben werden. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE Das Auftreten einer Allel-spezifischen Bande der richtigen Größe auf einer Gelspur zeigt ein positives Ergebnis für das betreffende Allel an. Die Größen der PCR-Produkte für ThromboType1 Test sind unten aufgelistet. Das Fehlen der Allel-spezifischen PCR- Produktbande zeigt das Fehlen des Allels in der DNA-Probe an (negatives Ergebnis), wenn die interne Kontrollbande als Hinweis für eine erfolgreiche Amplifikationsreaktion vorhanden ist. Ist in einer PCR-Reaktion weder eine Kontrollbande noch eine Allel-spezifische Bande sichtbar, so spricht dies für einen Ausfall der Amplifikationsreaktion. Die Probe muss erneut auf das Vorhandensein des betreffenden Allels getestet werden. Produkt PCR-Produktgröße (bp) HPA Kontrolle 85 Beachten Sie, dass die 1a und 1b Amplifikationen für jede Probe etwa die gleiche Menge an Produkt erzeugen, sofern die Allele vorhanden sind. Heterozygote Proben sollten a- und b-pcr-produkte von annähernd gleicher Intensität ergeben. Eine Probe, in der ein Allel-spezifisches Produkt wesentlich schwächer erscheint als das andere im gleichen HPA-System, ist möglicherweise nicht heterozygot Stattdessen ist die schwache Bande möglicherweise auf einen technischen Fehler oder auf unspezifische Amplifikation zurückzuführen ( read-through ). Beim read-through kommt es zur schwachen Amplifikation durch Allel-spezifische Primer von einer DNA, die das betreffende Allel nicht trägt. Diese Proben sollten mit einer geringeren Menge von Proben DNA nachuntersucht werden. Tritt die Bande in der Wiederholung in ähnlicher Intensität wie die alternierende Allele auf, ist es ein positives Ergebnis für die fragliche Reaktion und die Probe sollte positiv für die Allele typisiert werden als echt heterozygot. Dieses Ergebnis weist auf einen technische Fehler als Ursache für das Entstehen der schwachen Bande im Originalansatz hin. Tritt die schwache Bande in der Wiederholung erneut auf, spricht dieses für einen echten read-through oder ein falsch positives Ergebnis; die Probe sollte als negativ für das betreffende Allel eingestuft werden. LIMITATIONS Einschränkungen Der ThromboType1 Test enthält Materialien für die Vervielfältigung genomischer DNA-Sequenzen mittels Polymerasekettenreaktion und die nachfolgende Detektion HPA 1- Allel-spezifischer Sequenzen mittels Agarosegelelektrophorese. Unbekannte Varianten in den relevanten Gensequenzen können die Ergebnisse negativ beeinflussen. Um optimale Ergebnisse des ThromboType1 Tests sicherzustellen, sollten die DNA-Proben eine Konzentration zwischen 10 und 100 ng/µl mit einem 260/280nm Verhältnis von 1,60 1,90 aufweisen. Schlechte PCR-Resultate können durch funktionell geschädigte DNA oder durch DNA von geringem Reinheitsgrad entstehen. ThromboType1 Test IFUDE REV D

9 Falsch negative Resultate können durch ungeeignete Behandlung von Proben, Fehler bei der Durchführung des Tests, PCR- Inhibitoren oder ungeeignete genomische Proben-DNA entstehen. Kontaminationen durch verschleppte Nukleinsäuren, Überladung der Reaktionsansätze mit genomischer DNA oder von den Vorgaben abweichende Temperaturen im PCR-Protokoll können Gründe für falsch positive Ergebnisse sein. Für die Entwicklung dieses Tests wurde die DNA erwachsener Personen eingesezt. Der Test wurde nicht für die Verwendung pränataler Proben validiert. Dieser Test liefert gute Ergebnisse mit den PCR-Geräten ABI PE9700, 9600 und 2720 und mit dem MJ-Research (jetzt Bio-Rad) PTC-200 und dem Eppendorf Mastercycler und Mastercycler EP. Die Verwendung anderer PCR-Geräte kann Anpassungen der oben genannten PCR-Parameter erforderlich machen. Thermocycler sollten entsprechend den Anweisungen des Herstellers kalibriert und gewartet werden. SPEZIFISCHE CHARAKTERISTIKA DES TESTS Genauigkeit der Ergebnisse Die Genauigkeit des ThromboType1 Test wurde in drei Vergleichsstudien beurteilt: Vergleich von ThromboType1 Test und PAT Ein methodischer Vergleich wurde zwischen dem ThromboType1 Test und dem PAT Test durchgeführt. 15 HPA 1a/b Genotypen wurden im ThromboType1 Test und im PAT (n=30 Ergebnisse) durchgeführt. Die Allelverteilung war wie folgt: 8 HPA-1a/a, 3 HPA- 1b/b und 4 HPA-1a/b. Die Ergebnisse zeigten eine 100-ige % Übereinstimmung zwischen den Methoden. Vergleich von ThromboType1 Test und DNA-Sequenzierung DNA-Sequenzierungen wurden zur Ermittlung der HPA-1a/b Genotypen an 46 Proben mit folgender Verteilung der Allelen durchgeführt: 33 HPA-1a/a, 4 HPA-1b/b und 9 HPA-1a/b. Alle Proben wurden auch im ThromboType1 Test getested. Die Ergebnisse des ThromboType1 Test zeigten eine 100 %-ige Übereinstimmung mit den Ergebnissen der DNA-Sequenzierung. Vergleich von ThromboType1 Test und einem molekulargenetischen Typisierungstest auf DNA-Basis 36 Proben mit folgender Allelverteilung wurden in dieser Studie eingesetzt: 22 HPA-1a/a, 7 HPA-1b/b, und 7 HPA-1a/b. Die Proben wurden im ThromboType1 Test und zusätzlich mittels einer anderen PCR-basierten Methode im Rahmen einer unabhängigen externen Untersuchung (n=72) getestet. Die Auswertung der 72 Ergebnisse zeigte eine 100%-ige Übereinstimmung der Ergebnisse zwischen dem ThromboType1 Test und der Vergleichsmethode. Testpräzision Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse des ThromboType1 Test wurde mit 3 Proben ermittelt. Diese drei Proben, representativ für das Spektrum von Allelen, wurden in Doppelbestimmung an neun verschiedenen Tagen getestet. Die Ergebnisse zeigten eine 100%- ige Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen der Doppelbestimmungen und den Ergebnissen an den verschiedenen Tagen. BIBLIOGRAFIE 1. Williamson LM, et. al.; The Natural History of Fetomaternal Alloimmunization to the Platelet-specific Antigen HPA-1a (PL A1, Zw a ) as Determined by Antenatal Screening ; Blood 1998, vol. 92: Davornen A, et. al.; Human Platelet Antigen-specific Alloantibodies Implicated in 1162 Cases of neonatal alloimmune thrombocytopenia ; Transfusion 2004, vol 44: Newman PJ, et. al.; J Clin Invest 1989; vol. 83(5): Skogen B, et. al.; Transfusion 1994; vol. 34: Immucor GTI Diagnostics, Inc Crossroads Circle Waukesha, WI USA EC REP Immucor Medizinische Diagnostik GmbH Adam-Opel-Strasse 26A Rodermark Germany US and International Contact Information: Technical Support : waukeshatechsupport@immucor.com E-Gel ist ein Markenzeichen von Life Technologies Cooperation Immucor GTI Diagnostics, Inc IFUDE Rev D ThromboType1 Test IFUDE REV D