Online-Derivatisierung von Fettsäuren. Dr. Klaus Schrickel Thermo Fisher Scientific Dreieich, Germany

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1 Online-Derivatisierung von Fettsäuren Dr. Klaus Schrickel Thermo Fisher Scientific Dreieich, Germany

2 Anwendungsbeispiele Fettsäureanalytik Lebensmittel-Überwachung Nahrungsergänzungsmittel Medizinische Diagnostik Kosmetische Produkte Biokraftstoffe Bilderquelle: Google 2

3 SFA, MUFA, PUFA... Gesättigte Fettsäuren (SFA, Saturated Fatty Acids) Kohlenstoffketten ohne Doppelbindung Gesättigte Fettsäuren kommen meist in tierischen Lebensmitteln vor (wie Fleisch, Butter, Käse). Sie können vom Körper selbst gebildet werden. Sie müssen daher nicht in großen Mengen mit der Nahrung aufgenommen werden. Eine zu hohe Aufnahme an SFA erhöht den LDL-Cholesterinwert ("schlechtes" Cholesterin) und den Gesamtcholesterinspiegel. Einfach ungesättigte Fettsäuren (MUFA, Mono Unsaturated Fatty Acids) Kohlenstoffketten mit einer Doppelbindung Einfach ungesättigte Fettsäuren können vom Körper selbst gebildet werden. Sie sind vor allem in Pflanzenölen (wie Oliven- und Rapsöl) enthalten. Sie verbessern die Balance der Blutcholesterinwerte: Das "gute" HDL-Cholesterin bleibt gleich oder steigt. Das "schlechte" LDL-Cholesterin wird gesenkt. Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA, Poly Unsaturated Fatty Acids) lebensnotwenig Kohlenstoffketten mit mehreren Doppelbindungen Mehrfach ungesättigte Fettsäuren können vom Körper nicht gebildet werden. Die Zufuhr mit der Nahrung ist lebensnotwenig (essentiell). Sie kommen vor allem in Meeresfischen aus kalten Gewässern (Lachs, Makrele, Thunfisch), in Nüssen und manchen Pflanzenölen vor (Maiskeim-, Sonnenblumen-, Distelöl). Eine hohe Aufnahme an PUFA senkt den "schlechten" LDL-Cholesterinwert und den Gesamtcholesterinspiegel. 3

4 ISO

5 Analyse als Fettsäuremethylester (FAME) mittels GC Säule: Vorsäule: Detektor: FID, 280 C Injektor: Thermo Scientific TRACE TR-FAME GC Säule 60m x 0,25mm x 0,25µm, PN: 260M154P Guard Gold, 2m x 0.25mm + SilTite SS union SSL, 280 C, 4mm Splitlos-Liner + Glaswolle Trägergas: He, 1.5 ml/min constant flow, Split 10 ml/min Ofenprogramm: 80 C 4min 15 C/min 170 C 0min 3 C/min 240 C 1min Injektionsvol.:1 µl, Standard in Hexan (Cold Needle) 5

6 Probe: 37 FAME-Mix (Supelco ) FAME2 #9 FAME Mix 1:50 FID pa C4:0 C6:0 C8:0 C10:0 C11:0 C12:0 C13:0 C14:0 C14:1 C15:0 C15:1 C16:0 C16:1 C17:0 C17:1 C18:1n9t C18:0 C18:2n6t C18:1n9c C18:2n6c C18:3n6 C18:3n3 C20:0 C20:1n9c C20:2 C21:0 C20:3n6 C20:4n6 C20:3n3 C22:0 C22:1n9 C20:5n3 C22:2 C23: min C24:0 C24:1 C22:6n3 6

7 Methoden zur Derivatisierung Alkalische Umesterung in Na-Methylat Alkalische Verseifung mit NaOH und anschließende Methylierung mit BF 3 /Methanol TMSH-Verfahren: Hydrolyse und Methylierung im GC-Injektor oder in GC-Vial 7

8 Reaktionen 1. Verseifung 2: Veresterung BF 3 Quelle: Wikipedia 8

9 Probenvorbereitung nach Bedarf Als Instrumentenmethoden stehen zwei Basismethoden bereit, die in den Einzelparametern beliebig einstellbar sind Methode 1 mit alkalischer Verseifung von Glyceriden und anschließender Methylierung der freien Fettsäuren Methode 2 mit Methylierung freier Fettsäuren ohne vorgeschalteten Verseifungsschritt Jeweils mit der Option, die Probe direkt nach der Derivatisierung in den GC zu injizieren. Hierfür kann in der optionalen ATC-Station eine Injektionsspritze vorgehalten werden. 9

10 Ablauf 1. Aufheizen der Probe im Agitator 2. Zugabe von KOH/MeOH in Tray 1 3. Intensivschütteln im Vortexer 4. Inkubation und Verseifung im Agitator 5. Entnahme eines Aliquots von Tray 1 und Dosierung in Tray2 6. Zugabe von BF 3 /MeOH zur Methylierung 7. Intensivschütteln im Vortexer 8. Inkubation und Methylierung im Agitator 9. Zugabe von Heptan in Tray 2 für Extraktion FAME aus Wasser in Heptan 10.Zugabe von NaCl-Lösung in Tray 2, Hilfsreagenz zur besseren Extraktion 11.Intensivschütteln im Vortexer 12.Abwarten in Tray 2 bis Phasentrennung erreicht ist 13.Entnahme der überstehenden Heptanphase von Tray 2 und Dosierung in Tray 3 10

11 11 Samplerkonfiguration Übersicht

12 Traykonfiguration am Probenhalter Traykonfiguration am Probenhalter, Park Station, Inkubationsofen (Agitator) und Vortexer 12

13 Konfiguration der Lösungsmittel- und Waschstationen 13

14 14 Custom Methode am TriPlus RSH

15 15 Stand alone Derivatisierungs-Roboter

16 16 Vollautomatische Analysenstation

17 Biodiesel FAME Profile #14 Biodiesel ohne IS 1 - C4:0 2 - C6:0 3 - C8:0 4 - C10:0 5 - C12:0 6 - C13:0 7-8 C14:0 - C14: C15: C15:1 (Channel 1) techchrom C1 - : C C1-7 : C1 0 : : 8-1 : C1 c c 8-21 t + -: C2 t 3 - n C2 003 : 22 : : C C2 : 26 : :- : 2C : : 01 1,600 mv 1,500 1,400 1,300 1,200 1,100 1, C4:0 C6:0 C8:0 C10:0 C12:0 C14:0 C14:1 C15:0 C1 6 : 0 C1 6 : 1 C1 8 : 2 c + t C1 7 : 0 C1 7 : 1 C1 8 : 0 C1 8 : 1 c + t C1 8 : 3 n 3 C2 0 : 0 C2 0 : 1 C2 0 : 2 C2 2 : 0 C2 2 : 1 C2 2 : 2 C2 3 : 0 C2 4 : 0 C2 4 : min

18 Chromatogaphy Data System (CDS) - Sequenz Thermo Scientific Dionex Chromeleon CDS 18

19 19 Chromatogramm + Interaktive Charts

20 20 Chromatogramm + Interaktive Charts - Ausschnitt

21 Beispiel-Report Probeninfo Chromatogramm Auswertung Einzelpeaks Gruppen-Auswertung 21

22 Zusammenfassung Vollautomatische Analyse von Fettsäuren in einem System umfasst: Online-Probenvorbereitung GC-Analyse Berechnung aller relevanten Ergebnisse Grafische Darstellung der Ergebnisse im Report Verschiedene Optionen zur Verschachtelung zur optimalen Abbildung der Labor-Abläufe Automatische Abläufe minimieren Fehlerquellen Automatische Probenvorbereitung schafft Kapazitäten für andere, wichtige Tätigkeiten z.b. QS 22

23 Kontakt Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! Dr. Klaus Schrickel Produktspezialist GC, GC/MS Thermo Fisher Scientific Chromatography and Mass Spectrometry Division Im Steingrund Dreieich Germany Phone: / Mobil: / klaus.schrickel@thermofisher.com 23